專利名稱：：一種枳殼的炮制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥炮制領(lǐng)域，特別是一種枳殼的炮制方法。
背景技術(shù)：
：枳殼為蕓香科柑橘屬植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種的干燥未成熟果實。性溫，味苦、辛、酸，歸脾、胃經(jīng)，具有理氣寬中，行滯消脹之功效，主治胸脅氣滯，脹滿疼痛、食積不化，痰飲內(nèi)停，胃下垂，脫肛，子宮脫垂等。現(xiàn)代研究表明，枳殼中主要含有揮發(fā)油、黃酮類、生物堿類成分。黃酮類成分是評價枳殼飲片質(zhì)量的主要指標。柚皮苷和新橙皮苷是反映枳殼飲片內(nèi)在質(zhì)量的定量指標(王發(fā)英，徐歡，楊武亮等.枳殼質(zhì)量標準研究[J].中成藥，2009，31(12):1897-1901)，《中國藥典》2010版第一部規(guī)定枳殼的質(zhì)量控制的檢測指標是柚皮苷和新橙皮苷的含量，采用HPLC法同時控制枳殼藥材中柚皮苷和新橙皮苷的含量，該方法簡便、準確、重現(xiàn)性好。枳殼在臨床上多以炮制品入藥。歷代醫(yī)書中記載的炮制方法多達23種炮制方法，如凈制、切制、麩炒、炒制、炎制、醋制、制炭、酒制、槳水制、滑制、面炒制、火炮制、煨制、米炒制、蘿卜制、巴豆制、巴豆醋制、蒼術(shù)蘿卜子干漆茴香制、槐花制、蒸制、鹽制、蜜制等。從炮制方法的變革上看，早期是只去除瓤；而后期是在去除瓤的基礎(chǔ)上再采用其他的輔料炮制，是由生制熟的過程。《中國藥典》2010版第一部229-230頁規(guī)定的枳殼的炮制方法是取枳殼，除去雜質(zhì)，洗凈，潤透，切薄片，干燥后篩去碎落的瓤核即得。除上述臨床上常用"藥典法"外，還有獨具特色的"樟幫法"炮制的枳殼飲片。中國發(fā)明專利申請公開說明書(公開號CN101612234A，公開日2009年12月30日)記載了典型"樟幫法"炮制枳殼的方法先用刀挖去枳殼原料的內(nèi)囊，洗凈泥沙，水浸6-24小時，用鐵質(zhì)的壓件擠壓浸潤后得到枳殼原料；再將枳殼原料上木架，在30-35t:、相對濕度60-80%的環(huán)境中放置6-8天或14-20天使其自然發(fā)酵，取出洗干凈表面，切片；最后曬干得到枳殼飲片，俗稱鳳眼片。在上述過程中，枳殼經(jīng)特定的某種真菌發(fā)酵可產(chǎn)生具有藥理活性的橙皮素。但上述自然發(fā)酵工藝很不容易掌握，易造成炮制品合格率低，炮制過程中受污染的枳殼照片見圖1。另外，該方法對溫度、濕度要求高(溫度30-35t:，濕度60-80%)，秋、冬、春季生產(chǎn)需用控溫控濕的特殊設(shè)備，時間長(6-8天或14-20天)；上述諸多原因造成樟幫法炮制的枳殼生產(chǎn)效率低、成本高，質(zhì)量難以控制。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種快速、簡便的枳殼炮制方法，利用該方法能夠確保炮制后枳殼的質(zhì)量。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是—種枳殼的炮制方法，取枳殼原藥材，去除內(nèi)囊，洗凈泥沙，得到枳殼凈藥材，水潤6-12小時，壓制后上木架，人工接種枳殼凈藥材重量0.005-0.3%的毛霉，在16-35t:、相對濕度60-99%的環(huán)境中放置24-120小時，取出，切片，干燥即得枳殼飲片。本發(fā)明所述毛霉優(yōu)選自總狀毛霉、魯氏毛霉、高大毛霉中的一種或幾種；更優(yōu)選自總狀毛霉和魯氏毛霉中的一種或兩種；最優(yōu)選的是總狀毛霉。本發(fā)明所述人工接種毛霉的量優(yōu)選為枳殼凈藥材重量的0.01-0.03%。本發(fā)明所述環(huán)境的相對濕度優(yōu)選為77-95%。本發(fā)明優(yōu)選的一種實施方案是取枳殼原藥材，去除內(nèi)囊，洗凈泥沙，得到枳殼凈藥材，水潤6-12小時，壓制后上木架，人工接種枳殼凈藥材重量0.01%的總狀毛霉，在28°C、相對濕度92%的環(huán)境中放置48小時，取出，切片，干燥即得枳殼飲片。典型樟幫法炮制枳殼的過程實際上是在一定溫度、濕度條件下，一方面保證其成型，形成鳳眼片，同時使枳殼經(jīng)過某種特定真菌的發(fā)酵作用。枳殼上真菌的種類和數(shù)量是決定炮制后枳殼質(zhì)量的關(guān)鍵因素。只有使上述因素可控，才能保證炮制品的合格率。毛霉，又叫黑霉、長毛霉，拉丁名Mucor，接合菌亞門接合菌綱毛霉目毛霉科真菌中的一個大屬。以孢囊孢子和接合孢子繁殖。菌絲無隔、多核、分枝狀，在基物內(nèi)外能廣泛蔓延，無假根或匍甸菌絲。不產(chǎn)生定形菌落。菌絲體上直接生出單生、總狀分枝或假軸狀分枝的孢囊梗。各分枝頂端著生球形孢子囊，內(nèi)有形狀各異的囊軸，但無囊托。囊內(nèi)產(chǎn)大量球形、橢圓形、壁薄、光滑的孢囊孢子。孢子成熟后孢子囊即破裂并釋放孢子。有性生殖借異宗配合或同宗配合，形成一個接合孢子。某些種產(chǎn)生厚垣孢子。毛霉菌絲初期白色，后灰白色至黑色，這說明孢子囊大量成熟。毛霉菌絲體每日可延伸3厘米左右，生產(chǎn)速度明顯高于香菇菌絲。毛霉廣泛分布于酒曲、植物殘體、腐敗有機物、土壤、糞便、禾草及空氣中，在高溫、高濕度以及通風(fēng)不良的條件下生長良好。代表種如總狀毛霉(M.racemosush高大毛霉(M.mucedoh魯氏毛霉(M.rouxia皿s)等(魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979)。毛霉的用途很廣，常出現(xiàn)在酒藥中，能糖化淀粉并能生成少量乙醇，產(chǎn)生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，許多毛霉還能產(chǎn)生草酸、乳酸、琥珀酸及甘油等，有的毛霉能產(chǎn)生脂肪酶、果膠酶、凝乳酶等。毛霉具有重要工業(yè)應(yīng)用，比如高大毛霉能產(chǎn)生了羥基丁酮、脂肪酶；魯氏毛霉不僅用于釀造工業(yè)，還可用于做豆腐乳；總狀毛霉用于制造豆豉。，總狀毛霉(M.racemosus)、高大毛霉(M.mucedo)、魯氏毛霉(M.rouxia皿s)等可以從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心、或河南省焦作市調(diào)味品研究所菌種曲精廠等地購買。本發(fā)明的發(fā)明人通過對典型樟幫法炮制的枳殼飲片進行分離，鑒定，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌是總狀毛霉。具體的試驗過程如下(—)真菌的分離取典型樟幫法炮制過程中上架長霉的枳殼，用消毒后的剪刀剪取適量長霉枳殼，研碎稀釋混懸。混懸液涂布接種于玫瑰紅鈉培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)；在培養(yǎng)基經(jīng)過經(jīng)3次純化后，獲得優(yōu)勢單菌落菌株。(二)真菌菌落形態(tài)觀察及分離鑒定2.1、菌落形態(tài)觀察分別在在霉菌培養(yǎng)基上劃線接種上述獲得的優(yōu)勢單菌落菌株，28t:恒溫培養(yǎng)，連續(xù)幾天觀察菌落外觀形態(tài)、顏色、菌絲生長情況等。菌絲體在基質(zhì)和基質(zhì)里廣泛蔓延，菌絲白色透明，孢子囊初期無色，后為灰褐色。2.2、顯微形態(tài)觀察將單菌落的菌株制片后在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)、孢子形狀，記錄觀察結(jié)果并拍照，照片見圖2。顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)菌絲體均為無隔膜的單細胞多核，以孢子囊孢子繁殖，有假根和葡匍枝，孢子囊梗直接由菌絲體生出，單生分枝少，有的不分枝，分枝頂端有膨大的孢子囊，囊軸與孢囊梗相連處無囊托。2.3、鑒定綜合上述菌落形態(tài)和菌株顯微形態(tài)，對菌株進行鑒定，確定所分離得到的優(yōu)勢菌為總狀毛霉(Mucorracemosus)。下面通過試驗具體說明本發(fā)明方法的建立1.典型樟幫法條件的確定首先對中國發(fā)明專利申請公開說明書(公開號CN101612234A，公開日2009年12月30日)記載的典型樟幫法炮制枳殼的方法的溫度、濕度、時間條件進行了優(yōu)選以柚皮苷含量、橙皮苷含量、新橙皮苷含量、霉變性狀、成型性狀為評價指標。1.1正交實驗因素水平確定表l因素水平表a溫度rc)b相對濕度(％)c時間(天)~~1Ii^i2208533.24924_^_^_22_^_1.2實驗評價指標1.2.1樣品含量測定取炮制好的枳殼樣品粉末0.5g，，采用《中國藥典》2010版第一部229-230頁收載的高效液相法測定枳殼中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量。1.2.2樣品霉變性狀得分根據(jù)樣品的霉變程度和成型性進行評分，評分標準見表2、表3:表2外觀霉變評分表外觀性狀霉變性狀評分分值白色霉斑、霉菌黑色或綠色5白色霉斑、霉菌稍有黑色或綠色7.5布滿白色霉斑、菌絲(最好)10白色霉斑、菌絲較多7.5白色霉斑、菌絲較少5略見霉斑、菌絲2.55_表3外觀成型評分表_評分分值外觀性狀_10成型性好6成型性良好0不成型_1.2.3正交實驗及結(jié)果取藥材按樟幫法要求上架后，按正交設(shè)計表進行實驗。以時間、濕度、溫度為考察因素，以柚皮苷含量、橙皮苷含量、新橙皮苷含量、霉變性狀、成型性狀為評價指標。正交實驗安排及結(jié)果見表4。分析結(jié)果如下，表4樟幫法生枳殼飲片正交實驗表溫度濕度時間柚皮苷含量橙皮苷含量新橙皮苷含量成型霉變性狀。C%沃)(mg/g)(mg/g)_(mg/g)分值分值111134.292.23631.1302.5211225.661.65723.9402.5311327.341.92327.3107.5411428.48L84823.0907.5522132.652.47935.4802.56612234.062.18129.9905.012328.181.38821.5407.5812425.581.56120.9605.091136.942.62931.4907.51013231.032.14428.3607.5111334.613.05636.24610.0121431.291.59226.12107.51314125.371.80324.2107.51414227.851.82723.5407.51514328.792.02824.3565.01614436.782.25531.58107.51721141.382.83236.5205.01821222.65L50621.3605.01921338.612.29033.9607.52021422.681.71720.6307.52122123.401.51018.9605.02222220.201.44517.7605.02322318.981.46218.8107.52422426.651.42622.9707.52523127.301.71422.5205.02623231.061.68825.9705.027223.581.64922.8907.52823425.561.75321.9907.52924126.641.57124.0205.03024225.721.49923.9905.03124323.241.62320.0907.53224429.942.04426.7707.53331122.151.41618.7205.03431235.111.71926.55010.03531329.852.60530.97010.0361427.591.43923.1805.03732122.721.56119.8302.53832226.751.85827.5107.5392330.181.53524.9807.54032426.421.65822.62010.04133124.841.72922.3205.04233226.001.67322.4205.043328.571.88323.44107.54433425.471.64821.74105.04534121.751.68620.0505.04634224.641.55419.8207.5474322.891.34317.59610.04834427.10l.謝21.091010.04941123.511.44319.7205.05041234.131.77324.63010.05141325.721.45221.41010.05241437.531.80134.9207.55342127.526.79321.5207.55442236.812.02331.23010.0554228.512.24524.09010.05642432.731.72930.0307.5574132.661.57528.401010.0584229.451.97925.331010.0594331.351.45024.911010.060443謹1.77632.24107.56144133.002.03631.0465.086244232.391.56526.87105.06344332.222.03730.13107.56444445.451.89339.52107.51.2.4實驗結(jié)果分析以不同工藝的因素為自變量，飲片的柚皮苷含量，橙皮苷含量，新橙皮苷含量、成型和霉變性狀的標準化值為評判指標，用13.0版SPSS統(tǒng)計軟件進行相關(guān)性和方差分析，結(jié)果見表5至表6。表5方差分析表(n=64)因素離差平方和臨界值自由度方差顯著差總和0.923119.3475.00050.0000.000A0.6252.73415.000156.0000.001B0.5212.18815細156,0000，C0.6022.61215.000156.0000.0026變量分析表(n=64)指標A平均值B平均值C平均值誤差16°C0.4372天0.36077%0.4080.04620°C0.2933天0.37784%0.3250.046徹漢百24°C0.2794天0.35292%0.4110.04628°C0.5135天0.43499%0.3780.04616°C0.1272天0.15577%0.0940.033鵬依荘20°C0.0723天0.07684%0.0300.033位反百24°C0.0644天0.09792%0.0970.03328°C0.1385天0.07499%0.0810.03316°C0.4502天0.35577%0.3890.056宰f裕由存20°C0.2793天0.35684%0.3040.056祈但議百24°C0.2324天0.34692%0.3850.05628。C0.4695天0.39399%0.3520.05616°C0.2002天0.10077%0扁0.07020°C0.0033天0.12584%0細0扁P乂坐24°C0.2254天0.30092%0.4750.07028°C0.4755天0.37599%0.4750.07016°C0.5002天0.37577%0.5620.059霉變性狀20°C0.5003天0.56284%0.5630.05924°C0.6044天0.77192%0.6460.05928°C0.7505天0.64699%0.5830.059表4顯示在炮制工藝中，溫度、時間、濕度對工藝有顯著影B向，影響程度依次是溫度>時間>濕度。綜合分析，典型樟幫法枳殼炮制的最佳工藝為A4B2C3，即溫度28°C，時間3天，濕度92%工藝為佳。另取枳殼進行了3批驗證實驗。結(jié)果說明正交設(shè)計篩選出工藝穩(wěn)定。2在此最佳工藝條件的中的濕度、溫度條件下分別人工接種占枳殼凈藥材重量0.01%、0.02%、0.03%的總狀毛霉，于接種后2天與3天分別取樣，進行相關(guān)質(zhì)量指標的檢測，結(jié)果見表7。表7人工接種條件篩選<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>從上可以看出，采用人工接種霉菌，在2天的成型性、霉變性狀良好，且含量和3天相比無明顯差異，故人工接種發(fā)酵時間定為2天，即48小時。因此，本發(fā)明方法最佳工藝為:即溫度28°C，時間2天，濕度92%，接種量0.01%。以上述最佳工藝條件，按照本發(fā)明所述方法制備9批枳殼飲片，同時平行地按照中國發(fā)明專利申請公開說明書(公開號CN101612234A)記載的方法制備典型樟幫法枳殼飲片；測定兩種方法制備的枳殼飲片中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量，結(jié)果見表8。表8本發(fā)明方法和典型樟幫法制備的枳殼飲片含量比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>本發(fā)明最優(yōu)選方案所述炮制方法制備的枳殼飲片與典型樟幫法炮制的枳殼飲片無區(qū)別，見圖3和4。通過對典型樟幫法飲片與新方法制得樟幫法飲片的高效液相色譜分析(高效液相圖譜見圖5和6)，本發(fā)明方法所得的枳殼飲片與典型"樟幫法"制得的枳殼飲片的化學(xué)成分一致。典型"樟幫法"制備的枳殼飲片的柚皮苷含量平均為46.9mg/g，橙皮苷含量平均為2.03mg/g，新橙皮苷含量平均為33.96mg/g;本發(fā)明方法制備的枳殼飲片柚皮苷含量平均為54.56mg/g，橙皮苷含量平均為2.134mg/g，新橙皮苷含量平均為38.55mg/g，表明本發(fā)明方法制備的枳殼飲片柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量都高于典型樟幫法制備的枳殼飲片。本發(fā)明方法生產(chǎn)周期短，一年四季均可生產(chǎn)，無需特定的恒溫恒濕設(shè)備，穩(wěn)定可控，適合大生產(chǎn)等特點。本發(fā)明改變了傳統(tǒng)"樟幫法"炮制枳殼基本依賴自然條件的狀況，從而使炮制過程可控，保證了飲片質(zhì)量。圖1是炮制過程中受污染的枳殼飲片的照片圖2分離出的毛霉單菌落的菌株顯微照片圖3是典型樟幫法炮制的枳殼飲片的照片圖4是本發(fā)明方法制備的枳殼飲片的照片圖5是典型"樟幫法"炮制的枳殼飲片的HPLC圖譜，其中1為柚皮苷峰，2為橙皮苷峰，3為新橙皮苷峰。圖6是本發(fā)明方法炮制的枳殼飲片的HPLC圖譜，其中1為柚皮苷峰，2為橙皮苷峰，3為新橙皮苷峰。具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明做具體說明，但本發(fā)明并不限于下述實施例。炮制后枳殼含量測定的方法采用《中國藥典》2010版第一部229-230頁收載的高效液相法測定枳殼中柚皮苷、新橙皮苷含量的方法，其中柚皮苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110722-200309)、新橙皮苷(由江西中醫(yī)學(xué)院重點實驗室楊武亮教授提供，歸一法測定含量為99.34%)。實施例1取枳殼原藥材10Kg，用刀挖去枳殼原藥材的內(nèi)囊，洗凈泥沙，水潤6-12小時，壓制后上木架，人工接種lg毛霉，在28°C、相對濕度92%的環(huán)境中放置48小時，切片，干燥即得枳殼飲片。通過高效液相法測定柚皮苷含量5.611%，新橙皮苷含量為3.833%。實施例2取枳殼原藥材10Kg，用刀挖去枳殼原藥材的內(nèi)囊，洗凈泥沙，水潤6-12小時，壓制后上木架，人工接種2g毛霉，在16°C、相對濕度60%的環(huán)境中放置120小時，切片，干燥即得枳殼飲片。通過高效液相法測定柚皮苷含量5.465%，新橙皮苷含量為3.752%。實施例3取枳殼原藥材10Kg，用刀挖去枳殼原藥材的內(nèi)囊，洗凈泥沙，水潤6-12小時，壓制后上木架，人工接種lg毛霉，在28°C、相對濕度80%的環(huán)境中放置72小時，切片，干燥即得枳殼飲片。通過高效液相法測定柚皮苷含量5.%，新橙皮苷含量為3.786%。實施例4取枳殼原藥材1Kg，用刀挖去枳殼原藥材的內(nèi)囊，洗凈泥沙，水潤6-12小時，壓制后上木架，人工接種lg毛霉，在16°C、相對濕度77%的環(huán)境中放置36小時，切片，干燥即得枳殼飲片。通過高效液相法測定柚皮苷含量5.412%，新橙皮苷含量為3.674%。實施例5取枳殼原藥材1Kg，用刀挖去枳殼原藥材的內(nèi)囊，洗凈泥沙，水潤6-12小時，壓制后上木架，人工接種3g毛霉，在30°C、相對濕度80%的環(huán)境中放置24小時，切片，干燥即得枳殼飲片。通過高效液相法測定柚皮苷含量5.406%，新橙皮苷含量為3.619%。權(quán)利要求一種枳殼的炮制方法，其特征在于取枳殼原藥材，去除內(nèi)囊，洗凈泥沙，得到枳殼凈藥材，水潤6-12小時，壓制后上木架，人工接種枳殼凈藥材藥材重量0.005-0.3％的毛霉，在16-35℃、相對濕度60-99％的環(huán)境中放置24-120小時，取出，切片，干燥即得枳殼飲片。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種枳殼的炮制方法，其特征在于所述毛霉選自總狀毛霉、魯氏毛霉、高大毛霉中的一種或幾種。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種枳殼的炮制方法，其特征在于所述毛霉選自總狀毛霉和魯氏毛霉中的一種或兩種。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種枳殼的炮制方法，其特征在于所述毛霉為總狀毛霉。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4所述的一種枳殼的炮制方法，其特征在于所述人工接種毛霉的量為枳殼凈藥材重量的0.01-0.03%。6.根據(jù)權(quán)利要求1至4所述的一種枳殼的炮制方法，其特征在于所述環(huán)境的相對濕度為77-95%。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種枳殼的炮制方法，其特征在于所述環(huán)境的相對濕度為80-95%。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種枳殼的炮制方法，其特征在于取枳殼原藥材，去除內(nèi)囊，洗凈泥沙，得到枳殼凈藥材，水潤6-12小時，壓制后上木架，人工接種枳殼凈藥材重量0.01%的總狀毛霉，在281:、相對濕度92%的環(huán)境中放置48小時，取出，切片，干燥即得枳殼飲片。全文摘要本發(fā)明公開了一種枳殼的新炮制方法取枳殼原藥材，去除內(nèi)囊，洗凈泥沙，得到枳殼凈藥材，水潤6-12小時，壓制后上木架，人工接種枳殼凈藥材藥材重量0.005-0.3％的總狀毛霉，在16-35℃、相對濕度60-99％的環(huán)境中放置24-120小時，取出，切片，干燥即得枳殼飲片。本發(fā)明方法是對典型樟幫法炮制枳殼的改進。與典型樟幫法制備的枳殼飲片相比，本發(fā)明方法制備的枳殼飲片柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量都高于前者。本發(fā)明改變了傳統(tǒng)樟幫法炮制枳殼基本依賴自然條件的狀況，從而使炮制過程可控，保證了飲片質(zhì)量；而且本發(fā)明方法生產(chǎn)周期短，一年四季均可生產(chǎn)，無需特定的恒溫恒濕設(shè)備，穩(wěn)定可控，適合大生產(chǎn)。文檔編號A61P15/00GK101780168SQ201010119769公開日2010年7月21日申請日期2010年3月8日優(yōu)先權(quán)日2010年3月8日發(fā)明者何敏,姚冬琴,張的鳳,張金蓮,朱衛(wèi)豐,謝一輝申請人:江西中醫(yī)學(xué)院