專利名稱：預(yù)防乳腺癌復(fù)發(fā)的疫苗的制作方法
預(yù)防乳腺癌復(fù)發(fā)的疫苗序列表本申請包含通過EFS-Web遞交且通過參考以其整體并入本文的序列表。所述于 2009年12月7日生成的ASCII拷貝被命名為HMJ106PCT. txt,并且其大小為11，473byteSo政府權(quán)益本發(fā)明部分由政府資助完成。政府對本發(fā)明具有一定的權(quán)利。相關(guān)申請的交叉引用本申請主張2008年12月10日遞交的美國臨時專利申請?zhí)?1/121，220的權(quán)益， 其全部公開內(nèi)容在此通過引用作為參考。背景乳腺癌(BCa)是女性最常見的癌癥診斷并且是女性中與癌癥相關(guān)死亡的第二主導(dǎo)因素(Ries LAG 等人(編)SEER Cancer Statistics Review, 1975-2003, National Cancer Institute, Bethesda,MD) 0過去20年間在乳腺癌治療中的主要進展使得無疾病生存(DFS)率顯著提高。例如，已經(jīng)將利用對腫瘤相關(guān)抗原有反應(yīng)性的抗體療法用于阻斷特定的細胞過程以減緩疾病進展或者預(yù)防疾病復(fù)發(fā)。盡管近來在乳腺癌治療上有所進展，但是相當數(shù)量的患者最終將死于復(fù)發(fā)疾病。疫苗由于易于給藥，以及因為他們在感染性疾病中觀察到的高成功率而是預(yù)防、減緩或者抑制復(fù)發(fā)疾病的發(fā)展的引人注意的模型。構(gòu)建癌癥疫苗的基本原理在理論上是直接的。然而實踐中，有效的實體瘤癌癥疫苗的開發(fā)僅存有限的成功。例如，一個嘗試給予針對轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的肽疫苗的小組僅觀察到2. 6%的客觀反應(yīng)率(objective response) (Rosenberg SA 等人，(2004) Nat. Med. 10 :909-15)。對于這一低成功率存在許多可能的解釋(Campoli M等人，(2005)Cancer Treat. Res. 123 :61-88)。例如，即使抗原與特定類型的腫瘤細胞特異性結(jié)合，但該腫瘤細胞可以僅表達低水平的抗原，或者它可以位于隱蔽位點或者屏蔽免疫檢測。此外，在腫瘤生長時，它們經(jīng)常通過使抗原脫落而改變它們的抗原譜。同樣影響該低成功率的事實是腫瘤細胞可以表達非常低水平產(chǎn)生免疫應(yīng)答所需的MHC蛋白以及其它的共刺激蛋白。在晚期癌癥患者中存在其它面臨針對腫瘤接種疫苗嘗試的問題。此種患者趨于具有較大的原發(fā)和轉(zhuǎn)移性腫瘤，并且腫瘤內(nèi)部的細胞由于血流量差而可能不易接近。這與疫苗策略趨于對惡性血液病治療更成功的觀察相一致(Radford KJ等人，(2005)Pathology 37 :534-50 ；以及Molldrem JJ(2006)Biol. Bone Marrow Transplant. 12 :13-8)。此外，當腫瘤變成轉(zhuǎn)移性的，它們可以產(chǎn)生將免疫抑制因子釋放到它們的微環(huán)境中的能力(Campoli， 2005 ；以及 Kortylewski M 等人，(2005)NatureMed. 11 :1314-21) 轉(zhuǎn)移性腫瘤也已經(jīng)與外周血淋巴細胞的數(shù)量減少以及樹突細胞功能障礙相關(guān)聯(lián)(Gillanders TO等人，Q006) Breast Diseases :A Year Book and Quarterly 17 :26-8)。雖然這些因素中的一些或全部可以造成難于開發(fā)有效的預(yù)防性或治療性疫苗，但是主要的潛在挑戰(zhàn)是多數(shù)腫瘤抗原是自體抗原或者與自體抗原具有高度的同源性，并且因此認為其從屬于嚴格的免疫耐受中。因此很明顯，許多基于肽的癌癥疫苗(具有或沒有免疫刺激輔助物)由于低免疫原性以及缺乏特異性而在臨床實踐上可能注定僅有有限的成功。在動物實驗和乳腺癌患者的臨床檢測中，基于單抗原的原型乳腺癌疫苗已經(jīng)略有小成地誘導(dǎo)了可測量的免疫應(yīng)答。然而，所觀察到的免疫應(yīng)答沒有轉(zhuǎn)化成對于通過標準療法(例如，手術(shù)、放射性療法和化療)所緩解的疾病復(fù)發(fā)的臨床上顯著的保護性免疫。HER2/neu是許多上皮惡性腫瘤中表達的原癌基因(Slamon DJ等人，(1989) Science 244 :707-1 。HER2/neu是表皮生長因子受體家族的成員并且編碼參與調(diào)節(jié)細胞生長及繁殖的185kd酪氨酸激酶受體(Popescu NC等人(1989)Genomics 4 :362-366 ； Yarden Y 等人 QOOl)NatRev Mol Cell Bio 2:127-137·)。在 25-30 % 的浸潤性乳腺癌(BCa)中發(fā)現(xiàn)了 HER2/neU的過表達和/或擴增并且這與更具攻擊性的腫瘤以及更差的臨床結(jié)果相關(guān)聯(lián)。(Slamon DJ 等人 kience (1987) 235 177-182 ;Slamon DJ 等人 Science (1989) 244 :707-12 ；Toikkanen S 等人 J ClinOncol (1992) 10 1044-1048 ； Pritchard KI 等人(2006) N. Engl. J. Med. 354 :2103-11.)主要通過免疫組織化學(xué)(IHC)和熒光原位雜交(FISH)兩種檢測來進行HER2/neu 狀態(tài)的確定。IHC檢測HER2/neU蛋白的過表達并且以O(shè)至3+(0 =陰性，I+=低表達，2+ =中度，和3+=過表達)的半定量標度來報告。另一方面FISH檢測HER2/neU基因的擴增(過量拷貝)并且以HER2/neU基因拷貝數(shù)與17號染色體基因拷貝數(shù)的比來表示，如果 FISH 彡 2. O 個拷貝，那么解釋為“過表達”。(Hicks DG 等人HumPathol (2005) 36 =250-261.) IHC 和 FISH 的一致率約 90%。(Jacobs 等人 J Clin Oncol (1999) 17 :1533-1541.)將 FISH 認為是金標準，因為回顧性分析揭示了它是曲妥珠單抗(Tz)應(yīng)答的較佳預(yù)測；它是更加客觀且可再現(xiàn)的。(Press MF 等人 J Clin Oncol (2002) 14 :3095-3105 ；Bartlett J 等人 J Pathol (2003) 199 :411-417 ;WolffAC 等人 J Clin Oncol (2007) 25 :118-145.)對HER2/neU作為原癌基因的鑒定和量化帶來了基于體液或抗體的被動免疫治療，包括曲妥珠單抗(Herceptin Genentech Inc.，SouthSan Francisco, CA)的使用。
曲妥珠單抗是結(jié)合HER2/neU蛋白的胞外近膜結(jié)構(gòu)域的重組人化單克隆抗體。(Plosker GL 等人 Drugs (2006) 66 :449-475.)對 HER2/neu 過表達(IHC 3+或者 FISH 彡 2. 0)、結(jié)陽性 (NP)以及轉(zhuǎn)移性 BCa 患者指示使用 Tz (Vogel CL 等人 J Clin Oncol (2002) 20 :719-726 ； Piccart-Gebhart MJ等人N Engl J Med (2005) 353 :1659-167 且其在具有低至中度HER2/
neu表達的患者中顯示出非常有限的活性。(Herceptin (曲妥珠單抗)，prescription product insert, Genentech Inc, South San Francisco, CA :2000 年 9 月修訂·)研究的另一種免疫治療形式是靶向?qū)τ谥T如HER2/neU的腫瘤相關(guān)抗原上的表位的細胞免疫應(yīng)答的接種疫苗和主動免疫治療。HER2/neU是若干可以刺激免疫系統(tǒng)以識別并殺死表達HER2/neu的癌細胞的免疫原性肽的來源。(Fisk B等人J Exp Med(1995) 181 2109-2117.)兩種此類太被命名為E75和GP2。E75和GP2都是9氨基酸肽，它們是人白細胞抗原(HLA)-A2-限制的并且刺激CTL識別和裂解表達HER2/neu的癌細胞(Fisk B等人 J Exp Med(1995) 181 :2109-2117 ；Peoples GE 等人 Proc Natl Acad Sci USA(1995)92 432-436)。E75衍生自HER2/neu蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域，并且對應(yīng)于HER2/neu氨基酸序列的氨基酸 369-377 (KIFGSLAFL) (SEQ IDNO :3)，其在美國專利 No. 6，514，942 中表示為 SEQ IDNO :11，所述專利以其整體通過參考并入本文。全長HER2/neU蛋白質(zhì)序列如下所示，并且在美國專利No. 5，869，445中表示為SEQ ID NO :2，所述專利以其整體通過參考并入本文MKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLR SLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILffKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVC AGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVT ACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSL AFLPESFD⑶PASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGIS WLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQC VNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVK PDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKI RKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENT SPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYL EDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVffSYGVTVff ELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQ NEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGG⑶LTLGLEPSE EEAPRSPLAPSEGAGSDVFD⑶LGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPD VRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLY YWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV(SEQ ID NO 1)嘗試了利用E75作為抗癌疫苗，例如，在過量表達HER2/neU蛋白質(zhì)的患有晚期癌癥患者中作為與不同免疫佐劑組合的單肽疫苗GaksTZ等人，(1998)CanCer Res. 58 4902-8 ；Knutson KL 等人，(2002)Clin. Cancer Res. 8 1014-8 ；以及 Murray JL 等人， (2002) Cl in. Cancer Res. 8 :3407-18)；載于自體樹突細胞上并且重新注入(Brossart P等人，(2000) Blood 96 :3102-8 ；以及 Kono K 等人，(2002) Cl in. Cancer Res. 8 :3394-3400)； 或者嵌入能夠結(jié)合HLA II類分子的較長肽中以便募集CD4輔助性T細胞(Disis ML等人，(1999) Clin. Cancer Res. 5 :1289-97 ；以及 Disis ML 等人，(2002) J. Clin. Oncol. 20 2624-32)。每種方法都刺激了 E75特異的細胞毒性T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，但是它們在晚期乳腺癌女性中沒有顯示臨床顯著的治療性或保護性免疫。使用E75疫苗制品無法表現(xiàn)出有意義的臨床益處一部分是由于下述事實，E75衍生自“自體”腫瘤抗原。靶向“自體”腫瘤抗原的癌癥疫苗，例如衍生自HER2/neU的那些，由于自體蛋白質(zhì)的免疫耐受性特征而有特有的困難。此外，前面的研究已經(jīng)關(guān)注于患有晚期疾病的癌癥患者，例如III期或IV期癌癥，而非在標準療法后無病的患者。因此，這些使用E75作為抗癌疫苗的嘗試沒有表現(xiàn)出該疫苗預(yù)防或延緩緩和后的疾病的復(fù)發(fā)的能力。基于這些E75的研究，其他人最近進行了臨床試驗以確定E75誘導(dǎo)的免疫力是否賦予了預(yù)防高風(fēng)險乳腺癌患者的復(fù)發(fā)的臨床益處。Peoples GE 等人，J. Clin. Oncol. (2005)23 :7536-45 ；Peoples GE 等人，Clin Cancer Res (2008) 14(3) :797-803 ；Holmes 等人，CanceH2008) 113 1666-75。這些研究的數(shù)據(jù)表明增加的體內(nèi)E75誘導(dǎo)的DTH應(yīng)答與復(fù)發(fā)患者的降低的復(fù)發(fā)和增加的存活時間相關(guān)。 最初由Peoples等人描述的GP2是衍生自HER2/neU蛋白質(zhì)的跨膜部分的9氨基酸肽，其對應(yīng)于全長序列的氨基酸654-662(即IISAVVGIL :SE Q ID NO 2) (Peoples GE等人，Proc Natl Acad Sci USA (1995) 92 :432_436，其通過引用以其整體并入本文)。該肽是使用來自患有乳腺癌和卵巢癌的患者的腫瘤相關(guān)淋巴細胞分離的，隨后被發(fā)現(xiàn)在一些上皮惡性腫瘤(包括非小細胞肺癌和胰腺癌)中也存在(Linehan DC等人，J Immunol (1995) 155 4486-4491 ;Peiper M 等人，Surgery(1997) 122 :235-242 ;Yoshino I 等人，Cancer Res (1994) 54 :3387-3390 ；Peiper M 等人，Eur J Immunol (1997) 27 :1115-1123)。E75對于HLA-A2分子具有高的結(jié)合親和性，被認為是HER2/neu蛋白質(zhì)的免疫顯性肽。它同樣也是實驗室和臨床研究中最有意義的HER2/neU衍生的肽。Peoples等人， J. Clin. Oncol. (2005)23:7536-45。同時也預(yù)期免疫顯性肽E75誘導(dǎo)更有力的免疫應(yīng)答。 另一方面，GP2對HLA-A2具有相對差的結(jié)合親和力，而被認為是亞優(yōu)勢表位。(FiskB，等人 J Exp Med(19%) 181 :2109-2117.)這是靶向于針對HER-2/neu表位的細胞免疫應(yīng)答的疫苗策略之所以集中于E75而非GP2的原因之一。GP2以前的研究使用了自體樹突狀細胞離體脈沖GP2(和其它肽)并且皮下 (Brossart P 等人 Blood(2000)96 :3102-3108)或靜脈內(nèi)(Dees EC 等人 Cancer Immunol Immunother (2004) 53 :777-785)再次注射到患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌或卵巢癌的HER2/neu+患者中以誘導(dǎo)CTL應(yīng)答。Brossart等人檢測了體內(nèi)的肽特異性(GP2和E7Q CTL應(yīng)答，他們注意到，盡管有已知的在HLA-AL結(jié)合親和力上的差異，兩種肽表現(xiàn)出了相似的免疫應(yīng)答。Dees 等人評價了在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中的GP2-脈沖的樹突細胞，能夠臨床記錄到兩名患者中的穩(wěn)定疾病。但是，重要的是，沒有研究使用GP2作為肽疫苗。而在兩個研究中，用已經(jīng)被 GP2脈沖的樹突細胞注射患者。此外，與E75研究類似，GP2研究限于患有晚期癌癥的患者。 因此，Brossart和Dees都沒有證明GP2脈沖的樹突細胞預(yù)防或延緩緩和后的疾病復(fù)發(fā)的能力。如E75，癌癥疫苗靶向“自體”腫瘤抗原，如GP2所衍生自的HER2/neU，現(xiàn)今獨特的困難是由于自體蛋白質(zhì)的免疫耐受特征。Peoples等人已經(jīng)預(yù)先評價了使用GP2用于基于肽的乳腺癌疫苗試驗，這是通過在體外用GP2-脈沖的樹突細胞和自乳腺癌患者中獲得的CD8T細胞進行細胞毒性測定 (Mittendorf EA等人CanceH2006) 106 :2309-2317.)。盡管來自這些體外實驗的結(jié)果證實了在患有HER2/neU+乳腺癌女性中存在GP2特異性前體細胞毒性T淋巴細胞，但是結(jié)論是由于對給定肽的應(yīng)答的多樣性以及在體內(nèi)抗原表達的異質(zhì)性，需要用多種不同的肽(包括免疫顯性肽E7Q接種，來提供足夠的免疫應(yīng)答(Mittendorf EA等人Cancer (2006) 106 2309-2317.)。如上所述，指示了曲妥珠單抗用于HER2/neu過量表達((IHC 3+或FISH > 2. 0))、 結(jié)陽性(NP)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，并且表現(xiàn)出在具有低至中等HER2/neU表達的患者中非常有限的活性。類似地，在上述研究中，接受基于E75和GP2的疫苗的患者的選擇部分是基于過表達HER2/neU腫瘤的存在。因此，并不預(yù)期GP2肽疫苗在具有低至中等水平的HER2/ neu腫瘤表達的癌癥患者中有效。概述在一個實施方案中，本發(fā)明涉及在具有HER2/neU表達的腫瘤細胞的受試者中預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)的方法。在優(yōu)選的實施方案中，該方法涉及在用標準治療過程治療后有所緩解的受試者中預(yù)防乳腺癌復(fù)發(fā)。在一個實施方案中，標準治療過程是用曲妥珠單抗治療，所述治療可以與本文描述的方法一起繼續(xù)進行。該方法包括給予受試者有效量的包括藥學(xué)有效載體以及GP2肽的組合物。優(yōu)選地，GP2肽具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列。在一個實施方案中，除了 GP2肽，組合物不包含任何其它的HER2/neu衍生肽，包括例如免疫顯性肽E75. 可以通過本領(lǐng)域任何適合的方法完成給藥，例如接種或注射，更具體為皮內(nèi)注射，其可以以一次或多次單獨劑量來進行。該劑量可以包括相等濃度的肽和免疫佐劑，可以基本上同時給予，并且可以在皮膚表面的一個接種位點或者相互分開的位點給予。按月計，可以給予組合物約三至六次或者更多次直到建立保護性免疫。在一些方面中，組合物還包括諸如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)(優(yōu)選地重組人GM-CSF)的佐劑。在一些方面中，該方法還包括給予受試者加強疫苗(booster vaccine)劑量，其包括有效量的包括藥學(xué)有效載體以及具有SEQ IDNO :2的氨基酸序列的肽的組合物。一些方面，加強劑的組合物還包括諸如GM-CSF(優(yōu)選的重組人GM-CSF)的佐劑?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域的任何合適的方式實現(xiàn)加強劑的給藥，例如接種或注射，并且更特別地，皮內(nèi)注射，其可以用一個或多個分開的劑量進行。此類劑量可以包含相等濃度的肽和免疫佐劑，可以同時大量給藥，并且可以在皮膚表面的一個接種位點或者相互分開的位點給予。通常在初次免疫方案完成后給予加強劑，并且優(yōu)選地在初次免疫后，根據(jù)需要每6或12個月給予。受試者可以是任何哺乳動物，優(yōu)選人類。某些方面，人對于血液分型為人白細胞抗原A2或人白細胞抗原A3的主要的組織相容性抗原是陽性的。其它方面，來自人的癌細胞對可測水平的HER2/neu的表達是陽性的。一些方面，癌細胞表現(xiàn)出低或中度HER2/neu表達。例如，一些優(yōu)選的方面，來自人的癌細胞具有免疫組織化學(xué)(IHC)評分為1+或2+，和/ 或熒光原位雜交(FISH)評分小于2.0。其它方面，來自人的癌細胞可以具有IHC評分高達 3+。其它方面，來自人的癌細胞可以表現(xiàn)出HER2/neU的過表達。例如，一些優(yōu)選的方面，來自人的癌細胞具有免疫組織化學(xué)(IHC)評分為3+和/或熒光原位雜交(FISH)評分大于或等于2.0。在其他實施方案中，人預(yù)先不存在對GP2 (SEQ IDNO :2或SEQ ID NO 4)的免疫。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于本申請中描述的方法的組合物。另一方面，該組合物包括可藥用的載體，有效量的具有SEQ IDNO 2的氨基酸序列的肽，以及諸如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的佐劑。優(yōu)選以優(yōu)化的免疫方案給予組合物。在一個實施方案中，疫苗組合物包含0. 1-lmg/ml肽和0. 125-0. 5mg/ml佐劑。一些具體方面，疫苗組合物的優(yōu)選的濃度和方案包括(1) lmg/ml肽和0. 25mg/ml佐劑，(2)0. 5mg/ml肽和0. 25mg/ml 佐劑，(3) 0. lmg/ml 肽和 0. 25mg/ml 佐劑，(4) lmg/ml 肽和 0. 125mg/ml 佐劑，以及(5) 0. 5mg/ ml肽和0. 125mg/ml佐劑，各為每月接種，至少連續(xù)6個月，然后周期性加強接種(優(yōu)選地每半年或每年)，持續(xù)1年、2年或3年或更多年。附圖概述所包含的附圖提供對本發(fā)明的進一步的理解，并引入組成本說明書的一部分，附圖多方面圖解本發(fā)明，并與說明書一起用于解釋本發(fā)明的原理。附圖中

圖1通過劑量組顯示了針對GM-CSF劑量的平均局部反應(yīng)。在四個劑量組中用肽和 GM-CSF 接種患者。A IOOmcg 肽 /250mcg GM-CSF 劑量組。B. 500mcg 肽 /250mcg GM-CSF 劑量組。C. IOOOmcg 肽/250mcg GM-CSF 劑量組。D. 500mcg 肽/125mcg GM-CSF 劑量組。以毫米測量局部反應(yīng)(實線)。局部反應(yīng)> IOOmm硬結(jié)需要GM-CSF劑量減少50% (虛線)。 無肽劑量減少。圖2顯示了 GP2 I期試驗中的所有患者的毒性和免疫應(yīng)答。A 毒性-無患者經(jīng)歷3-5級的局部或全身毒性。B.離體免疫應(yīng)答——前-最大％特異性⑶8+T-細胞顯著性增加(p = 0. 001)。C.體內(nèi)免疫應(yīng)答——GP2前-后DTH顯著性增加(p = 0. 002)。也顯示了生理鹽水(NS)對照用于比較。圖3顯示了 GP2I期試驗中的患者的毒性和免疫應(yīng)答，所述試驗比較了無預(yù)先存在免疫性(前-二聚體< 0. 03)和預(yù)先存在免疫性(前-二聚體> 0. 03)。Α.毒性-盡管沒有顯著增加，在無預(yù)先存在免疫的患者中毒性有少量增加。B.離體免疫應(yīng)答-無預(yù)先存在免疫的患者在對接種的應(yīng)答中表現(xiàn)出前-最大、前-后和前-長期的％特異性CD8+T細胞的統(tǒng)計學(xué)顯著的增加(分別是P = O. 003，ρ = 0. 03和ρ = 0. 01)。C.體內(nèi)免疫應(yīng)答—— 前-后DTH應(yīng)答均顯著增加(無ρ = 0. 03和預(yù)先存在ρ = 0. 0004)。注意到在DTH應(yīng)答后無統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P = 0. 3)。圖4顯示了 GP2I期試驗中的所有患者的毒性和免疫應(yīng)答，所述試驗對比GM-CSF 劑量125mcg vs 250mcg。Α.毒性-盡管沒有顯著增加，在GM-CSF 250mcg的患者中毒性有少量增加。B.離體免疫應(yīng)答-GM-CSF 125mcg前-最大％特異性⑶8+T細胞沒有顯著增加 (p = 0. 17)，但是GM-CSF 250mcg前-最大％特異性CD8+T細胞則顯著增加(p = 0. 005)。 C.體內(nèi)免疫應(yīng)答-GM-CSF 125mcg和250mcg前-后DTH顯著增力口 (分別是ρ = 0. 009，且ρ =0. 008)。在GM-CSF 125mcg后DTH和GM-CSF 250mcg后DTH之間沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性(ρ =0. 1)。圖5顯示了應(yīng)答GP2的離體免疫應(yīng)答和表位擴展。在用GP2肽接種疫苗的應(yīng)答中測量平均Ε75特異性⑶8+Τ淋巴細胞。比較了接種前Ε75 二聚體vs最大(0.8士0.2% vs. 2.0士0.2%，ρ = 0.0001)，前 vs 后(0.8士0.2% vs. 1.2士0.2%，ρ = 0. 1)，以及前 vs 長期(0. 8士0. 2% vs. 1. 0士0. 2% ；ρ = 0. 6)。注意到在GP2和E75值之間沒有顯著差異， 但是注意到有更大的E75最大二聚體應(yīng)答的趨勢O. 0士0. 2% vs. 1. 4士0. 2%;p = 0. 07)。圖6顯示了 GP2 II期試驗中患者的體內(nèi)免疫應(yīng)答。在GP2肽組(PG)中，從接種前水平到接種后水平，對GP2的DTH反應(yīng)中值顯著增加(1.0士0.8cm至18. 0士3. Icm ； P < 0.0001)，而在對照佐劑組(AG)中，則具有較低的程度(0.0士 1.0cm至0.5士3. 3cm; ρ <0.01)。相較于 AG，在 PG 中接種后 DTH 顯著更大(18. 0 士 3. Icm vs 0. 5 士 3. 3cm，ρ = 0. 002)。詳細說明將多種涉及本發(fā)明方法和其它方面的術(shù)語用于本說明書和權(quán)利要求通篇。除非另有指明，否則以本領(lǐng)域普通含義給出該術(shù)語。對于其他特別定義的術(shù)語，以與此處提供的定義相一致的方式來解釋。術(shù)語“預(yù)防”的各種形式指通過任何客觀或主觀參數(shù)(包括放射學(xué)的或身體檢查的結(jié)果)所測量，在臨床緩解的患者中預(yù)先阻止或延緩乳腺癌復(fù)發(fā)(recurrence)/復(fù)發(fā) (relapse)的任何成功或該成功的任何象征?！坝行Я俊被颉爸委熡行Я俊痹诖嘶Q使用，并且指如在此所描述的對于實現(xiàn)特定生物學(xué)結(jié)果有效的化合物、物質(zhì)或組合物的量，該生物學(xué)結(jié)果例如但不限于在此公開、描述或示例的生物學(xué)結(jié)果。該結(jié)果可以包括但不限于由適于本領(lǐng)域的任何方法所測定的乳腺癌的預(yù)防，并且更具體地，復(fù)發(fā)乳腺癌的預(yù)防，例如受試者中復(fù)發(fā)的預(yù)防。最佳治療量指實現(xiàn)最佳治療結(jié)果的劑量、方案和加強劑的使用。
“可藥用的”指鑒于組合物、制劑、穩(wěn)定性、患者接受以及生物可利用性的角度，從藥學(xué)/毒理學(xué)觀點講，患者可接受的那些特性和/或物質(zhì)，以及從物理/化學(xué)觀點講，對從事制造的藥劑師而言可接受的那些特性和/或物質(zhì)?！翱伤幱幂d體”指不干擾活性成分的生物活性的效力并且對于其給予的宿主沒有毒性的介質(zhì)?！氨Ｗo性免疫”或“保護性免疫應(yīng)答”意指受試者建立了對于抗原如在此描述和示例的乳腺癌抗原的免疫原性組分的活性免疫應(yīng)答，以致在隨后暴露于該抗原時，受試者的免疫系統(tǒng)能夠靶向并破壞表達該抗原的細胞，從而減少受試者癌癥復(fù)發(fā)的發(fā)病率和死亡率。本發(fā)明上下文中的保護性免疫優(yōu)選由T淋巴細胞所賦予，但不排除其它?！邦A(yù)存免疫”被定義為至少0. 3%肽特異性二聚體水平?？梢允褂脴藴蕼y定，例如本申請中描述的HLA-A2免疫球蛋白二聚體測定，來測量肽特異性二聚體水平。術(shù)語“約”當在此用于指可測值例如量、持續(xù)時間等時意指包含與該特定值有士 20%或士 10%，更優(yōu)選士 5%，甚至更優(yōu)選士 1%，且還更優(yōu)選士 0. 的變化，該變化對于進行所公開的方法是適當?shù)??！半摹敝溉魏伟ㄍㄟ^肽鍵或修飾肽鍵(即肽電子等排體)相互連接的兩個或多個氨基酸。多肽指短鏈(通常稱作肽、寡肽或寡聚物)和較長鏈(通常稱作蛋白質(zhì))。多肽可以含有除20種基因編碼的氨基酸以外的氨基酸。多肽包括通過天然加工(例如翻譯后加工)或通過本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)修飾技術(shù)所修飾的氨基酸序列。此種修飾在基礎(chǔ)課本中被充分地描述并且在專著以及很多的研究文獻中被更加詳細地描述。修飾可以在多肽的任何位置發(fā)生，包括肽骨架、氨基酸側(cè)鏈以及氨基或羧基末端。應(yīng)理解的是在給定多肽的若干位點處，可以以相同或不同程度存在相同類型的修飾。給定多肽也可以含有許多類型的修飾。作為遍在蛋白化的結(jié)果，多肽可以分支，并且他們可以是帶有或不帶有分支的環(huán)形。環(huán)形、分支以及分支的環(huán)形多肽可以由天然翻譯后加工或者可以由合成方法所產(chǎn)生。修飾包括乙?；?、?；DP-核糖基化、酰胺化、黃素共價結(jié)合、血紅素部分的共價結(jié)合、核苷酸或核苷酸衍生物的共價結(jié)合、脂或脂衍生物的共價結(jié)合、磷脂酰肌醇的共價結(jié)合、交聯(lián)、環(huán)化、 二硫鍵形成、去甲基化、共價交聯(lián)的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲?；-羧化、糖基化、GPI錨形成、羥化、碘化、甲基化、豆蔻?；?、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、轉(zhuǎn)運RNA介導(dǎo)的氨基酸向蛋白質(zhì)的添加例如精氨?；?arginylation)，和遍在蛋白化?！凹訌妱敝附o予患者以增強、延長或維持保護性免疫以及克服由調(diào)節(jié)T細胞介導(dǎo)的T細胞應(yīng)答下調(diào)的劑量免疫原?！盁o乳腺癌”或者“無疾病”或者NED(無疾病證據(jù))意指患者處于由目前標準護理療法的治療所引起的臨床緩解。對于同義使用的“緩解”或“臨床緩解”，其意指根據(jù)臨床診斷，乳腺癌的臨床體征、放射學(xué)體征以及癥狀已經(jīng)顯著減少或者完全消失，盡管癌細胞仍舊可能存在于體內(nèi)。因此，認為緩解包括部分和完全緩解。殘留癌細胞的存在可以通過諸如 CTC(循環(huán)腫瘤細胞)檢測法來計算并且可以預(yù)測復(fù)發(fā)?！皬?fù)發(fā)(Relapse) ”或“復(fù)發(fā)(recurrence) ”或“再現(xiàn)(resurgence)，，在此互換使用，并且指在一段時間的改善或緩解后，乳腺癌的復(fù)發(fā)的放射照相診斷，或者復(fù)發(fā)的體征和癥狀。乳腺癌是世界范圍女性主要的健康關(guān)注。迄今嘗試的乳腺癌疫苗效力有限，尤其是對于預(yù)防在標準治療過程后減輕的患者的復(fù)發(fā)。如本申請所討論的，確定了給予HER2/ neu原癌基因的肽GP2(SEQ ID NO⑵可以誘導(dǎo)有效的體內(nèi)免疫應(yīng)答，所述應(yīng)答已知與無疾病患者中降低的乳腺癌復(fù)發(fā)率相關(guān)。GP2肽與MHC HLA-A2相關(guān)，并且因此可以誘導(dǎo)具有 HLA-A2單元型的患者中的保護性免疫。HLA-A2單元型已經(jīng)顯示為卵巢癌(Gamzatova等人， Gynecol Oncol (2006) 103 :145-50)和前列腺癌(Hueman 等人，Clin Cancer Res (2005) 11 7470-79 ；De Petris等人，Med Oncol (2004) 21 :49-52)中的陰性預(yù)測因子，并且這一發(fā)現(xiàn)可能也擴展至乳腺癌。因此，HLA-A2+患者似乎表現(xiàn)為減輕后癌癥復(fù)發(fā)的更高的風(fēng)險。但是， 意外證明包含GP2+GM-CSF的疫苗組合物有效誘導(dǎo)HLA-A2+患者中的強力的體內(nèi)免疫應(yīng)答， 所述患者已知與較之HLA-A2-對照患者更低的乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險和更長的無疾病存活相關(guān)。 此外，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)用GP2 (亞優(yōu)勢表位)和GM-CSF治療的患者表現(xiàn)出較之包含E75 (免疫優(yōu)勢表位)和GM-CSF的疫苗組合物更強力的DTH應(yīng)答。值得注意的是，這些結(jié)果并非通過組合GP2與另一表位(例如E7Q來產(chǎn)生多表位疫苗而獲得的，而是用單表位(即GP2) 疫苗來獲得的。此外，基于初步的數(shù)據(jù)，表明了 GP2也可以誘導(dǎo)具有HLA-A3單元型的患者中的保護性免疫。由于GP2衍生自HER2/neu蛋白質(zhì)，人們將預(yù)期過量表達HER2/neu的患者將較之那些具有低至中等HER2/neU表達的患者表現(xiàn)出對于基于GP2的疫苗更好的應(yīng)答。例如， 另一種基于 HER2/neu 的療法，曲妥珠單抗(Herceptill Genentech Inc.，South San Francisco, CA)僅僅被認為用于HER2/neu過表達(IHC 3+或FISH彡2. 0)，結(jié)陽性(NP)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，并且在具有低至中等的HER2/neU表達的患者中表現(xiàn)出非常有限的活性。 但是，出人意料地觀察到具有低至中等水平的HER2/neU表達的患者經(jīng)歷了針對GP2的強力的免疫應(yīng)答，強度類似于在過量表達HER2/neU的患者中的GP2誘導(dǎo)的應(yīng)答。因此，本發(fā)明的一個方案涉及誘導(dǎo)針對乳腺癌復(fù)發(fā)(relapse或recurrence)的保護性免疫的疫苗組合物。另一實施方案提供了誘導(dǎo)及維持針對乳腺癌的保護性免疫的方法，并且更具體的針對復(fù)發(fā)的乳腺癌。一些方面，本方法包括向受試者給予有效量的包括藥學(xué)有效的載體、具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列的多肽以及任選地免疫佐劑(例如GM-CSF) 的組合物。SEQ ID NO :2的變體包括具有如美國專利公開號NO. 20050169934(其以其整體通過參考并入本文)所描述的具有修飾的氨基酸側(cè)鏈的那些，其適于在本申請的疫苗組合物和方法中使用。此外，已經(jīng)鑒定了在密碼子655處的天然存在的多態(tài)性(異亮氨酸至纈氨酸的取代)，其產(chǎn)生具有序列IVSAVVGIL(SEQ ID NO :4)的多態(tài)型GP2肽(Papewalis等人， Nucleic Acid Res. (1991) 19:5452)。這一多態(tài)型GP2肽也適合用于本申請的疫苗組合物和方法。類似地，一些小組已經(jīng)調(diào)查了在GP2肽的多個位點上引入的單一、兩個和三個氨基酸取代，所述位點包括錨定殘基(第2位和第9位)，并且發(fā)現(xiàn)某些氨基酸取代導(dǎo)致GP2與 HLA-A2 的增加的結(jié)合(Tanaka 等人，Int JCancer (2001) 94 :540-44 ；Kuhns 等人，J Biol Chem(1999) 274 :36422-427 ；Sharma 等人，J Biol Chem(2001) 276 :21443_449，這些參考均在此以其整體通過引用并入本文)。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解可以對GP2進行某些取代(特別是在錨定殘基上)，而不負面影響其誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答的能力。在一個實施方案中，除了在增加GP2肽對HLA-A2分子的親和力的殘基處的取代外，GP2肽包含SEQ ID NO 2或SEQ ID NO :4的氨基酸序列。優(yōu)選地，取代發(fā)生在GP2的一個或兩個錨定殘基處(第2和第9位)。更優(yōu)選地，取代包含在第2位的異亮氨酸至亮氨酸的取代和/或在第9位的亮氨酸至纈氨酸的取代。在另一個實施方案中，除了在下述殘基處的取代外，GP2肽包含SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4的氨基酸序列，與包含SEQ ID NO 2的野生型GP2肽對HLA-2分子的親和力相比，所述取代不影響GP2肽對HLA-A2分子的親和力。用于測試GP2和HLA-A2 的結(jié)合親和力的測定是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如Siarma等人，J Biol Chem(2001) 276 21443-449中公開的T2細胞表面集合測定。在一個方面，GP2肽的氨基酸殘基不超過9、10、11、12、13、14或15個。在一個實施方案中，GP2肽的氨基酸殘基不超過9個。優(yōu)選地，具有不超過9個氨基酸的GP2肽是SEQ ID NO :2或SEQ IDNO :4，或具有在第2位和/或第9位處的取代的SEQ ID NO :2或SEQID NO 4的突變形式。受試者可以是任何動物，并且優(yōu)選哺乳動物例如人、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、 貓、狗、猴、牛、馬、豬等。最優(yōu)選人。高度優(yōu)選的方面，人對于HLA-A2單元型是陽性的。其它優(yōu)選的方面，人類對于人HER2/neU的表達是陽性的，優(yōu)選包括具有低和/或中度表達HER2/ neu的腫瘤的人類，以及作為HER2/neU的過表達者的人類。此外，我們的小組以前證明了曲妥珠單抗和GP2肽刺激的離體CTL之間可能的協(xié)同作用。用曲妥珠單抗預(yù)處理乳腺癌細胞，然后將其與GP2-肽誘導(dǎo)的CTL孵育，在三個腫瘤細胞系中，產(chǎn)生了較之用曲妥珠單抗或GP2-特異性CTL單獨處理而言增強的細胞毒性 (Mittendorf EA 等人，Annals of Surgical Oncology (2006) 13(8) :1085-1098)。鑒于本申請中公開的用GP2的實驗結(jié)果，這些發(fā)現(xiàn)表明在曲妥珠單抗治療期間同時GP2接種可能是有效的組合免疫療法?？梢愿鶕?jù)適于本領(lǐng)域的任何方法以凍干或液體制劑來配制疫苗組合物。液體形式制劑的非限制性實例包括溶液、懸劑、糖漿劑、漿液和乳劑。適合的液體載體包括任何適合的有機或無機溶劑，例如水、醇、鹽水溶液、緩沖的鹽水溶液、生理鹽水溶液、葡萄糖溶液、丙二醇水溶液等，優(yōu)選無菌形式。可以以中性或鹽形式配制疫苗組合物。可藥用的鹽包括酸加成鹽(由活性多肽的游離氨基形成)、及由無機酸(例如鹽酸或磷酸)或者有機酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸)等形成。由游離羧基形成的鹽也可以源自無機堿例如鈉、鉀、銨、鈣、或者鐵的氫氧化物，以及如異丙胺、三甲基胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的有機堿。優(yōu)選配制疫苗組合物用于接種或注射受試者。對于注射，本發(fā)明的疫苗組合物可以配制為水性溶液如水或醇，或者生理上相容的緩沖液如Hank’ s溶液、Ringer’ s溶液或生理鹽水緩沖液。該溶液可以含有配方劑如懸劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?？梢砸怨腆w形式制劑來制備注射制劑，該固體制劑旨在于例如使用前通過適合的介載體如無菌水、 鹽水溶液或醇構(gòu)建于使用前不久轉(zhuǎn)化成適于注射的液體形式制劑。也可以以緩釋介載體或緩釋劑配制疫苗組合物。可以通過接種或植入(例如皮下或肌肉內(nèi))或通過注射給予此長效的制劑。因此，例如可以用適合的聚合材料或疏水材料 (例如作為可接受的油中的乳液)或離子交換樹脂，或者作為略溶的衍生物(例如作為略溶的鹽)配制疫苗組合物。脂質(zhì)體和乳劑是適合用作載體的遞送介載體的公知實例。疫苗組合物可以包括增強疫苗保護效力的活性劑，例如佐劑。佐劑包括作用于增加對GP2肽抗原的保護性免疫應(yīng)答，從而降低疫苗中所需抗原量、和/或產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答所需給藥頻率的任何化合物或多種化合物。佐劑可以包括例如乳化劑、胞壁酰二肽、阿夫立定(avridine)、水性佐劑如氫氧化鋁、基于殼聚糖的佐劑、和本領(lǐng)域已知的多種皂苷、 油及其他物質(zhì)中的任一，例如愛菲金(Amphigen)、LPS、細菌細胞壁提取物、細菌DNA、CpG序列、合成的寡核苷酸及其組合(Schijns等人，(2000)Curr. Opin. Immunol. 12 :456)、草分枝桿菌(Mycobacterialphlei (M. phlei))細胞壁提取物((MCffE)(美國專利No. 4，744，984))、 草分枝桿菌(M. phlei) DNA (M-DNA)和M-DNA-M. phlei細胞壁復(fù)合物(MCC))?？梢杂米魅榛瘎┑幕衔锇ㄌ烊缓秃铣傻娜榛噭约瓣庪x子、陽離子和非離子化合物。合成的化合物中，陰離子乳化試劑包括例如月桂酸和油酸的鉀、鈉和銨鹽，脂肪酸的鈣、鎂和鋁鹽，以及有機磺酸鹽如硫酸月桂酯鈉。合成的陽離子試劑包括例如十六烷基三甲基溴化銨，而合成的非離子試劑示例為甘油酯(例如單硬脂酸甘油酯)、聚乙二醇酯和醚，以及山梨糖醇酐脂肪酸酯(例如山梨糖醇酐單棕櫚酸酯)及其聚氧乙烯衍生物(例如聚氧乙烯山梨糖醇酐單棕櫚酸酯)。天然乳化試劑包括阿拉伯膠、明膠、卵磷脂和膽固醇?？梢杂捎徒M分，例如單一油、油混合物、油包水乳液或水包油乳液來形成其他適合的佐劑。油可以是礦物油、植物油或動物油。礦物油是通過蒸餾技術(shù)獲自礦脂的液體碳氫化合物，并且本領(lǐng)域也稱作液體石蠟、液體礦脂或石蠟油。適合的動物油包括例如魚肝油、 大比目魚油、鯡魚油、羅非魚油和鯊魚肝油，其全部是市售可得的。適合的植物油包括例如芥花籽油、杏仁油、棉籽油、玉米油、橄欖油、花生油、紅花油、芝麻油、豆油等。Freimd’ s完全佐劑(FCA)和Freimd’ s不完全佐劑(FIA)是通常用于疫苗制劑的兩種常見佐劑，并且也適合用于本發(fā)明。FCA和FIA都是礦物油包水乳液；然而，F(xiàn)CA也含有滅活的分枝桿菌屬 (Mycobacterium sp.) 0也可以將免疫調(diào)節(jié)細胞因子用于疫苗組合物以增強疫苗效力，例如作為佐劑。該細胞因子的非限制性實例包括干擾素α (IFN-α)，白介素-2(IL_2)，以及粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，或其組合。GM-CSF是高度優(yōu)選的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的技術(shù)，包括但不限于混合、超聲法和微流化 (microfluidation)來制備包括GP2肽抗原以及還包括佐劑的疫苗組合物。佐劑可以組成約10%至約50% (ν/ν)的疫苗組合物，更優(yōu)選約20%至約40% (ν/ν)，并且更優(yōu)選約20% 至約30% (ν/ν)，或者這些范圍內(nèi)的任何整數(shù)。高度優(yōu)選約25% (ν/ν) 0可以通過灌注或注射(例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、十二指腸內(nèi)、腹膜內(nèi)等)給予疫苗組合物。也可以鼻內(nèi)、陰道、直腸、口服或經(jīng)皮給予疫苗組合物。此外，可以通過“無針”遞送體系給予疫苗組合物。優(yōu)選地，通過皮內(nèi)注射給予該組合物?？梢栽卺t(yī)生或醫(yī)生助理的指導(dǎo)下給藥。注射可以分成多次注射，此種分開接種優(yōu)選地基本上同時給藥。當作為分開接種給藥時，免疫原的劑量優(yōu)選在每個單獨的注射中等分，但也非必須。如果疫苗組合物中存在佐劑，佐劑的劑量優(yōu)選在每個單獨的注射中等分，但也非必須。用于分開接種的單獨的注射優(yōu)選在患者身體上彼此基本上鄰近的給予。一些優(yōu)選的方面，在身體上彼此至少隔開約Icm 給予注射。一些優(yōu)選的方面，在身體上彼此至少隔開約2. 5cm給予注射。高度優(yōu)選的方面， 在身體上彼此至少隔開約5cm給予注射。一些方面，在身體上彼此至少隔開約IOcm給予注射。一些方面，在身體上彼此隔開大于IOcm給予注射，例如在身體上彼此隔開約12. 5、15、 17. 5、20cm或者更多。初次免疫注射和加強劑注射可以按照在此所述和示例而作為分開接種給予?？梢允褂枚喾N可選的藥物遞送體系。此種體系的非限制性實例包括脂質(zhì)體和乳劑。也可以使用某些有機溶劑如二甲基亞砜。此外，可以使用緩釋體系，例如含有治療劑的固體聚合物的半滲透基質(zhì)來遞送疫苗。多種可用的緩釋材料是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。緩釋膠囊可以根據(jù)它們的化學(xué)性質(zhì)在若干天到若干周到若干月的范圍內(nèi)釋放疫苗組合物。為了預(yù)防處于乳腺癌緩解的患者乳腺癌復(fù)發(fā)，將治療有效量的疫苗組合物給予受試者。如以本領(lǐng)域中的任何適合方法所測量，治療有效量將在患者中提供GP2特異性細胞毒性T-淋巴細胞(CD8+)數(shù)量的臨床顯著增加，以及對于該抗原的細胞毒性T淋巴細胞應(yīng)答的臨床顯著增加。此外，由于表位擴展，治療有效量的GP2疫苗組合物將在患者中提供E75 特異性細胞毒性T-淋巴細胞(CD8+)的數(shù)量的增加，如本領(lǐng)域適合的任何方法所測量的?？傮w上，患者中，治療有效量的疫苗組合物將破壞殘留的微觀疾病并且顯著降低或消除患者中乳腺癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險。疫苗組合物的有效量可以取決于任何數(shù)量的變量，包括但不限于患者的物種、品種、體型、高度、重量、年齡、總體健康、制劑類型、給藥模式或方式、或者是否存在顯著增加患者復(fù)發(fā)乳腺癌的可能性的風(fēng)險因素。此風(fēng)險因素包括但不限于手術(shù)類型、淋巴結(jié)狀態(tài)和陽性數(shù)量、腫瘤大小、腫瘤組織學(xué)級別、激素受體(雌激素和孕酮受體)存在與否、HER2/neU 表達、淋巴血管浸潤以及遺傳傾向性(BRCA 1和幻。一些優(yōu)選的方面，有效量取決于患者是淋巴結(jié)陽性或淋巴結(jié)陰性，并且如果患者是淋巴結(jié)陽性，則取決于陽性結(jié)的數(shù)量和程度。所有情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用常規(guī)優(yōu)化技術(shù)和醫(yī)師熟練且知情的判斷以及其它對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的因素來常規(guī)確定適當?shù)挠行Я?。?yōu)選地，在此描述的疫苗組合物的治療有效量將對受試者提供治療預(yù)防益處而不造成實質(zhì)毒性?？梢栽诩毎囵B(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏型ㄟ^標準藥學(xué)方法(例如用于測定LD50 (群體中 50%致死的劑量)和ED50(群體中50%治療有效的劑量)的方法)來確定疫苗組合物的毒性和治療效力。毒性和治療效果之間的劑量比是治療指數(shù)并且它可以表示為LD50/ED50 比率。優(yōu)選顯示高治療指數(shù)的疫苗組合物?？梢詫@自細胞培養(yǎng)物檢測和動物研究的數(shù)據(jù)用來配制用于患者的劑量范圍。此疫苗組合物的劑量優(yōu)選處于包括具有少量或沒有毒性的 ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)?？梢愿鶕?jù)所用劑型以及使用的給藥途徑在此范圍內(nèi)改變劑量?？梢允褂枚拘孕畔⒁愿訙蚀_地確定對特定受試者如人的有用劑量。治療醫(yī)生可以由于毒性或器官功能障礙而終止、中斷或調(diào)整給藥，并且如果臨床應(yīng)答不足，可以按需要調(diào)整治療來提高應(yīng)答。預(yù)防復(fù)發(fā)乳腺癌的給藥劑量數(shù)量將隨患者病情的嚴重性、復(fù)發(fā)的相對風(fēng)險或者給藥途徑等等因素而變化?；颊卟∏榈膰乐匦钥梢岳绮糠滞ㄟ^標準預(yù)后評估方法來評估?？梢砸匀魏芜m于誘導(dǎo)和/或維持針對乳腺癌復(fù)發(fā)的保護性免疫，并且更具體地， 誘導(dǎo)和/或維持對GP2和/或E75 (由于表位擴展)的細胞毒性T淋巴細胞應(yīng)答的方案向患者給予疫苗組合物。例如，可以按在此所述和示例向患者給予疫苗組合物作為初次免疫， 隨后給予加強劑以增強和/或維持保護性免疫。一些方面，可以每月1次、2次或更多次向患者給予疫苗組合物。優(yōu)選每月一次連續(xù)6個月以建立保護性免疫應(yīng)答，尤其對于初次免疫方案。一些方面，可以在初次免疫方案完成后，以常規(guī)間隔如每6個月或更多個月給予加強劑。加強劑的給藥優(yōu)選為每6個月。也可以視需要給予加強劑。只要患者需要，可以持續(xù)疫苗給藥方案，包括初次免疫和加強劑給藥，例如在若干年的療程中，至患者終生。一些方面，疫苗方案包括在疫苗方案初始更頻繁的給藥，以及包括隨著時間而較不頻繁的給藥(如加強劑)以維持保護性免疫。可以在疫苗方案初始以較低劑量給予疫苗，而隨著時間以較高劑量給予。也可以在疫苗方案初始以較高劑量給予疫苗，而隨著時間以較低劑量給予?？梢孕薷暮?或調(diào)整初次疫苗和加強劑給藥的頻率以及給予的GP2的劑量以滿足個別患者的特別需要，由給藥醫(yī)生根據(jù)本領(lǐng)域的任何適合方法所確定。一些方面，疫苗組合物(包括作為加強劑給藥的組合物)包括約0. Img至約IOmg 的GP2肽。一些優(yōu)選的方面，該組合物包括約0. Img的GP2。一些優(yōu)選的方面，該組合物包括約Img的GP2。一些最優(yōu)選的方面，該組合物包括約0. 5mg的GP2?！﹥?yōu)選的方面，包括GP2的組合物(包括有作為加強劑給藥)的疫苗組合物還包括GM-CSF。此組合物優(yōu)選包括約0. Olmg至約0. 5mg的GM-CSF。一些優(yōu)選的方面，該組合物包括約0. 125mg的GM-CSF。一些優(yōu)選的方面，該組合物包括約0. 25mg的GM-CSF。一些特別優(yōu)選的方面，疫苗組合物在總共Iml體積中包括約0. 5mg至Img的GP2 肽以及0. 125至0. 250mg的GM-CSF，并且以每份0. 5ml的分開接種來每月給予，通過在患者身體上隔開約5cm注射給予，同時或混合給予。給藥方案優(yōu)選為每月給藥持續(xù)6個月。約 48小時的時間后，可以對注射位點評估紅斑和硬結(jié)的局部反應(yīng)。如果在兩位點的反應(yīng)匯合并且總硬結(jié)面積測量值> 100mm(或者患者感受到任何> 2級的全身毒性)，那么可以減少 GM-CSF的劑量，例如減半，盡管預(yù)期肽劑量保持不變。如果患者在隨后劑量上表現(xiàn)出強烈 (robust)的反應(yīng)，那么可以進行GM-CSF的進一步減少，例如減半。如果患者沒有表現(xiàn)出強烈的反應(yīng)，那么可以繼續(xù)以較高GM-CSF劑量給予患者。一些方面，類似地確定給藥方案和加強劑的劑量，開始用包括lmgGP2和0. 25mg GM-CSF的疫苗組合物、在初次免疫疫苗方案結(jié)束后約每六個月給予加強劑。提供下列實施例以一般性地描述本發(fā)明。它們并不旨在限制本發(fā)明。實施例1 :GP2+GM_CSF的I期試驗患者特征和臨床方案這是在無疾病的乳腺癌患者中HER2/neu衍生的GP2肽與GM-CSF免疫佐劑的第一個I期臨床試驗。該試驗得到地方倫理審查委員會(Institutional Review Boards)批準并且作為試驗性新藥應(yīng)用在Walter Reed Army Medical Center進行。已經(jīng)通過標準免疫組織化學(xué)在組織學(xué)上證明了所有患者是結(jié)節(jié)陰性的乳腺癌，表達所有水平的HER2/neU (IHC 1-3+)。在入組前，患者已經(jīng)完成了手術(shù)、化療和放射性療法(根據(jù)需要)的標準過程，并且進行激素化學(xué)預(yù)防的那些患者仍繼續(xù)它們的特定療法。在根據(jù)合格標準以及合適的咨詢并同意進行篩選后，令合適的HLA-A2+患者參與到研究中。在接種前，對患者用一組回憶抗原 (Mantoux測試)進行皮試。如果患者對2種抗原以上有反應(yīng)(> 5mm)，則認為患者是具有免疫活性的。我們集合并且接種了 18位結(jié)節(jié)陰性、無疾病的乳腺癌患者，他們具有所有水平的 HER2/neu表達(IHC 1-3+)。沒有患者從該項研究中退出，也沒有失去隨訪?；颊叩娜丝诮y(tǒng)計、預(yù)后因素和治療模式如表1所示。
表1. I期研究的患者的人口統(tǒng)計、預(yù)后因素和治療模式
權(quán)利要求
1.預(yù)防受試者乳腺癌復(fù)發(fā)的方法，其中受試者為在用標準治療過程治療后有所緩解， 所述方法包括給予受試者下述量的組合物，所述組合物的量能有效地預(yù)防乳腺癌復(fù)發(fā)，其中所述組合物包括藥學(xué)有效載體、具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列的肽和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，并且其中組合物不包含具有SEQ ID N0:3的氨基酸序列的E75肽。
2.權(quán)利要求1的方法，其中通過注射或接種給予該組合物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中該注射是皮內(nèi)注射。
4.權(quán)利要求2的方法，其中該組合物以一個或多個分次劑量注射。
5.權(quán)利要求4的方法，其中受試者上的注射位點彼此位置隔開約5cm。
6.權(quán)利要求1的方法，其中每月給予組合物，進行6個月。
7.權(quán)利要求1的方法，還包括給予該受試者加強劑，該加強劑包括有效量的包括藥學(xué)有效載體和具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的肽的疫苗加強劑組合物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中在完成初次免疫方案后每6個月或12個月給予該加強劑。
9.權(quán)利要求1的方法，其中受試者是人。
10.權(quán)利要求9的方法，其中人表達人白細胞抗原A2。
11.權(quán)利要求9的方法，其中來自人的癌細胞表達可測水平的HER2/neu。
12.權(quán)利要求11的方法，其中來自人的癌細胞具有低至中等的HER2/neU表達，其中低至中等的HER2/neU表達為對于HER2/neU基因表達具有免疫組織化學(xué)(IHC)等級1+或2+ 的蛋白表達，或熒光原位雜交(FISH)等級小于約2.0。
13.權(quán)利要求1的方法，其中粒細胞巨噬細胞集落刺激因子是重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。
14.權(quán)利要求8的方法，其中疫苗加強劑組合物還包括佐劑。
15.權(quán)利要求14的方法，其中該佐劑是粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。
16.權(quán)利要求1的方法，其中給予該組合物誘導(dǎo)對于具有SEQID NO :2的氨基酸序列的肽的細胞毒性T淋巴細胞應(yīng)答。
17.疫苗組合物，其包括可藥用載體、有效量的具有SEQID NO :2的氨基酸序列的肽、 以及粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，并且其中組合物不包含具有SEQ ID NO :3的氨基酸序列的E75肽。
18.權(quán)利要求17的組合物，其中肽的有效量是lmg/ml，佐劑劑量為0.1和0. 5mg/ml之間。
19.權(quán)利要求17的組合物，其中肽的有效量是lmg/ml，且粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的劑量是0. 25mg/ml。
20.權(quán)利要求1的方法，其中受試者不具有預(yù)先存在的針對具有SEQIDNO 2的氨基酸序列的肽的免疫。
全文摘要
提供了誘導(dǎo)和維持對HER2/neu原癌基因GP2的肽的保護性細胞毒性T淋巴細胞應(yīng)答的方法，其效應(yīng)為在臨床緩解中誘導(dǎo)和維持針對患者中乳腺癌的保護性和治療性免疫性，所述患者包括具有低至中等水平的HER2/neu表達的患者。所述方法包括向患者施用有效量的包含可藥用載體、佐劑例如GM-CSF、和GP2肽的疫苗組合物。該方法還包括根據(jù)降低的GP2特異性T細胞免疫性的需要，施用周期性增強疫苗劑量。還提供了用于所述方法的疫苗組合物。
文檔編號A61K39/00GK102245197SQ200980149494
公開日2011年11月16日 申請日期2009年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者G·皮普爾斯, S·龐尼亞 申請人:亨利·M·杰克遜軍事醫(yī)學(xué)促進基金會