專利名稱：一種抗hpv的抗體、其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫治療領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防或治療人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染相關(guān)疾病(例如宮頸病變，特別是宮頸癌)的抗體。本發(fā)明還涉及所述抗體的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前的研究表明，HPV感染與宮頸系統(tǒng)疾病——特別是宮頸癌——的發(fā)生有明顯的相關(guān)性°1995年，國際癌癥研究中心(International Agency for Research of Cancer, IARC)公布的研究結(jié)果證實(shí)，HPV與宮頸癌等宮頸系統(tǒng)疾病均有密切的因果關(guān)系在99. 8% 的宮頸癌患者中可檢測出HPV感染，而HPV陰性者幾乎不會發(fā)生宮頸癌；另外，98%以上的宮頸疾病患者中均可檢測出HPV。HPV病毒根據(jù)Ll基因的序列同源性可分為不同的型和亞型，同源性在90%以上的為一個型，而同源性在90 98%之間的HPV又可劃分為不同的亞型。根據(jù)HPV的型別或亞型與女性生殖道惡性腫瘤的關(guān)系，將HPV分為低危型和高危型。低危型HPV，例如HPV 6、11、 34,40,42等型別多見于良性宮頸病變，如宮頸濕疣及宮頸上皮輕度不典型性增生病變；而宮頸上皮重度不典型增生及宮頸癌中則以HPV 16、18、31、33、35、39、45型感染更為多見， 這些型為高危型HPV。針對不同人群的一系列研究已證實(shí)生殖道的HPV 16、18型感染與宮頸上皮重度病變(CIN I/CINII)宮頸癌的發(fā)生高度相關(guān)，較其他危險(xiǎn)因素更密切。據(jù)世界衛(wèi)生組織 (WHO)公布的《世界范圍內(nèi)HPV和宮頸癌2007報(bào)告》結(jié)果，我國婦女中58. 7%的子宮頸癌與HPV16型直接相關(guān)。HPV16E7基因在宮頸癌中持續(xù)存在并高表達(dá)，在宮頸癌的形成和惡性性狀的維持中起重要作用。HPV16E7蛋白共98個氨基酸，其序列如下MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQ LNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP。該蛋白有三個保守區(qū)(conserved region, CR) =CRl位于N端，CR2含有LXCXE結(jié)構(gòu)域，CR3含兩個鋅指樣結(jié)構(gòu)域。E7的中心功能就是通過三個保守區(qū)域之一與Rb蛋白家族(如PRb、P107、 P130)結(jié)合并通過泛素-26S蛋白酶體途徑降解Rb家族蛋白。Rb蛋白家族處于細(xì)胞周期Gl/ S關(guān)卡的中心環(huán)節(jié)。在去磷酸化狀態(tài)下Rb蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2f蛋白，阻止E2f蛋白激活眾多與DNA復(fù)制有關(guān)的蛋白因子，從而抑制DNA合成和細(xì)胞周期進(jìn)展，使細(xì)胞處于G0/G1期和進(jìn)行細(xì)胞分化。E7蛋白結(jié)合并降解Rb蛋白，釋放E2f蛋白，從而激活許多相關(guān)的DNA合成蛋白因子，加快DNA復(fù)制和細(xì)胞的分裂增殖，促進(jìn)細(xì)胞的分化。此外，E7蛋白還能結(jié)合細(xì)胞周期素A、細(xì)胞周期素Ε、P48等10多種其他蛋白，提高外源性DNA整合和細(xì)胞基因突變性等等，加速細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。因此，HPV16E7蛋白是宮頸癌腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)的抗原，是腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞在胞內(nèi)表達(dá)的抗原靶標(biāo)。由于是在胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的抗原，到細(xì)胞表面必須通過抗原提呈的過程?？乖岢始?xì)胞(比如樹突狀細(xì)胞，巨噬細(xì)胞)攝取相應(yīng)抗原，經(jīng)加工處理后，將抗原降解成8-10個氨基酸的短肽，這些短肽在高爾基體中和MHC-I類分子結(jié)合，然后通過胞膜循環(huán)展示在細(xì)胞表面。這個過程就稱為抗原提呈。提呈在細(xì)胞表面的MHC-I分子和短肽(稱為T細(xì)胞表位)，被T細(xì)胞識別，從而激活T細(xì)胞下游的免疫反應(yīng)。早期對HPV16 E7 抗原的研究表明HPV16E7有三個高親和力的T細(xì)胞表位，分別是第11-20位氨基酸殘基 YMLDLQPETT，第 49-57 位氨基酸殘基 RAHYNIVTF (SEQ ID NO :5，下稱“49-57 肽”)和第 86-93 位氨基酸殘基TLGIVCPI (下稱“86-93肽”)。一般，抗原的T細(xì)胞表位只有8-10個氨基酸。而單克隆抗體的可變區(qū)有三個 CDR(互補(bǔ)決定簇，complementary-determining region)區(qū),大約每個CDR區(qū)可識別10個氨基酸左右，單克隆抗體除了親和結(jié)合特定的T細(xì)胞表位外，還要識別其它表位，因此，只識別抗原的特定T細(xì)胞表位的單克隆抗體難以獲得。具體體現(xiàn)在在使用經(jīng)典的小鼠體內(nèi)單抗篩選中，用8-10個氨基酸的短肽單獨(dú)去免疫動物，很難產(chǎn)生抗體。針對這種情況，篩選T細(xì)胞表位抗體目前采用兩種方法解決。一種是用體外的噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行篩選，用T細(xì)胞表位的多肽作為親和原進(jìn)行篩選，這種方法技術(shù)平臺要求高，且抗體的親和力一般都不如體內(nèi)篩選出的抗體高。第二種方法是先用其它蛋白和表位多肽形成復(fù)合物，以提高其免疫原性，用該復(fù)合物免疫小鼠然后進(jìn)行單克隆抗體篩選和表位鑒定，該法中使用的其他蛋白多為MHC(主要組織相容性復(fù)合物)分子或KLH(鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白)分子。采用MHC分子的方法需要在體外表達(dá)MHC分子并通過體外變復(fù)性將 MHC分子和抗原肽組成復(fù)合物，該方法過程繁瑣，且制備出復(fù)合物的效率低。采用KLH等大分子偶聯(lián)同樣面臨著制備出復(fù)合物的效率低的問題。而且，未形成復(fù)合物的MHC或KLH分子由于同樣具有免疫原性，在免疫到動物體內(nèi)后會產(chǎn)生很多不需要的干擾性抗體，給隨后的目標(biāo)單克隆抗體篩選和表位鑒定帶來很大的干擾。因此，本領(lǐng)域中需要一種特異性針對HPV16E7蛋白的T細(xì)胞表位多肽的單克隆抗體及其生產(chǎn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述技術(shù)問題，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種特異性針對HPV16E7蛋白的49-57肽表位(如SEQ ID N0:5所示)的抗體，所述抗體具有如SEQ ID NOs :6_8所示的重鏈CDRU CDR2和CDR3區(qū)域和SEQ ID NOs :9_11所示的輕鏈CDRU CDR2和CDR3區(qū)域。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體具有如SEQ ID NO :1所示的重鏈可變區(qū)序列和如SEQ ID NO 2所示的輕鏈可變區(qū)序列。本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明抗體的方法，其包括將一種雙鏈RNA佐劑和SEQ ID NO 5所示的多肽混合形成復(fù)合物；將一種雙鏈RNA佐劑和SEQ ID NO 5所示的多肽混合形成復(fù)合物；將所述復(fù)合物免疫接種宿主；和從宿主的體液、組織或細(xì)胞獲得抗體。本發(fā)明特別提供了一種制備本發(fā)明抗體的方法，其包括將一種雙鏈RNA佐劑和SEQ ID NO 5所示的多肽混合形成復(fù)合物；將所述復(fù)合物免疫接種宿主；收獲宿主脾細(xì)胞并將其與骨髓瘤細(xì)胞融合，和
收集融合的細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體。在本發(fā)明制備所述抗體的方法中，采用了雙鏈RNA和表位多肽形成的復(fù)合物進(jìn)行宿主(例如，小鼠)免疫，并繼而篩選單克隆抗體。由于雙鏈RNA有別于通常用于和抗原形成復(fù)合物的其它蛋白分子(例如MHC和KLH)，本身并不產(chǎn)生干擾性抗體，因此產(chǎn)生的抗體全是針對表位多肽的單一抗體。該法制備抗體簡便快速，無特殊的技術(shù)平臺要求，且篩選出的抗體特異性高。在本發(fā)明的另一方面，還提供了本發(fā)明的抗體、含該抗體的組合物或試劑盒用于制備預(yù)防或治療HPV16感染疾病，特別是宮頸病變或?qū)m頸癌的藥物中的用途。


圖1顯示了本發(fā)明的6C10單克隆抗體的電泳檢測結(jié)果。圖2顯示了通過ELISA方法鑒定本發(fā)明6C10單克隆抗體親和力的結(jié)果。圖3顯示了通過T2荷載肽實(shí)驗(yàn)進(jìn)行本發(fā)明6C10單克隆抗體的表位鑒定的結(jié)果。 圖3A和圖;3B分別顯示E7的49-57肽荷載過的T2細(xì)胞流式細(xì)胞檢測結(jié)果和熒光顯微鏡檢測結(jié)果；圖3C和圖3D分別顯示E786-93肽荷載過的T2細(xì)胞流式細(xì)胞檢測結(jié)果和熒光顯微鏡檢測結(jié)果；圖3E和圖3F分別顯示無任何肽荷載過的T2細(xì)胞流式細(xì)胞檢測結(jié)果和熒光顯微鏡檢測結(jié)果。圖4顯示了使用本發(fā)明的6C10單克隆抗體進(jìn)行抑制腫瘤研究的成瘤率。圖5顯示了使用本發(fā)明的6C10單克隆抗體進(jìn)行抑制腫瘤研究的抑瘤率。圖6顯示了本發(fā)明的6C10單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列和核苷酸序列。圖7顯示了本發(fā)明的6C10單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列和核苷酸序列。序列說明
SEQIDNO 1為本發(fā)明抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列。
SEQIDNO 2為本發(fā)明抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
SEQIDNO 3為編碼本發(fā)明抗體重鏈可變區(qū)的核酸序列。
SEQIDNO 4為編碼本發(fā)明抗體輕鏈可變區(qū)的核酸序列。
SEQIDNO 5為HPV 16E7蛋白的第49-57位氨基酸序列。
SEQIDNOs:6-8為本發(fā)明抗體重鏈的⑶R 1-3的氨基酸序列。
SEQIDNOs9-11為本發(fā)明抗體輕鏈的⑶R 1-3的氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式雖然所描述的實(shí)施方案代表本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但應(yīng)理解的是，在不背離本發(fā)明精神的情況下本領(lǐng)域技術(shù)人員可作出任何變換。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體為通過雜交瘤技術(shù)制備而得的單克隆抗體。特別優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體為由保藏號為CGMCC 4144的6C10雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體。本發(fā)明在實(shí)施方案中提供一種包含本發(fā)明的抗體的藥物組合物或者試劑盒。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步含有其他治療劑，其中本發(fā)明的抗體可與所述其他治療劑以各自獨(dú)立的形式，或者彼此相混合的形式存在，再或者彼此之間可以形成偶聯(lián)結(jié)合。所述治療劑可以是抗腫瘤或抗病毒活性治療劑或生物毒素，例如5’ -氟尿嘧啶、氟達(dá)拉濱、克拉屈濱、阿糖胞苷、吉西他濱、卡培他濱、曲沙他濱、拉米夫定、恩曲他濱、扎西他濱、齊多夫定、阿巴卡韋、去羥肌苷、替諾福韋延胡索酸雙異丙酰氧基甲酯、司他夫定、 阿巴卡韋、順鉬、異環(huán)磷酰胺、卡鉬、博萊霉素或泰素等。在一個本發(fā)明抗體與其他治療劑形成偶聯(lián)物的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可起到將其偶聯(lián)的治療劑靶向目的治療區(qū)域的作用。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步含有如上所述治療劑，以及該試劑盒的使用說明。本發(fā)明所述“復(fù)合物”是通過將一種雙鏈RNA佐劑和SEQ ID NO :5所示的多肽進(jìn)行混合而形成。優(yōu)選地，用于形成所述復(fù)合物的雙鏈RNA為聚肌胞苷酸(PolylC， Polyinosinic acid-polycy tidy lie acid)或者 PolyICLC0在本發(fā)明抗體制備方法的一個實(shí)施方案中，將雙鏈RNA與E7 (49-57)肽進(jìn)行充分混合，其混合比可為1 0. 5到1 4(w/w)之間。在另一個實(shí)施方案中，所述宿主為小鼠、大鼠、兔子。在又一個實(shí)施方案中，所述骨髓瘤細(xì)胞為SP2/0瘤細(xì)胞。在本發(fā)明抗體制備方法中，所述經(jīng)融合的細(xì)胞克隆優(yōu)選為經(jīng)三次以上亞克隆后仍產(chǎn)生所述抗體的單克隆。特別優(yōu)選地，所述細(xì)胞克隆為6C10細(xì)胞克隆。本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括將篩選得到的單克隆細(xì)胞建立細(xì)胞株。該細(xì)胞株可穩(wěn)定傳代，并分泌特異性抗體。因此，本發(fā)明的方法可包括從細(xì)胞株獲得持續(xù)分泌特異性抗體的細(xì)胞單克隆。由上文所述，本發(fā)明也提供了一種生產(chǎn)能產(chǎn)生本發(fā)明抗體的細(xì)胞的方法，特別提供了產(chǎn)生6C10細(xì)胞克隆的方法。本發(fā)明的制備抗體的方法可進(jìn)一步包括將收集的抗體進(jìn)行純化。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生一種本發(fā)明抗體的細(xì)胞，在一個實(shí)施方案中，其為保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的(CGMCC)、保藏號為CGMCC 4144的6C10細(xì)胞。本發(fā)明抗體的純化可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的常規(guī)純化方法進(jìn)行，例如通過親和色譜法、離子交換色譜法、疏水色譜法、分子篩色譜法等。本發(fā)明的抗體可用于預(yù)防或治療HPV16感染疾病，包括向受試者給予有效量的本發(fā)明抗體，特別優(yōu)選的抗體為保藏號為CGMCC 4144的6C10細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體可用于預(yù)防/治療多種宮頸病變，特別是CIN I或 CIN II，以及宮頸癌變。通過以下實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，以便本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明。下述實(shí)施例僅僅出于示例性目的，并非意在限制本發(fā)明的范圍。已經(jīng)努力確保有關(guān)數(shù)字(如數(shù)量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但應(yīng)該考慮到會存在一些誤差和偏差。除非另有說明，溫度以。C為單位或者為環(huán)境溫度，壓力接近或等于大氣壓。應(yīng)當(dāng)理解的是，除非另有說明，下述各實(shí)施例中所用到的儀器設(shè)備均為本領(lǐng)域的常規(guī)設(shè)備。除非另有說明，所使用的培養(yǎng)基均為市售可得的常規(guī)培養(yǎng)基，本領(lǐng)域技術(shù)人員均熟知其中的成分及含量。為了簡便起見，在本文中有可能使用各種通用的縮寫，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠理解其含義。實(shí)施例
實(shí)施例1 :E7蛋白49-57肽的免疫復(fù)合物的制備和免疫接種HPV16病毒E7蛋白的49_57肽，氨基酸序列RAHYNIVTF ；分子量1119Da，理論等電點(diǎn)9. 04。該肽由吉爾生化公司合成，純度大于95%。以合成的雙鏈RNA——PolyIC為佐劑，其購自Sigma公司(目錄號P9582)。稱取PolyIC佐劑干粉和E7 (49-57)肽干粉，按質(zhì)量比5 2混合，加入純水溶解， 充分混勻，形成肉眼可見的白色顆粒狀復(fù)合物，在溶解的5-10分鐘之內(nèi)，將該復(fù)合物通過腹部皮下免疫BALB/c小鼠，每只小鼠免疫100 μ g PolyIC+40 μ g 49-57肽混合物。在初次免疫后的第14天和第觀天，以同樣的免疫劑量再加強(qiáng)免疫兩次。在初次免疫后第35天左右，采集小鼠血清即可檢測到有相應(yīng)的E7蛋白的相關(guān)抗體產(chǎn)生(檢測方法如以下實(shí)施例2 所述)。實(shí)施例2 血清抗體滴度的檢測對于按實(shí)施例1所述進(jìn)行過免疫的小鼠，在初次免疫后第35天時(shí)從尾靜脈采取少量血清，用直接酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)檢測血清抗體滴度。ELISA檢測血清抗體滴度步驟如下1.先用HPV16E7蛋白(該蛋白的制備方法為合成全長HPV 16E7基因，然后在 pET32a載體和BL21 (DE3)宿主中表達(dá)出帶Trx標(biāo)簽的E7融合蛋白，再用腸激酶將Trx標(biāo)簽切除掉即可獲得HPV16E7蛋白)，以每孔1 μ g的量包被96孔板。包被板在4°C孵育16小時(shí)，用洗滌緩沖液(含0. 05%Tween-20的PBS溶液)洗滌各孔6次，每孔加入封閉液(含 5%脫脂奶粉的PBS溶液)100 μ 1封閉2小時(shí)。2.每孔加入100μ 1用PBS溶液稀釋50倍的血清樣品，37°C反應(yīng)一小時(shí)。然后用洗滌緩沖液洗滌各孔3次，每次5分鐘。3.每孔加入100 μ 1的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG抗體(購自Calbiochem 公司，編號401215)，37°C孵育0. 5小時(shí)。然后用洗滌緩沖液洗滌各孔6次，以去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。4.每孔加入100 μ 1 TMB顯色液，室溫進(jìn)行顯色反應(yīng)20分鐘。5.每孔加入50 μ 1的終止液(2Μ硫酸溶液)終止顯色反應(yīng)。5分鐘后用酶標(biāo)儀測定450nm波長處的光吸收，并記錄結(jié)果。通過光吸收值判定血清的抗體存在情況。共測定了四只按照實(shí)施例1所述方法進(jìn)行免疫的小鼠和一只未經(jīng)免疫的陰性對照小鼠的血清，四只被免疫小鼠血清OD讀數(shù)分別為0. 323，1. 805,0. 347,0. 709，而陰性血清讀數(shù)0. 055。由此推斷通過PolyIC和抗原肽的復(fù)合物免疫小鼠能激活小鼠的免疫系統(tǒng)， 并產(chǎn)生相應(yīng)的E7蛋白的特異性抗體。實(shí)施例3 雜交瘤單克隆抗體的篩選1.細(xì)胞融合選擇血清滴度最高的一只小鼠，腹腔注射200 μ g PolyIC+80 μ g49_57肽的混合物進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫后第四天取脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合。具體步驟如下小鼠摘眼球取血， 將血液收集至1.5ml離心管中，直至小鼠死亡。收集的血液分離血清，-20°C保存。陽性克隆在檢測時(shí)用做陽性對照。采集完血液的小鼠進(jìn)行無菌采脾臟。在200目鋼篩網(wǎng)中研磨脾臟，收集脾細(xì)胞。將收集到的脾細(xì)胞用IOml RM1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0細(xì)胞)按照10 1到1 1的比例混合，混勻，IOOOrpm離心10分鐘。棄去上清，1分鐘內(nèi)加入37°C預(yù)熱的PEG 15001ml，37°C水浴1分鐘，在5分鐘內(nèi)緩慢加入20ml RM1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibico公司)，混勻，960rpm離心10分鐘。棄去上清，加入120ml含HAT的RM1640 培養(yǎng)基，混勻，接種到6塊96孔板中，每孔200μ 1，在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)。5至7天后，待孔中有清晰的克隆可見，每個克隆的細(xì)胞數(shù)達(dá)到IO3以上，將孔中的培養(yǎng)基吸出，加入新鮮的含HT的RM1640培養(yǎng)基，每孔200 μ 1，在37°C、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。吸出的培養(yǎng)基上清用如上所述的ELISA法檢測是否有特異性抗體產(chǎn)生。挑取ELISA檢測呈陽性的克隆繼續(xù)隨后的亞克隆篩選。2.亞克隆篩選飼養(yǎng)細(xì)胞的制備在采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆時(shí)需要有飼養(yǎng)層細(xì)胞的存在。提前一天制備飼養(yǎng)層細(xì)胞。取1只雌性8周齡以上昆明鼠收集腹腔巨噬細(xì)胞，并且接種于96 孔板中。有限稀釋法篩選亞克隆將上述選定的克隆用移液槍吹打制成細(xì)胞懸液，使用血球記數(shù)板記數(shù)。根據(jù)記數(shù)結(jié)果吸出含100個細(xì)胞的懸液加入20ml含10%胎牛血清的 RM1640培養(yǎng)基中，接種至1塊96孔板中，200 μ 1/孔，置于37°C、5 % CO2條件下培養(yǎng)，7至 10天后，待96孔板中的克隆長至整孔的六分之一到三分之一時(shí)，取細(xì)胞上清進(jìn)行特異性抗體的檢測，再挑選OD值較高、生長良好的克隆，進(jìn)行亞克隆篩選。若一個單克隆連續(xù)三次亞克隆，得到的所有克隆均為陽性時(shí)，可認(rèn)定該單克隆細(xì)胞能夠穩(wěn)定分泌特異性抗體，將該細(xì)胞建株，擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存建立細(xì)胞種子庫。按照上述標(biāo)準(zhǔn)挑取出編號為6C10的克隆，建立細(xì)胞種子庫。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液約800ml，以ftOtein A介質(zhì)純化抗體，得到6C10單克隆抗體，用作進(jìn)一步的鑒定。上述建立的6C10雜交瘤細(xì)胞株已于2010年9月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC 4144。實(shí)施例4 :6C10單克隆抗體的電泳檢測對純化后的6C10單克隆抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果如圖1所示，在二硫蘇糖醇還原電泳圖譜中，可見該單抗的約52KD的重鏈條帶和25KD的輕鏈條帶。實(shí)施例5 :6C10單克隆抗體親和力的鑒定以E7全長蛋白、Trx_E7(E7的第30_67位氨基酸殘基組成的多肽)和BSA (牛血清蛋白)分別作為包被抗原，6C10單抗作為檢測抗體，進(jìn)行ELISA檢測。結(jié)果示于圖2。從圖2的ELISA結(jié)果可以看出，含有E749-57肽的蛋白，例如E7全長蛋白和 Trx-E7 (30-67)蛋白可以和6C10單抗有很強(qiáng)的結(jié)合，ELISA實(shí)驗(yàn)中OD值大于1. 5。不含有 E749-57肽的蛋白，比如BSA蛋白，和6C10單抗幾乎沒有結(jié)合，ELISA實(shí)驗(yàn)中OD值小于0. 2。實(shí)施例6 :6C10單克隆抗體表位的鑒定使用T2荷載肽實(shí)驗(yàn)進(jìn)行本發(fā)明的單克隆抗體的表位鑒定。T2細(xì)胞(購自美國 ATCC庫，保藏號CRL-1992)是一種內(nèi)源性TAP缺陷、表面空載HLA-A2分子的細(xì)胞。外源加入的抗原肽能加載到T2細(xì)胞表面的HLA-A2分子上。將T2細(xì)胞在培養(yǎng)基中用終濃度20 μ g/ml的E749-57肽或E786-93肽或不加任何肽，孵育4小時(shí)。洗滌一次后，用染色緩沖液(PBS+0. 5% BSA+2mM EDTA)重懸后加入100 μ 1 純化的6C10單抗，37°C孵育30分鐘。洗滌一次后，用染色緩沖液(PBS+0. 5%BSA+2mM EDTA)重懸，然后加入2μ 1 FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(購自BD公司，目錄號349031)，室溫避光保存20分鐘后用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測細(xì)胞綠色熒光情況。結(jié)果如圖3所示。圖3Α和圖;3Β分別顯示Ε749-57肽荷載過的Τ2細(xì)胞流式細(xì)胞檢測結(jié)果和熒光顯微鏡檢測結(jié)果；圖3C和圖3D分別顯示Ε786-93肽荷載過的Τ2細(xì)胞流式細(xì)胞檢測結(jié)果和熒光顯微鏡檢測結(jié)果；圖3Ε和圖3F分別顯示無任何肽荷載過的Τ2細(xì)胞流式細(xì)胞檢測結(jié)果和熒光顯微鏡檢測結(jié)果。從圖3所示的結(jié)果可以看出，本發(fā)明的6C10單抗可以特異性識別位于Τ2細(xì)胞表面荷載的Ε749-57肽。由此證實(shí)了 6C10單抗的表位特異性。實(shí)施例7 單克隆抗體可變區(qū)(CDR)測序和序列分析取IX IO7個6C10雜交瘤細(xì)胞，采用PureLink總RNA純化試劑盒Qnvitrogen公司)，按試劑盒說明書操作抽提RNA。將約3 μ g抽提出的總RNA用于進(jìn)行一步法RT-PCR(使用Qiagen公司的OneSt印RT-PCR試劑盒)。
根據(jù)抗體可變區(qū)基因FRl區(qū)和FR4區(qū)保守區(qū)序列設(shè)計(jì)合成輕重鏈引物，重鏈引物
VH 正向引物5，-GA GGTGCA GCTGCA GGA GTC-3，；
VH 反向引物5’ -TGAGGA GACGGTGACCG TGGTCCCTTGGCCC-3，；
如下輕鏈引物如下VL 正向引物5，-GACA TTGTGA TGACCCA GTCT-3，；VL 反向引物5，-CCGTTTTA TTTCCA GCTTGGTCCC-3，。將重鏈和輕鏈的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別連接進(jìn)pMDIS-T載體(Takara公司)，挑選出陽性克隆后送至上海生工公司進(jìn)行DNA測序。測序結(jié)果顯示，所獲得的輕/重鏈可變區(qū)基因含有4個框架區(qū)和3個抗原互補(bǔ)決定區(qū)。該單抗的重鏈可變區(qū)序列如SEQ ID N0:1所示。6C10單抗VH基因全長348bp，編碼116個氨基酸。氨基酸序列分析結(jié)果顯示，VH 含有明確的4個框架區(qū)(FR)和3個抗原決定簇互補(bǔ)區(qū)(CDR)(其分別具有如下SEQ ID NOs 6-8所示序列)，在第22位和第95位為半胱氨酸，是與抗體二硫鍵形成有關(guān)的兩種特征性
氨基酸。SEQ ID NO 6 Asn Tyr Gly Met SerSEQ ID NO 7 Thr lie Asn SerAsn Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Gln GlySEQ ID NO 8 Glu Tyr Gly Lys Ala Phe Ala Tyr該單抗的輕鏈可變區(qū)序列如SEQ ID NO 2所示。6C10單抗VL基因全長324bp，編碼108個氨基酸。氨基酸序列分析結(jié)果顯示，VL 含有明確的4個框架區(qū)(FR)和3個抗原決定簇互補(bǔ)區(qū)(CDR)(其分別具有如下SEQ ID NOs 9-11所示序列)，在第92位為半胱氨酸，該輕鏈為異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，進(jìn)行了提前終止。SEQ ID NO 9 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His
SEQ ID NO: 10:Leu Val Ser Asn Leu Glu SerSEQ ID NO :11:Gln His lie Arg Glu Leu Thr實(shí)施例8 :6C10單克隆抗體的抑制腫瘤生成或生長的效果研究采用經(jīng)典的鼠源TC-I細(xì)胞(購自美國ATCC庫，保藏編號CRL-2785)接種建立E7 蛋白表達(dá)的宮頸癌腫瘤模型。表達(dá)E7抗原的TC-I細(xì)胞于來源于C57BL/6小鼠的肺原代細(xì)胞，通過導(dǎo)入HPV16的E7基因和被激活的人C-Ha-ras基因，該原代細(xì)胞株被轉(zhuǎn)化并獲得無限繁殖能力。對該腫瘤模型小鼠注射6C10單抗和各種對照蛋白，觀察腫瘤生長情況。收集體外培養(yǎng)生長良好的TC-I細(xì)胞，PBS洗3次，調(diào)整細(xì)胞密度，給予C57BL/6 小鼠左側(cè)腋皮下注射，每只接種0.2ml細(xì)胞懸液，約為IX IO5細(xì)胞。接種后將小鼠隨機(jī)分成4組，每組8只，按以下四種方式進(jìn)行給藥。陰性對照PBS給藥組腹皮下分別于接種后 2天、16天給藥兩次；陽性對照VRlll疫苗給藥組腹皮下分別于接種后2天、16天給藥兩次；6C10單抗給藥組頸背皮下分別于接種后0天、7天、14天、21天給藥四次；16X1同型對照單抗給藥組頸背皮下分別于接種后0天、7天、14天、21天給藥四次。其中，陽性對照 VRlll疫苗為基于HPV16E7蛋白的治療性疫苗，在小鼠腫瘤動物模型中有很好的抑制腫瘤生長效果。該疫苗的制備和表征可參見國際申請W02008/1M867A1，該申請的全部內(nèi)容通過援引的方式納入本文。同型對照16X1單抗為特異性針對HPV16病毒的外殼蛋白Ll的抗體，與HPV16E7蛋白無任何親和反應(yīng)。16X1單抗通過以HPV 16L1的病毒樣顆粒作為抗原免疫BALB/c小鼠，然后采用傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)篩選得到。每天觀察動物腫瘤生長情況，記錄接種后不同時(shí)間出現(xiàn)腫瘤的動物數(shù)(長短直徑均>=3mm才計(jì)算為腫瘤陽性)，計(jì)算成瘤率，即出現(xiàn)腫瘤動物數(shù)與每組實(shí)際動物數(shù)之比。 在腫瘤可觸及后，每周2次用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長短徑，計(jì)算腫瘤體積，即腫瘤體積=(長徑X短徑2)/2，抑瘤率計(jì)算公式抑瘤率=100% -給藥組腫瘤平均大小/PBS對照組腫瘤平均大小。觀察到60天時(shí)，殺死全部小鼠。接種腫瘤細(xì)胞后M天的成瘤率如圖4所示，60天內(nèi)的抑瘤率的結(jié)果如圖5所示。從圖4和圖5可以看出，6C10單抗和VRlll疫苗在抑制腫瘤生成和抑制腫瘤生長的效果顯著(P <0.001)區(qū)別于PBS對照組和同型16X1單抗組。說明6C10單抗給藥后有抑制腫瘤生成和抑制腫瘤生長的效果。
權(quán)利要求
1.一種特異性針對人乳頭狀瘤病毒HPV16的如SEQ ID :5所示抗原表位的抗體，所述抗體具有如SEQ ID NOs 6-8所示的重鏈CDRl、CDR2和CDR3區(qū)域和SEQ ID NOs :9_11所示的輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)域。
2.一種特異性針對人乳頭狀瘤病毒HPV16的如SEQ ID :5所示抗原表位的抗體，所述抗體具有如SEQ ID NO :1所示的重鏈可變區(qū)序列和如SEQ ID NO :2所示的輕鏈可變區(qū)序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的抗體，其特征在于，所述抗體是由宿主脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而成的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體。
4.如權(quán)利要求1或2所述的抗體，其特征在于，所述抗體為保藏號為CGMCC4144的 6C10細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體。
5.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的抗體。
6.如權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含另一種抗病毒或抗腫瘤藥物。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述另一種抗病毒或抗腫瘤藥物與所述抗體偶聯(lián)。
8.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的抗體。
9.一種產(chǎn)生如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的抗體的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞為保藏號為CGMCC 4144的6C10細(xì)胞。
10.一種制備權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的抗體的方法，其特征在于，所述方法包括將一種雙鏈RNA佐劑和SEQ ID NO 5所示的多肽混合形成復(fù)合物；將所述復(fù)合物免疫接種宿主；和從宿主的體液、組織或細(xì)胞獲得抗體。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法包括將一種雙鏈RNA佐劑和SEQ ID NO :5所示的多肽混合形成復(fù)合物；將所述復(fù)合物免疫接種宿主；收獲宿主脾細(xì)胞并將其與骨髓瘤細(xì)胞融合，和收集融合的細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述融合細(xì)胞為經(jīng)三次以上亞克隆后仍產(chǎn)生所述抗體的細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述宿主為小鼠、兔或大鼠。
14.如權(quán)利要求10-13任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述骨髓瘤細(xì)胞為SP2/0瘤細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求10-14任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述佐劑與所述多肽混合的重量比為1 0. 5至Ij 1 4。
16.如權(quán)利要求10-15任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述雙鏈RNA為PolyIC或 PolyICLCo
17.如權(quán)利要求10-16任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述融合細(xì)胞為6C10細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的抗體、如權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)的藥物組合物，或者如權(quán)利要求8的試劑盒用于制備預(yù)防或治療HPV16感染疾病、宮頸病變或?qū)m頸癌的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于治療人乳頭瘤病毒感染相關(guān)疾病——特別是宮頸癌——的抗體，及其制備方法和應(yīng)用。
文檔編號A61P15/00GK102443060SQ20101050594
公開日2012年5月9日 申請日期2010年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月13日
發(fā)明者叢薇, 劉瑞鋒, 張高峽, 田平生, 雷建強(qiáng) 申請人:上海澤潤生物科技有限公司