專利名稱：新型抗乳腺癌多肽疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開(kāi)了新型抗乳腺癌多肽疫苗的制備，其特征在于包括一個(gè)來(lái)源于HER2/ neu (表皮生長(zhǎng)因子受體)的多肽片段(E75或342-350)，一個(gè)效應(yīng)T細(xì)胞(Th，T輔助細(xì)胞) 抗原決定基，和一個(gè)TLR(toll-like rec印tor，toll樣細(xì)胞受體)的配基，以及連接這三組分的半胱氨酸。
背景技術(shù)：
每年約有120萬(wàn)婦女發(fā)生乳腺癌，約50萬(wàn)婦女死于乳腺癌。北美、北歐是乳腺癌的高發(fā)地區(qū)，其發(fā)病率約為亞非拉國(guó)家的4倍。我國(guó)雖是乳腺癌的低發(fā)地區(qū)，但其發(fā)病率正在逐年上升，發(fā)病的增長(zhǎng)速度卻高出高發(fā)國(guó)家1到2個(gè)百分點(diǎn)，尤其是滬、京、津及沿海地區(qū)是我國(guó)乳腺癌的高發(fā)區(qū)。更令人擔(dān)憂的是，與西方國(guó)家比較，我國(guó)乳癌患者發(fā)病年齡較輕， 發(fā)病高峰年齡在40-49歲，比西方婦女早10-15年?；趪?yán)峻的形勢(shì)，乳腺癌的治療與防復(fù)發(fā)引起了人們的廣泛關(guān)注。乳腺癌的傳統(tǒng)治療方法1.手術(shù)治療手術(shù)適應(yīng)癥Halsted首創(chuàng)乳癌根治術(shù)，因手術(shù)合理，療效明確，近百年來(lái)成為人們治療乳癌所遵循的標(biāo)準(zhǔn)方式。近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，對(duì)乳癌術(shù)式進(jìn)行了不少探索性修改，總的趨勢(shì)不外保守和擴(kuò)大兩方面，至今仍爭(zhēng)論不休。乳房局部切除和全乳切除是保守手術(shù)的代表性手術(shù)。2.放射治療可以提高手術(shù)切除率使部分不能手術(shù)的患者再獲手術(shù)機(jī)會(huì)，由于放射抑制了腫瘤細(xì)胞的活力可降低術(shù)后復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率從而提高生存率，由于放射延長(zhǎng)了術(shù)前觀察時(shí)間有使部分已有亞臨床型遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病例避免一次不必要的手術(shù)。3.化療通過(guò)化療科盡早控制微轉(zhuǎn)移灶使原發(fā)癌及其周圍擴(kuò)散的癌細(xì)胞產(chǎn)生退變或部分被殺滅以減少術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，進(jìn)展期乳癌以及炎癥型乳癌限制了手術(shù)治療的實(shí)施術(shù)前化療可使腫瘤縮小以便手術(shù)切除，可以根據(jù)切除腫瘤標(biāo)本評(píng)價(jià)術(shù)前化療效果作為術(shù)后或復(fù)發(fā)時(shí)選擇化療方案的參考。4.乳腺癌的最新治療方法腫瘤生物治療技術(shù)是近年來(lái)因生物技術(shù)發(fā)展而興起的一種全新的腫瘤治療手段，被認(rèn)為是除了手術(shù)、化療、 放療之外的第四種腫瘤治療模式，具有副作用小、抗腫瘤活性高、適應(yīng)癥廣等特點(diǎn)。將生物技術(shù)用于腫瘤治療是提高和改變患者自身機(jī)體免疫功能的治本的方法，被認(rèn)為是攻克腫瘤的最終辦法，其應(yīng)用前景廣闊。自從人類腫瘤分子特征的提高導(dǎo)致腫瘤相關(guān)抗原可以被人體的T淋巴細(xì)胞所識(shí)別后，發(fā)展抗腫瘤疫苗已成為一種趨勢(shì)。腫瘤的疫苗是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤患者自身的免疫監(jiān)測(cè)和殺瘤功能，有效地殺滅患者術(shù)后和放化療后體內(nèi)殘存的腫瘤細(xì)胞， 達(dá)到治療腫瘤，預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移和最終根治腫瘤的目的，具有特異性強(qiáng)，副作用輕等特點(diǎn)， 正逐步成為腫瘤綜合治療中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，也是當(dāng)前腫瘤治療基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的熱點(diǎn)與發(fā)展方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)了新型抗乳腺癌多肽疫苗，其特征在于包括來(lái)源于HER2/neU(表皮生長(zhǎng)因子受體)的多肽片段(E75或342-350)，一個(gè)效應(yīng)T細(xì)胞(Th，T輔助細(xì)胞)抗原決定基，一個(gè)TLR(toll-like receptor, toll樣細(xì)胞受體)的配基，和連接這三組分的半胱氨酸 ①以半胱氨酸為底物，通過(guò)高氯酸的氧化作用形成二聚化的半胱氨酸，加入乙酸叔丁酯與氨基酸的羧基酯化，加入棕櫚酰氯，在氨基處形成酰化反應(yīng)，還原二硫鍵并加入環(huán)氧丙醇， 在巰基處形成開(kāi)環(huán)氧的氧化反應(yīng)，再加入棕櫚酰氯，在兩個(gè)羥基處發(fā)生?；磻?yīng)，去掉最初半胱氨酸上的保護(hù)基，便制出Pam3Cys化合物；②氯甲基聚苯乙烯樹(shù)脂作為不溶性的固相載體，首先將一個(gè)氨基被封閉基團(tuán)Fmoc-保護(hù)的氨基酸共價(jià)連接在固相載體上，20% pipe (哌啶)的作用下，脫掉氨基的保護(hù)基，這樣第一個(gè)氨基酸就接到了固相載體上了，DIEA提供一個(gè)堿性的反應(yīng)環(huán)境，HBTu作為縮合劑，將第二個(gè)氨基酸再與已接在固相載體的第一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，這樣在固相載體上就生成了一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽，重復(fù)上述肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長(zhǎng)，直至達(dá)到所需要的肽鏈長(zhǎng)度，脫去保護(hù)基Fmoc-，水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，就得到了合成好的肽；③最后，將Pam3Cys上的羧基和E75 多肽上的氨基通過(guò)縮合反應(yīng)連接。本發(fā)明與現(xiàn)有同類疫苗相比，結(jié)構(gòu)新穎，合成方法獨(dú)到，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式1. TLR配基和化學(xué)合成1. 1.化合物(a)合成準(zhǔn)確稱取10. OOg胱氨酸(Cys)置于圓底燒瓶中，將體系置于冰浴中緩慢滴加 29. 75g高氯酸(Ηα04)。保持體系低溫，加入^Oml乙酸叔丁酯并繼續(xù)攪拌，初有白色不溶物而后逐漸消失。室溫?cái)嚢?，?jiàn)有大量固體析出時(shí)停止攪拌，室溫靜置過(guò)夜。將體系轉(zhuǎn)入冰箱0°C放置Mh，取出后迅速用布氏漏斗抽濾。濾渣用乙醚洗滌后加碳酸氫鈉溶液溶解，用等體積乙醚萃取3次。有機(jī)相經(jīng)飽和食鹽水洗滌和無(wú)水硫酸鈉干燥，去除溶劑得黃色油狀液體11.85g即為化合物(a)，產(chǎn)率81%。1. 2.化合物(b)合成將11. 35g化合物(a)溶解于200ml 二氯甲烷，將10. 85g碳酸氫鈉溶解于IOOml 蒸餾水。兩相混合，邊攪拌邊滴加20. 67g棕櫚酰氯，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。薄層色譜監(jiān)測(cè)(展開(kāi)劑中石油醚乙酸乙酯=7 2，ν/ν)，反應(yīng)結(jié)束后將體系轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置待其分層，放出有機(jī)相，水相用3 X 20ml 二氯甲烷萃取產(chǎn)物。所得有機(jī)相合并，用飽和食鹽水洗2次，力口無(wú)水硫酸鈉干燥，去除溶劑得到白色固體21. 39g即為化合物(b)，產(chǎn)率80%。1. 3.化合物(C)和(d)合成稱取10.30g化合物(b)溶解于二氯甲烷，加入5. 67g鋅粉，室溫?cái)嚢?。逐漸滴加甲醇/濃鹽酸(37% )/濃硫酸(98% )混合溶液(體積比100 7 1)作為活化劑開(kāi)始反應(yīng)。薄層色譜監(jiān)測(cè)(展開(kāi)劑為乙酸乙酯)反應(yīng)結(jié)束后，不進(jìn)行后處理直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。向體系加入碳酸氫鈉粉末至體系pH> 7，加入1. 61g環(huán)氧丙醇，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。薄層色譜監(jiān)測(cè)(展開(kāi)劑為乙酸乙酯)反應(yīng)結(jié)束后，將體系用砂芯漏斗墊硅藻土過(guò)濾，濾渣用 3X30ml 二氯甲烷/甲醇混合液(體積比3 1)洗滌。濾液合并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，用少量乙酸乙酯溶解，經(jīng)過(guò)硅膠柱色譜分離產(chǎn)物，去除溶劑得到黃色油狀液體8. 41g即為化合物(d)，產(chǎn)率69%。
1.4.化合物(e)合成稱取7.91g化合物(d)溶解于160ml 二氯甲烷中，依次加入5. IOg三乙胺和 0. 79gDMAP (4- 二甲氨基吡啶，用作催化劑)，混勻液體。邊搖動(dòng)邊滴加10. 31g棕櫚酰氯，放熱同時(shí)有酸霧產(chǎn)生。室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。薄層色譜監(jiān)測(cè)(展開(kāi)劑中石油醚與乙酸乙酯體積比為7 幻反應(yīng)情況，追加2. 98g棕櫚酰氯(同時(shí)追加三乙胺保證體系堿性環(huán)境)后轉(zhuǎn)化完全。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮體系，用硅膠柱色譜分離產(chǎn)物，去除溶劑得到白色固體26. 31g即為化合物(e)粗品。重溶解粗品于乙酸乙酯/石油醚混合液(體積比1 6)中，室溫靜置池，轉(zhuǎn)入冰箱0°C靜置池進(jìn)行重結(jié)晶。抽濾，用石油醚略洗濾渣，得到白色固體9. 90g即為化合物 (e)純品，產(chǎn)率63%。1. 5. Pam3Cys 合成將(e)溶解于IOml 二氯甲烷，加入95%三氟乙酸^iil，混勻后室溫?cái)嚢?。薄層色譜(展開(kāi)劑石油醚與乙酸乙酯體積比3 1，加一滴冰醋酸)檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，將體系用飽和食鹽水洗滌至流出液為PH為中性。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑得到白色蠟狀物質(zhì)。加入少量二氯甲烷至其完全溶解，再加入16倍體積的石油醚，室溫靜置1 冰箱o°c靜置1 待其重結(jié)晶。抽濾取濾渣，烘干得到白色固體8. 80g即為Pam3Cys純品，產(chǎn)率94%。2. Th抗原決定基和E75多肽的合成2. 1.稱取樹(shù)脂于DCM ( 二氯甲烷)，氬氣鼓動(dòng)5min ；2. 2.稱取 Fmoc-Leu-OH 0. 3mmol ；2. 3. Fmoc-Leu-OH DIEA=I 2 (η)氬氣鼓動(dòng) 90min ；2. 4. DCM 洗滌 5 次(次 /min)；2. 5.封閉樹(shù)脂活性 DCM DIEA MeOH = 3. 4ml 0.2ml 0.4ml 氬氣鼓動(dòng) IOmin ；2. 6. DCM洗滌5次(次/min)，再DMF (二甲基甲酰胺)洗滌5次(次/min)，后 20% pipe30min ；2. 7. 20% pipe洗滌一次，再DMF洗滌5次(次/min)，以脫出白色Fmoc粉末為宜；2. 8. Fmoc-Met-OH (0. 3mmol) HBTu DIEA=I 1 2 (η)氬氣鼓動(dòng) 90min ；2. 9. DMF 洗滌 5 次(次 /min)；2. 10. 20% pipe 氬氣鼓動(dòng) 30min ；2. 11. 20% pipe洗滌一次，DMF洗滌5次(次/min)；依次加入后續(xù)Fmoc-氨基酸，重復(fù)8-12的操作，按文獻(xiàn)順序連接多肽，最后用95% TFA, 2. 5% H20,2. 5% TIS將合成好的肽段與固相樹(shù)脂脫離。但要注意的是后續(xù)氨基酸的當(dāng)量要視情況依次遞增0. 3mmol, 0. 6mmol,0. 9mmol, 1. 2mmol,氬氣鼓動(dòng)時(shí)間隨氨基酸當(dāng)量遞增而遞增90min，120min, 150min,210mino氬氣鼓動(dòng)氨基酸連接以及20% pipe溶液脫Fmoc保護(hù)基團(tuán)的時(shí)間應(yīng)夠長(zhǎng)以保障反應(yīng)充分。3.Pam3Cys與E75多肽的連接Pam3Cys和E75多肽置于TBTU (0_苯并三氮唑-N，N, N' , N'-四甲基脲四氟硼酸酯)、HOBT (1-羥基-苯并三氮唑)、N-甲基嗎啉、DMF、DCM的混合溶液中攪拌過(guò)夜。
權(quán)利要求
1.一種新型抗乳腺癌E75多肽疫苗，其特征在于包括一個(gè)來(lái)源于HER2/neU(表皮生長(zhǎng)因子受體)的E75多肽片段，一個(gè)效應(yīng)T細(xì)胞(Th，T輔助細(xì)胞)抗原決定基，一個(gè) TLR(toll-likereceptor, toll樣細(xì)胞受體)的配基，和連接這三組分的半胱氨酸，該疫苗的研制方法為①以半胱氨酸為底物，通過(guò)高氯酸的氧化作用形成二聚化的半胱氨酸，力口入乙酸叔丁酯與氨基酸的羧基酯化，加入棕櫚酰氯，在氨基處形成?；磻?yīng)，還原二硫鍵并加入環(huán)氧丙醇，在巰基處形成開(kāi)環(huán)氧的氧化反應(yīng)，再加入棕櫚酰氯，在兩個(gè)羥基處發(fā)生酰化反應(yīng)，去掉最初半胱氨酸上的保護(hù)基，便制出Pam3Cys化合物；②氯甲基聚苯乙烯樹(shù)脂作為不溶性的固相載體，首先將一個(gè)氨基被封閉基團(tuán)Fmoc-保護(hù)的氨基酸共價(jià)連接在固相載體上，20% pipe的作用下，脫掉氨基的保護(hù)基，這樣第一個(gè)氨基酸就接到了固相載體上了， DIEA提供一個(gè)堿性的反應(yīng)環(huán)境，HBTu作為縮合劑，將第二個(gè)氨基酸再與已接在固相載體的第一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，這樣在固相載體上就生成了一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽， 重復(fù)上述肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長(zhǎng)，直至達(dá)到所需要的肽鏈長(zhǎng)度，脫去保護(hù)基Fmoc-，水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，就得到了合成好的肽；③最后，將Pam3Cys上的羧基和E75多肽上的氨基通過(guò)縮合反應(yīng)連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三組分疫苗的制備方法，其特征在于半胱氨酸與高氯酸的物質(zhì)的量比為1 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三組分疫苗的制備方法，其特征在于加入含4倍當(dāng)量的碳酸氫鈉的水溶液，加入2倍當(dāng)量的棕櫚酰氯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三組分疫苗的制備方法，其特征在于用鋅粉還原二硫鍵是， 逐漸滴加甲醇/鹽酸(37%)/濃硫酸混合溶液(體積比100 7 1)作為活化劑，然后加入2倍當(dāng)量的環(huán)氧丙醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三組分疫苗的制備方法，其特征在于加入3倍當(dāng)量的三乙胺和少量DMAP (4- 二甲氨基吡啶)作催化劑，邊搖動(dòng)邊滴加2倍當(dāng)量的棕櫚酰氯。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三組分疫苗的制備方法，其特征在于=Pam3Cys連接肽段時(shí)， 加入TBTU (0-苯并三氮唑-N，N，N' ,N'-四甲基脲四氟硼酸酯)、HOBT (1-羥基-苯并三氮唑)、N-甲基嗎啉、DMF( 二甲基甲酰胺)、DCM(二氯甲烷)，且DMF DCM = 5 2。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了新型抗乳腺癌多肽疫苗的研制方法，其特征在于包括一個(gè)來(lái)源于HER2/neu(表皮生長(zhǎng)因子受體)的多肽片段(E75或342-350肽段)，一個(gè)效應(yīng)T細(xì)胞(Th，T輔助細(xì)胞)抗原決定基，和一個(gè)TLR(toll-like receptor，toll樣細(xì)胞受體)的配基，連接這三組分的半胱氨酸。這些TLR的配基可以結(jié)合到樹(shù)突狀細(xì)胞表面的某些TLR上，促進(jìn)了樹(shù)狀細(xì)胞的成熟和炎癥因子的釋放，也增強(qiáng)了樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)衍生多肽的吞噬和遞呈；第二部分由Th抗原決定基組成，抗體產(chǎn)生的過(guò)程中需要CD4+Th細(xì)胞的參與，遞呈細(xì)胞(APC)將抗原遞呈到細(xì)胞表面的MHC上，需要激活CD4+Th細(xì)胞，才能引起細(xì)胞免疫過(guò)程；第三部分是多肽片段，它是由HER2/neu蛋白衍生出的肽鏈(E75或342-350)，可有效誘導(dǎo)體液免疫，當(dāng)其與免疫輔助物相結(jié)合，可以有效地誘導(dǎo)蛋白特異性免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61K39/385GK102475886SQ20101056154
公開(kāi)日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月29日
發(fā)明者周興亮, 尹芝南, 楊文娟, 楊昭慧, 洪章勇, 趙文哲 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)