專利名稱：索拉非尼在治療纖維化病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及索拉非尼(sorafenib)的一種新用途，具體涉及索拉非尼在治療 TGF- β介導(dǎo)的疾病中的應(yīng)用，更具體涉及索拉非尼在治療纖維化病中的應(yīng)用，更具體涉及索拉非尼在治療肝纖維化或肺纖維化中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中國(guó)是“肝病大國(guó)”，多種肝病的發(fā)病率一直居高不下。肝纖維化作為多種慢性肝病病理發(fā)生過(guò)程的重要特征(Friedman，2003)，一直是肝病研究和治療領(lǐng)域所關(guān)注的重要課題之一。肝纖維化是指肝細(xì)胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時(shí)，肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(特別是膠原)異常增加并堆積的病理過(guò)程。細(xì)胞外基質(zhì)的堆積構(gòu)成纖維疤痕，破壞肝臟的結(jié)構(gòu)， 并發(fā)新生肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的結(jié)節(jié)，導(dǎo)致肝臟功能和新陳代謝被破壞，最終出現(xiàn)肝硬化和肝癌等 (Gines等，2004)。肝纖維化成因復(fù)雜，TGF-β是目前已知最重要的一類促肝纖維化因子， 具有活化肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)肝臟膠原基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成等作用(Gressner等， 2002)。TGF-β蛋白家族包括TGF-i3 1、TGF-i3 2和TGF-i3 3等成員，它們具有相近的功能。其中TGF-β 1是最重要的成員，它是一個(gè)含有112個(gè)氨氨基酸、分子量為25kD的糖蛋白，并且在物種間高度保守，例如人和大鼠、小鼠的TGF-β 1序列有99%以上相同。人 TGF- β UTGF- β 2和TGF- β 3的基因分別定位于染色體19q3、lq41和14q24，均含有7個(gè)外顯子，其核苷酸序列高度同源，所編碼的前體分子C端者有9個(gè)保守的Cys，提示TGF-β 1、 TGF-i3 2和TGF-i3 3基因可能來(lái)自一個(gè)共同的祖先基因。另外，TGF-β也是這三種蛋白的總稱。鑒于TGF-β 1蛋白在TGF-β家族中的重要的代表性地位和TGF-β家族成員的高度同源性，許多研究者采用TGF-β 1來(lái)研究TGF-β蛋白家族的特性，有些公司的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中甚至將TGF-β 1蛋白直接寫(xiě)作TGF-β (參見(jiàn)，例如，拜維申公司(Biovision)的萬(wàn)維網(wǎng)站對(duì) TGF-β 1 的介紹，http://www. biovision. com/tgf-betal-human-recombinant-1765. html)。細(xì)胞對(duì)于TGF-β刺激下所產(chǎn)生的反應(yīng)取決于細(xì)胞類型和刺激時(shí)所處的微環(huán)境。 例如TGF-β能導(dǎo)致表皮細(xì)胞生長(zhǎng)終止并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，TGF-β也可以誘導(dǎo)細(xì)胞的上皮一間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(ΕΜΤ)。肝臟內(nèi)80%的細(xì)胞是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，受到損傷和炎癥時(shí)，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞通過(guò)自分泌和旁分泌作用產(chǎn)生TGF-β。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明TGF-β能刺激肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生ΕΜΤ，進(jìn)而形成活化的肌成纖維細(xì)胞，增加膠原等胞外基質(zhì)的合成，從而促進(jìn)纖維化疾病發(fā)生(Zeisberg 等，2007 ；Henderson 和 Forbes，2008)。盡管近年來(lái)在肝纖維化的治療領(lǐng)域已經(jīng)取得了諸多進(jìn)展，但是許多治療方案仍然無(wú)法獲得令人滿意的療效。在世界范圍，尤其是中國(guó)，肝纖維化的治療仍然是臨床上亟待解決的課題之一。因此，本領(lǐng)域非常需要一種改進(jìn)的治療方案和/或藥物來(lái)治療肝纖維化。目前，本領(lǐng)域中用于抑制TGF-β，從而抑制EMT和肝纖維化的治療選擇非常有限。 因此，本發(fā)明人對(duì)目前已在臨床應(yīng)用的幾十種小分子藥物進(jìn)行篩選。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)抗癌藥物索拉非尼能明顯抑制TGF-β信號(hào)，進(jìn)而抑制TGF-β誘導(dǎo)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的EMT進(jìn)程，從而治療肝纖維化。索拉非尼是具有下式結(jié)構(gòu)的4[4-[[4_氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基氨基]苯氧基]-N-甲基-吡啶-2-羧酰胺 它的甲苯磺酸鹽又名多吉美(Nexavar)，是一個(gè)多靶點(diǎn)的激酶抑制劑 (Sebolt-Leopold和English，2006)。已經(jīng)證明其作用靶點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管上的酪氨酸激酶受體，包括激酶Raf-I和B-Raf、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGFR、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體PDGFR、以及激酶FLT3和c-Kit等，通過(guò)特異性抑制受體酪氨酸激酶活性，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤血管生成(Shimizu等，1999 ；Gilliland和Griff in，2002 ；Heinrich等， 2002)。2005年12月，索拉非尼作為晚期腎癌的治療藥物，獲得美國(guó)食品藥品管理局的批準(zhǔn)，這是美國(guó)FDA十幾年來(lái)批準(zhǔn)的第一個(gè)治療腎癌的藥物，也是第一個(gè)口服的多靶點(diǎn)激酶抑制劑。之后，索拉非尼又被FDA批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性肝癌的治療。此前，該藥已獲準(zhǔn)在中國(guó)上市。研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼具有廣泛的抗腫瘤活性，對(duì)結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌以及黑色素瘤等也有很好的療效(Llovet等，2008)。然而，迄今為止尚未見(jiàn)有關(guān)索拉非尼抑制TGF-β的報(bào)道， 也沒(méi)有人證明索拉非尼能夠抑制EMT或肝纖維化。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供索拉非尼或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療TGF-β介導(dǎo)的疾病的藥物中的應(yīng)用。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供索拉非尼或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療TGF-β和STAT3介導(dǎo)的疾病的藥物中的應(yīng)用，其中，STAT3可以是TGF-β的下游蛋白。在又一個(gè)方面，本發(fā)明針對(duì)的疾病是EMT介導(dǎo)的疾病。更具體地，本發(fā)明針對(duì)的疾病可以是纖維化病，優(yōu)選肝纖維化或肺纖維化。在另一方面，本發(fā)明提供用索拉非尼或其藥學(xué)上可接受的鹽治療TGF-β介導(dǎo)的疾病的方法。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用索拉非尼或其藥學(xué)上可接受的鹽治療TGF-β和 STAT3介導(dǎo)的疾病的方法，其中，STAT3可以是TGF-β的下游蛋白。在又一個(gè)方面，本發(fā)明針對(duì)的疾病是EMT介導(dǎo)的疾病。更具體地，本發(fā)明針對(duì)的疾病可以是纖維化病，優(yōu)選肝纖維化或肺纖維化。在另一方面，本發(fā)明提供用索拉非尼或其鹽在體外抑制TGF-β的方法。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用索拉非尼或其鹽在體外抑制TGF-β和STAT3的方法，其中，STAT3可以是TGF-β的下游蛋白。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供用索拉非尼或其鹽在體外抑制EMT進(jìn)程的方法。在另一方面，本發(fā)明提供一種包含索拉非尼或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體的藥物組合物，所述藥物組合物可用于治療TGF-β介導(dǎo)的疾病、 TGF- β和STAT3介導(dǎo)的疾病、EMT介導(dǎo)的疾病、纖維化病、以及肝纖維化或肺纖維化。在一類實(shí)施方式中，TGF-β可以是TGF-β
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明還考慮到索拉非尼的多種類似物和衍生物，例如但不限于甲氧基-5-(三氟甲基)苯基)-N' -(4(2-(N-甲基氨基甲酰基)-4-吡啶氧基)苯基)脲、 N-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-N'氨基甲?；?-4-吡啶氧基)苯基)脲、 N-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-N' 甲基氨基甲?；?-4-吡啶氧基)苯基) 脲、N-甲氧基-4-氯-5-(三氟甲基)苯基)-N' -(3 (N-甲基氨基甲?；?-4-吡啶氧基)苯基)脲、N-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-N' -O氨基甲?；?4-吡啶氧基)苯基-)脲、N-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-N' 氨基甲酰基-4-吡啶氧基)苯基)脲(可參見(jiàn)美國(guó)專利US7235576，將其全文納入本文作參考)，由于它們可具有與索拉非尼相似的生物學(xué)作用，所以它們也可具有與索拉非尼相同的上述各項(xiàng)應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種篩選治療肝纖維化或肺纖維化的藥物的方法，所述方法包括將待篩藥物與TGF-β相接觸和測(cè)定TGF-β活性的步驟，如果接觸后TGF-β活性降低將該待篩藥物鑒定為治療肝纖維化或肺纖維化的藥物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述測(cè)定TGF-β活性的步驟是利用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)在細(xì)胞水平上進(jìn)行的。


圖1 :(Α)索拉非尼、厄洛替尼(Erlotinib)、吉非替尼(Gefitinib)、達(dá)布非龍 (Darbufelone)、塞來(lái)昔布(Celecoxib)等小分子藥物對(duì)AML12細(xì)胞的TGF-β信號(hào)的影響； ⑶0、1、2、5和10 μ M的索拉非尼對(duì)AML12細(xì)胞的TGF-β信號(hào)的影響；(C)在AML12細(xì)胞中，不同劑量的索拉非尼對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的Smad2蛋白磷酸化的抑制作用；(D)索拉非尼對(duì) TGF-β誘導(dǎo)的Smad7的mRNA水平的抑制作用。**，p < 0. 01，即統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異。圖2 :(A)不同劑量(0、1、5和10 μ M)的索拉非尼對(duì)5ng/ml的TGF-β 1誘導(dǎo)的小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞AML12發(fā)生的上皮一間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的抑制作用；(B)不同劑量(0、1、5和 10 μ Μ)的索拉非尼對(duì)5ng/ml的TGF-β 1誘導(dǎo)AML12細(xì)胞表達(dá)的上皮細(xì)胞標(biāo)識(shí)物和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的水平的影響；(C和D)索拉非尼對(duì)AML12細(xì)胞EMT過(guò)程的抑制作用的時(shí)間依賴性。圖3 不同劑量(0、1、5和10 μ Μ)的索拉非尼對(duì)5ng/ml的TGF-β 1誘導(dǎo)的AML12 細(xì)胞凋亡的抑制作用。**，P < 0.01，即統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異。圖 4:(Α)不同濃度(0、0· 5、1、2、5 和 10ng/ml)的 TGF-β 1 對(duì) AML12 細(xì)胞內(nèi) STAT3 磷酸化水平的影響；(B) 5ng/ml的TGF-β 1處理AML12細(xì)胞不同時(shí)間(0、1、2、4、8和16h) 后，對(duì)細(xì)胞內(nèi)STAT3磷酸化水平的影響；(C)在AML12細(xì)胞中，不同劑量(0、1、5和ΙΟμΜ)的索拉非尼對(duì)TGF-β 1誘導(dǎo)的STAT3磷酸化水平升高的抑制作用；(D)AML12細(xì)胞經(jīng)5 μ M索拉非尼處理后，細(xì)胞內(nèi)STAT3蛋白的定位。**，ρ < 0. 01，即統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異。圖5 ㈧在小鼠肝原代細(xì)胞中，5μΜ索拉非尼對(duì)TGF-β信號(hào)的影響；(B)通過(guò) Western印跡法檢測(cè)小鼠肝原代細(xì)胞中10 μ M索拉非尼對(duì)TGF-β 1誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞標(biāo)志物和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的水平的影響；(C)通過(guò)免疫熒光檢測(cè)小鼠肝原代細(xì)胞中5 μ M索拉非尼對(duì)TGF-β 1誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞標(biāo)志物ZO-I和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物纖連蛋白的水平的影響。圖6 (A)通過(guò)組織切片染色法證明索拉非尼能明顯減少CCl4誘導(dǎo)肝纖維化的小鼠模型中的肝組織膠原沉積；(B)通過(guò)羥脯氨酸含量的變化進(jìn)一步驗(yàn)證索拉非尼能明顯減少CC14誘導(dǎo)肝纖維化的小鼠模型中的小鼠肝組織膠原沉積；**，ρ < 0. 01，即統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異；(C)索拉非尼明顯減少CC14誘導(dǎo)肝纖維化的小鼠模型的肝臟組織中的α-SMA 蛋白。
具體實(shí)施例方式1.定義除非另有說(shuō)明，本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義?！八帉W(xué)上可接受的鹽”指某種化合物的藥學(xué)上可接受的鹽，該鹽可衍生自本領(lǐng)域熟知的各種有機(jī)和無(wú)機(jī)抗衡離子，包括，例如鈉、鉀、鈣、鎂、銨、四烷基銨等；當(dāng)分子含有堿性官能團(tuán)時(shí)，包括有機(jī)或無(wú)機(jī)酸的鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙酸鹽、馬來(lái)酸鹽、草酸鹽等?！八帉W(xué)有效量”和“治療有效量”指足以治療特定病癥或疾病或者其一種或多種癥狀和/或預(yù)防所述疾病或病癥發(fā)生的化合物的用量?！八帉W(xué)上可接受的賦形劑或載體”指可用于醫(yī)藥應(yīng)用的賦形劑或載體，其一般為惰性，包括但不限于本文和Ε. W. Martin的《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington' s Pharmaceutical Sciences)中記載的賦形劑或載體。" TGF-β ”是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，它是一類重要的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移、凋亡、血管生成、免疫反應(yīng)、胞外基質(zhì)合成以及早期胚胎發(fā)育等多個(gè)生物學(xué)事件(Rahimi和Leof，2007)，還能促進(jìn)EMT和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。"EM^giS —間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，即上皮細(xì)胞失去上皮細(xì)胞特性而獲得了間充質(zhì)細(xì)胞特性的一種現(xiàn)象(Zavadil和BOttinger，2005)。EMT是胚胎早期發(fā)育和器官生成過(guò)程中的重要現(xiàn)象，參與原腸運(yùn)動(dòng)、神經(jīng)脊細(xì)胞從神經(jīng)管的遷移運(yùn)動(dòng)，以及心血管瓣膜的形成等過(guò)程。同時(shí)成體組織的損傷修復(fù)，腎臟、肝臟、肺的纖維化，尤其是惡性腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，都與EMT緊密相關(guān)(Thiery等，2009)。除非文中另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“治療”指治療性和預(yù)防性手段，目的是預(yù)防或減慢(減弱)不良生理改變或失調(diào)，如纖維化病的發(fā)展或蔓延。對(duì)于本發(fā)明目的，有益或所需的臨床結(jié)果包括但不限于可檢測(cè)或不可檢測(cè)的癥狀緩解、疾病程度減輕，疾病狀態(tài)穩(wěn)定(即不惡化)，疾病進(jìn)展延遲或減慢，疾病狀態(tài)改善或減輕，以及緩解(部分或全部)?！爸委煛币部芍概c不接受治療的預(yù)計(jì)存活期相比，存活期延長(zhǎng)。需要治療的對(duì)象包括已經(jīng)患有疾病或失調(diào)的對(duì)象以及傾向于患病或失調(diào)的對(duì)象或需要預(yù)防疾病或失調(diào)的對(duì)象。"TGF-β介導(dǎo)的疾病”指TGF-β在基因突變、表達(dá)異常、磷酸化水平改變、活性改變、細(xì)胞定位改變等情況下可能引起的疾病，包括但不限于多種臟器的纖維化病變， 如肺纖維化、腎纖維化、肝纖維化等；多種心血管疾病，如遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥 (hereditary hemorrhagic telangiectasia, HTT)、原發(fā)性月市動(dòng)脈高壓(primary pulmonary hypertension, PPT)；以及馬凡氏綜合癥(Marfan Syndrome, MFS)等等。"TGF- β和STAT3介導(dǎo)的疾病”指TGF- β和STAT3在異常表達(dá)、磷酸化水平改變、 活性改變、細(xì)胞定位改變等情況下可能引起的疾病，更具體指TGF-β在表達(dá)異常、磷酸化水平改變、活性改變、細(xì)胞定位改變等情況下影響其下游蛋白STAT3的表達(dá)、磷酸化水平、 活性、細(xì)胞定位等特性，從而可能導(dǎo)致發(fā)生的疾病，包括但不限于多種臟器的纖維化病變， 如肺纖維化、腎纖維化、肝纖維化等；白血??；腫瘤；多種心血管疾病，如糖蛋白(GP) 130依賴性心肌肥大?！癊MT介導(dǎo)的疾病”指上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程異常時(shí)導(dǎo)致的疾病，包括但不限于多種臟器的纖維化病變，如肺纖維化、腎纖維化、肝纖維化等。2.藥物組合物和給藥方法在其它實(shí)施方式中，描述了包含有效量的索拉非尼和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。這些組合物適用于獸醫(yī)或人類給藥。本發(fā)明藥物組合物可以是給予患者的任何組合物形式。例如，該組合物可以是固體、液體或氣體(氣霧劑)形式。一般的給藥途徑包括但不限于口服、局部、胃腸道外、舌下、直腸、陰道、眼部、腫瘤內(nèi)和鼻內(nèi)。胃腸道外給藥包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸內(nèi)注射或輸注。在一個(gè)方面，胃腸道外給予該組合物。在又一方面，靜脈內(nèi)給予所述藥物組合物。 在又一方面，口服給予所述藥物組合物。可配制藥物組合物，使得在給予患者該組合物后其有效成分，即索拉非尼可被生物利用。藥物組合物可采取單一或多劑量單位的形式，例如，片劑可以是單劑量單位，氣霧劑的容器可容納一個(gè)或多個(gè)多個(gè)劑量單位。用于制備該藥物組合物的材料在其用量下應(yīng)無(wú)毒。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將明白該藥物組合物中活性成分的最佳劑量取決于各種因素。相關(guān)因素包括但不限于動(dòng)物類型 (如人)、索拉非尼的具體形式、給藥方式和具體的組成。藥學(xué)上可接受的載體可為顆粒狀，因此該組合物可以是，例如片劑或粉末形式。載體是液體時(shí)，該組合物可以是，例如口服糖漿或注射液。此外，載體可以是氣態(tài)或微粒，以提供用于(例如)吸入給藥的氣霧劑組合物。當(dāng)口服給藥時(shí)，該組合物優(yōu)選固體或液體形式，半固體、半液體、懸浮液和凝膠形式也包括在本文所考慮的固體或液體形式中。作為口服給藥的固體組合物，可將該組合物制成粉劑、顆粒劑、壓縮片劑、丸劑、膠囊、口香糖、糯米紙囊劑等。這種固體組合物一般含有一種或多種惰性稀釋劑。此外，可存在一種或多種以下物質(zhì)粘合劑如羧甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素或明膠；賦形劑如淀粉、乳糖或糊精、崩解劑如藻酸、藻酸鈉、原始凝膠(Primogel)、玉米淀粉等；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂；助流劑如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精、調(diào)味劑如薄荷、甲基水楊酸或橙味劑；以及著色劑。當(dāng)組合物是膠囊，如明膠膠囊形式時(shí)，除上述類型的材料外，它還可含有液態(tài)載體如聚乙二醇、環(huán)式糊精或脂肪油。該組合物可以是液體形式，如酏劑、糖漿、溶液、乳液或懸浮劑。液體可用于口服給藥或注射遞送。當(dāng)口服給藥時(shí)，組合物可含有甜味劑、防腐劑、染料/著色劑和味道增強(qiáng)劑中的一種或多種。注射給藥的組合物中，也可包含表面活性劑、防腐劑、濕潤(rùn)劑、分散劑、懸浮劑、緩沖液、穩(wěn)定劑和等滲劑中的一種或多種。無(wú)論是溶液、懸浮液或其它類似形式的液體組合物也可包含一種或多種以下物質(zhì)無(wú)菌稀釋劑如注射用水，鹽溶液，優(yōu)選生理鹽水、林格溶液、等滲氯化鈉，可用作溶劑或懸浮介質(zhì)的不揮發(fā)性油如合成的甘油單酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、環(huán)式糊精、丙二醇或其它溶劑；抗菌劑如芐基醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉； 螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖液如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽緩沖液，以及調(diào)節(jié)張力的物質(zhì)如氯化鈉或右旋糖?？蓪⑽改c道外組合物包裝在由玻璃、塑料或其它材料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。生理鹽水是示范性輔佐劑。注射組合物優(yōu)選無(wú)菌。在治療具體疾病或病癥中活性化合物的有效量取決于疾病或病癥的性質(zhì)，可用標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)測(cè)定有效量。此外，可任選地進(jìn)行體外或體內(nèi)試驗(yàn)以幫助鑒定最佳劑量范圍。用于組合物的準(zhǔn)確劑量也取決于給藥途徑，和疾病或失調(diào)的嚴(yán)重性，應(yīng)根據(jù)醫(yī)生的判斷和各個(gè)患者的情況來(lái)決定。該組合物含有治療有效量的活性化合物，以獲得合適劑量。該治療有效量一般至少約為該組合物重量的0.01%。當(dāng)口服給藥時(shí)，該治療有效量可約為該組合物重量的 0. 1% -80%。在一個(gè)方面，口服組合物可含有約占該組合物重量4% -50%的活性化合物。 在又一方面，制備本發(fā)明組合物，以使胃腸道外單位劑量含有約0. 01重量％ -2重量％的活性化合物。該藥物組合物可含有每千克體重約0. Ol-IOOOmg的活性化合物。在一個(gè)方面，該藥物組合物可包含約每千克體重0. I-IOOmg的活性化合物。在一個(gè)方面，該藥物組合物可包含約每千克體重I-IOOmg的活性化合物。在另一方面，給藥量約為0. l-25mg/kg體重的活性化合物。在另一方面，給藥量約為l-10mg/kg體重的活性化合物。在治療方案中，每天給予該藥物組合物的劑量可以是約0. Ol-IOOOmg活性化合物 /kg體重，優(yōu)選0. I-IOOmg活性化合物/kg體重，更優(yōu)選I-IOmg活性化合物/kg體重，最優(yōu)選2-5mg活性化合物/kg體重?；钚曰衔锘蛩幬锝M合物可通過(guò)任何方便的途徑，例如通過(guò)輸液或推注給藥，通過(guò)上皮或粘膜層(如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收。可以全身或局部給藥。已知各種遞送系統(tǒng)，如包裹在脂質(zhì)體、微粒、微膠囊、膠囊等中，它們可用于給予活性化合物或藥物組合物。在某些實(shí)施方式中，將一種以上的活性化合物或藥物組合物給予患者。例如也可通過(guò)使用吸入器或噴霧器，與促氣霧劑一起配制，或通過(guò)碳氟化合物或合成肺部表面活性劑灌注進(jìn)行肺部給藥。在又一實(shí)施方式中，活性化合物或組合物可以控釋系統(tǒng)遞送，例如但不限于使用泵或各種聚合材料。在又一實(shí)施方式中，可將控釋系統(tǒng)置于活性化合物或組合物的靶(如腦)的附近，因而僅需要全身給藥劑量的一部分(參見(jiàn)例如Goodson，《控釋的醫(yī)學(xué)應(yīng)用》 (Medical Applications ofControlled Release)，同上，第 2 卷，第 115-138 頁(yè)(1984))。 可用Langer綜述(Science 249:1527-1533(1990))中討論的其它控釋系統(tǒng)。藥學(xué)上可接受的載體可以是液體，如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來(lái)源的液體，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。藥學(xué)上可接受的載體可以是鹽水、阿拉伯樹(shù)膠、 明膠、淀粉糊、滑石粉、角蛋白、膠體氧化硅、尿素等。此外，可使用輔助劑、穩(wěn)定劑、增稠齊U、 潤(rùn)滑劑和著色劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)給予患者時(shí)，活性化合物或組合物和藥學(xué)上可接受的載體無(wú)菌。當(dāng)靜脈內(nèi)給予活性化合物時(shí)，水是示范性載體。鹽水溶液以及右旋糖和甘油的水溶液也可用作液體載體，尤其是注射溶液。合適的藥物載體還包括賦形劑如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，本發(fā)明組合物也可含有少量濕潤(rùn)劑或乳化劑，或PH緩沖劑。本發(fā)明組合物可采取溶液，懸液，乳液，片劑，丸劑，微型片劑，膠囊，含有液體、粉劑、緩釋劑、栓劑、乳劑、氣霧劑、噴霧劑、懸浮劑的膠囊形式或其它適合使用的形式。 其它合適的藥物載體的其它例子見(jiàn)E.W.Martin的《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington’ s Pharmaceutical Sciences)0在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)常規(guī)方法將活性化合物配成適合靜脈內(nèi)給予動(dòng)物，尤其是人的藥物組合物。用于靜脈內(nèi)給藥的載體一般是無(wú)菌等滲緩沖水溶液。需要時(shí)，該組合物也可包含增溶劑。用于靜脈內(nèi)給藥的組合物可任選地包含局部麻醉劑如利多卡因，以緩解注射部位的疼痛。通常，在標(biāo)明活性物質(zhì)用量的密封容器如安瓿或藥囊中以單位劑型單獨(dú)或混合形式，例如，作為凍干粉末或無(wú)水濃縮物提供。當(dāng)通過(guò)輸注給予活性化合物時(shí)，可用，例如含有藥物級(jí)無(wú)菌水或鹽水的輸液瓶配藥。當(dāng)通過(guò)注射給予活性化合物時(shí)，可提供裝有注射用無(wú)菌水或鹽水的安瓿，以便在給藥前混合這些成分。該組合物可用于局部給藥，此時(shí)載體可以是溶液、乳液、軟膏或凝膠基質(zhì)形式。如果用于透皮給藥，該組合物可以是透皮貼劑或離子電滲裝置形式。局部劑型可包含濃度約為0. 05% -50% w/v(每單位體積組合物中的重量)，另一方面為0. 1%-10%W/V的活性化合物。這可通過(guò)，例如但不限于手術(shù)期間局部輸注；局部施用，如術(shù)后與創(chuàng)傷敷料聯(lián)用；注射；導(dǎo)管方式；栓劑方式；或植入方式(植入物為多孔性、非多孔性或明膠材料，包括膜如硅塑(sialastic)膜或纖維)來(lái)實(shí)現(xiàn)。該組合物可用于直腸給藥，其形式為，例如在直腸中融化并釋放活性化合物的栓劑。該組合物可包含改變固體或液體劑量單位的物理形式的各種材料。例如，該組合物可包含在活性成分周?chē)纬砂峦鈿さ牟牧稀Ｐ纬砂峦鈿さ牟牧弦话闶嵌栊缘?，可選自例如糖、蟲(chóng)膠和其它腸溶包衣物質(zhì)?；蛘?，可將活性成分包裝在明膠膠囊中。該組合物可由氣態(tài)劑量單位組成，例如，可以是氣霧劑形式。術(shù)語(yǔ)氣霧劑用來(lái)指各種系統(tǒng)，從膠體性質(zhì)系統(tǒng)到由密封包裝組成的系統(tǒng)。可通過(guò)液化氣或壓縮氣體或通過(guò)適合地分散活性成分的泵系統(tǒng)進(jìn)行遞送。無(wú)論是固體、液體或氣體形式，本發(fā)明藥物組合物均可包括用于治療纖維化病的其它藥物。3.索拉非尼的用途本發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，索拉非尼通過(guò)抑制TGF- β和其下游的STAT3蛋白的磷酸化來(lái)抑制肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的EMT過(guò)程，因而逆轉(zhuǎn)肝纖維化。以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)證明索拉非尼的這種用途。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，以下提供的實(shí)施例僅為說(shuō)明目的，不以任何方式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例實(shí)施例1篩選TGF- β信號(hào)的抑制劑本申請(qǐng)人選取目前已在臨床使用的幾十種小分子化合物，通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因活性分析的方法篩選能抑制TGF-β信號(hào)的化合物。實(shí)驗(yàn)材料小鼠AML12肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)。TGF-β 1 蛋白購(gòu)自美國(guó) R&D 系統(tǒng)公司(R&D Systems, USA)。
熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)采用美國(guó)普洛麥格公司(Promega)出產(chǎn)的雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(Dual Luciferase Reporter Gene Assay System)。報(bào)告基因(CAGA) 12-Lux 由清華大學(xué)陳曄光教授饋贈(zèng)。質(zhì)粒pRL-SV40 購(gòu)自美國(guó)普洛麥格公司(ftOmega)。脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine Plus/Reagent)試劑盒購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogen)。實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)述1. AML12 細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine Plus/Reagent)試劑盒向M孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同組合的質(zhì)粒。以AML12細(xì)胞為例，每孔約含5X IO4個(gè)細(xì)胞，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量約為200ng。每孔包含200叫的16 -3報(bào)告基因(CAGA) 12-Lux、5ng的內(nèi)參報(bào)告基因 PRL-SV40。每個(gè)樣品重復(fù)3次，轉(zhuǎn)染24h后換成無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，并加入終濃度為5ng/ ml TGF- β 1和終濃度為5 μ M的待測(cè)小分子化合物，37攝氏度培養(yǎng)他。2.報(bào)告基因表達(dá)活性的檢測(cè)24孔板細(xì)胞使用PBS緩沖液洗2次。加入100 μ 11 X被動(dòng)passive)裂解緩沖液，在室溫下裂解細(xì)胞15min，不時(shí)搖晃使細(xì)胞從培養(yǎng)板上脫落下來(lái)。收集裂解液后用離心機(jī)以12000rpm離心30s，取上清部分進(jìn)行螢光素酶活性測(cè)定。取樣量一般為10μ 1，先測(cè)定目標(biāo)報(bào)告基因的活性(即螢火蟲(chóng)螢光素酶的活性)，然后測(cè)定內(nèi)參報(bào)告基因Renila(即海腎螢光素酶)的活性。兩種酶活測(cè)定時(shí)底物的用量均為17μ1。3.數(shù)據(jù)處理目標(biāo)報(bào)告基因的相對(duì)活性=目標(biāo)報(bào)告基因活性測(cè)量值/內(nèi)參報(bào)告基因活性測(cè)量值，即螢火蟲(chóng)螢光素酶/海腎螢光素酶。對(duì)每組實(shí)驗(yàn)三次重復(fù)后所記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，并利用學(xué)生氏t檢驗(yàn)(Mudent’ s t-test)對(duì)每組數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。*，P < 0.05，顯著差異；**，p < 0.01，極顯著差異。通過(guò)檢測(cè)索拉非尼、厄洛替尼、吉非替尼、達(dá)布非龍、塞來(lái)昔布等幾十種小分子藥物對(duì)TGF-β信號(hào)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗癌藥物索拉非尼能明顯抑制TGF-β信號(hào)(圖1Α)。實(shí)施例2索拉非尼是對(duì)TGF- β信號(hào)的抑制作用在篩選到索拉非尼后，本申請(qǐng)人研究了索拉非尼對(duì)TGF-β信號(hào)抑制效應(yīng)的量效關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)材料和方法同實(shí)施例1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在5ng/ml TGF- β 1的刺激下，索拉非尼對(duì)TGF- β信號(hào)有較強(qiáng)的抑制作用，且這種抑制作用呈劑量依賴性(圖1Β)。另外，本發(fā)明人還通過(guò)Western印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別測(cè)定索拉非尼對(duì) TGF-β 1下游分子Smad2的磷酸化水平和TGF-β 1通路的靶基因Smad7的mRNA水平的影響。實(shí)驗(yàn)材料p_Smad2/3和Smad2抗體購(gòu)自美國(guó)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司(CellSignaling Technology)。β -肌動(dòng)蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich)。
RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自加拿大富酶泰斯公司O^ermentas)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自加拿大富酶泰斯公司(i^ermentas)。引物均由上海生工生物工程公司合成。實(shí)驗(yàn)方法LWestern 印跡法用5ng/ml TGF-β 1和不同濃度的索拉非尼處理AML12細(xì)胞。48h后，細(xì)胞用PBS緩沖液洗滌二次，向60mm平皿內(nèi)加入Iml細(xì)胞裂解液(50mMTris_Cl pH = 7. 5，150mM NaCl, 2mM EDTA pH 8. 0,0. 5% Nonidet P-40及蛋白酶抑制劑)，置于冰上裂解lOmin。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到EP管內(nèi)，12000rpm離心lOmin，取上清，100°C煮lOmin。樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用p-Smad2/3和Smad2抗體檢測(cè)目的蛋白。用ECL顯色底物顯色，暗房?jī)?nèi)X光片壓片曝光，經(jīng)顯影和定影后保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2.實(shí)時(shí)熒光定量PCRAML12細(xì)胞經(jīng)5ng/ml TGF- β 1和5 μ M索拉非尼處理24h后提取細(xì)胞總RNA。細(xì)胞總RNA提取的方法見(jiàn)《分子克隆手冊(cè)(第二版)》。使用富酶泰斯公司(MBI)的RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作。以1/20體積的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為模板進(jìn)行目的基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中常用的內(nèi)參基因是β-肌動(dòng)蛋白， β-肌動(dòng)蛋白的引物序列為正向5' -TGAGCGCAAGTACTCTGTGTGGAT-3，(SEQ ID NO 1)； 反向5 ‘ -TAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG-3，(SEQ ID NO :2)。Smad7 引物序列為正向 5，-TCCTGCTGTGCAAAGTGTTC-3，(SEQ ID NO 3)；反向5，-AGTAAGGAGGAGGGGGAGAC-3，(SEQ ID NO 4)。結(jié)果證明，TGF-β 1處理細(xì)胞后能引起下游分子Smad2蛋白的磷酸化，而索拉非尼能明顯抑制下游分子Smad2蛋白的磷酸化水平(圖1C)。此外，索拉非尼還能抑制TGF-β 信號(hào)的靶基因Smad7mRNA水平(圖1D)。這些進(jìn)一步證明小分子藥物索拉非尼是TGF-β信號(hào)的抑制劑。實(shí)施例3.索拉非尼抑制TGF- β誘導(dǎo)的細(xì)胞EMT過(guò)程在本實(shí)施例中，本發(fā)明人利用TGF-β 1誘導(dǎo)AML12細(xì)胞發(fā)生EMT的細(xì)胞模型驗(yàn)證索拉非尼對(duì)細(xì)胞EMT過(guò)程的影響。實(shí)驗(yàn)材料E-鈣粘著蛋白(E-cadherin)抗體購(gòu)自美國(guó)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司；纖連蛋白(fibronectin)抗體和β -肌動(dòng)蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)西格瑪奧德里奇公司；ZO-I抗體購(gòu)自美國(guó)英杰公司(Invitrogen)；波形蛋白(vimentin)抗體購(gòu)自美國(guó)圣克魯茲生物技術(shù)公司(Santa Cruz Biotechnology)。實(shí)驗(yàn)方法=Western印跡法見(jiàn)實(shí)施例2。我們建立了 TGF-β 1誘導(dǎo)AML 12細(xì)胞發(fā)生EMT的細(xì)胞模型。在5ng/mlTGF_ β 1 的刺激下，小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞系A(chǔ)ML12發(fā)生了明顯的形態(tài)變化AML12細(xì)胞喪失其上皮細(xì)胞形態(tài)和特征，同時(shí)獲得間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和特征。另外，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度(1、5、10 和20μΜ)的索拉非尼后，用5ng/ml的TGF-β 1處理細(xì)胞。結(jié)果顯示，48小時(shí)后，10 μ M索拉非尼能顯著抑制TGF-β 1誘導(dǎo)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的EMT過(guò)程。這種抑制效果具有濃度依賴效應(yīng)，即隨著索拉非尼濃度的增加，抑制EMT的效果也越明顯(圖2Α)。在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的EMT過(guò)程中，除了細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化之外，多個(gè)標(biāo)志基因的表達(dá)也發(fā)生了顯著的變化。例如，TGF-β 1刺激AML12細(xì)胞48小時(shí)后，上皮細(xì)胞標(biāo)志物 E-鈣粘著蛋白和ZO-I蛋白的表達(dá)明顯減少，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物纖連蛋白和波形蛋白的表達(dá)明顯增加(圖2Β)。在TGF-β 1刺激AML12細(xì)胞的情況下，再加入一定濃度的索拉非尼，AML12細(xì)胞的E-鈣粘著蛋白和ZO-I蛋白的表達(dá)就會(huì)增加，而纖連蛋白和波形蛋白的表達(dá)相應(yīng)減少(圖2Β)。另外，索拉非尼對(duì)AML12細(xì)胞EMT過(guò)程的抑制作用還具有時(shí)間依賴性。用索拉非尼分別處理細(xì)胞M小時(shí)和48小時(shí)后，無(wú)論從細(xì)胞形態(tài)還是標(biāo)志基因的表達(dá)上，我們都能發(fā)現(xiàn)索拉非尼能有效抑制TGF- β信號(hào)誘導(dǎo)的細(xì)胞EMT過(guò)程(圖2C和2D)。實(shí)施例4.索拉非尼抑制TGF- β 1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡本發(fā)明人利用DNA梯法、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法來(lái)檢測(cè)索拉非尼對(duì)TGF-β 1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用。實(shí)驗(yàn)材料膜聯(lián)蛋白V(AnneXin V)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)拜維申公司 (Biovision)。實(shí)驗(yàn)方法1.流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡用5ng/ml的TGF-β 1和不同濃度的索拉非尼處理AML12細(xì)胞48小時(shí)，之后離心收集細(xì)胞，使用美國(guó)拜維申公司的膜聯(lián)蛋白V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色操作。操作完成后，樣品送中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所分子生物學(xué)平臺(tái)分析并統(tǒng)計(jì)。2.凋亡細(xì)胞的DNA片斷化檢測(cè)(DNA梯)在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入5ng/ml的TGF-β 1和不同濃度的索拉非尼，混勻后加入6 孔板中培養(yǎng)AML12細(xì)胞。48小時(shí)后，離心收取懸浮的凋亡細(xì)胞，連同貼壁的細(xì)胞一起加入 500 μ 1 的細(xì)胞裂解液(含 IOmM Tris-Cl (ρΗ 8. 0), 25mM EDTA(pH 8.0)，0· 25% 曲通 (Triton) X-IOO 和 5mg/ml RNA 酶 A)。放于冰上靜止 30min, 12000g 離心 15min。上清中加入蛋白酶K(2. 5mg/ml)56°C孵育過(guò)夜。次日，加入1/10體積3M醋酸鈉和2. 5倍體積的冷無(wú)水乙醇沉淀DNA。12000g離心15min后將沉淀的DNA溶解在水中，1. 2%瓊脂糖凝膠電泳分析，EB染色并照相。結(jié)果TGF_i3信號(hào)除了誘導(dǎo)AML12細(xì)胞發(fā)生EMT之外，還可誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞凋亡。通過(guò)流式細(xì)胞儀統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡的數(shù)量，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β 1可以促使約60%的細(xì)胞發(fā)生凋亡， 而在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)加入索拉非尼后，細(xì)胞凋亡的數(shù)量明顯減少。在ΙΟμΜ索拉非尼的作用下， 僅有約5%的細(xì)胞發(fā)生凋亡，這與空白對(duì)照組基本相同(圖3Α)。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的核固縮，并呈現(xiàn)碎片狀。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，可觀察到180-200bp整數(shù)倍的DNA片段，呈現(xiàn)階梯狀的DNA梯。用1 μ M索拉非尼處理后，DNA片段數(shù)減少；5 μ M和10 μ M索拉非尼處理后，DNA片段消失(圖，這說(shuō)明索拉非尼處理后細(xì)胞發(fā)生凋亡的數(shù)量明顯減少。
至此，我們通過(guò)多種檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法，發(fā)現(xiàn)小分子藥物索拉非尼抑制TGF-β 所引起的細(xì)胞凋亡，且在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)即索拉非尼的濃度越高，抑制細(xì)胞凋亡的效果越明顯。實(shí)施例5.索拉非尼抑制STAT3蛋白的磷酸化水平本發(fā)明人分別利用Western印跡法和免疫熒光的方法來(lái)驗(yàn)證索拉非尼對(duì)STAT3蛋白的磷酸化水平的抑制作用和對(duì)STAT3蛋白亞細(xì)胞定位的影響。實(shí)驗(yàn)材料p-STAT3 (Tyr7tl5)和STAT3抗體購(gòu)自美國(guó)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司；β-肌動(dòng)蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)西格瑪奧德里奇公司。實(shí)驗(yàn)方法1. Western印跡法見(jiàn)實(shí)施例2。2.細(xì)胞免疫熒光將AML12細(xì)胞鋪在蓋玻片上，長(zhǎng)到一定密度后取出蓋玻片，用PBS洗二次。選用 4%甲醛溶液或4%多聚甲醛固定細(xì)胞20min后，用PBS洗二次。用1%。曲通X-100通透處理細(xì)胞5min，通透后用PBS洗二次。10% BSA封閉60min。加入含STAT3抗體的一抗稀釋液(1 1000)，室溫孵育濁或者4°C過(guò)夜。PBST漂洗3次，每次5min。之后，加入FITC耦連的熒光二抗稀釋液(1 1000)，室溫孵育lh，注意避光。PBST漂洗3次，每次5min。最后加入DAPI稀釋液孵育lmin，并用蒸餾水漂洗。封片后，熒光顯微鏡觀察STAT3蛋白的亞細(xì)胞定位。結(jié)果在TGF-β 1誘導(dǎo)小鼠AML12細(xì)胞發(fā)生EMT和細(xì)胞凋亡過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子STAT3的磷酸化水平也隨之增加。即使在低濃度(例如lng/ml)的TGF-β 1刺激下， 在短時(shí)間(例如2小時(shí))內(nèi)，STAT3的磷酸化水平明顯增加(圖4Α和4Β)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)加入索拉非尼后，STAT3的磷酸化水平被抑制了(圖4C)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)索拉非尼還干擾轉(zhuǎn)錄因子STAT3的亞細(xì)胞定位。在正常情況下，作為轉(zhuǎn)錄因子的STAT3位于細(xì)胞核內(nèi)，起使基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能。細(xì)胞經(jīng)索拉非尼處理后，STAT3蛋白的亞細(xì)胞定位發(fā)生了改變絕大多數(shù)的STAT3蛋白位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)?？紤]到STAT3是細(xì)胞發(fā)生EMT的關(guān)鍵因子，結(jié)合之前的發(fā)現(xiàn)(圖2和圖3)，我們認(rèn)為正是由于索拉非尼促使轉(zhuǎn)錄因子STAT3從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的定位，從而阻止了 STAT3的轉(zhuǎn)錄功能，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的EMT過(guò)程。實(shí)施例6.索拉非尼抑制小鼠原代肝細(xì)胞的EMT過(guò)程本發(fā)明人通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因活性分析的方法來(lái)驗(yàn)證索拉非尼對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞EMT過(guò)程的影響。實(shí)驗(yàn)材料C57BL/6小鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；IV型膠原酶和α -SMA抗體購(gòu)自美國(guó)西格瑪奧德里奇公司；其余實(shí)驗(yàn)材料見(jiàn)實(shí)施例2。實(shí)驗(yàn)方法1.報(bào)告基因表達(dá)活性的檢測(cè)見(jiàn)實(shí)施例1。2. Western印跡法見(jiàn)實(shí)施例2。3.細(xì)胞免疫熒光見(jiàn)實(shí)施例5。
13
4.小鼠原代肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng)取C57BL/6小鼠，采用戊巴比妥鈉(100mg/kg)麻醉；打開(kāi)小鼠腹腔，向左側(cè)移開(kāi)小腸，暴露下腔靜脈和門(mén)靜脈，用21號(hào)套管針從下腔靜脈傳入，直至接近肝靜脈；采用含有 ImM EGTA和0. 1 %葡萄糖的緩沖液灌注肝臟，同時(shí)迅速切斷門(mén)靜脈使灌注液從門(mén)靜脈流出， 灌注速度為^il/min ；灌注20ml后更換含有0. 5mg/ml IV型膠原酶和5mM CaCl2的灌注液繼續(xù)灌注lOmin，立刻小心取出肝臟，置于含有緩沖液的IOmM培養(yǎng)皿中，用剪刀剪開(kāi)肝臟包膜，輕輕晃動(dòng)使肝細(xì)胞釋放出來(lái)；采用70 μ m的細(xì)胞濾器過(guò)濾；使用IOml的DMEM洗滌細(xì)胞 2次，SOOrpm離心后收取肝細(xì)胞。分離后的肝細(xì)胞立刻用4%臺(tái)盼藍(lán)染色，在顯微鏡下觀察， 核呈藍(lán)色為死細(xì)胞，拒染的細(xì)胞為活細(xì)胞，將細(xì)胞接種于膠原包被的12孔培養(yǎng)皿中，采用含有10%胎牛血清，100u/ml青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在5% C02，37°C培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小鼠原代肝細(xì)胞中，索拉非尼同樣能夠顯著抑制TGF-β信號(hào)(圖 5A)。通過(guò)western印跡和免疫熒光的方法，我們也發(fā)現(xiàn)索拉非尼還能抑制TGF-β誘導(dǎo)的 EMT過(guò)程中標(biāo)志性基因的表達(dá)變化(圖5Β和5C)。這就說(shuō)明索拉非尼不但能夠抑制AML12 細(xì)胞系的TGF-β信號(hào)和EMT過(guò)程，而且對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞也有同樣的效應(yīng)。實(shí)施例7.索拉非尼對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的治療效果本發(fā)明人通過(guò)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的動(dòng)物模型來(lái)驗(yàn)證索拉非尼對(duì)肝纖維化的療效。實(shí)驗(yàn)材料C57BL/6小鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。建模方法為了進(jìn)一步研究索拉非尼治療肝纖維化的可能性，本申請(qǐng)人建立了 CCl4S導(dǎo)的小鼠肝纖維化的動(dòng)物模型。即選取合適小鼠作為模型組，每周二次腹腔注射50%的CCl4/橄欖油溶液。二周后，模型組的小鼠在接受腹腔注射CCl4的基礎(chǔ)上，每日通過(guò)強(qiáng)飼法接受一定劑量的藥物載體(DMS0，作為安慰劑)。8周后，選取小鼠肝臟標(biāo)本，切片后進(jìn)行H&E染色和天狼星紅染色，檢測(cè)肝臟膠原密度。實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)組的小鼠在接受腹腔注射CCl4的基礎(chǔ)上，每日通過(guò)強(qiáng)飼法接受一定劑量 (4mg/kg)的索拉非尼。在這種劑量下，藥物索拉非尼并不影響小鼠的存活和體重等生理指標(biāo)(表1)。表1小分子藥物索拉非尼不影響小鼠的存活和體重等生理指標(biāo)
權(quán)利要求
1.索拉非尼或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療TGF-β介導(dǎo)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疾病是TGF-β和STAT3介導(dǎo)的疾病。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疾病是EMT介導(dǎo)的疾病。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疾病是纖維化病。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述纖維化病是肝纖維化或肺纖維化。
6.一種用索拉非尼或其鹽在體外抑制TGF-β的方法。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法還能在體外抑制STAT3。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法還能在體外抑制EMT進(jìn)程。
9.一種篩選治療肝纖維化或肺纖維化的藥物的方法，所述方法包括將待篩藥物與 TGF-β相接觸和測(cè)定TGF-β活性的步驟，如果接觸后TGF-β活性降低將該待篩藥物鑒定為治療肝纖維化或肺纖維化的藥物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述測(cè)定TGF-β活性的步驟是利用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)在細(xì)胞水平上進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明涉及索拉非尼的一種新用途，具體涉及索拉非尼在治療TGF-β介導(dǎo)的疾病中的應(yīng)用，更具體涉及索拉非尼在治療纖維化病中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供索拉非尼或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療TGF-β介導(dǎo)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/44GK102406641SQ20101028864
公開(kāi)日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2010年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月20日
發(fā)明者丁小燕, 劉平, 劉成海, 孫明瑜, 徐沁, 楊科, 陳躍磊 申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院, 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院