專利名稱：一種抑制新生血管生成的融合多肽及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血管新生的抑制肽(蛋白)，該多肽的編碼基因，以及該多肽在治 療新生血管增生異常的疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
一般血管生成(angiogenesis)分為病理的與正常的。正常的如胚胎發(fā)育期間 除主動(dòng)脈、主靜脈以外的器官發(fā)育都涉及到血管形成，以維持形成器官的各類細(xì)胞的養(yǎng) 分、氧氣的供給，使之不因?yàn)轲B(yǎng)料不足或氧氣不足而發(fā)生壞死。這樣的情況還見諸于懷孕 (pregnancy)、傷口愈合等。另一類angiogenesis指的是病理的，比如動(dòng)脈粥樣硬化、實(shí)體腫瘤等。實(shí)體腫瘤 從某種意義上也可以認(rèn)為是一種器官發(fā)育，只是這種“器官發(fā)育”是有害的，失去控制的，無 法逆轉(zhuǎn)的。實(shí)體腫瘤在早期并不形成血管，在細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，往往只有極少數(shù)可以頑強(qiáng)的 存活下來，而大部分癌細(xì)胞早期都已被免疫系統(tǒng)或者因?yàn)樽陨淼牟环€(wěn)定性以及代謝方面的 障礙而很快被消滅或壞死。但癌細(xì)胞一旦存活下來，為了適應(yīng)機(jī)體復(fù)雜的環(huán)境，需要對(duì)自身 基因組進(jìn)行調(diào)整。如癌細(xì)胞表面的凋亡受體缺失時(shí)，癌細(xì)胞將變得對(duì)營養(yǎng)條件不敏感，因其 生長(zhǎng)因子受體等已經(jīng)可以自我激活，可以適應(yīng)對(duì)苛刻條件的耐受等。這么一個(gè)過程在臨床 上被認(rèn)為是潛伏期(dormancy)，甚至無法通過臨床的手段進(jìn)行監(jiān)測(cè)。而癌細(xì)胞一旦經(jīng)過這 個(gè)過程，將變得無法抑制，表現(xiàn)為癌細(xì)胞群體的幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)。腫瘤生長(zhǎng)到Icm3時(shí)(這時(shí) 大概有IO12個(gè)癌細(xì)胞)，如果沒有血管來供給養(yǎng)分與氧氣，癌細(xì)胞最終會(huì)走向壞死。但大部 分癌細(xì)胞都能突破這個(gè)極限！也就在這個(gè)數(shù)目(約IO12個(gè)癌細(xì)胞)下，癌細(xì)胞群體開始分 泌生長(zhǎng)因子與各類蛋白酶，為血管的形成準(zhǔn)備充分條件。血管的主要成分中，單純的血管腔主要是基質(zhì)組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，起支架作用；在血 管腔外部附著的細(xì)胞叫外皮細(xì)胞(mural cells)，而貼在內(nèi)側(cè)的叫內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells)0血管的各個(gè)成分來源于骨髓里的干細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞與外皮細(xì)胞都由同樣的祖先分 化而來(coomon precursors)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF主要使祖先細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞， 而血小板衍生生長(zhǎng)因子PDGF則使祖先細(xì)胞分化為外皮細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞還分為動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì) 胞與靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，這種命運(yùn)的決定是由Notch信號(hào)通路決定的。形成血管還需要其他的輔助細(xì)胞，比如巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、 中心粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞，通過這些免疫細(xì)胞的參與來檢測(cè)或抗衡生長(zhǎng)因子的作 用以及進(jìn)行免疫監(jiān)視，使得不正常的發(fā)育受到即時(shí)調(diào)控。但腫瘤組織作為失去平衡的一種 器官發(fā)育，免疫細(xì)胞已經(jīng)被腫瘤細(xì)胞分泌的各種因子教育過，而轉(zhuǎn)而為腫瘤細(xì)胞服務(wù)了，不 但表現(xiàn)為抗腫瘤免疫能力降低，反而還分泌很多金屬基質(zhì)蛋白酶來使腫瘤細(xì)胞周圍的組織 發(fā)生降解，為腫瘤的遷移做打掃道路的作用。同時(shí)，由于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，各方面調(diào)節(jié)來 不及有效平衡，使得腫瘤組織的血管常常是沒有足夠多的外皮細(xì)胞來限制血管腔，血管腔 通透性很差，經(jīng)常發(fā)生出血。這種出血現(xiàn)象如果嚴(yán)重的話，常會(huì)在大小便中顯示，表明已到癌的晚期，再施救已經(jīng)來不及了。腫瘤血管的形成中，內(nèi)皮細(xì)胞扮演了很重要的角色。癌細(xì)胞會(huì)分泌VEGF、成纖維細(xì) 胞生長(zhǎng)因子FGF等生長(zhǎng)因子，使得骨髓中內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞，而內(nèi)皮細(xì)胞由于表 面的各種黏附分子，常?？梢砸粋€(gè)一個(gè)黏附在一起，并可以牢牢的黏附在血管腔上。同時(shí)腫 瘤組織里的巨噬細(xì)胞分泌各種蛋白酶，主要是金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)，使血管腔發(fā)生滲漏， 為毛細(xì)血管的形成準(zhǔn)備條件。毛細(xì)血管只有在現(xiàn)有血管的基礎(chǔ)上才能形成。鑒于大約一半的腫瘤都是實(shí)體腫瘤且都能形成血管，并且臨床也顯示抗血管增生 類藥物可以顯著提高患者的生命時(shí)間或改善生活質(zhì)量?？鼓[瘤血管治療因此而具有非常深 刻而廣泛的意義。因此，靶向性作用腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞為腫瘤治療提供了新的思路，具有 看好的臨床前景。自Folkman提出抑制腫 瘤血管可以治療腫瘤的假說以來(N Engl J Med, 1971, 285:1182-1186.)，許多具有抗血管生成作用的物質(zhì)相繼被發(fā)現(xiàn)，其中尤以內(nèi)源性血管生成 因子備受人們的重視。Angiostatin (AS，血管生長(zhǎng)抑素)是纖溶酶原的一個(gè)蛋白片段，分子量38kD，是一 個(gè)較強(qiáng)的血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖抑制劑(Cell，1994，79 =315-328) 0 Angiostatin 包括纖溶酶原(本身含有5個(gè)kringles結(jié)構(gòu))的第1 4kringleS結(jié)構(gòu)，這4個(gè)kringles 結(jié)構(gòu)具有很高的同源性(J Bio Chem, 1996,271 =29461-29467) Angiostatin的抑制血管 生成活性主要通過kringlesl 3來完成，在kringlesl 3片段中kringle 1、3的活性 大于kringle 2的活性。系統(tǒng)地運(yùn)用Angiostatin能阻斷裸鼠移植瘤的血管生成和腫瘤轉(zhuǎn) 移。研究表明不同類型的腫瘤以相同的或完全不同的方法產(chǎn)生Angiostatin，一種類型腫瘤 也可有多種機(jī)制產(chǎn)生AS。Lewis肺癌細(xì)胞依賴巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)產(chǎn)生 Angiostatin。實(shí)驗(yàn)證明巨噬細(xì)胞MMP (或MMP12)是最有效的產(chǎn)生Angiostatin的MMP。研究 表明，腫瘤細(xì)胞能直接產(chǎn)生Angiostatin或與腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞協(xié)同產(chǎn)生Angiostatin。 機(jī)體在缺乏實(shí)體瘤的情況下也可產(chǎn)生Angiostatin。Angiostatin的抗血管生成活性可能 具有種屬特異性。用人AS治療鼠血管瘤，發(fā)現(xiàn)AS也明顯抑制了原發(fā)的非轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)，這 種抑制作用是通過誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡而實(shí)現(xiàn)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增生并無抑制，AS通過多種 形式誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。End0Statin(恩度，內(nèi)皮生長(zhǎng)抑素)分子量約為18kD，由184個(gè)氨基酸殘基構(gòu) 成。作為膠原蛋白18的球形羧基末端的一部分，Endostatin有著廣泛的組織分布，其中 肝細(xì)胞也是其來源之一。Endostatin最主要的生物學(xué)功能是抑制內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、移動(dòng) 及生血管作用。Endostatin作為內(nèi)源性的抗血管生成活性物質(zhì)，可以抑制Lewis肺癌細(xì) 胞、T241纖維肉瘤細(xì)胞及EOMA細(xì)胞在腫瘤移植動(dòng)物體內(nèi)的生長(zhǎng)。其對(duì)實(shí)體腫瘤的抑制作 用機(jī)理較復(fù)雜，已知Zn2+在Thl細(xì)胞的影響下可以激活內(nèi)源性Endostatin抑制腫瘤的生 長(zhǎng)，并可明顯抑制VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和移動(dòng)，對(duì)VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞移動(dòng)產(chǎn)生多步 驟的抑制。PhanabalM等報(bào)道Endostatin可使內(nèi)皮細(xì)胞停留在細(xì)胞生長(zhǎng)周期的Gl期，并 可引起人HUVEC及人HMVEC細(xì)胞的凋亡，對(duì)非內(nèi)皮細(xì)胞無此作用(J Bio Chem. 1999,274 11721-11726)。Endostatin可引起牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并導(dǎo)致bcl-2基因及Bcl2-xl抗 凋亡蛋白表達(dá)水平的明顯下降但對(duì)Bax蛋白無顯著影響，提示Endostatin可通過誘使內(nèi)皮 細(xì)胞發(fā)生凋亡來抑制新生血管生長(zhǎng)。Endostatin可能通過結(jié)合參與細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞外生長(zhǎng)因子受體而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)內(nèi)傳，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與移動(dòng)，而 發(fā)揮強(qiáng)效的抗腫瘤血管生成作用。早年，通過篩選研究者發(fā)現(xiàn)一個(gè)人工十肽在抑制基質(zhì)金屬蛋白酶方面有效，并在 小鼠腫瘤模型中顯示出治療效果?；趪鴥?nèi)外大量關(guān)于抗腫瘤血管形成和癌細(xì)胞遷移的理論與應(yīng)用研究的基礎(chǔ)上， 我們?cè)O(shè)計(jì)和研制出既能抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，又能有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的雙靶點(diǎn)抗腫瘤 多肽(參見中國專利ZL 200410006549.8)。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明設(shè)計(jì)出更強(qiáng)效的三靶點(diǎn)抗 腫瘤多肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人工合成的融合多肽(蛋白)及其編碼基因，該融合多 肽具有抑制新生血管生成的作用，進(jìn)一步的，利用該融合多肽來治療新生血管增生異常的 疾病，如類風(fēng)濕，二型糖尿病引發(fā)的視網(wǎng)膜充血，以及腫瘤等。在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明所提供的抑制 新生血管生成的多肽，命名為MEK，是 具有序列表中SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的多肽。SEQ ID No. 2所示氨基酸序列多肽由125個(gè)氨基酸殘基組成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員 應(yīng)當(dāng)理解，將SEQ ID No. 2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而 衍生的多肽，在不涉及關(guān)鍵位點(diǎn)的情況下，可具有與SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的多肽相 同或相近的活性。因此，本發(fā)明的抑制新生血管生成的多肽也包括此類衍生多肽，而不局限 于SEQID No. 2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的抑制新生血管生成的多肽MEK是一個(gè)三靶點(diǎn)多肽，具有如下排列十肽-endo 的前 25 肽-kringle 5其中十肽，是靶向性抑制金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP2/MMP9)的活性肽；endo的前25 肽，是來源于恩度(endostatin)基因編碼的蛋白序列的前25個(gè)氨基酸殘基，此25個(gè)氨基 酸殘基具有全長(zhǎng)恩度的功效；kringle 5(簡(jiǎn)稱k5)是來源于angiostatin的第五個(gè)結(jié)構(gòu) 域，是angiostatin最具活力的結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明還提供了上述多肽的編碼基因，可以是序列表中SEQ IDNo. 2所示的多核苷酸，也可以是其他的編碼相同多肽的多核苷酸。序列表中SEQ ID No. 1所示的多核苷酸由375個(gè)堿基組成，編碼SEQ ID No. 2所 示的融合多肽。含有本發(fā)明多肽的編碼基因的表達(dá)載體及細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的多肽MEK是將三個(gè)高活性的特異性作用內(nèi)皮細(xì)胞的分子用基因工程手 段整合在一起，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，相比于我們較早得到的雙靶點(diǎn)基因工程重組蛋白R(shí)K5，，該多 肽可以更有效的抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，進(jìn)而抑制新生血管的生成。因此，MEK可應(yīng)用 于制備治療由新生血管增生異常產(chǎn)生的疾病的藥物，如用于治療類風(fēng)濕、二型糖尿病引發(fā) 的視網(wǎng)膜充血、腫瘤等。在腫瘤治療中，可以更有效的抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，為腫瘤治療 增加了更高效的新藥。


圖1是實(shí)施例1提純的MEK融合多肽的電泳圖譜。圖2是實(shí)施例2中MEK對(duì)細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)的結(jié)果。圖3是實(shí)施例3中MEK對(duì)細(xì)胞遷移抑制試驗(yàn)的結(jié)果。圖4是實(shí)施例4中在光學(xué)顯微鏡下觀察到的未長(zhǎng)微細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，其中 A是未經(jīng)染色的圖像，B是結(jié)晶紫染色后的圖像。圖5是實(shí)施例4中對(duì)生長(zhǎng)出的毛細(xì)血管用不同蛋白(RK5和MEK)處理前后的對(duì)照?qǐng)D。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1、融合多肽MEK的表達(dá)1、融和多肽(蛋白)的設(shè)計(jì)將一個(gè)抑制金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP2或MMP9)十肽，endostatin的前25肽以及 angiostatin的k5序列，按照順序十肽-25肽-K5連在一起，形成了 MEK的融合序列，如序 列表中SEQID No. 2所示，其中最前端的10個(gè)氨基酸殘基(CTTHWGFTLC)組成的是抑制金 屬基質(zhì)蛋白酶MMP2/9的活性小肽；接下來的25個(gè)氨基酸殘基組成的是endostatin的前25 肽；隨后的9個(gè)氨基酸殘基(ERETPSEED)是連接肽序列；最后的81個(gè)氨基酸殘基組成的是 angiostatin 白勺 k52、融合多肽表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)下述引物引物 1 :5’ -CTCGAGAAAAGATGTACAACTCACTGGGGTTTCACACTTTGCCACAGCCACCGCGACTT C-3’(下劃線部分是Xhol的酶切位點(diǎn))；引物 2 :5，-TTCGGAAGGAGTCTCTCTTTCGCCCCGCATGCCGCCTGACAG-3，；引物 3 :5’ -CTGTCAGGCGGCATGCGGGGCGAAAGAGAGACTCCTTCCGAA-3’ ；引物 4 5，-GAATTCTCAGGCACACTGAGGGACATC-3，(下劃線部分是 EcoRI 的酶切位 點(diǎn))o以引物1為上游引物，引物2為下游引物，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)(北大醫(yī)院 腫瘤研究所贈(zèng)與)的cDNA為模板PCR得到十肽-25肽融合片段的基因序列。以引物3為上 游引物，引物4為下游引物，質(zhì)粒pPIC9K-RK5 (本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，構(gòu)建過程參見中國專 利ZL200410006549. 8說明書實(shí)施例1部分)為模板PCR得到連接肽和k5結(jié)構(gòu)域融合片段 的基因序列。將兩個(gè)PCR的產(chǎn)物混合在一起作為模板，以引物1為上游引物，引物4為下游 引物再次PCR獲得編碼全長(zhǎng)三靶點(diǎn)融合多肽的DNA片段，將該DNA片段連入T載體(購自 北京Genestar公司)并轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，然后提取質(zhì)粒用Xhol和EcoRI雙酶切將編碼 三靶點(diǎn)融合多肽的核酸片段切下，與同樣用Xhol和EcoRI酶切的高效表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K (購 自美國Invitrogen公司)進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K_MEK。通過上述基因工程方法將編碼十肽-25肽_k5核苷酸序列融合在一起，形成的融 合核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示。所得到的重組質(zhì)粒PPIC9K-MEK通過基因測(cè) 序鑒定，確定其序列的正確性。3、融合多肽的生產(chǎn)
將重組質(zhì)粒pPIC9K-MEK轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞GS115(畢赤酵母菌，購自Invitrogen公 司)。轉(zhuǎn)染后篩選能穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白MEK的克隆株。將這樣的菌株收藏保存作為MEK的 生產(chǎn)菌株。將篩選得到的轉(zhuǎn)化子分別接種于200mL BMGY(甘油培養(yǎng)基)液體培養(yǎng)基中，30°C 振蕩培養(yǎng)至0D600為2.0以上。無菌狀態(tài)下收集菌液，6000r/min離心6min，去上清，用 60mLBMMY(甲醇培養(yǎng)基)酵母培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，30°C，振蕩培養(yǎng)4天，每天在培養(yǎng)液中加入終 濃度為的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。發(fā)酵液5000g離心收集上清，加入硫酸氨至終濃度為85 %進(jìn)行硫酸氨沉淀， 10000g離心收集沉淀。沉淀物重懸于50ml 0. 05M PBS(pH 7. 4，含1. 7M硫酸氨)，上疏水 柱 Phenyls印harose 6Fast Flow (15 X 60mm)，用 0. 05M PBS (pH 7.4)洗脫，收集。洗脫液 在0.05M PBS (pH 8)中透析，然后上離子交換柱DEAE S印harose Fast Flow column。用
0.05M PBS (pH 8，with 1M NaCl)洗脫，收集，15% SDS-PAGE鑒定，考馬斯亮藍(lán)染色。鑒定 結(jié)果如圖1所示，其中最左側(cè)的泳道是分子量標(biāo)記物，每個(gè)泳道的蛋白染色代表相應(yīng)收集 管中蛋白的純度。實(shí)施例2、MEK對(duì)細(xì)胞增殖抑制的試驗(yàn)HUVEC是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞，該細(xì)胞是公認(rèn)的用于抑制血管生成的研究材料。本試 驗(yàn)使用的材料內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)為新生兒臍帶分離，10代以內(nèi)，北大醫(yī)院腫瘤研究所贈(zèng) 與；MTT購自sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)液來自GIBC0公司；小牛血清來自GIBC0公司方法內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC在M199，20% FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的細(xì)胞按
1.2 X 105個(gè)均等轉(zhuǎn)移至12孔細(xì)胞板中，每孔1ml培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天，加入不同濃度的k5、RK5、 MEK(濃度分別為 0. 125ii g/ml、0. 25y g/ml、0. 75 y g/ml、1. 5 y g/ml)，處理 72 小時(shí)后每孔 加入50ml MTT(5ug/ml)作用4小時(shí)。然后吸干培養(yǎng)基加入1. 6ml無水乙醇，570nm檢測(cè)紫 外吸收。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出在0.25118-1.5118濃度下，1^1(具有很好 的抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力。實(shí)施例3、MEK對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制的試驗(yàn)材料內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)為新生兒臍帶分離，24孔懸掛式Transwell遷移小室 購自Millipore公司，matrigel基質(zhì)膠購自BD公司，結(jié)晶紫購自Merk公司，bFGF、VEGF購 自sigma公司。方法將matrigel基質(zhì)膠4°C融化后，按照1 3 (matrigel基質(zhì)膠無血清M199) 的體積比用無血清的M199稀釋，上室加入50 yg稀釋后的基質(zhì)膠。過夜凝固，上室用3% FBS 的 M199 接種 2 X 105 個(gè)細(xì)胞，下室加入含 20 % FBS 的 M199，60ng/ml VEGF, 60ng/ml bFGF, 并在下室加入蛋白，遷移72小時(shí)內(nèi)，用4%甲醛固定20分鐘后，用去離子水溶解的0. 結(jié) 晶紫染色，充分用PBS洗滌后，進(jìn)行拍照或統(tǒng)計(jì)。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，表明在濃度為1 P g/ml的蛋白處理下，MEK對(duì)HUVEC的遷移 抑制大于RK5。實(shí)施例4、MEK對(duì)HUVEC形成毛細(xì)血管能力影響的試驗(yàn)材料內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)為新生兒臍帶分離，10代內(nèi)可用。bFGF購自sigma公
司o
方法將matrigel膠按照1 2體積比用無血清M199稀釋后，加入60ng/ml bFGF， 鋪至24孔板，2小時(shí)凝固后，將HUVEC細(xì)胞接種在鋪有matrigel膠的孔里。大約2天內(nèi)形 成毛細(xì)血管樣形狀。用蛋白處理48-72小時(shí)。處理完后拍照。結(jié)果如下在基質(zhì)(matrix)中，生長(zhǎng)因子會(huì)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生毛細(xì)血管樣的細(xì)胞 形態(tài)。可以在體外模擬血管形成的狀態(tài)。雙靶點(diǎn)RK5可以微弱抑制血管形成，而三靶點(diǎn)MEK 可以強(qiáng)烈抑制血管形態(tài)的生成。圖4是在光學(xué)顯微鏡下觀察到的未長(zhǎng)微細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞 形態(tài)，其中A是未經(jīng)染色的圖像，B是結(jié)晶紫染色后的圖像。圖5是在生長(zhǎng)毛細(xì)血管時(shí)用不 同蛋白處理前后的對(duì)照?qǐng)D，其中A和C分別是用RK5蛋白處理前和1微克RK5蛋白處理72h 后的圖像，B和D分別是用MEK蛋白處理前和1微克MEK蛋白處理72h后的圖像，可以看出 MEK可以較強(qiáng)抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力。
權(quán)利要求
一種融合多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一種融合多肽的編碼基因，是編碼SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的多核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于，所述基因的堿基序列如SEQID No. 1所
4.含權(quán)利要求2所述基因的表達(dá)載體。
5.含權(quán)利要求2所述基因的細(xì)胞系。
6.權(quán)利要求1所述融合多肽在制備治療抑制新生血管異常生長(zhǎng)引起的疾病的藥物中 的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述融合多肽在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制新生血管生成的融合多肽及其編碼基因與應(yīng)用，該融合多肽是靶向性抑制金屬基質(zhì)蛋白酶的活性十肽、恩度的前25肽和血管生長(zhǎng)抑素的kringle 5結(jié)構(gòu)域組成的三靶點(diǎn)多肽。細(xì)胞試驗(yàn)表明，該融合多肽可以有效的抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，進(jìn)而抑制新生血管的生成，從而可應(yīng)用于制備治療由新生血管增生異常產(chǎn)生的疾病的藥物，并可用于腫瘤治療。
文檔編號(hào)A61P29/00GK101870734SQ20101018200
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日
發(fā)明者任宏偉, 王厚斌, 顧軍 申請(qǐng)人:北京大學(xué)