專利名稱：與喜樹堿類藥物敏感相關(guān)的miRNA的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種與喜樹堿類藥物敏感相關(guān)的miRNA 的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胃癌是世界上致死率第二位的癌癥，占每年新增癌癥患者的10%。喜樹堿(CPTs) 被稱為拓?fù)洚悩?gòu)酶I的“毒藥”，已被批準(zhǔn)用于包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的化學(xué)治療并且療效顯著。這類化合物能夠與拓?fù)洚悩?gòu)酶I和DNA形成的共價復(fù)合體結(jié)合形成三元可解離復(fù)合物，通過復(fù)制沖突模型造成DNA損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。但其在治療腫瘤方面的療效因人而異，耐藥性仍然是臨床治療上的一個難題。細(xì)胞對喜樹堿類藥物原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥的機(jī)制仍不確定，以前的研究表明耐藥表型可能是由腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物積累不足， 藥物靶標(biāo)拓?fù)洚悩?gòu)酶I發(fā)生改變或者細(xì)胞的藥物反應(yīng)如DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡發(fā)生改變等原因所造成。Micro RNA(miRNA)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)、長度在21_25bp之間、高度保守的非編碼小RNA0它們以序列特異性方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在發(fā)育、凋亡、代謝以及人類疾病方面都起著不容忽視的作用，從而受到廣泛關(guān)注。結(jié)合到RISC復(fù)合物(asymmetric RISC assembly)上的miRNA通過與靶mRNA的3' UTR區(qū)結(jié)合，引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制從而改變靶基因的表達(dá)水平。目前人類基因組中鑒定出的miRNA已經(jīng)超過1000個，據(jù)估計可調(diào)節(jié)約30%基因的表達(dá)和翻譯。大約50%得到注解的miRNAs在基因組上定位于與腫瘤發(fā)生相關(guān)的區(qū)域和脆性位點(diǎn)(fragile sites)，有些miRNA可能起到腫瘤抑癌基因或致癌基因的作用。miRNA在許多腫瘤中表達(dá)異常，是潛在的藥物靶點(diǎn)。但是，miRNA在藥物敏感性方面的作用直到近幾年才被揭示。2007年Bertino等人提出了 “miRNA的藥物基因組學(xué)”概念， 指出通過研究miRNA及miRNA突變?nèi)绾胃蓴_miRNA的正常功能進(jìn)而改變病人藥物反應(yīng)程度，最終可找出某些特定的miRNA用以指導(dǎo)病人的個性化用藥。近年來的研究表明，miRNA 相關(guān)的各種突變(miR-mutations)及miRNA表達(dá)水平的改變(misexpression)均能影響其對靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，從而改變靶蛋白的表達(dá)水平，最終影響腫瘤細(xì)胞的藥敏性。2007 年Mishra等首次證實miR-M結(jié)合位點(diǎn)的單堿基突變導(dǎo)致細(xì)胞對甲氨蝶呤的敏感性發(fā)生改變。正常情況下，miR-M可下調(diào)二氫葉酸還原酶(DHFR)的表達(dá)，使細(xì)胞對甲氨蝶呤敏感，但在有些細(xì)胞內(nèi)，DHFR的3' UTR區(qū)靠近miR-M結(jié)合位點(diǎn)處發(fā)生829C — T的單堿基突變，致使miR-M無法正常與DHFR的mRNA配對，DHFR mRNA的半衰期延長為原來的兩倍，DHFR的 mRNA及蛋白水平均升高。因此同樣劑量的甲氨蝶呤對細(xì)胞起不到原有作用，即產(chǎn)生了藥物不敏感現(xiàn)象。此外，miRNA表達(dá)水平的異常也會影響腫瘤細(xì)胞的藥物敏感度。Meng等證實膽管癌病人存在miR-21過表達(dá)現(xiàn)象，并且這種過表達(dá)導(dǎo)致病人對吉西他濱不敏感。2007年 Si等發(fā)現(xiàn)用反義核酸技術(shù)下調(diào)miR-21可以增強(qiáng)MCF7細(xì)胞對拓?fù)涮婵档拿舾行裕@可能是由于抑制miR-21造成BCL-2蛋白的低表達(dá)，從而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。Tsang等人的研究表明let_7a通過下調(diào)細(xì)胞凋亡中的啟動酶Caspase-3抑制了細(xì)胞凋亡，在A431和!fepG2細(xì)胞中過表達(dá)let_7a可增強(qiáng)它們對阿霉素、紫杉醇及干擾素-Y的耐藥性，抑制let_7a則增加化療藥物引發(fā)的細(xì)胞凋亡。miR-214可靶向PTEN的3' UTR區(qū)導(dǎo)致PTEN蛋白低表達(dá)，Akt通路過度激活從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，致使過表達(dá)miR-214的卵巢癌病人對順鉬不敏感。其他研究揭示了 miR-15b 和 miR-16、miR_221 和 miR-222、miR-328、miR-27a 和 miR-451 的異常表達(dá)也與人類腫瘤細(xì)胞的耐藥性相關(guān)。美國國家癌癥研究中心(NCI)建立了 60種腫瘤細(xì)胞系NCI-60的miRNA表達(dá)譜，并擬合出了用于預(yù)測腫瘤細(xì)胞對紫杉醇、5-氟尿嘧啶、阿霉素和環(huán)磷酰胺敏感程度的mRNA及miRNA特征譜。但NCI60細(xì)胞系中卻缺少了原發(fā)性耐藥極為明顯的胃癌及肝癌細(xì)胞系，而且目前用樣本或誘導(dǎo)細(xì)胞系進(jìn)行獲得性耐藥的研究極為廣泛，但實際上原發(fā)性耐藥對于個性化治療更具指導(dǎo)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決缺少喜樹堿類藥物羥基喜樹堿(HCPT)原發(fā)性耐藥相關(guān)的miRNA的技術(shù)問題，提供一種與喜樹堿類藥物敏感相關(guān)的miRNA的應(yīng)用，為臨床個性化用藥提供依據(jù)。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種miRNA的用途，用于制備檢測腫瘤病人對于喜樹堿類藥物敏感程度的試劑或試劑盒；其中，所述miRNA選自SEQ ID NO :1 25所示序列的 miRNA。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用于檢測腫瘤病人對于喜樹堿類藥物敏感程度的試劑盒，所述的試劑盒包含特異性地針對miRNA或其前體的引物或探針，所述miRNA 選自SEQID NO :1 25所示序列的miRNA。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種miRNA生物芯片，包括固相載體和探針，所述探針包含與喜樹堿類藥物敏感相關(guān)的miRNA序列的互補(bǔ)序列，該miRNA選自SEQ ID N0:1 25所示的序列。利用本發(fā)明的miRNA生物芯片或試劑盒，可以檢測細(xì)胞對喜樹堿類藥物的敏感性，從而判斷病人對喜樹堿類藥物是否產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)一步實現(xiàn)臨床個性化用藥。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種miRNA的用途，用于制備或篩選治療腫瘤的藥物，所述藥物用于改善腫瘤細(xì)胞對喜樹堿類藥物的敏感性，所述miRNA選自SEQ ID NO 1 25所示序列的miRNA。所述藥物包含選自SEQ ID N0:5 13、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO: 25 的 miRNA 或包含抗選自 SEQ ID N0:1 4、SEQ ID NO: 14 19、SEQ ID NO :21 22、 SEQ ID NO : 的miRNA的反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸與選自SEQ ID N0:1 4、SEQ ID NO :14 19、SEQID N0:21 22、SEQ ID NO :24 的 miRNA 序列互補(bǔ)。包含選自SEQ ID NO 5 13、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO 25 的 miRNA的藥物，可以施用于因低表達(dá)miRNA而引起對喜樹堿類藥物羥基喜樹堿不敏感的 HCPT耐藥性病人，進(jìn)而改善對HCPT的敏感性，提高HCPT的藥效。包含抗miRNA的反義寡核苷酸的藥物，可以施用于因過表達(dá)miRNA而引起對喜樹堿類藥物羥基喜樹堿不敏感的HCPT耐藥性病人，進(jìn)而改善對HCPT的敏感性，提高HCPT的藥效。 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種篩選改善腫瘤細(xì)胞對喜樹堿類藥物的敏感性的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括(1)用候選物質(zhì)處理表達(dá)miRNA的體系，所述的miRNA選自具有SEQ ID NO :1 4、SEQID NO 14 19、SEQ ID NO 21 22、SEQ ID NO 24 所示的序列的 miRNA ；禾口(2)檢測所述體系中miRNA的表達(dá)；其中，若所述候選物質(zhì)可降低miRNA的表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是能改善腫瘤細(xì)胞對喜樹堿類藥物的敏感性的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種篩選改善腫瘤細(xì)胞對喜樹堿類藥物的敏感性的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括(1)用候選物質(zhì)處理表達(dá)miRNA的體系，所述的miRNA選自具有SEQ ID NO :5 13、SEQID NO :20、SEQ ID NO 23 所示的序列的 miRNA ；禾口(2)檢測所述體系中miRNA的表達(dá)；其中，若所述候選物質(zhì)可提高miRNA的表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是能改善腫瘤細(xì)胞對喜樹堿類藥物的敏感性的潛在物質(zhì)。優(yōu)選的，上述腫瘤細(xì)胞為胃癌細(xì)胞。在本發(fā)明中，所述喜樹堿類藥物包括羥基喜樹堿、拓普替康、伊立替康、7_乙基-10-羥基喜樹堿、或9-氨基、9-硝基喜樹堿。本發(fā)明與喜樹堿類藥物敏感相關(guān)的miRNA，可以用作預(yù)測病人對羥基喜樹堿藥物敏感程度的分子標(biāo)志，為臨床個性化用藥提供依據(jù)，同時為抗耐藥腫瘤藥物設(shè)計和篩選提供新的靶點(diǎn)。


下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1是本發(fā)明實施例1中6株胃癌細(xì)胞系對HCPT的敏感性檢測圖；圖2是本發(fā)明實施例2區(qū)分胃癌細(xì)胞系對HCPT敏感程度的miRNA特征譜圖；圖3是本發(fā)明實施例3實時定量PCR驗證miRNA芯片結(jié)果的檢測圖；圖4是本發(fā)明實施例4區(qū)分胃癌細(xì)胞系對HCPT敏感程度的mRNA特征譜圖。
具體實施例方式下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規(guī)條件，如《精編分子生物學(xué)實驗指南》(F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.塞德曼等主編，馬學(xué)軍，舒躍龍的譯.北京 科學(xué)出版社，2004)中所述的方法進(jìn)行。實施例1羥基喜樹堿(HCPT)對人胃癌細(xì)胞的作用分析6 株人類胃癌細(xì)胞系BGC823，SGC7901, MGC803, HGC27, NCI-N87 和 AGS 對 HCPT的敏感程度，具體實驗步驟如下(1)細(xì)胞培養(yǎng)將6 株胃癌細(xì)胞系 BGC823，SGC7901, MGC803, HGC27, NCI-N87 和 AGS(購自上海生科院細(xì)胞資源中心)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco BRL, GrandIsland, NY)中，培養(yǎng)箱條件為37°C，5% C02及完全濕度。將增殖良好處于對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化分散后計數(shù)，制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板內(nèi)，100 μ L/孔(視倍增時間的不同，每孔5000-10000個細(xì)胞)，預(yù)培養(yǎng) Mh。每孔加預(yù)先制備好的羥基喜樹堿藥物(黃石飛云制藥有限公司)100 μ L，共5個藥物濃度，分別為羥基喜樹堿臨床用藥血漿峰值(1. 0 μ g/ml)的100倍、10倍，1倍、0. 1倍及0. 01 倍。每個藥物濃度設(shè)5個復(fù)孔，并設(shè)空白對照(只加RPMI1640培養(yǎng)液)和正常對照孔(不加藥物，加等量RPMI1640培養(yǎng)液)，置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱在全濕條件下培養(yǎng)48h。(2)磺酰羅丹明(SRB)顯色方法測定細(xì)胞生長細(xì)胞在加藥培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，每個小孔加入預(yù)冷的50% TCA液50ul (終濃度為10% )固定；加TCA時必須輕輕加在培養(yǎng)液表面，靜置5分鐘后再將平板移至4度放置lh。倒掉固定液，培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中干燥后，每孔加入100ul0.4% (w/v) SRB (溶于醋酸)液，在室溫放置10-30分鐘。棄去各孔內(nèi)液體后用醋酸洗滌5遍，去除未結(jié)合的染料，空氣中干燥后用150ul pH為10. 5、10mmol/ L unbuffered Trisbase (三羥甲基胺基甲烷)溶解，在平板振蕩器上振蕩5min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在515nm波長處測定每個小孔的OD值，用空白對照調(diào)零。用7個0D515數(shù)值計算細(xì)胞在各個濃度下的生長抑制率(GI)，公式如下=Ti >/ = Tz時，GI = [(Ti-Tz)/(C-Tz)] xlOO ；Ti < Tz時，GI = [(Ti-Tz)/Tz]XlOO0其中，Ti是不同藥物濃度下測得的0D515，Tz 是給藥之前細(xì)胞的初始0D515，C是未加藥物的對照組細(xì)胞的0D515。GI50是與對照組相比，加藥組細(xì)胞的生長抑制率達(dá)到50%時的藥物濃度值，該值可以由生長抑制率曲線估得。 所有的實驗都重復(fù)至少三次。(3)結(jié)果6 株人類胃癌細(xì)胞系(BGC823，SGC7901，MGC803，HGC27，NCI-N87 和 AGS)經(jīng)過上述細(xì)胞培養(yǎng)、并用五種不同濃度的HCPT (10—1，ΙΟ"2, ΙΟ"3, ΙΟ"4,10-5mg/ml)處理細(xì)胞、然后SRB方法測定細(xì)胞生長，結(jié)果表明該6個胃癌細(xì)胞系對羥基喜樹堿的敏感程度各不相同，并且導(dǎo)致細(xì)胞50%生長抑制的藥物濃度GI50值在不同細(xì)胞間有顯著差異，尤其是BGC823和AGS 之間(見圖la)。當(dāng)用血漿峰值濃度(1. 0 μ g/ml)的HCPT處理細(xì)胞時，AGS細(xì)胞系死亡而 BGC823細(xì)胞系的生長與未加藥的對照組相比受到的抑制很小(見圖lb)。SGC7901，MGC803， HGC27和NCI-N87對HCPT的敏感度居中。根據(jù)藥物敏感程度，這6株細(xì)胞系可以分為兩大類第一類(AGQ在HCPT中死亡，完全無法增殖；第二類(其余5個)與不加藥的對照相比，以較慢的速率增殖。實際上羥基喜樹堿對第二類細(xì)胞的生長抑制率在不同細(xì)胞系間具有顯著差異。 實施例2HCPT-不敏感和HCPT-敏感細(xì)胞系的miRNA表達(dá)譜為研究miRNA在HCPT原發(fā)性耐藥中的作用，利用Agilent的microRNA芯片V2. 0 對6株胃癌細(xì)胞系的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行全面分析，具體實驗方法如下(1)總RNA提取和質(zhì)量評估取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的6株細(xì)胞系(每個細(xì)胞系3個生物重復(fù))，使用mirVanaTM miRNAIsolation Kit (Ambion，Austin，Texas)抽提總 RNA。通過 NanoDrop 1000 測定濃度， 使用 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara，California)評估總 RNA 的質(zhì)量， 結(jié)果表明抽提得到的RNA符合下一步芯片實驗的要求。
(2)Agilent miRNA 芯片實驗利用 Agilent 的 miRNA Complete Labeling 禾口 Hyb Kit (Agilent, Santa Clara, Cali-fornia)進(jìn)行標(biāo)記和雜交反應(yīng)。具體如下用適量體積的1ΧΤΕ(ρΗ7. 5)或DNase/ RNase-free水將抽提后的Total RNA樣品稀釋至約50_100ng/ μ L，然后按IOOng的總量吸取RNA樣品，用DNase/RNase-free水補(bǔ)至3 μ L。加入1 μ L的去磷酸化混合液，置于37°C 金屬浴中，保溫30分鐘。在每管樣品中添加2. 8μ L 100% DMS0，置于100°C金屬浴中加熱 5-10分鐘。上述反應(yīng)結(jié)束后，將樣品管迅速轉(zhuǎn)入冰水浴中冷卻，立即取4. 5μ L已配制的連接反應(yīng)混合液加入到樣品管中，置于16°C溫育2小時。反應(yīng)結(jié)束后，將樣品置于真空濃縮儀中完全抽干，重新溶解在ISyL無菌水(無核酸酶)中，在每管中加入4.5yL配制好的 10XGE Blocking Agent，22. 5 μ L2 XHi-RPM雜交液(室溫放置)，輕微渦旋混勻，在100°C 金屬浴中加熱5分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，迅速將其轉(zhuǎn)至冰水浴中 冷卻5分鐘。用移液器緩慢地將約45μ L反應(yīng)液吸至蓋片上，將芯片點(diǎn)樣面(帶有“Agilent”字樣面)朝下緩慢放置在蓋片，組裝雜交室并擰緊，稍微晃動組裝好的雜交室以使里面所有的氣泡可以自由移動。將雜交室平衡放置在雜交爐的架子上，溫度設(shè)定在55°C，轉(zhuǎn)速為20rpm，雜交20小時。從雜交爐中取出雜交裝置，經(jīng)基因表達(dá)洗滌液(GeneExpression Wash Buffer) 1和基因表達(dá)洗滌液 (Gene Expression Wash Buffer) 2洗滌后利用Agilent掃描儀獲取圖像，通過Agilent特征提取(Feature Extraction, FE)軟件版本 9· 5. 3 (Agilent, Santa Clara, California)提取數(shù)據(jù)。在 GeneSpring GX 軟件(zcomSiliconGenetics, Redwood City, CA, USA)中對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化及統(tǒng)計分析。(3)結(jié)果上述Agilent的microRNA芯片有15744個探針，包括723個人的miRNA，每個 miRNA重復(fù)16次。芯片得到的miRNA信號值經(jīng)quantile歸一化和flag篩選(present或者marginal)后，剩余279個miRNA。ANOVA分析顯示HCPT-不敏感(BGC823)和HCPT-敏感 (AGS)細(xì)胞系之間有137個顯著差異miRNA(P < 0. 05)，倍數(shù)差異在1. 5倍以上。圖2是利用歸一化后的探針信號強(qiáng)度的值進(jìn)行的層次聚類圖，圖2a是利用對HCPT最不敏感的細(xì)胞系BGC823和最敏感的細(xì)胞系A(chǔ)GS之間的137個顯著差異的miRNA構(gòu)建的層次聚類圖， 表明利用這些差異miRNA進(jìn)行層次聚類可以按藥物敏感度正確區(qū)分6株細(xì)胞系。進(jìn)一步結(jié)合HCPT敏感度居中的細(xì)胞系(SGC7901，MGC803，HGC27和NCI-N87)中這些miRNA的表達(dá)情況，找到25個表達(dá)水平與藥物敏感度線性相關(guān)的miRNA，其中12個miRNA在HCPT-不敏感的細(xì)胞系中低表達(dá)，13個miRNA高表達(dá)(表1)。這25個miRNA可能在胃癌細(xì)胞對HCPT的原發(fā)性耐藥中發(fā)揮了一定作用，以它們進(jìn)行的層次聚類可以按照藥物敏感度很好的將6株細(xì)胞系區(qū)分開來(見圖2b)，說明這25個miRNA特征譜的有效性。表1 25個表達(dá)水平與藥物敏感度線性相關(guān)的miRNA.DX1AHCPT耐藥細(xì)胞系中的序列表編號
miRNAlt、田染色體定位
miR-132上調(diào)SEQIDNO:117pl3.3miR-224上調(diào)SEQIDNO:2Xq28miR-338-3p上調(diào)SEQIDNO:317q25.3miR-452上調(diào)SEQIDNO:4Xq28miR-141下調(diào)SEQIDNO:512pl3.31miR-200a下調(diào)SEQIDNO:6lp36.33miR-200b下調(diào)SEQIDNO:7lp36.33miR-200c下調(diào)SEQIDNO:812pl3.31miR-371-3p下調(diào)SEQIDNO:919ql3.41miR-371-5p下調(diào)SEQIDNO:1019ql3.4lmiR-372下調(diào)SEQIDNO:1119ql3.4lmiR-373下調(diào)SEQIDNO:1219q13.4lmiR-429下調(diào)SEQIDNO::131p36.33let-7g上調(diào)SEQIDNO;:143p21.1miR-126上調(diào)SEQIDNO::159q34.3miR-196a上調(diào)SEQIDNO::16I7q21.32 12ql3.13miR-196b上調(diào)SEQIDNO::177p15.2miR-19b上調(diào)SEQIDNO::1813q31.3 Xq26.2miR-27a上調(diào)SEQIDNO::1919p13.12miR-31下調(diào)SEQIDNO::209p21.3miR-365上調(diào)SEQIDNO::21I6pl3.12 17qll.2miR-424上調(diào)SEQIDNO::22Xq26.3miR-7下調(diào)SEQIDNO::239q21.32 15q26.1 19pl3.3miR-98上調(diào)SEQIDNO::24Xpl 1.22miR-99b下調(diào)SEQIDNO::2519ql3.33實施例3實時定量PCR驗證miRNA芯片結(jié)果為驗證miRNA芯片的結(jié)果，隨機(jī)選取12個差異miRNA進(jìn)行實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)，包括 miR_196a，miR-365，miR-424, miR_99b，miR-98, miR-224, miR-338_3p， miR-141, miR-200a, miR_200b，miR-372 和 miR-373。對 miRNA 而言，利用 miScript ReverseTranscription試劑盒將六株胃癌細(xì)胞系的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以該cDNA為模板，通過 miScript Primer Assay 及 miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Germany)進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μ L，包括1 μ 1的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，10 μ 1的2x SYBR Green MasterMix, 1 μ 1 IOx mikript通用引物，1 μ 1 IOx特異性引物(上海生工)和7 μ 1 RNase-free 水。在 7900HT 核酸序列定量檢測儀(Sequence Detection System, Applied Biosystems,Austin,TX,USA)上進(jìn)行反應(yīng)，程序如下首先95°C反應(yīng)15min ；然后進(jìn)行40個如下循環(huán)941，1&;551，308;701，3如。反應(yīng)結(jié)束測定溶解曲線以判斷產(chǎn)物特異性。將每個miRNA的Ct值與U6進(jìn)行比較，計算相對表達(dá)水平，然后乘以102。每個數(shù)據(jù)點(diǎn)都有三次重復(fù)實驗，通過SDS2.3軟件(Bio-Rad)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。如圖3所示，定量結(jié)果與芯片結(jié)果基本吻合。miR-196a，miR-365, miR-424, miR-99b和miR-98所有的細(xì)胞系中均有表達(dá)， 并且表達(dá)水平與HCPT敏感度相關(guān)。高表達(dá)miR-196a，miR-365, miR-424, miR-98或者低表達(dá)miR-99b的細(xì)胞系對HCPT的敏感度更小。miR_2M和miR-338_3p只在第二類細(xì)胞中表達(dá),而 mir-141，miR-200a, miR-200b, miR-372 和 miR-373 只在第一類細(xì)胞(AGS)中表達(dá)。
8這在一定程度上暗示某些miRNA的表達(dá)可能影響細(xì)胞對HCPT的敏感程度。實施例4 HCPT-不敏感和HCPT-敏感細(xì)胞系的mRNA表達(dá)譜為研究不同藥物敏感度的細(xì)胞系在基因表達(dá)譜上的差異，用Affymetrix HG-U133+PM芯片對6株胃癌細(xì)胞系做了全基因組表達(dá)譜分析。每個細(xì)胞系取3個生物學(xué)重復(fù)。探針的標(biāo)記、雜交及掃描均依照說明進(jìn)行。簡言之，首先利用帶有T7啟動子的poly-(T) 引物對500ng總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后通過cDNA 二鏈合成將單鏈cDNA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈。通過體外轉(zhuǎn)錄得到生物素標(biāo)記的aRNA，片段化后與Affymetrix HG-U133+PM Array Plate在48°C 雜交16小時。利用Affymetrix Titan系統(tǒng)對芯片洗滌、染色和掃描。使用Expression Console 軟件(Affymetrix, Santa Clara, California)提取數(shù)據(jù)。在 GeneSpring GX 軟件 (zcomSiliconGenetics, Redwood City, CA, USA)中對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化及統(tǒng)計分析，利用歸一化后的探針信號強(qiáng)度的10 值可進(jìn)一步制出層次聚類圖(見圖4)。結(jié)果307個基因在HCPT-不敏感和HCPT-敏感細(xì)胞系中的表達(dá)有顯著差異(P < 0. 05)，倍數(shù)在2倍以上，且表達(dá)水平與HCPT敏感程度線性相關(guān)。利用表達(dá)程度與胃癌細(xì)胞系對HCPT的敏感程度線性相關(guān)的307個mRNA構(gòu)建的層次聚類圖如圖如所示。其中， 經(jīng)過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)33個基因已被報道與腫瘤發(fā)生、發(fā)展或化療敏感性相關(guān)，包括凋亡相關(guān)基因如 BAX，TIALl，TPD52L1, BAG, SP3, RPS27L, PLSCR3 和 TP53INP1，細(xì)胞分裂相關(guān)基因如 MCM2，細(xì)胞黏附或轉(zhuǎn)移相關(guān)基因如TIMP2，VSNLl, FUT8，TBX3，檢測點(diǎn)基因如RADl等。利用 33個基因做的層次聚類能夠?qū)?個細(xì)胞系按照藥物敏感程度正確聚類(見圖4b)。實施例5miRNA靶基因的分析miRNA通過引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，因此有必要分析 miRNA的下游靶基因。針對上述25個miRNA，利用miRGen數(shù)據(jù)庫(http://www. diana. pcbi. upenn. edu/cgi-bin/miRGen)預(yù)測它們的靶基因，該數(shù)據(jù)庫整合了多種miRNA靶基因預(yù)測方法，包括TargetScanS，miRanda和PicTar。為減少假陽性率，采用至少在兩種預(yù)測方法中都被預(yù)測出來的靶基因。通過以上方法預(yù)測，獲得25個差異miRNA的潛在靶基因，各差異miRNA的潛在靶基因數(shù)目見下表2。許多靶基因是化療敏感性相關(guān)基因，包括⑶ΚΝ1Β(ρ27)，ΑΝΧΑ1(ρ35)， PDCD4, UGTlAl，T0P1, CYP3A4, ABCG2 (BCRP)，CHEKl，TDP1，BCL-2 和 SUM01。表2 25個差異miRNA的潛在靶基因數(shù)目_miRNA預(yù)測靶基因_數(shù)目
miR--132177
miR--224194
miR--338-3p140
miR--452146
miR--141280
miR--200a13
miR--200b39權(quán)利要求
1.一種miRNA的用途，其特征在于，用于制備檢測腫瘤病人對于喜樹堿類藥物敏感程度的試劑或試劑盒；其中，所述的miRNA選自具有SEQ ID NO :1 25所示的序列的miRNA。
2.一種用于檢測腫瘤病人對于喜樹堿類藥物敏感程度的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含特異性地針對miRNA或其前體的引物或探針，所述的miRNA選自具有SEQ ID NO :1 25所示的序列的miRNA。
3.—種miRNA的用途，其特征在于，用于制備治療腫瘤的組合物；或用于篩選治療腫瘤的組合物，所述組合物用于改善腫瘤細(xì)胞對喜樹堿類藥物的敏感性；所述的miRNA選自具有SEQ ID NO :1 25所示的序列的miRNA。
4.一種篩選改善腫瘤細(xì)胞對喜樹堿類藥物的敏感性的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括(1)用候選物質(zhì)處理表達(dá)miRNA的體系，所述的miRNA選自具有SEQID N0:1 4、 SEQID NO 14 19、SEQ ID NO 21 22、SEQ ID NO 24 所示的序列的 miRNA ；禾口(2)檢測所述體系中miRNA的表達(dá)；其中，若所述候選物質(zhì)可降低miRNA的表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是能改善腫瘤細(xì)胞對喜樹堿類藥物的敏感性的潛在物質(zhì)。
5.一種篩選改善腫瘤細(xì)胞對喜樹堿類藥物的敏感性的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括(1)用候選物質(zhì)處理表達(dá)miRNA的體系，所述的miRNA選自具有SEQID NO 5 13、 SEQID NO :20、SEQ ID NO 23 所示的序列的 miRNA ；禾口(2)檢測所述體系中miRNA的表達(dá)；其中，若所述候選物質(zhì)可提高miRNA的表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是能改善腫瘤細(xì)胞對喜樹堿類藥物的敏感性的潛在物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的miRNA的用途，其特征在于，所述喜樹堿類藥物包括羥基喜樹堿、拓普替康、伊立替康、7-乙基-10-羥基喜樹堿、或9-氨基、9-硝基喜樹堿。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述喜樹堿類藥物包括羥基喜樹堿、拓普替康、伊立替康、7-乙基-10-羥基喜樹堿、或9-氨基、9-硝基喜樹堿。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的miRNA的用途，其特征在于，所述腫瘤為胃癌。
9.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞為胃癌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開一種與喜樹堿類藥物敏感相關(guān)的miRNA在檢測腫瘤細(xì)胞對喜樹堿類藥物產(chǎn)生耐藥性中的用途，該miRNA選自SEQ ID NO1～25所示序列。本發(fā)明還公開了上述miRNA在制備或篩選治療腫瘤的藥物中的用途。本發(fā)明與喜樹堿類藥物敏感相關(guān)的miRNA，可以用作預(yù)測病人對羥基喜樹堿藥物敏感程度的分子標(biāo)志，為臨床個性化用藥提供依據(jù)，同時為抗耐藥腫瘤藥物設(shè)計和篩選提供新的靶點(diǎn)。
文檔編號A61K48/00GK102191310SQ201010120559
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月9日
發(fā)明者武雪梅, 肖華勝 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院