專利名稱：用于治療肌肉損傷的方法
用于治療肌肉損傷的方法本申請是申請?zhí)枮椤?1819946. 1”，發(fā)明名稱為“用于治療肌肉損傷的方法”的發(fā)明 專利申請的分案申請。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及用于治療肌肉損傷的方法。本發(fā)明特別涉及通過給受損的肌肉施用神 經(jīng)毒素而對該受損的肌肉進(jìn)行治療的方法。肌肉損傷包括骨骼肌的急性損傷如挫傷(撞傷)、裂傷、局部缺血、扭傷、以及完 全破裂。這些損傷可造成巨痛并且可以使患者喪失能力，使之不能工作或甚至使之不能進(jìn) 行正常的日?；顒?。在骨骼肌的急性損傷中，最常見的是扭傷(也被稱為拉伸而產(chǎn)生的損 傷)。例如，在由職業(yè)或運(yùn)動醫(yī)學(xué)專職人員所治療的所有損傷中，扭傷占到高至30%的水 平。Garrett 等人，Am J Sports Med, 24 (6) :S2-S8,19960肌肉扭傷性損傷的特征為肌-腱單元的破壞。該肌-腱單元的破壞可以發(fā)生在肌 肉的任何部分。這種類型的損傷最常見地發(fā)生在環(huán)繞著兩個關(guān)節(jié)運(yùn)轉(zhuǎn)的淺層肌肉的肌腱接 點(diǎn)(MTJ)附近，如大腿直肌、半腱肌和腓腸肌。離奇的運(yùn)動、或肌肉的異常應(yīng)用都可以導(dǎo)致肌肉扭傷。例如，離心收縮使用較少的 活性運(yùn)動單元來產(chǎn)生較高的力量。在該類情況中，在拉伸期間，過度延伸的肌肉單元經(jīng)受了 過度的拉力。該過度的拉力可以造成該肌肉收縮部件微觀上的損害，集中表現(xiàn)為Z-線的隨 機(jī)破壞。當(dāng)肌肉受到損害時，患者可能會經(jīng)受一種延遲發(fā)作的肌肉痛苦，其特征為疼痛、無 力以及活動范圍受到限制。該疼痛在肌肉損傷后約1至2天最為強(qiáng)烈，而活動范圍受到限 制的情況可持續(xù)一周或更長的時間。如果對骨骼肌的輕微扭傷進(jìn)行了不恰當(dāng)?shù)奶幚恚瑒t可 能會發(fā)生更為嚴(yán)重的損傷。以損傷的嚴(yán)重程度和血腫的性質(zhì)為基礎(chǔ)，有三種類別的肌肉扭傷(1)輕度(一 度)扭傷；少數(shù)肌肉纖維撕裂；不喪失力量或最低程度的喪失力量和限制活動的輕微腫脹 和不適；( 中度(二度)扭傷；力量明顯喪失的肌肉纖維的更大損害，和C3)嚴(yán)重(三度) 扭傷；橫跨整個肌腹的撕裂，使得肌肉功能全部喪失。在肌肉扭傷期間肌內(nèi)血管的撕裂常?？梢詫?dǎo)致大量的血腫。在受損肌肉中存在兩 種不同類型的血腫肌內(nèi)的和肌間的血腫。第一種類型，肌內(nèi)的血腫，在規(guī)模上被限制于完 整的肌肉筋膜內(nèi)。其中血液的外滲增加了肌內(nèi)的壓力，壓縮并限制了該血腫的大小。該類血 腫產(chǎn)生疼痛并使肌肉喪失功能。第二種類型，肌間的血腫，當(dāng)肌肉筋膜破裂時形成，并且外 滲的血液散布到肌間的空間中而不會顯著增加肌肉內(nèi)的壓力。如果肌肉內(nèi)的壓力不增加， 則這種類型的血腫不會造成明顯的疼痛。對于扭傷性損傷的治療而言，關(guān)鍵在于將受損的肌肉進(jìn)行固定，尤其是在損傷后 的前兩至三天內(nèi)要對受損的肌肉進(jìn)行固定，這是因為在損傷后受損肌肉的立即活動常常會 造成最初損傷部位的再破裂。再破裂可以導(dǎo)致更嚴(yán)重的損傷、延遲愈合并使組織形成瘢痕。 Jarvinen 等人，Curr Opin Rheumatol，第 12 卷155-161 Q000)。通過對受損肌肉進(jìn)行固定可以避免被損害部位的再破裂，優(yōu)選在損傷后立即進(jìn)行 固定。固定可以使得新形成的肉芽組織獲得足夠的拉力以抵制由可收縮的肌肉所產(chǎn)生的力fio用于固定受損/扭傷肌肉的一種公知的方法需要使用物理學(xué)上的約束物或管狀 物。例如，可以使用一種頸圈來固定受損頸部的屈肌或伸肌。但是，約束物的應(yīng)用常常很麻 煩并且不舒服。此外，對于某些肌肉群的損傷而言，使用物理學(xué)上的約束物是不實際或不可 能的。例如，很難用一種約束物來固定扭傷的上斜方肌或最大的臀肌。肉毒桿菌毒素厭氧的、革蘭氏陽性菌肉毒梭菌可產(chǎn)生一種有效的多肽神經(jīng)毒素一肉毒桿菌毒 素，其在人和動物中可造成一種被稱為肉毒中毒的神經(jīng)性麻痹疾病。在土壤中發(fā)現(xiàn)了肉毒 梭菌的芽孢并且其可以在滅菌和密封不當(dāng)?shù)募矣霉揞^食品容器中進(jìn)行生長，其為很多肉毒 中毒事件的原因。肉毒中毒的結(jié)果一般在食用了被肉毒梭菌培養(yǎng)物或芽孢所感染的食品后 18至36小時顯現(xiàn)出來。該肉毒桿菌毒素顯然可不被減弱的通過腸的內(nèi)層并攻擊外周的運(yùn) 動神經(jīng)元。肉毒桿菌毒素中毒的癥狀可以從行走、吞咽、以及說話困難發(fā)展為呼吸肌麻痹和 死亡。對于人而言，A型肉毒桿菌毒素(“BoNT/A”)是已知的最致命的天然生物學(xué)神經(jīng) 毒素。肉毒桿菌毒素(精制的神經(jīng)毒素復(fù)合體)血清型A在小鼠中的LD5tl約為50皮克。肉 毒桿菌毒素的一個單位(U)被定義為在給體重分別為18-20克的雌性Swiss Webster小鼠 進(jìn)行腹腔內(nèi)注射后的LD5tlt5已經(jīng)對七種免疫學(xué)上不同的肉毒神經(jīng)毒素的特性進(jìn)行了描述， 這些毒素分別為肉毒神經(jīng)毒素血清型A、B、Ci、D、E、F和G，其通過與血清型特異性抗體中和 而被區(qū)別開。肉毒桿菌毒素的不同血清型隨著它們所影響的動物種屬以及它們所誘發(fā)的麻 痹的嚴(yán)重程度和持續(xù)時間而變化。例如，當(dāng)對大鼠中所產(chǎn)生的麻痹速度進(jìn)行測定時，已經(jīng)測 得BoNt/A比肉毒桿菌毒素血清型B (BoNT/B)的效力強(qiáng)500倍。此外，已經(jīng)測得BoNt/B在 480U/kg的劑量下對靈長類動物無毒，該劑量12倍于BoNt/A對靈長類動物的LD5tl值。以 高親和力與膽堿能運(yùn)動神經(jīng)元顯著結(jié)合的肉毒桿菌毒素被轉(zhuǎn)運(yùn)到該神經(jīng)元中并阻斷乙酰 膽堿的釋放。肉毒桿菌毒素在臨床中已經(jīng)被用于以骨骼肌活動過度為特征的神經(jīng)肌肉病癥的 治療。BoNt/A已經(jīng)被美國食品和藥品管理局批準(zhǔn)用于治療瞼痙攣、斜視和一側(cè)面痙攣。很 顯然，與BoNt/A相比，非-血清型A的肉毒桿菌毒素血清型的效力更低和/或活性持續(xù)時 間更短。在幾個小時之內(nèi)可注意到肉毒桿菌毒素如BoNt/A的肌內(nèi)的臨床作用。因此，正如 所測定的那樣，在肌內(nèi)注射時，注意到大多數(shù)(如果不是所有的)肉毒桿菌毒素都能在注射 后的一天之內(nèi)產(chǎn)生顯著的肌肉麻痹作用是十分重要的(通過小鼠趾外展評分(DAQ進(jìn)行測
定)。Aoki K. R.，Preclinical Update on BOTOX (Α型肉毒桿菌毒素)-相對于其它的
肉毒桿菌毒素制劑的精制神經(jīng)毒素復(fù)合物，Eur J.Neur 1999，6(suppl 4) :S3_S10。BoNt/ A進(jìn)行單次肌內(nèi)注射而獲得癥狀緩解的持續(xù)時間一般平均約為3個月。在同樣待審的序列 號為09/620840的美國專利申請中陳述了具有縮短的體內(nèi)生物活性周期的包括A型肉毒桿 菌毒素在內(nèi)的肉毒桿菌毒素，該申請在這里被全文引入作為參考。雖然所有的肉毒桿菌毒素血清型都顯著地抑制在神經(jīng)肌肉結(jié)合處的神經(jīng)遞質(zhì)乙 酰膽堿的釋放，但是它們是通過影響不同的神經(jīng)分泌蛋白和/或在不同的位點(diǎn)對這些蛋白 進(jìn)行裂解而發(fā)揮作用的。例如，肉毒桿菌血清型A和E都裂解25千道爾頓(kD)的突觸小 體相關(guān)蛋白(SNAP-25)，但是它們靶向于這種蛋白內(nèi)的不同氨基酸序列。BoNT/B、D、F和G作用于小泡相關(guān)蛋白(VAMP，也被稱為小突觸泡蛋白)，其中各血清型在不同的位點(diǎn)對蛋 白進(jìn)行裂解。最后，已經(jīng)表明肉毒桿菌毒素血清Sc1 (Bomyc1)能夠裂解突觸融合蛋白和 SNAP-25。這些作用機(jī)理上的差異可以影響各種肉毒桿菌毒素血清型作用的相對強(qiáng)度和/ 或持續(xù)時間。無論是何種血清型，毒素中毒的分子機(jī)理看起來是相似的并且包括至少三個步驟 或階段。在該過程的第一步中，毒素以高親和力與靶神經(jīng)元的突觸前膜通過H鏈和細(xì)胞表 面受體之間特定的相互作用結(jié)合；認(rèn)為該受體對于肉毒桿菌毒素的各血清型和破傷風(fēng)毒素 而言是不同的。H鏈的羧基末端片段——Hc看起來對該毒素對細(xì)胞表面的靶向是十分重要 的。在第二步中，該毒素通過被毒害細(xì)胞的漿膜。該毒素首先通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作 用被細(xì)胞吞沒，并形成包含該毒素的核內(nèi)體。然后，該毒素從該核內(nèi)體中脫逸進(jìn)入到該細(xì)胞 的細(xì)胞漿中。認(rèn)為最后一步是被該H鏈的氨基末端片段——Hn所介導(dǎo)的，在接觸約5. 5或 更低的PH值時，其可以觸發(fā)該毒素形態(tài)上的改變。已知核內(nèi)體具有一種可降低核內(nèi)體內(nèi)pH 值的質(zhì)子泵。該形態(tài)上的變化暴露出毒素中的疏水殘基，這使得該毒素自身包埋到該核內(nèi) 體的膜中。然后，該毒素通過該核內(nèi)體的膜被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。該肉毒桿菌毒素活性機(jī)理中的最后一步似乎包括通過L鏈所進(jìn)行的關(guān)鍵的細(xì)胞 內(nèi)胞吐蛋白的裂解。肉毒桿菌和破傷風(fēng)毒素的全部毒性活性都包含于全毒素的L鏈中；該 L鏈?zhǔn)且环N鋅(Zn++)肽鏈內(nèi)切酶，其可選擇性地裂解識別所必須的蛋白并能使包含神經(jīng)遞 質(zhì)的小泡與漿膜的胞漿表面進(jìn)行對接，并且該小泡與該漿膜進(jìn)行融合。破傷風(fēng)神經(jīng)毒素、肉 毒桿菌毒素/B、/D、/F、和/G可造成小突觸泡蛋白(也被稱為小泡相關(guān)膜蛋白(VAMP))—— 一種突觸小體膜蛋白的降解。作為這些裂解結(jié)果中的任何一種結(jié)果存在于該突觸小泡的細(xì) 胞質(zhì)表面上的大多數(shù)VAMP都可以被除去。各毒素可以特異性地裂解不同的鍵。對于所有七種已知的肉毒桿菌毒素血清型而言，該肉毒桿菌毒素蛋白分子的分子 量約為150kD。有趣的是，該肉毒桿菌毒素由梭狀芽孢桿菌釋放，其是包含150kD肉毒桿菌 毒素蛋白分子以及與其相結(jié)合的非毒素蛋白的復(fù)合體形式。因此，該BoNt/A復(fù)合體可以由 梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生，如900kD、500kD和300kD的形式。BoNT/B和C1似乎僅僅可以以500kD 復(fù)合體的形式被產(chǎn)生。BoNT/D可以以300kD和500kD復(fù)合體的形式被產(chǎn)生。最后，BoNT/E 和F僅僅可以以約300kD復(fù)合體的形式被產(chǎn)生。最后，BoNT/E和F僅僅可以以約300kD復(fù) 合體的形式被產(chǎn)生。認(rèn)為該復(fù)合體(即分子量高于約150kD)包含一種非毒素的血細(xì)胞凝 集素蛋白和一種非毒素以及一種非毒素的非血細(xì)胞凝集素蛋白。這兩種非毒素蛋白(其與 該肉毒桿菌毒素分子一起構(gòu)成相關(guān)的神經(jīng)毒素復(fù)合體)可以提供穩(wěn)定性以對抗肉毒桿菌 毒素分子的變性作用并且當(dāng)毒素被攝取時可以使其免受消化道酸的影響。此外，有可能較 大的(分子量高于約150kD)肉毒桿菌毒素復(fù)合體可以使得該肉毒桿菌毒素以較慢的擴(kuò)散 速率離開肉毒桿菌毒素復(fù)合體的肌內(nèi)注射部位。在體外研究中已經(jīng)證實了肉毒桿菌毒素能抑制鉀陽離子所誘導(dǎo)的乙酰膽堿和去 甲腎上腺素從腦干組織主要細(xì)胞培養(yǎng)物中的釋放。此外，已經(jīng)有報道稱肉毒桿菌毒素能抑 制在脊髓神經(jīng)元的主要培養(yǎng)物中所誘發(fā)的甘氨酸和谷氨酸鹽的釋放，并且還已經(jīng)有關(guān)于在 腦突觸體制品內(nèi)肉毒桿菌毒素可抑制各種神經(jīng)遞質(zhì)——乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素、 CGRP和谷氨酸鹽釋放的報道。
BoNt/A是通過在發(fā)酵器內(nèi)植入肉毒梭菌并使其培養(yǎng)物進(jìn)行生長，然后對其進(jìn)行捕 獲并用已知的方法對該發(fā)酵了的混合物進(jìn)行純化而獲得的。所有的肉毒桿菌毒素血清型在 開始時都作為無活性的單鏈蛋白而被合成，其必須被蛋白酶裂解或切斷從而變?yōu)榫哂猩窠?jīng) 活性的物質(zhì)。能生成肉毒桿菌毒素血清型A和G的細(xì)菌菌株具有內(nèi)源性蛋白酶，因此可以 從細(xì)菌培養(yǎng)物中以具有顯著活性的形式回收血清型A和G。相反，肉毒桿菌毒素血清型Cp D和E是通過用無蛋白水解作用的菌株來合成的，因此當(dāng)從培養(yǎng)物中被回收時其一般沒有 活性。血清型B和F是用具有蛋白水解性和無蛋白水解性的菌株一起來進(jìn)行合成的，因此 其可以以活性形式被回收或者可以以無活性的形式被回收。但是，即使能產(chǎn)生例如BoNt/B 血清型的蛋白水解性的菌株，也僅僅能裂解所產(chǎn)生毒素的一部分。切斷與未切斷分子的確 切比例取決于培養(yǎng)的時間以及培養(yǎng)的溫度。因此，一定百分比的任何一種制劑，例如BoNt/ B毒素可能是沒有活性的，這可能是已知的BoNt/B的功效遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于BoNt/A的原因。在臨床 制劑中存在的沒有活性的肉毒桿菌毒素分子對該制劑的總蛋白負(fù)荷有貢獻(xiàn)，其與抗原性的 增加有關(guān)，但對于其臨床功效沒有幫助。此外，已知在肌內(nèi)注射時，BoNt/B具有較短的活性 作用持續(xù)時間并且在相同劑量水平下其效力也比BoNt/A低。已經(jīng)有報道稱BoNt/A已經(jīng)被用于臨床中，其應(yīng)用如下(1)每次肌注(多種肌肉)約75-125個單位的BOTOX 1，用于治療頸肌張力障 礙；(1 由 Allergan，Inc.，of Irvine, California 得到，注冊商標(biāo)BOTOX )(2)每次肌注5-10個單位的BOTOX ，用于治療眉間線(眉溝)(向降眉間肌內(nèi) 肌注5個單位，向各皺眉肌眉肌內(nèi)肌注10個單位)；(3)通過向恥骨直腸肌肌內(nèi)注射約30-80個單位的BOTOX 治療便秘；(4)通過向上眼瞼的外側(cè)瞼板前眼輪匝肌和下眼瞼的外側(cè)瞼板前眼輪匝肌每次肌 內(nèi)注射約1-5個單位的BOTOX 治療瞼痙攣。(5)為了治療斜視，用約1-5個單位的BOTOX 對眼外的肌肉進(jìn)行肌注，注射量可 以隨著所注射肌肉的大小以及所需的肌肉麻痹程度(即所需屈光度校正數(shù)的量)而進(jìn)行變 化。(6)為了治療中風(fēng)后的上肢痙攣，可以向五種如下的不同上肢屈肌中肌注
BOTOX :(a)指深屈肌(flexor digitorum profundus) :7. 5U 至 30U(b)指淺屈肌(flexor digitorum sublimus) :7. 5U 至 30U(c)腕尺骨屈肌(flexor carpi ulnaris) :10U 至 40U(d)腕橈骨屈肌(flexor carpi radialis) :15U 至 60U(e)肱二頭肌50U至200U。所列出的五種肌肉中的每一種都在相同的治療期間進(jìn) 行注射，以便于該患者在每次治療期間通過肌注，上肢屈肌可接受90U至360U的BOTOX 。BoNt/A對各種臨床疾病的成功治療已經(jīng)導(dǎo)致了對其它的肉毒桿菌毒素血清型的 興趣。已經(jīng)對兩種商業(yè)上可獲得的BoNT/A制劑(BOTOX 和Dysport )以及BoNt/B和 F制劑(都得自Wako Chemicals,日本)進(jìn)行了研究，以便于測定其臨床前的局部肌無力功 效、安全性和潛在的抗原性。將肉毒桿菌毒素制劑注射到右側(cè)腓腸肌的頂部(0.5至200.0 個單位/kg)，并用小鼠趾外展記分試驗(DAQ來對肌無力進(jìn)行評估。由劑量響應(yīng)曲線來計 算ED5tl值。另外再用一些小鼠通過肌注來測定LD5tl劑量。通過LD5tZED5tl來計算出治療指數(shù)。各組小鼠可以在后肢上注射BOTOX (5. 0至10. 0個單位/kg)或BoNt/B (50. 0至400. 0個 單位/kg)，然后對肌無力和增加的水消耗量進(jìn)行試驗，后者是一種公認(rèn)的用于干燥口腔的 模型。通過用兔子進(jìn)行的每月肌注一次的試驗來對潛在的抗原性進(jìn)行評估O. 0或8. 7個單 位/kg的BoNt/B或3. 0個單位/kg的BOTOX )。最大的肌無力程度和持續(xù)時間與所有的 血清型劑量相關(guān)。DAS ED50 值(單位/kg)如下B0T0X :6. 7，Dysport :24. 7，BoNt/ B :11. 8至244. 0，BoNT/F :4. 3。BOTOX 的作用持續(xù)時間比BoNt/B或BoNt/F長。治療指 數(shù)值如下:B0T0X :10. 5，DySport : 6. 3，BoNt/B :4. 8。雖然 BoNt/B 在使肌無力時作 用較弱，但是用BoNt/B進(jìn)行注射的小鼠的水消耗量高于用BOTOX 進(jìn)行注射的小鼠。在注 射四個月后，四只兔子中的兩只(用1.5ng/kg進(jìn)行處理的情況)和四只兔子中的四只(用 6. 5ng/kg進(jìn)行處理的情況)對BoNt/B產(chǎn)生了抗體。在一種獨(dú)立的研究中，9只用BOTOX 進(jìn)行了處理的兔子沒有一只對BoNt/A產(chǎn)生抗體。DAS結(jié)果表明BoNt/A的相對峰強(qiáng)度等于 BoNt/F，而BoNt/F比BoNt/B強(qiáng)。至于作用的持續(xù)時間而言，BoNt/A比BoNt/B的持續(xù)時間 長，而BoNt/B的作用持續(xù)時間比BoNt/F長。正如由治療指數(shù)值所表明的那樣，BoNt/A的 兩種商品化制劑(BOTOX 和Dysport )是不同的。在后肢注射BoNt/B后所觀察到的 水消耗行為增加表明在臨床上，相當(dāng)數(shù)量的這種血清型進(jìn)入了鼠科動物的體循環(huán)。該結(jié)果 還表明為了獲得與BoNt/A相當(dāng)?shù)墓πВ仨氃黾铀鶛z驗的其它血清型的劑量。增加劑量可 能會涉及安全性問題。此外，在兔子中，血清型B比BOTOX 具有更強(qiáng)的抗原性，這可能是 因為為達(dá)到BoNt/B的有效劑量注射了較高的蛋白負(fù)荷。破傷風(fēng)神經(jīng)毒素主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起作用，而肉毒桿菌神經(jīng)毒素在神經(jīng)肌肉 結(jié)合處起作用；二者都可以通過抑制乙酰膽堿從受影響的神經(jīng)元的軸突中釋放到突觸中， 導(dǎo)致麻痹而起作用。受影響的神經(jīng)元的中毒作用是長期的并且到目前為止，認(rèn)為其是不可 逆的。已知破傷風(fēng)神經(jīng)毒素是以一種免疫學(xué)上獨(dú)特的血清型存在的。乙酰膽堿一般僅僅是在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)由各種類型的神經(jīng)元釋放一種單一類型的小 分子神經(jīng)遞質(zhì)。該神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿是由腦的許多區(qū)域內(nèi)的神經(jīng)元所分泌的，但是具體 地是由運(yùn)動原皮層的大錐體細(xì)胞、基底神經(jīng)節(jié)內(nèi)的數(shù)種不同的神經(jīng)元、支配骨骼肌的運(yùn)動 神經(jīng)元、自主神經(jīng)系統(tǒng)(交感神經(jīng)和副交感神經(jīng))的節(jié)前神經(jīng)元、副交感神經(jīng)系統(tǒng)的節(jié) 后神經(jīng)元、以及交感神經(jīng)系統(tǒng)的一些節(jié)后神經(jīng)元所分泌的。從本質(zhì)上來講，僅汗腺、立毛 (pri loerector)肌肉以及一些血管的節(jié)后交感神經(jīng)纖維是膽堿能的，而交感神經(jīng)系統(tǒng)的大 多數(shù)節(jié)后神經(jīng)元都釋放神經(jīng)遞質(zhì)——去甲腎上腺素。在大多數(shù)情況中，乙酰膽堿具有興奮 作用。但是，已知乙酰膽堿在某些外周副交感神經(jīng)末梢具有抑制作用，如通過迷走神經(jīng)而抑 制心臟。自主神經(jīng)系統(tǒng)的輸出信號是通過交感神經(jīng)系統(tǒng)或副交感神經(jīng)系統(tǒng)而被傳送到機(jī) 體中的。交感神經(jīng)系統(tǒng)的節(jié)前神經(jīng)元從位于脊髓中側(cè)角中的節(jié)前交感神經(jīng)神經(jīng)元細(xì)胞體 中延伸出去。該從細(xì)胞體延伸出來的節(jié)前交感神經(jīng)纖維、具有節(jié)后神經(jīng)元的突觸位于椎旁 (paravertebral)的交感神經(jīng)節(jié)中或椎骨(prevertebral)前的神經(jīng)節(jié)中。因為交感神經(jīng)和 副交感神經(jīng)系統(tǒng)的節(jié)前神經(jīng)元都是膽堿能的，所以對該神經(jīng)節(jié)使用乙酰膽堿會同時興奮交 感神經(jīng)和副交感神經(jīng)的節(jié)后神經(jīng)元。乙酰膽堿可激活兩種類型的受體，毒蕈堿和煙堿受體。在由副交感神經(jīng)系統(tǒng)的節(jié)后神經(jīng)元所刺激的所有效應(yīng)器細(xì)胞中以及由交感神經(jīng)系統(tǒng)的節(jié)后膽堿能神經(jīng)元所刺激的 這些效應(yīng)器細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了毒蕈堿受體。在交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)的節(jié)前和節(jié)后神經(jīng)元間 的突觸中都發(fā)現(xiàn)了煙堿受體。該煙堿受體還存在于神經(jīng)肌肉結(jié)合處的骨骼肌纖維的許多膜 上。當(dāng)小的、澄明的細(xì)胞內(nèi)小泡與突觸前的神經(jīng)元細(xì)胞膜融合時，從膽堿能神經(jīng)元中 釋放出乙酰膽堿。許多非神經(jīng)元的分泌細(xì)胞，如腎上腺髓質(zhì)(以及PC12細(xì)胞系)和胰島細(xì) 胞可分別從大量的密核小泡中釋放兒茶酚胺和胰島素。PC12細(xì)胞系是一種被廣泛用作交感 腎上腺的研發(fā)所需的組織培養(yǎng)模型中的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞的純系細(xì)胞。在體外，通過滲 透作用(如通過電穿孔)或通過向去神經(jīng)細(xì)胞中直接注射肉毒桿菌毒素，該毒素抑制兩類 化合物從兩種類型的細(xì)胞中的釋放。還已知肉毒桿菌毒素可以阻斷神經(jīng)遞質(zhì)——谷氨酸從 皮層突觸體細(xì)胞培養(yǎng)物中的釋放。神經(jīng)肌肉結(jié)合處是在骨骼肌中通過軸突與肌細(xì)胞的接近而形成的。通過神經(jīng)系統(tǒng) 傳遞的信號在該末端軸突產(chǎn)生動作電位，激活離子通道并導(dǎo)致了神經(jīng)遞質(zhì)——乙酰膽堿從 神經(jīng)內(nèi)突觸小泡中釋放，例如在神經(jīng)肌肉結(jié)合處的運(yùn)動終板處。該乙酰膽堿通過細(xì)胞外間 隙與肌肉終板的表面上的乙酰膽堿受體蛋白進(jìn)行結(jié)合。一旦進(jìn)行了足夠的結(jié)合，則該肌細(xì) 胞的動作電位可引起特定的膜離子通道改變，產(chǎn)生肌細(xì)胞收縮。然后，乙酰膽堿從該肌細(xì)胞 中釋放出來并被細(xì)胞外間隙中的膽堿酯酶所代謝。該代謝產(chǎn)物重新循環(huán)回到末端軸突中被 再加工成另外的乙酰膽堿。正如上面所討論的那樣，目前治療受損肌肉的方法仍然很不夠。需要一種改良的 治療受損肌肉的方法。發(fā)明_既述根據(jù)本發(fā)明，一種用于治療受損肌肉的有效方法包括在體內(nèi)局部地將治療有效量 的神經(jīng)毒素給藥到該受損肌肉中或周圍的步驟。該神經(jīng)毒素能為受損的肌肉提供一種暫時 的化學(xué)去神經(jīng)作用并能減少該肌肉的收縮。本發(fā)明的目的是要促進(jìn)受損肌肉的愈合并迅速 恢復(fù)其功能。受損肌肉可以是例如扭傷的肌肉。在一個實施方案中，該神經(jīng)毒素是通過肌 內(nèi)或皮下的方式來進(jìn)行給藥的。在另一個實施方案中，神經(jīng)毒素的給藥步驟是在物理治療 和/或手術(shù)之前和/或之后進(jìn)行的。還是根據(jù)本發(fā)明，神經(jīng)毒素的給藥步驟是在肌肉被損傷后立即進(jìn)行的，或是在其 后切實可行時立即進(jìn)行的。在一個實施方案中，至少在該受損的肌肉修復(fù)過程的第1階段 和/或第2階段期間該神經(jīng)毒素可以有效的固定或基本固定該受損的肌肉。根據(jù)本發(fā)明，該神經(jīng)毒素可以包含靶向組分、治療組分和轉(zhuǎn)運(yùn)組分。該靶向組分可 以與一種突觸前的運(yùn)動神經(jīng)元相結(jié)合。在一個實施方案中，該靶向組分可以包含丁酸桿菌 (butyricum)毒素、破傷風(fēng)毒素、或A、B、C1, D、E、F、G型肉毒桿菌毒素或其變異體的重鏈的 羧基末端片段。治療組分可以干擾或調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)從神經(jīng)元中的釋放或其加工。在一個實 施方案中，該治療組分包含丁酸桿菌毒素、破傷風(fēng)毒素、或A、B、C1, D、E、F、G型肉毒桿菌毒 素或其變異體的輕鏈。轉(zhuǎn)運(yùn)組分可促進(jìn)該神經(jīng)毒素的至少一部分，例如治療組分，轉(zhuǎn)運(yùn)到靶 細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)。在一個實施方案中，該轉(zhuǎn)運(yùn)組分可包含丁酸桿菌毒素、破傷風(fēng)毒素、或A、 B、C” D、Ε、F、G型肉毒桿菌毒素或其變異體的重鏈的氨基末端片段。還是根據(jù)本發(fā)明，該神經(jīng)毒素是一種Α、B、E和/或F型的肉毒桿菌毒素。在優(yōu)選的實施方案中，治療受損的肌肉所用的神經(jīng)毒素是A型肉毒桿菌毒素。實際上，優(yōu)選使用A 型肉毒桿菌毒素是因為其在商業(yè)上可以獲得、其已知的臨床應(yīng)用、以及正如這里所公開的， 根據(jù)本發(fā)明，可成功的用其進(jìn)行肌肉損傷的治療。使用約0. lU/kg至約30U/kg的A型肉毒 桿菌毒素和約lU/kg至約150U/kg的B型肉毒桿菌毒素屬于本發(fā)明所公開的實際方法的范 疇。關(guān)于其它的肉毒桿菌毒素血清型(包括E型和F型毒素)，正如這里所敘述的那樣，所 用的U/kg劑量范圍為約0. lU/kg至約150U/kg。還是根據(jù)本發(fā)明，該神經(jīng)毒素可以重組進(jìn)行生產(chǎn)。本發(fā)明的詳細(xì)實施方案是一種通過給受損肌肉經(jīng)體內(nèi)、局部給予治療有效量的肉 毒桿菌毒素而對受損的肌肉進(jìn)行治療的方法(如促進(jìn)痊愈)，從而對受損的肌肉進(jìn)行治療。 該肉毒桿菌毒素可以是A型肉毒桿菌毒素。值得注意的是，本發(fā)明還包含了一種治療與受 損肌肉有關(guān)的疼痛的方法，該方法是通過給受損肌肉經(jīng)體內(nèi)、局部的施用治療有效量的肉 毒桿菌毒素，從而減輕與受損肌肉有關(guān)的疼痛。這里所描述的各種和每一種特征、以及該類特征中兩個或更多特征的各種和每一 種組合都屬于本發(fā)明的范疇，前提條件是在該類組合中所包含的這些特征不會互相矛盾。提供如下的定義并在這里對其進(jìn)行應(yīng)用。“約”指的是大約或接近，并且本文涉及所述的數(shù)值或范圍時指的是所敘述或所要 求的數(shù)值或范圍的士 10%?！爸劓湣敝傅氖撬鬆钛挎邨U菌神經(jīng)毒素的重鏈。其優(yōu)選具有約IOOkDa的分子量并 且在這里被稱為H鏈或H?！癏/’指的是得自梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素的H鏈的大約相當(dāng)于該H鏈的氨基末端片 段的片段(優(yōu)選具有約50kDa的分子量)，或?qū)?yīng)于完整H鏈中的該片段的部分。認(rèn)為其包 含在穿越細(xì)胞內(nèi)核內(nèi)體膜的L鏈的轉(zhuǎn)運(yùn)作用中所涉及的天然或野生型梭狀芽孢桿菌神經(jīng) 毒素的部分?！癏e”指的是得自梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素的H鏈的大約相當(dāng)于該H鏈的羧基末端片 段的片段(約50kDa)，或?qū)?yīng)于完整H鏈中的該片段的部分。認(rèn)為其是致免疫性的并且包 含以高親和力與運(yùn)動神經(jīng)元進(jìn)行突觸前結(jié)合時所涉及的天然或野生型梭狀芽孢桿菌神經(jīng) 毒素的部分?！笆軗p肌肉”包括扭傷、撕裂或撕開的肌肉，以及帶有挫傷(撞傷)、裂傷、局部缺血 或破裂的肌肉?！拜p鏈”指的是梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素的輕鏈。其優(yōu)選具有約50kDa的分子量，并 且被稱為L鏈、L或梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素的蛋白水解區(qū)域(氨基酸序列)。認(rèn)為當(dāng)被釋放 到靶細(xì)胞的細(xì)胞漿中時，該輕鏈?zhǔn)且环N有效的神經(jīng)遞質(zhì)釋放的抑制劑。“局部給藥”指的是將藥物直接給藥于動物體表或體內(nèi)的需要藥物在該部位上發(fā) 揮某種生物作用的部位上或該部位附近。局部給藥排除系統(tǒng)途徑的給藥，如靜脈內(nèi)給藥或 口服給藥。“神經(jīng)毒素”指的是能干擾或調(diào)節(jié)神經(jīng)元的至少一種功能的化學(xué)實體。“神經(jīng)毒素” 可以是天然存在的或可以是人造的。此外，該“神經(jīng)毒素”可以是一種小分子、大分子、多肽、 共軛的多肽或它們的混合物。
“變異體”指的是與母體化學(xué)實體有略微的差別但是仍然具有生物學(xué)作用的化學(xué) 實體。變異體的生物學(xué)作用可以與母體的生物學(xué)作用基本相同或優(yōu)于母體的作用。例如， 至少有一個氨基酸被置換、修飾、缺失或增加的肉毒桿菌毒素的變異輕鏈可具有相同的或 更強(qiáng)的阻止神經(jīng)遞質(zhì)小泡釋放的能力。此外，變異體的生物學(xué)作用也可降低。例如，除去了 亮氨酸基元的A型肉毒桿菌毒素的變異輕鏈可比母體的(或天然的)A型肉毒桿菌毒素輕 鏈具有更短的生物學(xué)持續(xù)性。發(fā)明描述在主要實施方案中，本發(fā)明治療受損的肌肉的一種有效方法可包括將治療有效量 的神經(jīng)毒素局部給藥于受損的肌肉的步驟。優(yōu)選地，該受損的肌肉是被扭傷的肌肉。骨骼肌的扭傷性損害可被劃分為剪切性損傷。在剪切性損傷中，不僅肌纖維被撕 裂，而且mysial鞘也被撕裂。在肌肉損傷后幾乎馬上就開始了肌肉的修復(fù)過程。剪切性損 傷的修復(fù)過程可以被分為三個階段。第1階段是破壞階段，其特征為形成血腫、肌纖維壞死、以及炎性細(xì)胞反應(yīng)。在扭 傷后，在靠近于其末梢肌腱結(jié)合處(MTJ)的部位常常會出現(xiàn)其它健康肌肉的破裂部位。破 裂的肌纖維收縮并在殘余部分之間形成一個缺口。因為骨骼肌的血管豐富，所以從被撕裂 的血管中出血是不可避免的，所以該缺口被血腫所填充，隨后被瘢痕組織所取代。在剪切性 損傷中，機(jī)械力撕裂了整個肌纖維，損害了肌纖維的漿膜并且在殘余部分的末端留下了肌 漿開口。因為肌纖維是很長的、串狀細(xì)胞，該壞死從這種部位開始延伸到該破裂的肌纖維的 整個長度上。在剪切性損傷中血管也被撕裂；因此，血液所運(yùn)載的炎性細(xì)胞立即進(jìn)入到該損 傷部位并誘導(dǎo)炎癥。在損傷后，第1個階段會持續(xù)約2至3天。第2個階段是修復(fù)階段，其由壞死組織的吞噬細(xì)胞溶解、肌纖維的再生、結(jié)締組織 瘢痕的產(chǎn)生、以及毛細(xì)管的內(nèi)向成長所組成。在受損肌肉組織再生中的關(guān)鍵步驟是受損傷 區(qū)域的血管形成。血管補(bǔ)充的修復(fù)對于受損肌肉的再生而言是必須的。新的毛細(xì)管從存活 的大血管上伸出，向著損傷區(qū)域的中心生長。這些新的毛細(xì)血管幫助向再生區(qū)域提供足夠 的氧供應(yīng)。第3個階段是改型階段，其由再生肌纖維的成熟、瘢痕組織的收縮和整理、以及被 修復(fù)肌肉的功能恢復(fù)所組成。在第1個階段后，第2個階段(修復(fù))和第3個階段(改型) 常常同時發(fā)生，并且持續(xù)約2天至約6個星期。在本發(fā)明的一個實施方案中，該神經(jīng)毒素被局部給藥以固定受損肌肉而促進(jìn)愈 合，優(yōu)選地通過肌內(nèi)給藥。本發(fā)明所公開的神經(jīng)毒素的局部給藥還能減少由于肌肉損傷而 產(chǎn)生的疼痛。優(yōu)選地，在損傷時或損傷后立即進(jìn)行該神經(jīng)毒素的給藥。在一個優(yōu)選的實施 方案中，在破壞階段(第1階段)中，該神經(jīng)毒素能有效的固定受損的肌肉以防止該肌肉的 再次破裂。不希望用任何特定作用機(jī)理的理論對本發(fā)明進(jìn)行限制，認(rèn)為在修復(fù)和/或改型階 段期間的固定是有益的，這是因為這種固定可以使得受損傷區(qū)域中毛細(xì)管更快更強(qiáng)的向內(nèi) 生長，并且可以使得肌肉纖維更好的再生和定向。因此，在一個實施方案中，在修復(fù)階段 (第2階段)和/或改型階段(第3階段)中不具有神經(jīng)毒素的固定作用。在更優(yōu)選的實 施方案中，在第1階段期間施用神經(jīng)毒素，其能有效的固定受損的肌肉，但是在該修復(fù)過程 的第2和3個階段中不施用神經(jīng)毒素。例如，如果在損傷后立即注射該神經(jīng)毒素，優(yōu)選肌內(nèi)注射，優(yōu)選地在給藥后約3天的時間內(nèi)該神經(jīng)毒素固定該受損的肌肉。或者該神經(jīng)毒素僅 僅在這種程度下具有固定作用，在這種程度中，在對受損的肌肉進(jìn)行應(yīng)用后，病人在基礎(chǔ)活 動中只經(jīng)受很小的痛苦或不會經(jīng)受痛苦。當(dāng)達(dá)到這種臨界點(diǎn)時，應(yīng)當(dāng)鼓勵病人開始積極的 漸進(jìn)的進(jìn)行活動。在本發(fā)明的另外一個實施方案中，在第1-3個階段的所有階段以及在其隨后的肌 肉損傷恢復(fù)期中，該神經(jīng)毒素都可有效的固定受損肌肉。神經(jīng)毒素，如某些肉毒桿菌毒素，其需要少于約一天至約七天的時間來表現(xiàn)出顯 著的臨床肌肉麻痹作用和/或其中的肌肉麻痹作用在注射后可持續(xù)幾個月的時間，這樣的 神經(jīng)毒素在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，這樣的神經(jīng)毒素可被用于治療相對嚴(yán)重或持續(xù)時間較長的 肌肉損傷或為了治愈的目的而需要進(jìn)行長期的肌肉固定的情況。在主要實施方案中，該神經(jīng)毒素是一種神經(jīng)肌肉阻滯劑。表1非限制性地列出了 一些神經(jīng)肌肉阻滯劑以及其可能的作用部位。在一個實施方案中，將具有能將肌肉，優(yōu)選受 損的肌肉固定至少約5天，優(yōu)選至少約3天的能力的神經(jīng)肌肉阻滯劑進(jìn)行給藥來對受損肌 肉進(jìn)行治療。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，該神經(jīng)毒素是一種肉毒桿菌毒素，這是因為 肉毒桿菌毒素的已知應(yīng)用和臨床安全性所導(dǎo)致的，如E型肉毒桿菌毒素可用于治療肌肉疾 病如肌肉痙攣。在本發(fā)明特別優(yōu)選的一個實施方案中，特別是對于嚴(yán)重的，或三度肌肉損傷 而言，局部給藥的肉毒桿菌毒素是一種E型肉毒桿菌毒素。在這些實施方案中也可以使用 A型肉毒桿菌毒素。表 權(quán)利要求
1.神經(jīng)毒素在制備用于治療損傷肌肉的局部給藥的藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所說的局部給藥是肌內(nèi)注射。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其中該神經(jīng)毒素基本固定受損的肌肉。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所說的神經(jīng)毒素在受損肌肉的修復(fù)過程的第1和第 2個階段可以有效的固定該受損的肌肉。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所說的神經(jīng)毒素在受損肌肉的修復(fù)過程的第1個階 段中可以有效的固定該受損的肌肉。
6.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所說的神經(jīng)毒素是A、B、C”D、E、F、或G型肉毒桿菌
7.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所說的神經(jīng)毒素是通過重組制備的神經(jīng)毒素。
8.肉毒桿菌毒素在制備用于治療損傷肌肉的局部給藥的藥物中的用途。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其中所說的肉毒桿菌毒素是A型肉毒桿菌毒素。
10.A型肉毒桿菌毒素在制備用于促進(jìn)損傷肌肉愈合的局部給藥的藥物中的用途。
11.肉毒桿菌毒素在制備用于治療損傷肌肉有關(guān)的疼痛的局部給藥的藥物中的用途。
12.如權(quán)利要求11所述的用途，其中所說的肉毒桿菌毒素是A型肉毒桿菌毒素。
全文摘要
一種用于治療受損肌肉的方法，通過神經(jīng)毒素的局部給藥來促進(jìn)受損肌肉的愈合和/或減少與受損的肌肉有關(guān)的疼痛，其中所說的神經(jīng)毒素如肉毒桿菌毒素。
文檔編號A61P21/02GK102078597SQ201010621020
公開日2011年6月1日 申請日期2001年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月4日
發(fā)明者G·F·布羅克斯, K·R·奧基 申請人:阿勒根公司