專利名稱：一種卷柏雌性激素類活性成分的提取分離方法
一種卷柏雌性激素類活性成分的提取分離方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是一種卷柏雌性激素類活性成分的提取分離方法。
背景技術：
由于健康狀況和生活條件的普遍提高，英國、日本婦女的平均預期壽命己分別達 80,82. 5歲，即很多婦女，1/3以上的時間將在絕經后度過。伴隨而來的更年期綜合征，如潮 熱、情緒變化、心血管系統(tǒng)疾病、骨質疏松、免疫功能衰退等嚴重影響了更年期婦女的正常 生活。雌激素替代療法(estrogen replacementtreatment, ERT)在改善這些癥狀的同時， 也增加了宮內膜癌、乳腺癌等的發(fā)病率。目前，植物雌激素作為一種天然的選擇性雌激素受 體調節(jié)劑，具有防治心腦血管系統(tǒng)疾病，預防骨質疏松，調節(jié)自主神經，降低乳腺癌、子宮內 膜癌的發(fā)病率等作用。因此，從天然植物中尋找和研究開發(fā)具有雌激素作用的藥物，包括發(fā) 現和篩選其活性成分，確定給藥劑量，探討作用途徑，對臨床安全用藥具有重要意義，從而 為人類的健康需求提供更多的選擇。卷柏(Selaginellatamariscina (Beauv.) Spring)為多年生草本植物,為蕨類卷 柏科(Selaginellaceae)卷柏屬(Selaginella)植物卷柏的全草。卷柏中含有大量的黃酮 類、木脂素類、核苷類和多酚類化合物。前期的研究發(fā)現，卷柏具有雌激素樣作用，報告基因 瞬時表達檢測卷柏發(fā)揮雌激素活性主要是通過ERβ受體的介導。為了明確卷柏中發(fā)揮雌 激素作用的為何種化合物，如何提取這種化合物，是需要認真解決的技術問題。

發(fā)明內容
針對上述情況，為克服現有技術之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種卷柏雌性激 素類活性成分的提取分離方法，可有效解決卷柏雌性激素類活性成分的提取分離，以滿足 制備治療雌性激素缺乏癥的藥物問題。本發(fā)明解決的技術方案是，首先將卷柏用質量濃度為95%的乙醇回流提取2次， 每次2小時，每次乙醇加入量為卷柏重量的10倍，提取物減壓濃縮干燥得到醇提物，另作它 用；然后將乙醇提取后的藥渣每次加原藥材10倍重量的水煎煮2次，每次2小時，合并兩次 水煎液，減壓濃縮干燥得到水提物；藥渣水提物置入80°C水浴，使其完全溶解，再加入95% 乙醇，使其含乙醇濃度為30 %，攪拌，4°C靜置過夜(12-24小時)，離心，沉淀，得第一次上 清液；第一次上清液再加入95%乙醇，使其乙醇濃度為50%，攪拌，4°C靜置過夜(12-24小 時)，600r/min離心10分鐘，沉淀，得第二次上清液；第二次上清液再加入95%乙醇，使乙 醇濃度為80%，攪拌，4°C靜置過夜(12-24小時)，600r/min離心10分鐘，沉淀，得第三次上 清液；然后，將第三次上清液減壓、濃縮、干燥，得卷柏藥渣水提物去糖成分，即本發(fā)明卷柏 雌性激素類活性成分。本發(fā)明方法簡單，科學，穩(wěn)定可靠，具有以下突出的特點(1)工藝簡單采用95%乙醇回流提取后，直接對藥渣進行水煎，過程簡單，操作方 便。
(2)工藝安全性強，生產成本低本發(fā)明整個工藝所用溶劑均為蒸餾水和乙醇，價格 較低，未用到有毒有機試劑，提高了生產的安全性，降低了生產成本，適用于工業(yè)大規(guī)模生產。(3)交叉成分少95%乙醇和水的極性相差較大，且卷柏經95%乙醇回流后，藥渣 再對其水煎，從提取材料來源上保證了提取物成分之間的無交叉或交叉較少，從而避免了 極性相近化合物在不同部位的大量交叉和流失，適合于對無法明確極性范圍或極性范圍較 大的中藥活性成分的篩選研究。
具體實施例方式以下結合實施例和有關試驗資料對本發(fā)明的具體實施方式
作詳細說明。
本發(fā)明在實施中，具體是由以下步驟實現的實施例一首先將卷柏120g用質量濃度為95%的乙醇回流提取2次，每次2小時， 每次乙醇加入量為1200ml，提取物減壓濃縮干燥得到醇提物，另作它用；然后將乙醇提取 后的藥渣每次加水1200ml煎煮2次，每次2小時，合并兩次水煎液，減壓濃縮干燥得到水提 物9. 39g ；藥渣水提物9. 39g置入80°C水浴，使其完全溶解，再加入95 %乙醇，使其含乙醇 濃度為30%，攪拌，4°C靜置12小時過夜，600r/min離心10分鐘，沉淀，得第一次上清液；第 一次上清液再加入95%乙醇，使其乙醇濃度為50%，攪拌，4°C靜置12小時過夜，600r/min 離心10分鐘，沉淀，得第二次上清液；第二次上清液再加入95%乙醇，使乙醇濃度為80%， 攪拌，4°C靜置12小時過夜，600r/min離心10分鐘，沉淀，得第三次上清液；然后，將第三次 上清液減壓、濃縮、干燥，得卷柏藥渣水提物去糖成分1. 43g，即本發(fā)明卷柏雌性激素類活性 成分。實施例二首先將卷柏240g用質量濃度為95%的乙醇回流提取2次，每次2小時，每次乙 醇加入量為2400ml，提取物減壓濃縮干燥得到醇提物，另作它用；然后將乙醇提取后的藥 渣每次加水2400ml煎煮2次，每次2小時，合并兩次水煎液，減壓濃縮干燥得到水提物 19. 44g ；藥渣水提物19. 44g置入80°C水浴，使其完全溶解，再加入95%乙醇，使其含乙醇濃 度為30%，攪拌，4°C靜置20小時過夜，600r/min離心10分鐘，沉淀，得第一次上清液；第一 次上清液再加入95%乙醇，使其乙醇濃度為50%，攪拌，4°C靜置20小時過夜，600r/min離 心10分鐘，沉淀，得第二次上清液；第二次上清液再加入95%乙醇，使乙醇濃度為80%，攪 拌，4°C靜置20小時過夜，600r/min離心10分鐘，沉淀，得第三次上清液；然后，將第三次上 清液減壓、濃縮、干燥，得卷柏藥渣水提物去糖成分3. 23g，即本發(fā)明卷柏雌性激素類活性成 分。實施例三首先將卷柏360g用質量濃度為95%的乙醇回流提取2次，每次2小時，每次乙 醇加入量為3600ml，提取物減壓濃縮干燥得到醇提物，另作它用；然后將乙醇提取后的藥 渣每次加水3600ml煎煮2次，每次2小時，合并兩次水煎液，減壓濃縮干燥得到水提物 27. 15g ；藥渣水提物27. 15g置入80°C水浴，使其完全溶解，再加入95%乙醇，使其含乙醇濃 度為30%，攪拌，4°C靜置24小時過夜，600r/min離心10分鐘，沉淀，得第一次上清液；第一 次上清液再加入95%乙醇，使其乙醇濃度為50%，攪拌，4°C靜置24小時過夜，600r/min離心10分鐘，沉淀，得第二次上清液；第二次上清液再加入95%乙醇，使乙醇濃度為80%，攪 拌，4°C靜置24小時過夜，600r/min離心10分鐘，沉淀，得第三次上清液；然后，將第三次上 清液減壓、濃縮、干燥，得卷柏藥渣水提物去糖成分4. 31g，即本發(fā)明卷柏雌性激素類活性成 分。上述三次試驗的水提物得率為7. 82%，卷柏藥渣水提物去糖成分的平均得率為 15.9%，上述制備過程經過多次、多種劑量的制備，其得率均取得了相近似的結果，證明該 制備方法穩(wěn)定可靠，有實際的應用意義。本發(fā)明方法可有效用于卷柏雌性激素類活性成分的提取分離，并經試驗取得了滿 意的效果，有關試驗資料如下(1)小鼠子宮增重法性未成熟雌性小鼠按體重均衡和隨機的原則分組，每組10只。空白對照組每日 灌胃0. Olml/lOg蒸餾水；陽性對照組每日灌胃陽性藥0. 01ml/10g(己烯雌酚片按0. 35mg/ kg/d給藥)。 卷柏各給藥組按臨床用藥的20倍量X提取率計算，配成相應濃度的混懸液， 每日按0.01ml/10g灌胃。所有小鼠給藥期間均自由進食飲水。持續(xù)給藥7天后，與第8天 摘除眼球取血，脫頸處死小鼠，迅速剝離子宮、脾臟、胸腺稱重。所有實驗均平行重復三次。子宮系數(％ )=子宮濕重/小鼠體重X 100%(2)統(tǒng)計處理實驗數據以〕± s表示，SPSS13. 0進行單因素方差分析(One-Way AN0VA)統(tǒng)計處理。實驗結果1聚酰胺柱分離法中卷柏各部位對性未成熟小鼠子宮系數的影響卷柏總部位與空白組比極顯著性增加小鼠子宮系數(ρ <0.01)，卷柏水、50%、 80%部位與空白組比無顯著性差異(ρ > 0. 05)。(表1)表1聚酰胺柱分離法中卷柏各部位對性未成熟小鼠子宮系數的影響U±s，n=30)
IFiMij給藥劑MSl(g)子宮濕S(mg) 子S系數(％)
—如飢—16.58±1.0214.10±3.090.090±0.015
尼爾雌醇組1.7mg/kg/d14.11±1.0569.95士8.840.551±0.1012)
卷捫總部位組0.293g/kg/d16.53±1.0632.66±10.840.245±0.0712)4)
卷柏水部位組0.097g/kg/d 17.25±1.2319.5ft±3.350.119±0.0154)
卷Kl 50%部侈/IH0.085g/kg/d16.71 士0.9516.89±3.620.116±0.0144)
卷柏 80%部位組0.037g/kg/d17.76±1.9519.13±4.180.123±0·0204)注與空白對照組比較，υ表示P < 0. 05,2)表示P < 0.01 ；與尼爾雌醇組比較，3) 表示 P < 0. 05,4)表示 P < 0. 01。上述結果顯示，卷柏總部位經聚酰胺柱分離后，各部位對小鼠子宮無明顯作用，無 法明確卷柏發(fā)揮雌激素樣作用的活性部位，說明此種分離方法不適合于卷柏雌激素活性部 位的提取和分離。
2 95%乙醇回流藥渣水提法中卷柏各用藥組對性未成熟小鼠子宮系數的影響卷柏水提高劑量組與空白組比極顯著增加小鼠子宮系數(ρ < 0. 01)；卷柏水提低 劑量，醇提高、低劑量組均與空白組比無差異(ρ >0.05)。(表2)表2 95%乙醇回流藥渣水提法中卷柏各提取物對性未成熟小鼠子宮系數的影向 (χ 士 s,n=30)
權利要求
一種卷柏雌性激素類活性成分的提取分離方法，其特征在于，首先將卷柏用質量濃度為95％的乙醇回流提取2次，每次2小時，每次乙醇加入量為卷柏重量的10倍，提取物減壓濃縮干燥得到醇提物，另作它用；然后將乙醇提取后的藥渣每次加原藥材10倍重量的水煎煮2次，每次2小時，合并兩次水煎液，減壓濃縮干燥得到水提物；藥渣水提物置入80℃水浴，使其完全溶解，再加入95％乙醇，使其含乙醇濃度為30％，攪拌，4℃靜置過夜，離心，沉淀，得第一次上清液；第一次上清液再加入95％乙醇，使其乙醇濃度為50％，攪拌，4℃靜置過夜，600r/min離心10分鐘，沉淀，得第二次上清液；第二次上清液再加入95％乙醇，使乙醇濃度為80％，攪拌，4℃靜置過夜，600r/min離心10分鐘，沉淀，得第三次上清液；然后，將第三次上清液減壓、濃縮、干燥，得卷柏藥渣水提物去糖成分。
2.根據權利要求1所述的卷柏雌性激素類活性成分的提取分離方法，其特征在于，首 先將卷柏120g用質量濃度為95%的乙醇回流提取2次，每次2小時，每次乙醇加入量為 1200ml，提取物減壓濃縮干燥得到醇提物，另作它用；然后將乙醇提取后的藥渣每次加水 1200ml煎煮2次，每次2小時，合并兩次水煎液，減壓濃縮干燥得到水提物9. 39g ；藥渣水提 物9. 39g置入80°C水浴，使其完全溶解，再加入95%乙醇，使其含乙醇濃度為30%，攪拌， 4°C靜置12小時過夜，600r/min離心10分鐘，沉淀，得第一次上清液；第一次上清液再加入 95%乙醇，使其乙醇濃度為50%，攪拌，4°C靜置12小時過夜，600r/min離心10分鐘，沉淀， 得第二次上清液；第二次上清液再加入95%乙醇，使乙醇濃度為80%，攪拌，4°C靜置12小 時過夜，600r/min離心10分鐘，沉淀，得第三次上清液；然后，將第三次上清液減壓、濃縮、 干燥，得卷柏藥渣水提物去糖成分1. 43g，即本發(fā)明卷柏雌性激素類活性成分。
3.根據權利要求1所述的卷柏雌性激素類活性成分的提取分離方法，其特征在于，首 先將卷柏240g用質量濃度為95%的乙醇回流提取2次，每次2小時，每次乙醇加入量為 2400ml，提取物減壓濃縮干燥得到醇提物，另作它用；然后將乙醇提取后的藥渣每次加水 2400ml煎煮2次，每次2小時，合并兩次水煎液，減壓濃縮干燥得到水提物19. 44g ；藥渣水 提物19. 44g置入80°C水浴，使其完全溶解，再加入95 %乙醇，使其含乙醇濃度為30 %，攪 拌，4°C靜置20小時過夜，600r/min離心10分鐘，沉淀，得第一次上清液；第一次上清液再 加入95%乙醇，使其乙醇濃度為50%，攪拌，4°C靜置20小時過夜，600r/min離心10分鐘， 沉淀，得第二次上清液；第二次上清液再加入95%乙醇，使乙醇濃度為80%，攪拌，4°C靜置 20小時過夜，600r/min離心10分鐘，沉淀，得第三次上清液；然后，將第三次上清液減壓、濃 縮、干燥，得卷柏藥渣水提物去糖成分3. 23g，即本發(fā)明卷柏雌性激素類活性成分。
4.根據權利要求1所述的卷柏雌性激素類活性成分的提取分離方法，其特征在于，首 先將卷柏360g用質量濃度為95%的乙醇回流提取2次，每次2小時，每次乙醇加入量為 3600ml，提取物減壓濃縮干燥得到醇提物，另作它用；然后將乙醇提取后的藥渣每次加水 3600ml煎煮2次，每次2小時，合并兩次水煎液，減壓濃縮干燥得到水提物27. 15g ；藥渣水 提物27. 15g置入80°C水浴，使其完全溶解，再加入95 %乙醇，使其含乙醇濃度為30 %，攪 拌，4°C靜置24小時過夜，600r/min離心10分鐘，沉淀，得第一次上清液；第一次上清液再 加入95%乙醇，使其乙醇濃度為50%，攪拌，4°C靜置24小時過夜，600r/min離心10分鐘， 沉淀，得第二次上清液；第二次上清液再加入95%乙醇，使乙醇濃度為80%，攪拌，4°C靜置 24小時過夜，600r/min離心10分鐘，沉淀，得第三次上清液；然后，將第三次上清液減壓、濃 縮、干燥，得卷柏藥渣水提物去糖成分4. 31g，即本發(fā)明卷柏雌性激素類活性成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及卷柏雌性激素類活性成分的提取分離方法，可有效解決卷柏雌性激素類活性成分的提取分離，以滿足制備治療雌性激素缺乏癥的藥物問題，方法是，首先將卷柏用乙醇回流提取2次，提取物減壓濃縮干燥得到醇提物，另作它用；然后將乙醇提取后的藥渣每次加原藥材10倍重量的水煎煮2次，每次2小時，合并兩次水煎液，減壓濃縮干燥得到水提物；藥渣水提物置入80℃水浴，使其完全溶解，再加入乙醇，攪拌，4℃靜置過夜，離心，沉淀，得上清液，將上清液減壓、濃縮、干燥，本發(fā)明方法簡單，科學，穩(wěn)定可靠，工藝簡單，操作方便，工藝安全性強，生產成本低，適用于工業(yè)大規(guī)模生產，交叉成分少。
文檔編號A61K36/11GK101966206SQ201010299060
公開日2011年2月9日 申請日期2010年10月8日 優(yōu)先權日2010年10月8日
發(fā)明者馮衛(wèi)生, 李冬梅, 王小蘭, 蔣云, 鄭曉珂 申請人:河南中醫(yī)學院