專利名稱：采用組合療法的眼病和過(guò)度血管新生的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于通過(guò)涉及給予細(xì)胞和中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)(signalling)的化合物的 組合療法來(lái)治療或預(yù)防眼病，以及與血管發(fā)生相關(guān)的疾病的方法。
背景技術(shù)：
血管發(fā)牛血管發(fā)生(或血管新生，新血管形成)是新血管的形成和分化。在健康的成年人 或成熟組織中一般不存在。然而，在復(fù)原傷口和恢復(fù)受傷或損傷之后的組織血流的健康身 體內(nèi)則會(huì)出現(xiàn)血管發(fā)生。在女性中，血管發(fā)生也出現(xiàn)在每月的生殖周期和懷孕期間。在這 些過(guò)程中，新血管的形成是受到嚴(yán)格控制的。血管發(fā)牛與疾病在許多嚴(yán)重疾病狀態(tài)下，身體失去了對(duì)血管發(fā)生的控制。在很多疾病中都會(huì)出現(xiàn) 過(guò)度血管發(fā)生，如癌癥、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、關(guān)節(jié)炎和牛皮癬。在這些病癥之 中，新血管為患病組織輸送營(yíng)養(yǎng)，破壞正常組織，并且在癌癥的情況下，新血管使得腫瘤細(xì) 胞能夠逃逸進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)中并定植于其他器官中(腫瘤轉(zhuǎn)移)。腫瘤生長(zhǎng)是血管發(fā)生依賴性的假說(shuō)首次于1971年提出(Folkman，1971)。按照其 最簡(jiǎn)單的表述，該假說(shuō)提出，超過(guò)一定階段的腫瘤體積膨脹需要新的毛細(xì)血管誘導(dǎo)分化。例 如，除非通過(guò)高功率顯微鏡對(duì)組織切片進(jìn)行檢測(cè)，否則在小鼠的早期血管前階段中不能檢 測(cè)到肺部微小轉(zhuǎn)移。支持腫瘤形成是血管發(fā)生依賴性這一觀點(diǎn)的其他間接證據(jù)能夠在美國(guó) 專利 5，639，725,5, 629，327,5, 792，845,5, 733，876 和 5，854，205 中找到。為了模擬血管發(fā)生，腫瘤上調(diào)其各種血管發(fā)生因子的產(chǎn)生，包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng) 因子(a FGF和β FGF) (Kandel et al.，1991)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子/血管通透因子 (VEGF/VPF)和HGF。然而，許多惡性腫瘤也產(chǎn)生血管發(fā)生的抑制劑，包括血管生成抑制因 子蛋白和凝血酶敏感蛋白(Chen et al. , 1995 ；Good et al. , 1990 ；0' Reilly et al.，
1994)。假設(shè)血管原性表型是新生血管形成的這些正負(fù)調(diào)節(jié)劑之間凈平衡的結(jié)果(Good etal. ,1990 ；0' Reilly et al.，1994)。已經(jīng)鑒別出了幾種其他內(nèi)源性血管發(fā)生抑制劑， 但是并非所有的內(nèi)源性血管發(fā)生抑制劑都與腫瘤存在相關(guān)。它們包括，血小板因子4 (Gupta et al. , 1995 ；Maione et al.，1990)、干擾素-α、干擾素誘導(dǎo)蛋白 10 (Angiolillo et al.， 1995 ；Strieter et al.，1995)，其是由白細(xì)胞介素-12 和 / 或干擾素-γ (Voest et al.，
1995),gro-β (Cao et al.，1995)和泌乳刺激素的 16kDa N-端片段(Clapp et al.，1993) 誘導(dǎo)的。眼病由眼中組織或結(jié)構(gòu)功能障礙所致的許多眼部疾病或病癥會(huì)導(dǎo)致視力下降或完全 喪失視力。近來(lái)眼科疾病越來(lái)越多，包括由于電視、計(jì)算機(jī)、游戲機(jī)和其他數(shù)碼產(chǎn)品，以及隱 形眼鏡的廣泛使用導(dǎo)致的疾病，如干眼和視疲勞。在這些眼科疾病中，年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)在西方社會(huì)的老年人群中尤其流行。在美國(guó)、加拿大、英格蘭、威爾士、蘇格蘭和澳大利亞，AMD是年齡超過(guò)65的患者中法定 的不可逆失明的最常見(jiàn)的病因。盡管患者的第一只眼睛的中心視力喪失時(shí)他們的平均年齡 為約65歲，但一些患者在四十幾或五十幾歲時(shí)就開(kāi)始發(fā)展疾病征兆。由于現(xiàn)代生活方式和 預(yù)期壽命增加，受到這種疾病侵?jǐn)_的人數(shù)穩(wěn)步增加。眼中新血管形成是嚴(yán)重眼部疾病如AMD和糖尿病性視網(wǎng)膜病變的基礎(chǔ)。約10% 15%的患者會(huì)表現(xiàn)出這種疾病的滲出性(濕)形式。滲出性AMD的特征在于血管發(fā)生和病 理性新生血管的形成。這種疾病與每年在對(duì)側(cè)眼中發(fā)展失明障礙約10% 15%的累積機(jī) 率是雙向的。糖尿病性視網(wǎng)膜病變是約40% 45%被診斷患有I型或II型糖尿病的的患者中 出現(xiàn)的糖尿病的并發(fā)癥。糖尿病性視網(wǎng)膜病變通常影響雙眼并以四個(gè)階段發(fā)展。第一階段， 輕度非增殖性視網(wǎng)膜病變，特征在于眼中微血管瘤。在視網(wǎng)膜的毛細(xì)血管和小血管中出現(xiàn) 小面積的腫脹。在第二階段，中度非增殖性視網(wǎng)膜病變，供給視網(wǎng)膜的血管開(kāi)始堵塞。在第 三階段，出現(xiàn)重度非增殖性視網(wǎng)膜病變，受阻的血管導(dǎo)致視網(wǎng)膜的供血減少，并且視網(wǎng)膜向 眼睛發(fā)出信號(hào)以發(fā)展新的血管(血管發(fā)生)從而為視網(wǎng)膜供血。在第四階段即最高級(jí)的階 段，發(fā)生增殖性視網(wǎng)膜病變，發(fā)生血管發(fā)生，但是新血管是異常且脆弱的，并沿著視網(wǎng)膜和 填充眼睛的玻璃體凝膠的表面生長(zhǎng)。當(dāng)這些薄血管破裂或滲漏血液時(shí)，就能夠?qū)е聡?yán)重的 視力喪失或失明。貝伐單抗是一種用于治療AMD的化合物，然而該療法的副作用在視網(wǎng)膜脫離中增 加(Chan et al.，2007 ；Kook et al.，2008 ；Garg et al.，2008)。隨著年齡的增加，玻璃體液從凝膠變成液體并且隨著這種變化逐漸萎縮并從視網(wǎng) 膜的ILM脫離。這個(gè)過(guò)程被稱為“玻璃體后脫離”(PVD)，其在40歲之后出現(xiàn)是正常的。然 而，玻璃體中的退化性變化也可以是由病理性病癥所誘導(dǎo)，如糖尿病、伊爾斯氏病(視網(wǎng)膜 靜脈周圍炎，Eale' sdisease)和葡萄膜炎。而且，PVD會(huì)比近視人群和那些接受過(guò)白內(nèi)障 手術(shù)的人中的正常情況出現(xiàn)得更早。通常，玻璃體與視網(wǎng)膜完全脫離。然而，玻璃體偶爾會(huì) 在某些地方緊密連接于視網(wǎng)膜。這些小的抗病灶(foci ofresisting)，玻璃體的異常強(qiáng)力 連接能夠在連接位置從玻璃體向視網(wǎng)膜傳輸較大的牽引力。由玻璃體產(chǎn)生的這種持續(xù)的牽 引感通常會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜中產(chǎn)生馬蹄形撕裂。如果視網(wǎng)膜撕裂沒(méi)有得到修復(fù)，玻璃體液體就 會(huì)通過(guò)該撕裂處滲透到視網(wǎng)膜中或視網(wǎng)膜之下并導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離，視網(wǎng)膜脫離是一種非常 嚴(yán)重的威脅視力的病癥。另外，玻璃體和ILM之間的持續(xù)連接能夠?qū)е卵芷屏殉鲅?，這會(huì) 導(dǎo)致玻璃體混濁(clouding)和渾濁(opacification)。不完全的PVD的發(fā)展對(duì)于包括玻璃體黃斑牽引綜合征、玻璃體積血、黃斑裂孔、黃 斑水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性黃斑病變和視網(wǎng)膜脫離的許多玻璃體視網(wǎng)膜病都會(huì)
產(chǎn)生影響。仍需要能夠用于治療或預(yù)防眼病和/或血管發(fā)生相關(guān)的病癥的其他療法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)利用包含細(xì)胞和中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物 的組合療法來(lái)治療或預(yù)防眼病時(shí)具有協(xié)同作用。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種治療 或預(yù)防受治療者中眼病的方法，該方法包括向受治療者給予i)細(xì)胞、和ii)中斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物。采用本發(fā)明的方法能夠治療或預(yù)防的眼病的實(shí)例包括，但不限于，視網(wǎng)膜缺血、視 網(wǎng)膜炎癥、視網(wǎng)膜水腫、視網(wǎng)膜脫離、黃斑裂孔、牽引性視網(wǎng)膜病變、玻璃體積血、牽引性黃 斑病變、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、糖尿病性黃斑水腫、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、黃斑變性、角膜移植 排斥、新生血管性青光眼、晶狀體后纖維組織增生和/或虹膜潮紅(rubeosis)。在一種優(yōu)選 的實(shí)施方式中，眼病是視網(wǎng)膜脫離、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變和/或黃斑變 性。在一種實(shí)施方式中，黃斑變性是干性年齡相關(guān)性黃斑變性或濕性年齡相關(guān)性黃斑 變性。優(yōu)選黃斑變性是濕性年齡相關(guān)性黃斑變性。之前，本申請(qǐng)的申請(qǐng)人已經(jīng)提出，干細(xì)胞，或其后代細(xì)胞，能夠用于治療或預(yù)防血 管發(fā)生-相關(guān)的病癥(參見(jiàn)WO 2008/006168)。他們也已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用包含 細(xì)胞和中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物的組合療法來(lái)治療或預(yù)防血管發(fā)生-相關(guān)的病癥時(shí) 具有協(xié)同作用。因此在第二方面，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防受治療者中與血管發(fā)生相 關(guān)的疾病的方法，該方法包括向所述受治療者給予i)細(xì)胞、和ii)中斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物。采用本發(fā)明的方法能夠治療或預(yù)防的與血管發(fā)生相關(guān)的疾病的實(shí)例包括但不 限于，血管發(fā)生依賴性的癌癥、良性腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、眼部血管發(fā)生病、奧 斯勒-韋伯綜合征(Osier-Webber Syndrome)、心肌血管發(fā)生、斑塊內(nèi)血管新生(plaque neovascularization)、毛細(xì)血管擴(kuò)張、血友病性關(guān)節(jié)病(hemophiliac joints)、血管纖維 瘤、傷口肉芽形成、腸粘連、動(dòng)脈粥樣硬化、硬皮病、肥厚性瘢痕、貓抓病和幽門(mén)螺桿菌致潰 瘍。在一種實(shí)施方式中，細(xì)胞是干細(xì)胞，或其后代細(xì)胞。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，干 細(xì)胞獲自骨髓或眼睛。優(yōu)選地，干細(xì)胞是間質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)。優(yōu)選地，間質(zhì)前體細(xì)胞是TNAP+、STR0-1+、 VCAM-1+、ΤΗΥ-Γ、STR0-2+、⑶45+、⑶146+、3G5+或它們的任意組合。在另一種實(shí)施方式中，至 少一些STRO-丨+細(xì)胞是STRO-Itoi。在另一種實(shí)施方式中，還沒(méi)有對(duì)MPC進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，其是TNAP+。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，后代細(xì)胞通過(guò)體外培養(yǎng)MPC而獲得。在一種實(shí)施方式中，該化合物結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和/或降低其生產(chǎn)。優(yōu)選地， 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是VEGF-A，VEGF-B, VEGF-C和/或VEGF-D。更優(yōu)選地，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子是 VEGF-A。在一種實(shí)施方式中，該減少血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子產(chǎn)生的化合物結(jié)合缺氧誘導(dǎo)因子 1 (HIF-I)和/或降低其生產(chǎn)。在一種可替代的實(shí)施方式中，該化合物結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體和/或降低其 生產(chǎn)。優(yōu)選地，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體選自VEGFR1、VEGFR2和/或VEGFR3。更優(yōu)選地，血 管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體是VEGFRl和/或VEGFR2。在還有的另一種替代實(shí)施方式中，該化合物結(jié)合參與通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與血 管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(如VEGFR酪氨酸激酶)結(jié)合而誘導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的分子和/或降 低其生產(chǎn)。
在一種實(shí)施方式中，該化合物是多肽。更優(yōu)選地，該多肽是抗體、抗體相關(guān)的分子、 和/或它們中的任一種的片段。在另一實(shí)施方式中，該化合物是多核苷酸。實(shí)例包括但不限于，反義多核苷酸、正 義多核苷酸(有義多核苷酸，sense polynucleotide)、催化多核苷酸、雙鏈體RNA分子、或 編碼其中的任一種或多種的多核苷酸。在一種實(shí)施方式中，至少一些細(xì)胞經(jīng)過(guò)遺傳修飾。本發(fā)明還提供了細(xì)胞和中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物在制造用于治療或預(yù)防受 治療者中眼病的組合療法的藥物中的用途。另外，本發(fā)明還提供了細(xì)胞和中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物作為用于治療或預(yù)防 受治療者中眼病的組合療法中的藥物的用途。本發(fā)明還提供了細(xì)胞和中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物細(xì)胞和中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo) 的化合物在制造用于治療或預(yù)防受治療者中與血管發(fā)生相關(guān)的病癥的組合療法的藥物中 的用途。另外，本發(fā)明還提供了細(xì)胞和中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物細(xì)胞和中斷VEGF-信 號(hào)傳導(dǎo)的化合物作為用于治療或預(yù)防受治療者中與血管發(fā)生相關(guān)的病癥的組合療法中的 藥物的用途。在另一方面，本發(fā)明提供了一種包含細(xì)胞和中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物以及可 選的藥用載體的組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了一種包含細(xì)胞和中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物的試劑 盒。該細(xì)胞和化合物可以在相同或不同的容器中。顯然，本發(fā)明一方面的優(yōu)選性質(zhì)和特征可適用于本發(fā)明的許多其他方面。在說(shuō)明書(shū)全文中，詞語(yǔ)“包含”或其變體如“包括”或“含有”應(yīng)被理解為意指包 括所述的元件、整體或步驟，或元件、整體或步驟的組，但并不排除任何其他元件、整體或步 驟，或元件、整體或步驟的組。


圖1.研究設(shè)計(jì)。圖2.異源MPC在減少血管滲漏方面等價(jià)于抗-VEGF，且與抗-VEGF有協(xié)同效應(yīng)。圖3.將異源MPC與抗-VEGF組合消除了嚴(yán)重滲漏的血管。圖4.將異源MPC與抗-VEGF組合對(duì)高級(jí)別滲漏血管的協(xié)同益處。圖5.通過(guò)異源MPC和抗-VEGF的組合持續(xù)預(yù)防階段4疾病，而通過(guò)單獨(dú)的抗-VEGF 僅僅是短效的。圖6.異源MPC與抗-VEGF的組合在階段1疾病中維持較高比例的激光受損血管。圖7.異源MPC與抗-VEGF的組合預(yù)防視網(wǎng)膜脫離。圖8.異源MPC與抗-VEGF的組合預(yù)防激光誘導(dǎo)的血管新生(或稱新血管形成) 之后的視網(wǎng)膜脫離。關(guān)鍵序列表SEQ ID NO 1-人 VEGF-A (活化處理的肽)。
SEQ ID NO :2_ 人 VEGF-B (活化處理的肽)。
SEQIDNO3-人VEGF-C (活化處理的肽)。
SEQIDNO4-人VEGF-D (活化處理的肽)。
SEQIDNO5-人VEGFR-K-信號(hào)序列)。
SEQIDNO6-人VEGFR-2(-信號(hào)序列)。
SEQIDNO7-人VEGFR-3(-信號(hào)序列)。
SEQIDNO8-人 HIF-I α。
SEQIDNO9-全長(zhǎng)人VEGF-A的編碼序列。
SEQIDNO10-全長(zhǎng)人VEGF-B的編碼序列。
SEQIDNO11·-全長(zhǎng)人VEGF-C的編碼序列。
SEQIDNO12·-全長(zhǎng)人VEGF-D的編碼序列。
SEQIDNO13-全長(zhǎng)人VEGFR-I的編碼序列。
SEQIDNO14·-全長(zhǎng)人VEGFR-2的編碼序列。
SEQIDNO15·-全長(zhǎng)人VEGFR-3的編碼序列。
SEQIDNO16-人HIF-I α的編碼序列。
具體實(shí)施例方式通用技術(shù)除非另外明確指出，本文中所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都應(yīng)該采用其在本領(lǐng) 域(例如，在干細(xì)胞生物學(xué)中、細(xì)胞培養(yǎng)學(xué)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)化 學(xué)和生物化學(xué))普通技術(shù)人員通所理解的相同意義。除非另外明確指出，在本發(fā)明中所使用的重組蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)(物)和免疫技術(shù) 都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)方法。這些技術(shù)在以下來(lái)源的文獻(xiàn)中有描述和解釋，例 如，J. Perbal, A Practical Guide to MolecularCloning，John Wiley and Sons (1984)、 J.Sambrook et al.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989) Λ Τ.A.Brown (編 者)，Essential Molecular Biology :A Practical Approach,第 1 卷和第 2 卷，IRL Press (1991)、D. Μ. Glover 和 B. D. Hames (編 者)，DNACloning :A Practical Approach，1-4 卷，IRL Press(1995 和 1996)、以及 F. Μ. Ausubel et al.(編者)，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988，包括直到現(xiàn)在的所有更新)，EdHarlow 禾口 David Lane (編者)Antibodies :A Laboratory Manual, Cold SpringHarbour Laboratory, (1988) λ I^XM J. E. Coligan et al.(編者)Current Protocolsin Immunology, John Wiley & Sons (包括直到現(xiàn)在的所有更新)。治療或預(yù)防疾病如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“受治療者”(本文中也稱之為“患者”)包括溫血?jiǎng)游铮?優(yōu)選哺乳動(dòng)物，包括人類。受治療者可以是，例如牲畜(例如，羊、牛、馬、驢、豬)、伴侶動(dòng)物 (例如，狗、貓)、實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠)、或捕獲的野生動(dòng)物 (例如，狐貍、鹿)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，受治療者是靈長(zhǎng)類動(dòng)物。在一種更加優(yōu)選的 實(shí)施方式中，受治療者是人類。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療”、“醫(yī)療”或“處理”包括給予治療有效量的如本文中所定義的細(xì)胞，和治療有效量的如本文中定義的化合物，從而足以減少或消除眼病和/ 或與血管發(fā)生相關(guān)的病癥的至少一種癥狀。在一種實(shí)施方式中，該疾病是濕性年齡相關(guān)的 黃斑變性，并且該方法降低了該疾病的嚴(yán)重程度和/或延遲或預(yù)防該疾病的復(fù)發(fā)。在另一 種實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法比單獨(dú)給予中斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-信號(hào)傳導(dǎo)的化合 物的療效時(shí)間增長(zhǎng)。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”包括給予治療有效量的如本文中定義的細(xì)胞和治 療有效量的如本文中定義的化合物，從而足以終止或抑制眼病和/或與血管發(fā)生相關(guān)的病 癥的至少一種癥狀發(fā)展。眼病如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“眼病”是一種影響或涉及眼睛或眼睛的部件或區(qū)域之一 的疾病或病癥。眼睛包括眼球和構(gòu)成眼球的組織和流體、眼周肌肉(如斜肌和眼直肌)以 及眼球內(nèi)和眼球附近的視神經(jīng)部分。在一種實(shí)施方式中，眼病的至少部分特征在于視網(wǎng)膜脫離和/或血管滲漏。應(yīng)該理解，本發(fā)明的方法可以用于預(yù)防或治療眼睛或與眼睛相關(guān)的任何疾病，或 在一種實(shí)施方式中，可以用于預(yù)防或治療任何眼科病癥。采用本發(fā)明的方法能夠治療或預(yù) 防的眼病的實(shí)例包括但不限于，鞏膜外層炎、鞏膜炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、青光眼、黃斑變 性、視網(wǎng)膜脫離、全色盲/Maskim、弱視、屈光參差、阿蓋爾羅伯遜瞳孔(Argyll Robertson pupi 1)、散光、屈光參差、失明、瞼板腺囊腫、色盲、全色盲/Maskim、內(nèi)斜視、外斜視、飛蚊癥 (floaters)、玻璃體脫離、福克斯?fàn)I養(yǎng)不良、遠(yuǎn)視眼(hypermetropia)、遠(yuǎn)視(hyperopia)、 高血壓性視網(wǎng)膜病變、虹膜炎、圓錐角膜、雷伯氏的先天性黑蒙(Leber' s congenital amaurosis)、雷伯氏遺傳性視神經(jīng)病變、黃斑水腫、近視、夜盲癥、眼肌麻痹(包括進(jìn)行性 外部眼肌麻痹和內(nèi)部眼肌麻痹、眼局部麻痹(opthalmoparesis))、老花眼、翼狀胬肉、紅 眼(藥)、視網(wǎng)膜色素變性、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜劈裂癥、河盲癥、眼肌麻痹、暗點(diǎn) (scotoma)、雪盲/電光性眼炎(arc eye)、眼瞼疾病、瞼下垂、眼外腫瘤、斜視。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可以用于預(yù)防或治療黃斑變性。在一種 實(shí)施方式中，黃斑變性的特征在于黃斑的損壞或裂開(kāi)(breakdown)，在一種實(shí)施方式中黃斑 是眼睛后面的一小片區(qū)域。在一種實(shí)施方式中，黃斑變性導(dǎo)致中心視力的進(jìn)行性喪失，但并 不是完全失明。在一種實(shí)施方式中，黃斑變性是干型的，而在另一實(shí)施方式中，黃斑變性是 濕型的。在一種實(shí)施方式中，干型的特征在于黃斑組織功能消弱和喪失。在一種實(shí)施方式 中，濕型的特征在于黃斑后面的異常血管的生長(zhǎng)。在一種實(shí)施方式中，如果不對(duì)異常血管出 血或滲漏進(jìn)行治療就會(huì)導(dǎo)致疤痕組織的形成。在一些實(shí)施方式中，干型的黃斑變性能夠轉(zhuǎn) 化成濕型。在一種實(shí)施方式中，黃斑變性是年齡相關(guān)的，在一種實(shí)施方式中其是由伴有視網(wǎng) 膜色素上皮下方的維管組織增殖的通過(guò)布魯赫膜中缺陷的脈絡(luò)毛細(xì)管的向內(nèi)生長(zhǎng)所導(dǎo)致 的。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可以用于治療或預(yù)防視網(wǎng)膜病變。在一種 實(shí)施方式中，視網(wǎng)膜病變是指視網(wǎng)膜的疾病，在一種實(shí)施方式中其特征在于發(fā)炎而在另一 種實(shí)施方式中，這是由于眼睛內(nèi)的血管損傷所致。在一種實(shí)施方式中，視網(wǎng)膜病變是糖尿病 性視網(wǎng)膜病變，在一種實(shí)施方式中，視網(wǎng)膜病變是由視網(wǎng)膜血管內(nèi)變化導(dǎo)致糖尿病的并發(fā) 癥。在一種實(shí)施方式中，視網(wǎng)膜內(nèi)血管滲漏血液和/或生長(zhǎng)脆弱、毛刷狀分支和疤痕組織，在一種實(shí)施方式中，視網(wǎng)膜傳送至大腦的圖像模糊或扭曲。在另一實(shí)施方式中，視網(wǎng)膜病 變是增殖性視網(wǎng)膜病變，在一種實(shí)施方式中，其特征在于視網(wǎng)膜表面上生長(zhǎng)新的異常的血 管(新血管發(fā)生)。在一種實(shí)施方式中，瞳孔周圍的新血管發(fā)生使眼壓增加，在一種實(shí)施方 式中，導(dǎo)致青光眼。在另一種實(shí)施方式中，新血管發(fā)生產(chǎn)生破裂和出血的更薄弱管壁的新血 管，或?qū)е掳毯劢M織生長(zhǎng)，在一種實(shí)施方式中，牽拉視網(wǎng)膜離開(kāi)眼后部(視網(wǎng)膜脫離)。在一 種實(shí)施方式中，視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)理與非酶糖化作用、糖基化作用、高級(jí)糖化作用終產(chǎn)物 的累積、自由基介導(dǎo)的蛋白質(zhì)損傷、基質(zhì)蛋白酶的上調(diào)、生長(zhǎng)因子的確定(elaboration)、血 管內(nèi)皮細(xì)胞中粘附分子的分泌、或它們的組合有關(guān)。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，視網(wǎng)膜病變是指早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)，在一種實(shí)施方 式中，當(dāng)視網(wǎng)膜上生長(zhǎng)異常血管和疤痕組織時(shí)就會(huì)在早產(chǎn)嬰兒中出現(xiàn)早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變。 在一種實(shí)施方式中，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變是由促進(jìn)早產(chǎn)兒存活必要治療所引起的。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可以用于治療或預(yù)防視網(wǎng)膜脫離，尤其包 括，裂孔源性、牽引性或滲出性視網(wǎng)膜脫離，在一種實(shí)施方式中，視網(wǎng)膜脫離是視網(wǎng)膜從其 支持層分離。在一種實(shí)施方式中，視網(wǎng)膜脫離與視網(wǎng)膜中的撕裂或孔有關(guān)，眼內(nèi)部液體會(huì)通 過(guò)該撕裂或孔滲漏。在一種實(shí)施方式中，視網(wǎng)膜脫離是由外傷、衰老過(guò)程、嚴(yán)重的糖尿病、炎 性疾病、新生血管、或早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變引起的，而在另一實(shí)施方式中，視網(wǎng)膜脫離是自發(fā) 發(fā)生的。在一種實(shí)施方式中，從小的視網(wǎng)膜血管出血會(huì)在脫離過(guò)程中使玻璃體渾濁，在一種 實(shí)施方式中，會(huì)造成圖像模糊和扭曲。在一種實(shí)施方式中，視網(wǎng)膜脫離會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的視力喪 失，包括失明。血管發(fā)生如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“血管發(fā)生”被定義為涉及新血管生長(zhǎng)和/或血管發(fā)育成 為組織的組織血管化過(guò)程，因而也被稱為新血管形成。該過(guò)程能夠按照三種方式中之一進(jìn) 行血管能夠從現(xiàn)有的血管長(zhǎng)出，由前體細(xì)胞能夠新形成發(fā)育成血管(血管發(fā)生)，和/或 現(xiàn)有小血管的直徑增大。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“與血管發(fā)生相關(guān)的疾病”是特征在于過(guò)度和/或異常性 新血管形成的任何病癥。任何與血管發(fā)生相關(guān)的疾病可以采用本發(fā)明的方法進(jìn)行治療或 預(yù)防。與血管發(fā)生相關(guān)的疾病包括但不限于，血管生成依賴性癌癥，包括，例如，實(shí)體瘤、血 源性腫瘤(blood born tumor)如白血病和腫瘤轉(zhuǎn)移；良性腫瘤，如血管瘤、聽(tīng)神經(jīng)瘤、神經(jīng) 纖維瘤、沙眼和膿性肉芽腫；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；牛皮癬；眼部血管發(fā)生性疾病，例如，糖尿病性 視網(wǎng)膜病變、糖尿病性黃斑水腫、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變，包括干性年齡相關(guān)的黃斑變性和濕性 年齡相關(guān)的黃斑變性的黃斑變性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶狀體后纖維組織增 生；虹膜潮紅；奧斯勒-韋伯綜合征；心肌血管發(fā)生性失明；斑塊新生血管；毛細(xì)血管擴(kuò)張； 血友病性關(guān)節(jié)??；血管纖維瘤；及傷口肉芽形成。本發(fā)明的方法，也適用于治療或預(yù)防具有 作為病理后果如貓抓病(Rochele minalia quintosa)和潰瘍(幽門(mén)螺桿菌(Helicokicter pylorii))的血管發(fā)生的疾病。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，與血管發(fā)生相關(guān)的疾病是一種眼科血管發(fā)生疾病。正 如本文中所使用的，“眼科血管發(fā)生疾病”是特征在于過(guò)度和/或異常性新血管形成的眼病。 其實(shí)例包括但不限于，糖尿病性視網(wǎng)膜病變、糖尿病黃斑水腫、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、黃斑變 性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶狀體后纖維組織增生和虹膜潮紅。
干細(xì)胞及其后代細(xì)胞這種細(xì)胞可以是能夠用于治療眼病和/或血管發(fā)生相關(guān)的病癥的任何細(xì)胞類型。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”是指能夠產(chǎn)生表現(xiàn)型和基因型相同的子代 (daughter)的自我更新細(xì)胞以及至少一種其他最終細(xì)胞類型(例如，終末分化的細(xì)胞)。 術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”包括全能細(xì)胞、多能細(xì)胞和多潛能細(xì)胞，以及由它們分化而得到的祖細(xì)胞和 /或前體細(xì)胞。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“全能細(xì)胞(totipotent cell) ”或“全潛能細(xì)胞 (totipotential cell) ”是指能夠形成完整胚胎(例如，胚泡)的細(xì)胞。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“多能細(xì)胞(pluripotent cell) ”或“多能性細(xì)胞 (pluripotential cell) ”是指具有完全分化多能性，即生長(zhǎng)成任何哺乳動(dòng)物體的約沈種細(xì) 胞類型的能力的細(xì)胞。多能細(xì)胞能夠自我更新，并能夠在組織中保持不活動(dòng)或休眠。對(duì)于“多潛能細(xì)胞(multipotential cell)”或“多潛能性細(xì)胞 (multipotentcell) ”，我們是指能夠產(chǎn)生任何幾種成熟細(xì)胞類型的細(xì)胞。如本文中所使用 的，這個(gè)短語(yǔ)涵蓋了成體或胚胎干細(xì)胞和祖細(xì)胞，如間質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)和這些細(xì)胞的多 潛能后代。與多能細(xì)胞不同，多潛能細(xì)胞并不具有形成所有細(xì)胞類型的能力。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“祖細(xì)胞”是指必定會(huì)分化成特體類型的細(xì)胞或形成特定 的組織類型的細(xì)胞。間質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)是在骨髓、血液、牙髓細(xì)胞、脂肪組織、皮膚、脾臟、胰腺、腦、 腎、肝、心臟、眼睛(包括視網(wǎng)膜)、腦、毛囊、腸、肺、淋巴結(jié)、胸腺、骨、韌帶、肌腱、骨骼肌、真 皮和骨膜中發(fā)現(xiàn)的；并能夠分化成不同種系如中胚層、內(nèi)胚層和外胚層的細(xì)胞。因此，MPC 能夠分化成大量的細(xì)胞類型，包括但不限于，脂肪組織、骨組織、軟骨組織、彈性組織、肌肉 組織和纖維性結(jié)締組織。這些細(xì)胞所進(jìn)入的特定譜系定型和分化途徑取決于源于力學(xué)影響 和/或內(nèi)生生物因素，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞活素類和/或由宿主組織構(gòu)建的局部微環(huán)境條件的 各種影響。因此，間質(zhì)前體細(xì)胞是分裂產(chǎn)生子代細(xì)胞的非造血祖細(xì)胞，該子代細(xì)胞是干細(xì)胞 或及時(shí)將不可逆地分化而產(chǎn)生表型細(xì)胞的前體細(xì)胞。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明方法中所使用的細(xì)胞從獲自受治療者的樣品進(jìn) 行富集。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“富集”、“濃縮”或它們的變型用于描述當(dāng)與未處理細(xì)胞群相 比時(shí)，其中細(xì)胞群的一種特定細(xì)胞類型的比例或許多特定細(xì)胞類型的比例增加。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明中所使用的細(xì)胞是TNAP+、STR0-1+、VCAM-1+、 ΤΗΥ-Γ、STR0-2+、CD45+、CD146+、3G5+ 或它們的任意組合。優(yōu)選地，STRO-Γ 細(xì)胞是 STRO-Is (STRO-Ibright)。優(yōu)選地，STR0-1 亮細(xì)胞另外是 VCAM-1+、ΤΗΥ-Γ、STR0-2+ 和 / 或 CD146+ 中的 一種或多種。在一種實(shí)施方式中，間質(zhì)前體細(xì)胞是如WO 2004/85630中定義的血管周的間質(zhì)前 體細(xì)胞。當(dāng)我們對(duì)于一種給定的標(biāo)記物稱細(xì)胞為“陽(yáng)性”時(shí)，根據(jù)該標(biāo)記物存在于細(xì)胞表面 的程度，其可以是那個(gè)標(biāo)記的一個(gè)低的(Io或暗)或高的(亮，bri)表達(dá)子，其中該術(shù)語(yǔ)涉 及在細(xì)胞的顏色分選過(guò)程中所使用的熒光或其他顏色的強(qiáng)度。在被分選的特定細(xì)胞群上的 標(biāo)記物環(huán)境中，應(yīng)理解Io (或暗或暗淡)和bri的區(qū)別。在本文中，當(dāng)我們對(duì)于一種給定標(biāo) 記物稱細(xì)胞為“陰性”時(shí)，并不意味著該標(biāo)記物根本不會(huì)被該細(xì)胞表達(dá)。這是指該標(biāo)記物被那種細(xì)胞表達(dá)的水平相對(duì)較低，并且當(dāng)其被可檢測(cè)地標(biāo)記時(shí)所產(chǎn)生信號(hào)非常低。當(dāng)本文中使用術(shù)語(yǔ)“亮”時(shí)，是指當(dāng)被可檢測(cè)地標(biāo)記時(shí)產(chǎn)生相對(duì)高信號(hào)的細(xì)胞表面 上的標(biāo)記物。盡管不期望受限于理論，但是有人提出，“亮”細(xì)胞比樣品中其他細(xì)胞表達(dá)更 多的靶標(biāo)記蛋白(例如，由STR0-1識(shí)別的抗原)。例如，當(dāng)用FITC-結(jié)合的STR0-1抗體標(biāo) 記而通過(guò)FACS分析檢測(cè)時(shí)，STRO-Itoi細(xì)胞比非-亮細(xì)胞(STRO-丨》 / )產(chǎn)生更大的熒 光信號(hào)。優(yōu)選低，“亮”細(xì)胞構(gòu)成初始樣品中所含的至少約0. 的最亮標(biāo)記的骨髓單核細(xì) 胞。在其他實(shí)施方式中，“亮”細(xì)胞構(gòu)成初始樣品中所含的至少約0. 1%，至少約0.5%，至 少約1%，至少約1. 5%或至少約2%的最亮標(biāo)記的骨髓單核細(xì)胞。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式 中，STR0-1 細(xì)胞具有STR0-1表面表達(dá)的21og幅度的較高表達(dá)。這是相對(duì)于“背景”來(lái)計(jì) 算的，即屬于STRO-Γ的細(xì)胞。通過(guò)對(duì)比，STR0-1灰暗和/或STR0-1+#細(xì)胞具有STR0-1表 面表達(dá)的不到21og幅度的較高表達(dá)，典型地約Ilog幅度的較高表達(dá)或低于“背景”。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“TNAP”預(yù)想涵蓋所有組織非特異性堿性磷酸酶的同種型 (isoform)。例如，該術(shù)語(yǔ)涵蓋肝臟同種型(LAP)、骨同種型(BAP)和腎同種型(KAP)。在一 種優(yōu)選的實(shí)施方式中，TNAP是BAP。在一種尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，本文中所使用的TNAP 是指能夠結(jié)合STR0-3抗體的分子，該STR0-3抗體是由于2005年12月19日根據(jù)布達(dá)佩斯 條約以保藏登錄號(hào)PTA-7282保藏在ATCC的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的。另外，在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，該細(xì)胞能夠產(chǎn)生克隆的CFU-F。優(yōu)選較大比例的多潛能細(xì)胞能夠分化成至少兩種不同的種系。多潛能細(xì)胞能夠 定型(commit)的種系的非限制性實(shí)例包括骨前體細(xì)胞；肝細(xì)胞前體，其是膽管上皮細(xì)胞和 肝細(xì)胞多潛能的；神經(jīng)限制性細(xì)胞(neuralrestricted cell)，其能夠產(chǎn)生發(fā)展為少突神經(jīng) 膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞前體；發(fā)展成神經(jīng)元的中性前體；心肌和心肌細(xì)胞的 前體，響應(yīng)于葡萄糖而分泌胰島素的胰島β細(xì)胞系的前體。其他種系包括但不限于，成牙 本質(zhì)細(xì)胞、產(chǎn)生牙本質(zhì)的細(xì)胞和軟骨細(xì)胞、以及以下的前體細(xì)胞視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、成 纖維細(xì)胞、皮膚細(xì)胞如角化細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、輸尿管上皮細(xì)胞、平滑肌和骨骼肌 細(xì)胞、睪丸祖細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肌腱、韌帶、軟骨、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓間質(zhì)細(xì)胞、 心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、周細(xì)胞、血管細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì) 胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。在一種實(shí)施方式中，干細(xì)胞及其后代能夠分化成周細(xì)胞。在另一種實(shí)施方式中，“多潛能細(xì)胞”在培養(yǎng)后不能產(chǎn)生造血細(xì)胞。本發(fā)明的方法適用的干細(xì)胞可以來(lái)自于成體組織、胚胎或胎兒。術(shù)語(yǔ)“成體”以最 廣泛的意義使用，包括出生后的受治療者。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“成體”是指青 春后期的受治療者。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“成體”也能夠包括取自雌性的臍帶血。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生于本文中描述的體外培養(yǎng)干細(xì)胞和包括干細(xì)胞以及其后代等 的的直系后代的后代細(xì)胞(其也能夠稱之為擴(kuò)展細(xì)胞)的用途。根據(jù)培養(yǎng)條件(包括在培 養(yǎng)基中的刺激因子的數(shù)目和/或類型)的不同，本發(fā)明的擴(kuò)展細(xì)胞可以具有各種不同的表 型、傳代數(shù)等。在某些實(shí)施方式中，后代細(xì)胞獲自親代群傳代后約2，約3，約4，約5，約6，約 7，約8，約9，或約10代。然而，后代細(xì)胞可以獲自父本群之后任何傳代數(shù)。后代細(xì)胞可以通過(guò)在任何合適的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)而獲得。對(duì)于本文中提到的細(xì)胞 培養(yǎng)基，所使用的術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)基”包括細(xì)胞所處環(huán)境的構(gòu)成。培養(yǎng)基可以是固態(tài)的、液態(tài)的、氣態(tài)的或各種多種相態(tài)和物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基包括液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基以及不維持細(xì)胞生長(zhǎng) 的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基還包括凝膠介質(zhì)如瓊脂、瓊脂糖、明膠和膠原基質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)基”也 是指預(yù)想用于細(xì)胞培養(yǎng)的物質(zhì)，即使其并不接觸細(xì)胞。換句話說(shuō)，為細(xì)菌培養(yǎng)制備的營(yíng)養(yǎng)豐 富的液體就是一種培養(yǎng)基。類似地，當(dāng)與水或其他液體混合時(shí)成為合適用于細(xì)胞培養(yǎng)的粉 末混合物，可以被稱為“粉狀培養(yǎng)基”。在一種實(shí)施方式中，適用于本發(fā)明方法的后代細(xì)胞通過(guò)采用用STR0-3抗體標(biāo)記 的磁珠從骨髓中分離TNAP+細(xì)胞，并如先前所述在補(bǔ)充有20%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺 和100 μ m L-抗壞血酸-2-磷酸鹽的α -MEM中培養(yǎng)皿培養(yǎng)而獲得(對(duì)于有關(guān)培養(yǎng)條件的 進(jìn)一步細(xì)節(jié)，參見(jiàn) Gronthos et al. (1995))。在一種實(shí)施方式中，這種擴(kuò)展的細(xì)胞(至少5代之后)可以是TNAP_、CC9+、HLA類 I+、HLA 類 ΙΓ、CD 14\ CD CD3-、CDlla-c-、CD3r、CD86-和 / 或 CD8(T。然而，在與本文 中描述的培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)條件下，不同標(biāo)記物的表達(dá)可以是不同的。而且，盡管這些表 型的細(xì)胞可以在擴(kuò)展細(xì)胞群中占優(yōu)勢(shì)，但是并不意味著不存在那些不具有這種表型(這些 表型)的少量比例的細(xì)胞(例如，擴(kuò)展細(xì)胞的小百分?jǐn)?shù)可以是CC9—)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方 式中，本發(fā)明的擴(kuò)展細(xì)胞仍具有分化成不同細(xì)胞類型的能力。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明方法中使用的擴(kuò)展細(xì)胞群中包含至少25%，更優(yōu)選至 少50%的細(xì)胞是CC9+。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明方法中使用的擴(kuò)展細(xì)胞群中包含至少40%，更優(yōu)選 至少45%的細(xì)胞是STR0-1+。在另一種實(shí)施方式中，后代細(xì)胞可以表達(dá)選自由以下標(biāo)記物組成的組中的標(biāo)記 物L(fēng)FA-3、THY-I、VCAM-I、ICAM-I、PECAM-1、P-選擇蛋白、L-選擇蛋白、3G5、CD49a/CD49b/ CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD18、CD61、整聯(lián)蛋白 β、6-19、血栓調(diào)節(jié)蛋白、CD10、 CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素-R、(STR0-2 =瘦素-R)、RANKL, STRO-Ii^P⑶146或這些標(biāo)記物的任意組合。在一種實(shí)施方式中，后代細(xì)胞是在WO 2006/032092中定義的多潛能擴(kuò)展的MPC后 代(MEMP)。WO 01/04268和WO 2004/085630中描述了制備可由其獲得的后代的MPC富集 群的方法。在體外環(huán)境中，MPC幾乎不會(huì)以絕對(duì)純凈制劑存在，起一般與其他屬于組織特異 性定型細(xì)胞(TSCC) —起存在。WO 01/04268涉及從骨髓以約0. 1 %至90%的純度水平收獲 這種細(xì)胞。含有可由其獲得的后代的MPC的群可以直接從組織源收獲，或可替代地可以是 已經(jīng)離體(ex vivo)擴(kuò)展的群。例如，后代可以獲自收獲的、未擴(kuò)展的、基本上純的MPC群，包含它們所在的群 中的全部細(xì)胞的至少約 0. 1 %，1 %，5 %，10 %，20 %，30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 % 或 95%。這個(gè)水平可以例如通過(guò)對(duì)于選自由TNAP、STR0-1亮、3G5+、VCAM-I、THY-U CD 146和 STR0-2組成的組中的至少一種標(biāo)記物呈陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行選擇而實(shí)現(xiàn)。MPC起始群可以，例如，來(lái)自于WO 01/04268或WO 2004/085630中所列出的任何一 種或多種組織類型，即骨髓、牙髓細(xì)胞、脂肪組織和皮膚，或可能更廣泛地來(lái)自于脂肪組織、 牙齒、牙髓、皮膚、肝臟、腎臟、心臟、視網(wǎng)膜、腦、毛囊、腸、肺、脾、淋巴結(jié)、胸腺、胰、骨、韌帶、 骨髓、肌腱和骨骼肌。MEMPS與新收獲MPC的區(qū)別之處在于它們對(duì)于標(biāo)記物STRO-Itoi呈陽(yáng)性而對(duì)于標(biāo)記物堿性磷酸酶(ALP)呈陰性。相比而言，新分離的MPC對(duì)于STR0-ltoi*ALP都呈陽(yáng)性。在 本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，至少15%, 20%, 30%,40%, 50%,60%, 70%,80%,90%^ 95%的所給予的細(xì)胞具有表型STRO-Itoi, ALP—。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，MEMPS對(duì)于Ki67、 ⑶44和/或⑶49c/t^9、VLA-3、α 3 β 1中的一種或多種標(biāo)記物呈陽(yáng)性。在還有的另一優(yōu) 選實(shí)施方式中，MEMP并不表現(xiàn)出TERT活性和/或?qū)τ跇?biāo)記物⑶18呈陰性。在一種實(shí)施方式中，細(xì)胞取自患有血管發(fā)生相關(guān)疾病的患者，利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)體外 培養(yǎng)并向患者作為自體同源或異源移植物進(jìn)行給藥。在一種可替代實(shí)施方式中，使用了一 種或多種已構(gòu)建的人細(xì)胞系的細(xì)胞。在本發(fā)明另一有用的實(shí)施方式中，使用非人動(dòng)物的細(xì) 胞(或如果患者不是人類，而來(lái)自另一物種)。本發(fā)明能夠采用來(lái)自任何非人動(dòng)物物種的細(xì)胞來(lái)實(shí)施，包括但不限于，非人靈長(zhǎng) 類動(dòng)物細(xì)胞、有蹄動(dòng)物、犬科、貓科、兔類動(dòng)物、嚙齒類動(dòng)物、鳥(niǎo)類和魚(yú)類動(dòng)物細(xì)胞?？梢杂糜?實(shí)施本發(fā)明的靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于黑猩猩、狒狒、獼猴和任何其他新大陸猴或舊 大陸猴的細(xì)胞?？梢杂糜趯?shí)施本發(fā)明的有蹄動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于牛、豬、綿羊、山羊、馬、 水牛和野牛的細(xì)胞。可以用于實(shí)施本發(fā)明的嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于，小鼠、大鼠、豚 鼠、倉(cāng)鼠和沙鼠細(xì)胞。可以用于實(shí)施本發(fā)明的兔類動(dòng)物種的實(shí)例包括家兔、長(zhǎng)腿野兔、野兔、 棉尾兔(cottontail)、雪鞋兔(snowshoe rabbit)和鼠兔。可以用于實(shí)施本發(fā)明的鳥(niǎo)類物 種的實(shí)例是雞(原雞(Gallus gallus))。適用于本發(fā)明方法的細(xì)胞可以在使用之前儲(chǔ)存。保存和儲(chǔ)存真核細(xì)胞，尤其是 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法和方案在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的(cf.，例如，Pollard, J. W. and Walker, J. Μ. (1997)Basic Cell Culture Protocols,第 二 版，Humana Press, Totowa, N. J.； Freshney, R. I. (2000) Culture of AnimalCells，第四版，Wiley-Liss，Hoboken，N. J.)。維 持所分離的干細(xì)胞如間質(zhì)干細(xì)胞/祖細(xì)胞，或其后代細(xì)胞的生物活性的任何方法都可以結(jié) 合本發(fā)明使用。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)使用低溫冷藏來(lái)維持和儲(chǔ)存細(xì)胞。在一種實(shí)施方式中，細(xì)胞是同種異源的或自體同源的。能夠用于治療或預(yù)防眼病的細(xì)胞類型的其他實(shí)例包括但不限于，WO 07/130060 (來(lái)自視網(wǎng)膜外組織的成年視網(wǎng)膜干細(xì)胞)、US 2008089868 (視網(wǎng)膜干細(xì)胞)、US 2001031256 (神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞和豬視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)、US20060(^900 (視網(wǎng)膜色素上皮 細(xì)胞)、US 2007248644(馬勒干細(xì)胞)和US 616 (hNT-神經(jīng)元細(xì)胞)中描述的細(xì)胞。能夠用于本發(fā)明方法的其他細(xì)胞類型的實(shí)例包括但不限于，⑶34+造血干細(xì)胞、來(lái) 自于脂肪組織的細(xì)胞、來(lái)自于STR0-1-骨髓的MPC、胚胎干細(xì)胞、和骨髓或外周血單核細(xì)胞。細(xì)胞分選技術(shù)適用于本發(fā)明方法的細(xì)胞能夠利用各種技術(shù)獲取。例如，能夠使用許多細(xì)胞分選 技術(shù)，這些技術(shù)根據(jù)與細(xì)胞-抗體復(fù)合物有關(guān)的性質(zhì)，或連接于抗體的標(biāo)記(Iable)而物理 分離細(xì)胞。這種標(biāo)記可以是磁性顆?；驘晒夥肿??？贵w可以是交聯(lián)的而使之形成可通過(guò)其 密度分離的多細(xì)胞的聚集體?？商娲兀贵w可以粘附于所需的細(xì)胞粘附的靜態(tài)基質(zhì)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用結(jié)合于TNAP+、STR0-1+、VCAM-1+、ΤΗΥ-Γ、STR0-2+、 3G5+、⑶45+、⑶146+的抗體(或其他結(jié)合劑)來(lái)分離這些細(xì)胞。更優(yōu)選地，使用結(jié)合于TNAP+ 或STRO-Γ的抗體(或其他結(jié)合劑)來(lái)分離這些細(xì)胞。從未結(jié)合的細(xì)胞中分離抗體結(jié)合的細(xì)胞的各種方法是已知的。例如，結(jié)合于細(xì)胞的抗體(或抗同型抗體(anti-isotype antibody))能夠被標(biāo)記并隨后通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記存在 的機(jī)械細(xì)胞分選器來(lái)分離細(xì)胞。熒光活化的細(xì)胞分選器在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)是公知的。在一種 實(shí)施方式中，抗-TNAP抗體和/或STR0-1抗體連接至固體載體。各種固體載體對(duì)于本領(lǐng) 域技術(shù)人員公知的，包括但不限于，瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、中空纖維膜、聚合物和塑料培養(yǎng) 皿。能夠通過(guò)從細(xì)胞懸浮液中簡(jiǎn)單物理分離固體載體而將經(jīng)由抗體結(jié)合的細(xì)胞細(xì)胞懸浮液 中除去。超順磁性微粒子可以用于細(xì)胞分離。例如，可以用抗-TNAP抗體和/或STROng-I 抗體來(lái)涂覆微粒?？贵w標(biāo)記的超順磁微?？梢噪S后用包含所關(guān)注細(xì)胞的溶液進(jìn)行培養(yǎng)。微 粒結(jié)合于所需干細(xì)胞的表面，并且隨后能夠在磁場(chǎng)中收集這些細(xì)胞。在另一實(shí)例中，細(xì)胞樣品容許物理接觸，例如，固體載體連接的抗-TNAP單克 隆抗體和/或抗-STR0-1單克隆抗體。固相連接能夠包括，例如，將抗體吸附于塑料、 硝基纖維素或其他表面上?？贵w也能夠吸附于中空纖維膜的大孔的壁上(足夠大而容 許細(xì)胞流過(guò))?？商娲?，抗體能夠共價(jià)地連接至表面或珠上，如法瑪西亞瓊脂糖凝膠 6MB(PharmaciaSepharose 6MB)的大珠上。采用包含干細(xì)胞的懸浮液對(duì)于固相-連接抗體 培養(yǎng)的精確條件和持續(xù)時(shí)間取決于對(duì)所采用系統(tǒng)具有特異性的幾種因素。然而，合適條件 的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。在使干細(xì)胞結(jié)合足夠的時(shí)間之后，用生理緩沖劑隨后洗脫或沖洗掉未結(jié)合的細(xì) 胞?？苫厥瘴唇Y(jié)合的細(xì)胞能夠以用于其他目的或在合適的測(cè)試完成后以確保所需分離已經(jīng) 達(dá)到后丟棄。結(jié)合的細(xì)胞隨后通過(guò)任何合適的方法從固相分離，這些方法主要取決于固相 和抗體的性質(zhì)。例如，通過(guò)劇烈攪拌使結(jié)合的細(xì)胞從塑料培養(yǎng)皿洗脫?？商娲?，結(jié)合的細(xì) 胞能夠通過(guò)酶的“間隙(nicking) ”或消化固相和抗體之間的酶敏性“間隔區(qū)(spacer) ”序 列而被洗脫。結(jié)合于瓊脂糖珠的間隔區(qū)，可以從例如Wiarmacia商購(gòu)獲得。被洗脫的富集的細(xì)胞部分隨后可以通過(guò)離心用緩沖液沖洗，并且所述富集的部分 可以根據(jù)常規(guī)技術(shù)以存活狀態(tài)低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?，將培養(yǎng)物擴(kuò)展和/或引入至患者中。中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物適用于本發(fā)明方法的化合物能夠是降低VEGF發(fā)揮其正常生物效應(yīng)能力的任何類 型的分子。例如，該化合物可以結(jié)合VEGF本身、其受體，或在通過(guò)VEGF結(jié)合之后在VEGF受 體的活化后被活化和/或合成的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白或轉(zhuǎn)錄因子，或減少它們的的產(chǎn)生。因 此，如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物”是指減少VEGF、VEGF受體或 其他涉及VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的分子的量，和/或VEGF通過(guò)其相應(yīng)受體發(fā)送信號(hào)并產(chǎn)生相關(guān)下 游生物學(xué)效應(yīng)(如促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或分裂)的能力。化合物和其靶(例如，VEGF)之間的結(jié)合可以由共價(jià)或非共價(jià)相互作用或共價(jià)和 非共價(jià)相互作用的組合而介導(dǎo)。當(dāng)該相互作用產(chǎn)生非共價(jià)結(jié)合絡(luò)合物時(shí)，所產(chǎn)生的結(jié)合典 型地是靜電結(jié)合、氫鍵或親水/親脂相互作用的結(jié)果。在一種實(shí)施方式中，該化合物是純化 的和/或重組多肽。尤其優(yōu)選的化合物是純化的和/或重組的抗體、抗體相關(guān)的分子或其 抗原結(jié)合片段。盡管并不是必要的，但是該化合物可以特異性地結(jié)合于靶。短語(yǔ)“特異性地結(jié)合” 是指在特定條件下，化合物結(jié)合于靶而不結(jié)合于大量的其他物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)或碳水化合 物。例如，在一種實(shí)施方式中，化合物特異性地結(jié)合于VEGF-A，而不結(jié)合其他的VEGF。在另一種實(shí)施方式中，如果在化合物與靶的結(jié)合與另一種蛋白質(zhì)與靶的結(jié)合相比時(shí)，它們之間 存在超過(guò)10倍的差異，且優(yōu)選25、50或100倍時(shí)，就認(rèn)為化合物是“特異性地結(jié)合”。適用于本發(fā)明的化合物的實(shí)例包括但不限于，VEGF的喹唑啉衍生物抑制劑 (US 2007265286, US 2003199491 和 US 6809097)、五羥黃酮(槲皮素，quercetin)(抑 制VEGFMTO 02/057473)、VEGFR酪氨酸激酶的喹唑啉衍生物抑制劑(US 2007027145)、 VEGFR酪氨酸激酶的氨基苯甲酸衍生物抑制劑(US 6720424)、VEGFR酪氨酸激酶的吡 啶衍生物抑制劑(US 2003158409)、雷生汀(Recentin) (Astra Zeneca)(抑制所有三種 VEGFR) (W0 07/060402)、舒尼替尼(Novartis)(抑制所有三種 VEGFR) (W0 08/031835 和 US 6，573，293)、培加尼布(Macugen ) (US 6，051，698)、阿昔替尼(Pfizer)(抑制所有 三種 VEGFR) (W0 2004/087152)、索拉非尼(Bayer Pharmaceuticals) (WO 07/053573)、 VEGFR-I結(jié)合肽(US2005100963)、阻斷結(jié)合于受體的VEGF的富精氨酸抗-血管內(nèi)皮生 長(zhǎng)因子肽(US 7291601)、VEGF-Trap (Regeneron Pharmaceuticals) (US2005032699)、可 溶性的 VEGF 受體(US20061 10364 和 Tseng et al.，2002)、VEGF-C 和 VEGF-D 擬肽抑制 劑(US 2002065218)、阻斷 VEGF 從 VEGF-肝素復(fù)合物釋放的 PAI-I (US 2004121955)、US 2002068697、W002/081520、US 20060234941、US 2002058619 中描述的抑制劑、以及以下所 概括的其他實(shí)例。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中、該化合物是來(lái)尼珠單抗(Lucentis)、阿瓦斯汀 或 VEGF-iTrap。靶分子的實(shí)例在一種實(shí)施方式中，這種中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物的靶分子是血管內(nèi)皮生長(zhǎng) 因子。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子”或“VEGF”是指一組在細(xì)胞表面結(jié) 合于酪氨酸激酶受體(VEGF受體，或VEGFR)而刺激血管發(fā)生、血管形成和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的 生長(zhǎng)因子(參見(jiàn)，例如，Breen，2007)。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“VEGF-A”是指結(jié)合于VEGFR-I和VEGFR-2受體以刺激 內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生有絲分裂和細(xì)胞遷移，刺激MMOP活性，增加α νβ 3活性，促進(jìn)血管腔的產(chǎn)生 和穿孔的VEGF多肽生長(zhǎng)因子家族中的成員，其對(duì)于巨噬細(xì)胞和粒性白細(xì)胞是趨化性的，并 也是一種強(qiáng)效血管擴(kuò)張劑(Breen, 2007 ；Eremina和Quaggin, 2004)。另外，已經(jīng)鑒別出了 VEGF-A的剪接轉(zhuǎn)錄變異體，其產(chǎn)生VEGF-A的多個(gè)不同的同種型。VEGF-A多肽的實(shí)例包括 含有SEQ ID NO :1的氨基酸序列的蛋白，以及其變體和/或突變體。另外，編碼前原VEGF-A 的開(kāi)放讀碼框的實(shí)例是由SEQID NO 9提供的。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“VEGF-B”是指結(jié)合于VEGFR-I受體以刺激血管發(fā)生，內(nèi) 皮細(xì)胞有絲分裂和遷移的VEGF多肽生長(zhǎng)因子家族的成員(Breen，2007 ;01ofsson et al., 1996)。另外，已經(jīng)鑒別了 VEGF-B的剪接轉(zhuǎn)錄變異體，其產(chǎn)生VEGF-A的多個(gè)不同的同種型。 VEGF-B多肽的實(shí)例包括含有SEQ ID NO :2的氨基酸序列的蛋白，以及其變體和/或突變體。 另外，編碼前原VEGF-B的開(kāi)放讀框碼框的實(shí)例是由SEQ ID NO 10提供的。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“ VEGF-C”是指結(jié)合于VEGFR-2和Flt4受體以刺激內(nèi)皮 細(xì)胞有絲分裂和遷移以及淋巴血管發(fā)生的VEGF多肽生長(zhǎng)因子家族中的成員(Breen，2007 ； Su et al.，2007)。VEGF-C經(jīng)過(guò)絡(luò)合物蛋白水解成熟以產(chǎn)生幾個(gè)同種型而僅有完全處理的 形式(fully processedfrom)能夠結(jié)合并活化其同源VEGFR-2受體。VEGF-C多肽的實(shí)例包括含有SEQ ID NO :3的氨基酸序列的蛋白，以及其變體和/或突變體。另外，編碼前原 VEGF-C的開(kāi)放讀碼框的實(shí)例是由SEQ ID NO 11提供的。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“VEGF-D”是指結(jié)合于VEGFR-2受體和VEGFR-3受體以 刺激血管發(fā)生，淋巴管新生和內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和遷移的VEGF多肽生長(zhǎng)因子家族的成員。 VEGF-D經(jīng)過(guò)絡(luò)合物蛋白水解成熟而產(chǎn)生幾個(gè)同種型而僅有完全處理的形式能夠結(jié)合并活 化其同源VEGFR-2受體和VEGFR-3受體。VEGF-D多肽的實(shí)例包括含有SEQ ID NO :4的氨 基酸序列的蛋白，以及其變體和/或突變體。另外，編碼前原VEGF-D的開(kāi)放讀碼框的實(shí)例 是由SEQ ID N0:12提供的。在一種實(shí)施方式中，中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的靶分子是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“VEGFR-1” (也被稱為為Flt_l)是指位于細(xì)胞表面上的 VEGF酪氨酸激酶受體家族的成員1，其含有7個(gè)胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域 和一個(gè)包含酪氨酸激酶功能的胞內(nèi)域，VEGF-A和VEGF-B結(jié)合于此(Olsson et al.，2006 ； Cross et al.，2003)。一旦結(jié)合配體(例如，VEGF-A)，VEGFR-I受體發(fā)生二聚并通過(guò)磷酸 轉(zhuǎn)移作用被活化一刺激血管發(fā)生、血管形成和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)。VEGFR-I多肽的實(shí)例包括含 有SEQ ID NO :5的氨基酸序列的蛋白，以及其變體和/或突變體。另外，編碼VEGF-I的開(kāi) 放讀碼框的實(shí)例是由SEQ ID NO 13提供的。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“VEGFR-2” (也被稱為KDR或Flk_l)是指位于細(xì)胞表面 上的VEGF酪氨酸激酶受體家族的成員2，其含有7個(gè)胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)包含酪氨酸激酶功能的胞內(nèi)域，VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D結(jié)合于此(Olsson et al. ,2006 ；Crosset al.，2003)。一旦與配體結(jié)合，VEGFR-2受體就發(fā)生二聚并通過(guò)磷酸 轉(zhuǎn)移作用被活化以刺激血管發(fā)生、血管形成和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)。VEGFR-2多肽的實(shí)例包括含 有SEQ ID NO :6的氨基酸序列的蛋白，以及其變體和/或突變體。另外，編碼VEGF-2的開(kāi) 放讀碼框的實(shí)例是由SEQ ID N0:14提供的。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“VEGFR-3”(也被稱為為Fltk-4)是指位于細(xì)胞表面上的 VEGF酪氨酸激酶受體家族的成員3，其含有7個(gè)胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域 和一個(gè)包含酪氨酸激酶功能的胞內(nèi)域，VEGF-C和VEGF-D結(jié)合于此(Olsson et al.，2006 ； Cross et al.，2003)。一旦結(jié)合配體，VEGFR-3受體二聚并通過(guò)磷酸轉(zhuǎn)移作用被活化而介 導(dǎo)血管增生。VEGFR-3多肽的實(shí)例包括含有SEQ ID NO :7的氨基酸序列的蛋白，以及其變 體和/或突變體。另外，編碼VEGF-3的開(kāi)放讀碼框的實(shí)例是由SEQ ID N0:15提供的。在另外一種實(shí)施方式中，中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的靶分子使血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的生 長(zhǎng)減少。例如，該靶分子可以是缺氧誘導(dǎo)因子I(HIF-I)。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“缺氧誘導(dǎo)因子1” (HIF-I)是指調(diào)節(jié)參與低氧響應(yīng)中的 基因的轉(zhuǎn)錄因子。例如，已知HIF-I在低氧響應(yīng)中上調(diào)VEGF表達(dá)(Zhang et al.，2007)。 HIF-I α是HIF-I的可誘導(dǎo)亞單元。HIF-I多肽的實(shí)例包括SEQ ID NO :8的氨基酸序列的 蛋白，以及其變體和/或突變體。另外，編碼HIF-I的開(kāi)放讀碼框的實(shí)例是由SEQ ID Ν0 16提供的。靶向于HIF-I的化合物實(shí)例包括但不限于，棘霉素(Kong et al.，2005)、 BDDF-I (W0 08/004798)、S-2-氨基-3- [4 ‘ -N, N，- 二 (2-氯乙基)氨基]苯基丙酸 N-氧 化物二 鹽酸鹽(PX-478) (US 2005049309)、黑毛霉素(Kunget al. ,2004),3-(5 ‘-羥甲基-2 ‘-呋喃基)-1-節(jié)基吲唑(YC-I) (Yeo et al.，2003)、103D5R(Tan et al.， 2005)、quinocarmycin 單檸檬酸鹽及其衍生物(Rapisardaet al. ,2002) ,3-(5'-羥甲 基-2'-呋喃基)-1-芐基吲唑(US 2004198798)、以及 NSC-134754 和 NSC-643735 (Chau et al.，2005)。在另外一種實(shí)施方式中，中斷VEGF-信號(hào)傳遞的靶分子是經(jīng)由VEGF結(jié)合之后在 VEGF受體活化作用后活化和/或合成的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白或轉(zhuǎn)錄因子?？贵w-一般性抗體可以作為完整免疫球蛋白存在，或作為以各種形式的修飾物(modification) 存在，包括，例如，但不限于，包括Vh或\域的域抗體、重鏈可變區(qū)的二聚體(VHH，對(duì)于駱駝 科動(dòng)物描述的)、輕鏈可變區(qū)的二聚體(VLL)、僅包含輕鏈和重鏈可變區(qū)的Fv片段、或包含 重鏈可變區(qū)和CHl域的Fd片段。術(shù)語(yǔ)“抗體”也涵蓋由連接在一起形成單鏈抗體的重鏈和 輕鏈可變區(qū)的 scFv (Bird et al. , 1988 ；Huston et al.，1988)和 scFv 的低聚物，如二聚 體和三聚體。非天然存在的抗體包含至少一個(gè)⑶R，更優(yōu)選至少一個(gè)可變域，在本文中其也 被稱為“抗體相關(guān)的分子”。術(shù)語(yǔ)“抗體”也涵蓋抗體的片段，如包含可變區(qū)和部分恒定區(qū)的 Fab、(Fab' )2*FabFc2片段。⑶R嫁接的抗體片段和抗體片段的低聚物也涵蓋在內(nèi)。Fv 的重鏈和輕鏈組分可以來(lái)自于相同的抗體或不同的抗體，由此產(chǎn)生嵌合Fv區(qū)。抗體可以 是動(dòng)物(例如，小鼠、家兔或大鼠)抗體或人源抗體或可以是嵌合抗體(Morrison et al.， 1984)或人源化抗體(Jones et al.，1986)。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括這些各 種形式。利用本文中提供的準(zhǔn)則和以上引述的參考文獻(xiàn)和如Harlow & Lane(Supra)之類 的出版物中描述的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，能夠容易地制作出適用于本發(fā)明方法的抗 體?？贵w可以是包含可變輕鏈和可變重(Vh)鏈的Fv區(qū)。輕鏈和重鏈可以直接或 通過(guò)連接子連接在一起。如本文中所使用的連接子是指共價(jià)連接至輕鏈和重鏈并提供兩條 鏈之間足夠間隔和柔性，以使它們能夠?qū)崿F(xiàn)其中它們能夠特異性結(jié)合其所指向的抗原決定 基的構(gòu)造。蛋白連接子由于它們可以表達(dá)為融合多肽的Ig部分的固有組分而是特別優(yōu)選 的。在另一實(shí)施方式中，在本發(fā)明的方法中使用重組生產(chǎn)的單鏈scFv抗體，優(yōu)選人源 化的scFv。各種免疫分析方式可以用于選擇與靶分子(如VEGF或其受體)具有特異性免疫 反應(yīng)活性的抗體。例如，表面標(biāo)記和流式細(xì)胞測(cè)量分析或固相ELISA免疫分析都常規(guī)用于 選擇與蛋白或碳水化合物具有特異性免疫反應(yīng)活性的抗體。參見(jiàn)Harlow & Lane(Supra), 其中描述了免疫分析方式和能夠用于測(cè)定特異性免疫反應(yīng)活性的條件。能夠適用于本發(fā)明方法的抗體、抗體相關(guān)的分子或其片段的實(shí)例包括但不限于， 抗-VEGF-A抗體如貝伐單抗(阿瓦斯汀)(US 6，054, 297)、來(lái)尼珠單抗(Lucentis) (US 6，407, 213)和描述于US 5730977和US2002032315中的那些；抗-VEGF-B抗體如描述于US 2004005671和W007/140534中的那些；抗-VEGF-C抗體如描述于US 6403088中的那些； 抗-VEGF-D抗體如描述于US 7097986中的那些；抗-VEGFR-I抗體如描述于US 2003088075 中的那些；抗-VEGFR-2抗體如描述于US 6344339，WO 99/40118和US 2003176674中的那 些；以及抗-VEGFR-3抗體如描述于US 6824777中的那些。
單克隆抗體通過(guò)雜交瘤制備單克隆抗體的一般方法是公知的。產(chǎn)生永生化抗體的細(xì)胞系能夠 通過(guò)細(xì)胞融合，并且也可以通過(guò)其他技術(shù)如B淋巴細(xì)胞與成瘤DNA直接轉(zhuǎn)化，或與愛(ài)波斯 坦-巴爾病毒(Epstein-Barr viru)轉(zhuǎn)染來(lái)制備。對(duì)靶抗原決定基生產(chǎn)的單克隆抗體的面 板能夠?qū)Ω鞣N性質(zhì)進(jìn)行篩選；即，對(duì)于異型和抗原決定基親合性。來(lái)自于動(dòng)物的單克隆抗體都能夠用于支配體內(nèi)和體外免疫療法。然而，據(jù)觀察，例 如，當(dāng)來(lái)自小鼠的單克隆抗體能夠作為治療藥物用于人類時(shí)，患者產(chǎn)生人抗鼠抗體。因此， 來(lái)自于動(dòng)物的單克隆抗體對(duì)于治療，尤其是用長(zhǎng)期使用時(shí)，并不是優(yōu)選的。然而，采用所構(gòu) 建的遺傳工程技術(shù)，可以創(chuàng)造具有來(lái)自于動(dòng)物的和來(lái)自于人的部分的嵌合抗體或人源化的 抗體。動(dòng)物能夠是，例如，小鼠或其他嚙齒類動(dòng)物，如大鼠。如果嵌合抗體的可變區(qū)是，例如，來(lái)自于小鼠的，而恒定區(qū)是來(lái)自于人的，則該嵌 合抗體一般比“純的”鼠源單克隆抗體的免疫原性要差。這些嵌合抗體可能更適用于治療 應(yīng)用，從而認(rèn)為“純的”鼠源抗體是不適合的。產(chǎn)生嵌合抗體的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員都是可以利用的。例如，輕鏈和重鏈能 夠利用，例如，免疫球蛋白輕鏈和免疫球蛋白重鏈在單獨(dú)的質(zhì)粒中單獨(dú)表達(dá)。隨后將它們進(jìn) 行純化并體外組裝成完整抗體；完成這種組裝的方法已經(jīng)進(jìn)行了描述(參見(jiàn)，例如，Sim et al.，1986)。這種DNA構(gòu)建體(或構(gòu)件，construct)可以包含編碼抗體輕鏈或重鏈可變區(qū) 的功能重排基因的DNA，其中該抗體編碼連接于編碼人恒定區(qū)的DNA。用輕鏈和重鏈的DNA 構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的淋巴細(xì)胞(如骨髓瘤或雜交瘤)能夠表達(dá)和組裝這種抗體鏈。從還原分離的輕鏈和重鏈形成IgG抗體的體外反應(yīng)參數(shù)也已經(jīng)進(jìn)行了描述。也 可以在同一細(xì)胞中共表達(dá)輕鏈和重鏈，從而實(shí)現(xiàn)輕鏈和重鏈發(fā)生胞內(nèi)締合并連接成完整的 H2L2 IgG抗體。這種共表達(dá)能夠采用相同的或不同的質(zhì)粒在相同的宿主細(xì)胞中完成。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體是人源化的，即通過(guò)分子模型技術(shù)產(chǎn)生抗 體，其中抗體人源部分最大化而同時(shí)導(dǎo)致幾乎沒(méi)有或沒(méi)有損失可歸于，例如，親代大鼠、兔 或鼠科動(dòng)物抗體的可變區(qū)的結(jié)合親合性。以下描述的方法可適用于抗體的人源化。在確定人源化過(guò)程中使用什么樣的人源化抗體序列時(shí)需要考慮幾個(gè)因素。輕鏈和 重鏈的人源化應(yīng)彼此獨(dú)立地考慮，但是考慮輕鏈和重鏈的原理是基本上類似的。這種選擇過(guò)程基于以下基本原理給定抗體的抗原特異性和親合性主要是通過(guò)可 變區(qū)CDR的氨基酸序列來(lái)確定的?？勺儏^(qū)框架殘基幾乎沒(méi)有或沒(méi)有直接貢獻(xiàn)?？蚣軈^(qū)的主 要功能是在其適當(dāng)?shù)目臻g定向上固定CDR從而識(shí)別抗原。因此，如果人可變域框架與其所 起源的動(dòng)物可變域的同源程度最高，則動(dòng)物如嚙齒動(dòng)物CDR替代成人可變域框架最可能導(dǎo) 致其適當(dāng)?shù)目臻g定向得以保留。應(yīng)該優(yōu)先選擇人可變域，從而高度同源于動(dòng)物可變域。合 適的人抗體可變域序列能夠如下進(jìn)行選擇。步驟1.利用計(jì)算機(jī)程序，搜索那些與動(dòng)物源抗體可變域同源程度最高的人抗體 可變域序列的所有可用的蛋白質(zhì)(和DNA)數(shù)據(jù)庫(kù)。合適程序的輸出結(jié)果是與動(dòng)物源抗體 同源程度雖高的序列列表、每一序列的同源百分?jǐn)?shù)、以及動(dòng)物源序列的每一序列比對(duì)。這對(duì) 于重鏈和輕鏈可變域序列都是分別完成的。如果僅包含人免疫球蛋白序列，則以上分析就 更容易完成。步驟2.列出人抗體可變域序列并比對(duì)同源性。首先，除了可變程度較高的重鏈的⑶R3之外，在⑶R的長(zhǎng)度上進(jìn)行比對(duì)。將人重鏈和κ和λ輕鏈分成多個(gè)亞組；重鏈3 個(gè)亞組，κ鏈4個(gè)亞組，λ鏈6個(gè)亞組。每一亞組中⑶R的大小類似但是在亞組之間是 可以是不同的。通?？梢詫?dòng)物源抗體CDR匹配于人亞組的抗體作為同源性的一級(jí)近似 (firstapproximation)。隨后對(duì)具有相似長(zhǎng)度⑶R的抗體來(lái)比對(duì)氨基酸序列的同源性，尤 其是在CDR中，而且在周圍框架區(qū)內(nèi)進(jìn)行比對(duì)。選擇最具同源性的人可變域作為人源化的 框架。實(shí)際人源化方法/技術(shù)根據(jù)EP-A-0239400，抗體可以通過(guò)將所需的⑶R嫁接到人框架來(lái)實(shí)施人源化。編 碼所需的改造抗體的DNA序列能夠因此以期望改造其⑶R的人DNA開(kāi)始來(lái)制造。將包含所 需CDR的動(dòng)物源可變域氨基酸序列與所選擇的人抗體可變域序列的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。 對(duì)人可變域中需要改變成動(dòng)物中對(duì)應(yīng)殘基之處的殘基進(jìn)行標(biāo)記以將人可變域引入動(dòng)物源 的CDR。還可以具有需要在人序列中替換、加入和從人序列中刪除的殘基。合成的寡核苷酸能夠用于誘變?nèi)丝勺冇蚩蚣芤允蛊浒璧臍埢＿@些寡核苷 酸能夠是任何方便的尺寸。一種通常由可利用的具體合成子的能力僅受限于長(zhǎng)度。寡核苷 酸體外定向誘變的方法是公知的?？商娲?，人源化可以采用WO 92/07075的重組聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。 利用這種方法，可以在人抗體的框架區(qū)之間剪接⑶R。一般而言，WO 92/07075的技術(shù)能夠 利用包含兩個(gè)人框架區(qū)(AB和CD)及其之間通過(guò)供體CDR替換的CDR的模版來(lái)實(shí)施。引物 A和B用于擴(kuò)增框架區(qū)AB，而引物C和D用于擴(kuò)增框架區(qū)⑶。然而，引物B和C每一個(gè)在 其5'端處還包含對(duì)應(yīng)于所有或至少部分供體⑶R序列的附加序列。引物B和C重疊足夠 的長(zhǎng)度從而能夠在容許實(shí)施PCR的條件下在它們的5'端相互進(jìn)行退火。因此，擴(kuò)增的區(qū)域 AB和CD可以通過(guò)重疊延伸進(jìn)行基因剪接從而在單個(gè)反應(yīng)中生成人源化產(chǎn)物。在誘變反應(yīng)以改造抗體之后，可將經(jīng)誘變的DNA連接于編碼輕鏈和重鏈恒定區(qū)的 合適DNA，克隆到表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這些步驟能夠按照 常規(guī)的模式完成。改造的抗體因此可以通過(guò)包括以下步驟的方法進(jìn)行制備(a)制備包含可操作地連接于編碼Ig重鏈或輕鏈的至少一個(gè)可變域的DNA序列的 合適啟動(dòng)子的第一可復(fù)制表達(dá)載體，可變域包括人抗體和本發(fā)明的人源化抗體所需的CDR 的框架區(qū)；(b)制備包含可操作地連接于分別編碼互補(bǔ)Ig輕鏈或重鏈的至少可變域的DNA序 列的合適啟動(dòng)子的第二可復(fù)制表達(dá)載體；(c)用所制備的該第一載體或兩個(gè)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞系；和(d)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系以生成所述改變的抗體。優(yōu)選地，步驟(a)中的DNA序列都編碼人抗體鏈的可變域和每一個(gè)恒定域。人源化 抗體能夠利用任何合適的重組表達(dá)系統(tǒng)來(lái)制備。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化而生成改變的抗體的細(xì)胞系可以 是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系或永生化哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，其有利地是淋巴來(lái)源的，如骨髓 瘤細(xì)胞系、雜交瘤細(xì)胞系、三源雜交瘤(trioma)細(xì)胞系或四源雜交瘤(quadroma)細(xì)胞系。 該細(xì)胞系也可以包含正常淋巴細(xì)胞，如B-細(xì)胞，其是通過(guò)用病毒，如愛(ài)波斯坦-巴爾病毒轉(zhuǎn) 化而永生化的。最優(yōu)選地，永生化細(xì)胞系是骨髓瘤細(xì)胞系或其衍生物。適用于抗體表達(dá)的CHO細(xì)胞可以是二氫葉酸還原酶(dhfr)缺陷型的因而其生長(zhǎng)依賴于胸苷和次黃嘌呤。親本的dhfrXHO細(xì)胞系用編碼抗體和能夠進(jìn)行dhfr陽(yáng)性表型的 CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)化體選擇的dhfr基因的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過(guò)在缺乏胸苷和次黃嘌呤的培養(yǎng)基上 培養(yǎng)菌落而實(shí)施選擇，胸苷和次黃嘌呤的缺乏防止未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生長(zhǎng)而從廢物再利用的葉 酸途徑轉(zhuǎn)化細(xì)胞，而由此繞過(guò)了選擇系統(tǒng)。這些轉(zhuǎn)化體通常由于所關(guān)注的轉(zhuǎn)染DNA和編碼 dhfr的DNA發(fā)生共合(co-integration)而表達(dá)低水平的所關(guān)注的DNA?？梢酝ㄟ^(guò)采用氨 甲喋呤(MTX)實(shí)施擴(kuò)增來(lái)增加編碼抗體的DNA的表達(dá)水平。這種藥物是酶dhfr的直接抑 制劑從而使得能夠分離出抗性菌落，這些抗性菌落擴(kuò)增其dhfr基因拷貝數(shù)以使得其能夠 足以在這些條件下存活。由于編碼dhfr和抗體的DNA序列緊密連接于初始轉(zhuǎn)化體中，因此 通常存在伴隨擴(kuò)增，從而增加了所需抗體的表達(dá)。適合于與CHO或骨髓瘤細(xì)胞一起使用的另一優(yōu)選表達(dá)系統(tǒng)是W087/04462中描述 的谷氨酰胺合成酶(GS)擴(kuò)增系統(tǒng)。這種系統(tǒng)涉及用編碼酶GS的DNA和編碼所需抗體的 DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。所選擇的細(xì)胞隨后在無(wú)谷氨酰胺培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并由此能夠假定整合了編碼 GS的DNA。這些所選擇的克隆隨后采用甲硫氨酸砜亞胺(Msx)來(lái)進(jìn)行酶GS的抑制作用。為 了存活，該細(xì)胞將會(huì)采用編碼抗體的DNA的伴隨擴(kuò)增而擴(kuò)增編碼GS的DNA。盡管用于產(chǎn)生人源化抗體的細(xì)胞系優(yōu)選是哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，但可替代地可以使用 任何其他合適的細(xì)胞系，如細(xì)菌細(xì)胞系或酵母細(xì)胞系。具體而言，可以設(shè)想，也能夠使用來(lái) 自于大腸桿菌的細(xì)菌菌株。檢測(cè)所獲得抗體的功能性。如果功能性消失，則需要轉(zhuǎn)到步驟 (2)并改變抗體的框架。表達(dá)之后，整個(gè)抗體、其二聚體、單個(gè)輕鏈和重鏈或其他免疫球蛋白形式，都能夠 根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，包括硫酸銨沉淀法、親合柱法、柱色譜法、凝膠電泳法等進(jìn)行回收 和純化(通常參見(jiàn)，Scopes，R. , ProteinPurif ication, Springer-Verlag, N. Y (1982)) 對(duì) 于醫(yī)藥用途，優(yōu)選至少約90 %至95 %同質(zhì)性的基本純凈的免疫球蛋白，且98 %至99 %或更 高同質(zhì)性的免疫球蛋白是最優(yōu)選的。純化之后，部分達(dá)到或達(dá)到所需的同質(zhì)性，則隨后就可 以將人源化抗體用于治療或開(kāi)發(fā)和實(shí)施分析過(guò)程，免疫熒光染色等(一般參見(jiàn)Lefkovits 和 Pernis (編者)，Immunological Methods，第 I 卷和第 II 卷，Academic Press, (1979 和 1981))。也可以通過(guò)將抗原給予轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)制備具有全長(zhǎng)人可變域的抗體，該轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物經(jīng)過(guò)改造響應(yīng)抗原激發(fā)而產(chǎn)生這種抗體，而其內(nèi)源性基因座已失效。各種隨后的操控能 夠?qū)嵤┡c獲得抗體本身或其類似物(參見(jiàn)，例如，US 6，075，181)?；虺聊谝环N實(shí)施方式中，采用基因沉默中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)。術(shù)語(yǔ)“RNA干擾”、“RNAi” 或“基因沉默”一般是指其中雙鏈RNA(dsRNA)分子降低核酸序列的表達(dá)的方法，該雙鏈RNA 分子與該核酸序列共用大部分的同源性或全部的同源性。然而，最近發(fā)現(xiàn)，利用非RNA雙鏈 分子也能夠?qū)崿F(xiàn)基因沉默(參見(jiàn)，例如，US 20070004667) 0RNA干擾(RNAi)尤其適用于特異性抑制特定RNA和/或蛋白的產(chǎn)生。盡管不期 望受限于理論，但是Waterhouse et al. (1998)已經(jīng)提供了一個(gè)用于dsRNA (雙鏈體RNA) 通過(guò)該機(jī)制能夠降低蛋白質(zhì)產(chǎn)生的機(jī)制的模型。這種技術(shù)依賴于包含基本上相同于所關(guān)注 基因的mRNA的序列或其部分的sRNA分子的存在，在這種情況下是編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽 的mRNA的存在。方便地，dsRNA能夠由重組載體或宿主細(xì)胞的單個(gè)啟動(dòng)子產(chǎn)生，其中正義和反義序列通過(guò)不相關(guān)序列側(cè)接，這能夠使正義和反義序列與形成環(huán)結(jié)構(gòu)的不相關(guān)序列雜 交而形成dsRNA分子。本發(fā)明的合適dsRNA分子的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)充分屬于本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人 員的能力范圍，尤其考慮 Waterhouse et al. (1998)，Smith et al. (2000)、WO 99/32619, W099/53050.W0 99/49029 和 WO 01/34815。本發(fā)明包括包含和/或編碼基因沉默的雙鏈區(qū)的核酸分子的用途。核酸分子典型 地是RNA但可以包含DNA、化學(xué)修飾核苷酸和非核苷酸。雙鏈區(qū)應(yīng)該有至少19個(gè)毗鄰核苷酸，例如約19至23個(gè)核苷酸，或可以更長(zhǎng)，例 如，30或50個(gè)核苷酸，或100個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)。可以使用對(duì)應(yīng)于整個(gè)基因轉(zhuǎn)錄物的全長(zhǎng)序 列。優(yōu)選地，它們的長(zhǎng)度為約19至約23個(gè)核苷酸。核酸分子的雙鏈區(qū)域與靶轉(zhuǎn)錄物的同一性應(yīng)該至少為90 %且更優(yōu)選95 % 100% O核酸分子的同一性百分?jǐn)?shù)(% )通過(guò)GAP(Needleman和mmsch，1970)分析(GCG 程序)以空位產(chǎn)生罰分(gap creation penalty) =5禾口空位延伸罰分(gap extension penalty) = 0. 3來(lái)確定。優(yōu)選地，兩個(gè)序列在其全長(zhǎng)長(zhǎng)度上進(jìn)行比對(duì)。核酸分子當(dāng)然可以包含功能上用于穩(wěn)定該分子的不相關(guān)序列。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“短干擾RNA”或“siRNA”是指包含能夠抑制或下調(diào)基因 表達(dá)(例如，通過(guò)以序列特異性方式介導(dǎo)RNAi)的核糖核苷酸的核酸分子，其中雙鏈部分的 長(zhǎng)度小于50個(gè)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度為約19至約23個(gè)核苷酸。例如，siRNA能夠是包含自互 補(bǔ)的正義和反義區(qū)的核酸分子，其中反義區(qū)域包含互補(bǔ)于靶核酸分子中核苷酸序列的核苷 酸序列或其部分，正義區(qū)具有對(duì)應(yīng)于靶核酸序列的核苷酸序列或其部分。siRNA能夠由兩個(gè) 獨(dú)立的寡核苷酸組裝而成，其中一條鏈?zhǔn)钦x鏈而另一條是反義鏈，其中反義和正義鏈?zhǔn)?自互補(bǔ)的。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)siRNA是指等價(jià)于用于描述能夠介導(dǎo)序列特異性RNAi， 例如微小RNA(miRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)、短干擾寡核苷酸、短干擾核酸(siNA)、短干擾修 飾的寡核苷酸、化學(xué)修飾的siRNA、轉(zhuǎn)錄后基因沉默RNA(ptgsRNA)等的核酸分子的其他術(shù) 語(yǔ)。另外，如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)RNAi是指等價(jià)于用于描述序列特異性RNA干擾，如轉(zhuǎn)錄 后基因沉默、轉(zhuǎn)錄抑制或?qū)嶒?yàn)胚胎學(xué)(epigenetics)的其他術(shù)語(yǔ)。例如，本發(fā)明的siRNA分 子在實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)上能夠用于轉(zhuǎn)錄后水平或轉(zhuǎn)錄前水平這兩種水平下的基因沉默。在一個(gè)非 限制性實(shí)例中，通過(guò)本發(fā)明的siRNA分子完成的基因表達(dá)的漸成式調(diào)節(jié)能夠由siRNA介導(dǎo) 的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾從而改變基因表達(dá)。優(yōu)選的小干擾RNA( ‘siRNA’)分子包含與靶mRNA的約19至23個(gè)毗鄰核苷酸相 同的核苷酸序列。在一種實(shí)施方式中，靶mRNA序列開(kāi)始于雙核苷酸AA，包含約30 % 70 % (優(yōu)選30-60%，更優(yōu)選40-60%，且更優(yōu)選約45% -55% )的GC內(nèi)容物，并且例如，按照通 過(guò)標(biāo)準(zhǔn)BLAST搜索測(cè)定，除了將要引入到鳥(niǎo)類動(dòng)物(優(yōu)選雞)基因組中的靶之外，其與任何 核苷酸序列都不具有高百分比的同一性。對(duì)于“shRNA”或“短發(fā)夾RNA”是指少于約50個(gè)核苷酸，優(yōu)選約19至約23個(gè)核 苷酸的siRNA分子，其與位于相同RNA分子上的互補(bǔ)序列堿基配對(duì)，并且其中所述序列和互 補(bǔ)序列通過(guò)至少約4至15個(gè)核苷酸的未成對(duì)區(qū)域而被分隔開(kāi)，該未成對(duì)區(qū)域在由堿基互補(bǔ) 性的兩個(gè)區(qū)域產(chǎn)生的干結(jié)構(gòu)之上形成單鏈環(huán)。單鏈環(huán)的序列實(shí)例是5' UUCAAGAGA 3'和 5' UUUGUGUAG 3'。
所包含的shRNA是雙指的或二指和多指發(fā)夾dsRNA，其中RNA分子包含兩個(gè)或多個(gè) 這種由單鏈間隔區(qū)隔開(kāi)的干環(huán)結(jié)構(gòu)。對(duì)于設(shè)計(jì)siRNA已經(jīng)有既定的標(biāo)準(zhǔn)(參見(jiàn)，例如，Elbashire et al. ,2001 ； Amarzguioui et al. ,2004 ；Reynolds et al. ,2004) 在一些商業(yè)化供應(yīng)商如 Ambion、 Dharmacon, GenScript和OligoEngine的網(wǎng)站上能夠找到詳細(xì)內(nèi)容。典型地，必須產(chǎn)生許 多siRNA并進(jìn)行篩選才能比較其有效性。經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)后，適用于本發(fā)明方法的dsRNA能夠通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法，例如， 通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄、重組、或合成方式來(lái)產(chǎn)生。siRNA能夠通過(guò)使用重組酶如T7 RNA聚合物酶、 和DNA寡核苷酸模版體外產(chǎn)生，或能夠，例如，在培養(yǎng)的細(xì)胞中體內(nèi)制備。在一種優(yōu)選的實(shí) 施方式中，核酸分子是合成產(chǎn)生的。另外，對(duì)于由包含，例如，RNA聚合物酶III啟動(dòng)子的載體產(chǎn)生發(fā)夾siRNA的策略 已經(jīng)進(jìn)行了描述。已經(jīng)構(gòu)建了用于利用Hl-RNA或snTORNA啟動(dòng)子在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)發(fā)夾 siRNA的各種載體。以上描述的RNA分子(例如，第一部分、連接序列、和第二部分)能夠被 可操作地連接于這種啟動(dòng)子。當(dāng)通過(guò)RNA聚合物酶III進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，第一和第二部分形成了 發(fā)夾的雙鏈體主干(stem)而連接序列形成環(huán)(loop) 0 pSuper載體(OligoEngines Ltd.， Seattle, Wash.)也能夠用于產(chǎn)生siRNA?？梢砸牒塑账岬男揎楏w或類似物來(lái)改善本發(fā)明的核酸分子的性能。改善的性能 包括核酸酶耐性增加和/或滲透細(xì)胞膜的能力增加。因此，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”和“雙鏈RNA 分子”等包括合成修飾的堿基例如，但不限于，肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲 基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤和其他烷基腺嘌呤、5-鹵代尿嘧啶、5-鹵代胞嘧啶、6-氮雜胞嘧啶 和6-氮雜胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-鹵代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-巰基腺嘌 呤、8-巰基烷基腺嘌呤、8-羥基腺嘌呤和其他8位取代的腺嘌呤、8-鹵代鳥(niǎo)嘌呤、8-氨基鳥(niǎo) 嘌呤、8-巰基鳥(niǎo)嘌呤、8-巰基烷基鳥(niǎo)嘌呤、8-羥基鳥(niǎo)嘌呤和其他取代的鳥(niǎo)嘌呤、其他氮雜和 去氮腺嘌呤、其他氮雜和去氮鳥(niǎo)嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。在一種實(shí)施方式中，雙鏈分子、優(yōu)選dsRNA，包含含有其中用U代替T的SEQ ID No 9至16提供的任意一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的至少19個(gè)毗鄰核苷酸的寡核苷酸，其中該分子 的雙鏈部分的長(zhǎng)度為至少19個(gè)堿基對(duì)并包含所述寡核苷酸。本發(fā)明方法中能夠使用的雙鏈分子的實(shí)例包括但不限于，CN1804038、CN 1834254、 WO 08/045576、 US 2006025370、 US 2006094032、 GB 2406569、 CA 2537085、 WO 03/070910、US 2006217332、US2005222066、US 2005054596、US 2004209832 和 US 2004138163、US2005148530 和 US 2005171039 中描述的那些。反義多核苷酸術(shù)語(yǔ)“反義多核苷酸”應(yīng)該是指DNA或RNA或其組合的分子，這種分子互補(bǔ)于至少 一部分編碼本發(fā)明的多肽的特異性mRNA分子并能夠干擾轉(zhuǎn)錄后事件如mRNA翻譯。反義方 法的使用在本領(lǐng)域中是公知的(參見(jiàn)，例如，G. Hartmann和S. Endres，Manual of Antisense Methodology，Kluwer (1999))。Senior (1998)認(rèn)為反義方法對(duì)于操控基因表達(dá)現(xiàn)在已經(jīng)是 一種非常完善的技術(shù)。本發(fā)明的一種反義多核苷酸將會(huì)在生理?xiàng)l件下雜交于靶多核苷酸。如本文中所使 用的，術(shù)語(yǔ)“在生理?xiàng)l件下雜交于靶多核苷酸的反義多核苷酸”是指多核苷酸(其全部或部分單鏈的)至少能夠在標(biāo)準(zhǔn)條件下與編碼蛋白的mRNA，例如SEQ ID NO 9至SEQ ID NO 16 中任一種提供的那些，在細(xì)胞中，優(yōu)選在人細(xì)胞中形成雙鏈的多核苷酸。反義分子可以包括對(duì)應(yīng)于結(jié)構(gòu)基因或?qū)τ诨虮磉_(dá)或剪接事件實(shí)施控制的序列 的序列。例如，反義序列可以對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的基因的靶向編碼區(qū)域，或5'-未翻譯區(qū)域 (UTR)或3' -UTR或其組合。其可以部分互補(bǔ)于靶基因的基因的內(nèi)含子序列，其可以是轉(zhuǎn) 錄期間或之后被剪切掉的，優(yōu)選僅僅互補(bǔ)于靶基因的外顯子序列。從UTR的趨異度一般較 大的觀點(diǎn)來(lái)看，靶向這些區(qū)域提供了基因抑制的較大特異性。反義序列的長(zhǎng)度應(yīng)該為至少19個(gè)毗鄰核苷酸，優(yōu)選至少50個(gè)核苷酸，且更優(yōu)選至 少100、200、500或1000個(gè)核苷酸?；パa(bǔ)于整個(gè)基因轉(zhuǎn)錄物的全長(zhǎng)序列都可以使用。長(zhǎng)度 最優(yōu)選100-2000個(gè)核苷酸。反義序列與被靶向轉(zhuǎn)錄物同一性程度應(yīng)該至少為90%竊更優(yōu) 選95% 100%。反義RNA分子當(dāng)然可以包含功能上可以穩(wěn)定該分子的不相關(guān)序列。本發(fā)明方法中能夠使用的反義多核苷酸的實(shí)例包括但不限于描述于US 2003186920 和 WO 07/013704 中的那些。催化性多核苷酸術(shù)語(yǔ)“催化性多核苷酸/核酸”是指特異性識(shí)別獨(dú)特底物并催化這種底物化學(xué)修 飾的DNA分子或含DNA分子(本領(lǐng)域中也被稱為“脫氧核酶”)或RNA分子或含RNA分子 (也被稱為“核酶”)。在催化性核酸中的核酸堿基可以是堿基A、C、G、T(而對(duì)于RNA為U)。典型地，催化性的核酸含有一種特異性識(shí)別靶核酸的反義序列，并具有核酸酶切 活性(本文中也稱之為“催化域(catalytic domain)”)。本發(fā)明中尤其適用的核酶的類型 有錘頭核酶(Haseloff 和 Gerlach, 1988 ；Perrimanet al.，1992)和發(fā)夾核酶(Shippy et al.，1999)。本發(fā)明中適用的核酶和編碼這種核酶的DNA能夠采用本領(lǐng)域中公知的方法進(jìn)行 化學(xué)合成。脫氧核酶也能夠由可操作地連接于RNA聚合物酶啟動(dòng)子，例如，T7 RNA聚合物 酶或SP6 RNA聚合物酶的啟動(dòng)子的DNA分子(轉(zhuǎn)錄后就能產(chǎn)生RNA分子)來(lái)制備。因此， 本發(fā)明還提供了一種編碼本發(fā)明的催化性多核苷酸的核酸分子，即DNA或cDNA。當(dāng)載體也 包含可操作地連接于DNA分子的RNA聚合物酶啟動(dòng)子時(shí)，核酶能夠在用RNA聚合物酶和核 苷酸進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)體外生產(chǎn)。在一種獨(dú)立的實(shí)施方式中，DNA能夠被插入到表達(dá)盒或轉(zhuǎn)錄盒 中。合成之后，RNA分子能夠通過(guò)連接(ligation)于具有使核酶穩(wěn)定并使其耐核糖核酸酶 的能力的DNA分子而進(jìn)行修飾。如同本文中所述的反應(yīng)多核苷酸一樣，本發(fā)明的催化性多核苷酸應(yīng)該也能夠在 “生理?xiàng)l件”，即細(xì)胞(尤其是在動(dòng)物細(xì)胞如人細(xì)胞中的條件)中的那些條件下雜交靶核酸 分子(例如，編碼由SEQ ID NO 1至8提供的任何多肽的mRNA)。本發(fā)明方法中能夠使用的核酶的實(shí)例包括但不限于，US 6, 346, 398, Ciafre et al. (2004)和 Weng et al. (2005)中描述的那些?；虔煼ū疚闹忻枋龅闹委熜远嗪塑账岱肿涌梢愿鶕?jù)本發(fā)明通過(guò)在經(jīng)常被稱為“基因療 法”的治療方法中表達(dá)這種多核苷酸來(lái)使用。因此，來(lái)自患者的細(xì)胞可以與多核苷酸(如 DNA或RNA) —起進(jìn)行設(shè)計(jì)來(lái)體外編碼多核苷酸。隨后，所設(shè)計(jì)的細(xì)胞能夠提供于使用這種 多核苷酸治療的患者，或有關(guān)經(jīng)由其編碼的多肽(例如，抗VEGF抗體)之處。在該實(shí)施方式中，細(xì)胞可以，例如，通過(guò)使用逆轉(zhuǎn)錄酶病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化，例如干細(xì)胞或分化的干細(xì)胞 而進(jìn)行體外設(shè)計(jì)。這種方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，并且在本發(fā)明中其用途根據(jù)本文中的教 導(dǎo)顯而易見(jiàn)。而且，對(duì)于通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法體內(nèi)表達(dá)多核苷酸，可以體內(nèi)設(shè)計(jì)細(xì)胞。例如， 多核苷酸可以對(duì)于在復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或腺病毒載體或其他載體(如痘病毒載 體)中的表達(dá)進(jìn)行設(shè)計(jì)。隨后可以分離表達(dá)構(gòu)建體。包裝的細(xì)胞采用包含編碼本文中所述 多核苷酸的RNA的質(zhì)粒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)換而使包裝的細(xì)胞現(xiàn)在產(chǎn)生包含所關(guān)注的基因的感染 病毒粒子。這些生產(chǎn)者細(xì)胞可以給藥至患者以進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞設(shè)計(jì)和體內(nèi)多核苷酸表達(dá)。對(duì) 于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，給予多核苷酸的這些和其他方法是顯而易見(jiàn) 的?？捎杀疚闹幸陨咸峒暗哪孓D(zhuǎn)錄酶病毒質(zhì)粒載體得到的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒包括但不限 于，莫洛尼鼠白血病病毒、脾壞死病毒、勞斯肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒、禽白血病病毒、長(zhǎng)臂 猿猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳腺腫瘤病毒。在一種優(yōu) 選的實(shí)施方式中，逆轉(zhuǎn)錄酶病毒質(zhì)粒載體來(lái)自于莫洛尼鼠白血病病毒。這樣的載體包括一種或多種表達(dá)多核苷酸的啟動(dòng)子。可以采用的合適啟動(dòng)子包括 但不限于，逆轉(zhuǎn)錄酶病毒LTR ;SV40啟動(dòng)子；和人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子。也可以使用細(xì) 胞啟動(dòng)子，如真核細(xì)胞啟動(dòng)子包括但不限于，組蛋白、RNA聚合酶III、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、 熱休克啟動(dòng)子、白蛋白啟動(dòng)子、人珠蛋白啟動(dòng)子和α-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。其他可以采用的病 毒啟動(dòng)子包括但不限于，腺病毒啟動(dòng)子、胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子和B 19細(xì)小病毒啟動(dòng)子。對(duì) 于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，合適啟動(dòng)子的選擇是顯而易見(jiàn)的。逆轉(zhuǎn)錄酶病毒質(zhì)粒載體能夠用于將包裝的細(xì)胞系轉(zhuǎn)換以形成生產(chǎn)者細(xì)胞系?？梢?被轉(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于，由Miller (1990)描述的PE501、PA317、Y_2、Y_AM、 PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、YCRE、YCRIP、GP+E-86、GP+envAml2 和 DAN 細(xì)胞系。該載體可 以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法轉(zhuǎn)換成包裝細(xì)胞。這種方法包括但不限于電穿孔、脂質(zhì)體的 使用和CaPO4沉淀。在一種替代方式中，逆轉(zhuǎn)錄酶病毒質(zhì)粒載體可以被包封成脂質(zhì)體，或耦 合于脂質(zhì)，并且然后給予宿主。生產(chǎn)者細(xì)胞系將產(chǎn)生感染的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體顆粒，其包括多核苷酸。這種逆轉(zhuǎn) 錄酶病毒載體顆粒隨后用于體外或者體內(nèi)轉(zhuǎn)換真核細(xì)胞。轉(zhuǎn)換的真核細(xì)胞將表達(dá)該多核苷 酸，并且相關(guān)地產(chǎn)生有其編碼的多肽?？梢赞D(zhuǎn)換的真核細(xì)胞包括但不限于，真核干細(xì)胞、視 網(wǎng)膜干細(xì)胞、真核腫瘤細(xì)胞、以及造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì) 胞、肌細(xì)胞(尤其是骨骼肌細(xì)胞)、內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。在一種實(shí)施方式中，作為組合療法的部分給藥的細(xì)胞并不是遺傳修飾的細(xì)胞而是 使其產(chǎn)生化合物。在一種尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，作為組合療法的部分給藥的這種細(xì)胞并 不是遺傳修飾的細(xì)胞而是使其產(chǎn)生抗VEGF單克隆抗體。為了監(jiān)控連續(xù)遺傳修飾和選擇將多核苷酸整合到其中的細(xì)胞，構(gòu)建體或載體中可 以包含選擇性標(biāo)記。非限制性實(shí)例包括抗藥性標(biāo)記，如G148或潮霉素。另外，可以使用陰 性選擇，例如，其中標(biāo)記是HSV-tk基因。這個(gè)基因使該細(xì)胞對(duì)藥物如阿昔洛韋和更昔洛韋 敏感。通常使用NeoR(新霉素/G148耐受性)基因，但是任何方便的標(biāo)記基因都可以使用， 只要其基因序列不已經(jīng)存在于靶細(xì)胞中的基因都能夠使用。另外，非限制性實(shí)例包括低親和性的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGFR)、增強(qiáng)的熒光綠蛋白(EFGP)、二氫葉酸還原酶基因(DHFR)、細(xì) 菌hisD基因、鼠科動(dòng)物CDMOiAQ、鼠科動(dòng)物CDSa(Iyt)、賦予嘌呤霉素或腐草霉素耐受性 的細(xì)菌基因、和半乳糖苷酶。其他多核苷酸序列可以引入到相同載體上的細(xì)胞中或可以引入到第二載體上的 宿主細(xì)胞中。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，選擇性標(biāo)記將包含于與該多核苷酸相同的載體上。本發(fā)明也涵蓋遺傳上修飾的內(nèi)源信基因的啟動(dòng)子區(qū)域以使該內(nèi)源性基因的表達(dá) 上調(diào)以導(dǎo)致編碼的蛋白相比于野生型細(xì)胞產(chǎn)生增加。在本發(fā)明一種有用的實(shí)施方式中，細(xì)胞經(jīng)過(guò)遺傳修飾而包含中斷或抑制血管發(fā)生 的基因。該基因可以編碼細(xì)胞毒性藥物如蓖麻毒蛋白。在另一實(shí)施方式中，該基因編碼引 發(fā)免疫排斥響應(yīng)的細(xì)胞表面分子。例如，該細(xì)胞能夠遺傳修飾而產(chǎn)生al，3半乳糖基轉(zhuǎn)移 酶。這種酶合成屬于關(guān)鍵異種抗原的α 1，3半乳糖基抗原決定基，而其表達(dá)通過(guò)所實(shí)施的 抗體循環(huán)和/或通過(guò)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫排斥導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因內(nèi)源性細(xì)胞的超急性排斥。根據(jù)本發(fā)明的基因療法可以涉及基因療法的多核苷酸在患者中的暫時(shí)(臨時(shí))存 在或?qū)⒍嗪塑账嵊谰靡牖颊唧w內(nèi)。組合物及其給藥典型地，細(xì)胞和化合物在含有至少一種藥用載體的藥物組合物中給藥。另外，本發(fā) 明的一個(gè)方面涉及包含細(xì)胞和中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物，以及可選的一種藥用載體的 組合物。短語(yǔ)“藥用的，，是指在合理的醫(yī)療判斷范圍內(nèi)，適用于與人和動(dòng)物組織接觸，而不 會(huì)產(chǎn)生過(guò)度毒性、刺激、過(guò)敏響應(yīng)或其他問(wèn)題或并發(fā)癥，并與合理的受益/風(fēng)險(xiǎn)率相當(dāng)?shù)哪?些化合物、物質(zhì)、組合物、和/或劑量形式。本文中所使用的短語(yǔ)“藥用載體”是指藥用物質(zhì)、 組合物或載體，如液體或固體填料、稀釋劑、賦形劑、或溶劑包封物質(zhì)。藥用載體包括鹽水、水性緩沖溶液、溶劑和/或分散介質(zhì)。這種載體的使用在本領(lǐng) 域內(nèi)是眾所周知的。溶液優(yōu)選無(wú)菌的并屬于達(dá)到存在易于可注射性的程度的流體。優(yōu)選地， 溶液在生產(chǎn)和儲(chǔ)存的條件下是穩(wěn)定的并通過(guò)使用，例如，尼泊金、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、 水楊乙汞等而抗微生物如細(xì)菌和真菌的污染行為來(lái)儲(chǔ)存。能夠用作藥用載體的物質(zhì)和溶液的一些實(shí)例包括(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗 糖，( 淀粉，如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；C3)纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素、乙基纖 維素和醋酸纖維素；⑷粉末黃芪膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石；⑶賦形劑，如可可脂 和栓劑蠟；(9)油，如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和豆油；(10) 二醇，如 丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇；(1 酯，如油酸乙酯和月桂酸乙 酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)褐藻酸；(16)無(wú)熱原水；(17)生 理鹽水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；00) pH值緩沖溶液；(21)聚酯，聚碳酸酯和/或聚酸 酐；和0 其他藥物制劑中采用的無(wú)毒相容性物質(zhì)。包含適用于本發(fā)明方法的細(xì)胞的藥物組合物可以包含聚合物載體或胞外基質(zhì)。各種生物或合成固體基質(zhì)物質(zhì)(即，固體支持基質(zhì)、生物粘合劑或敷料、以及生物 /醫(yī)療支架)都適用于本發(fā)明中?；|(zhì)物質(zhì)優(yōu)選醫(yī)療上可接受的且適用于體內(nèi)應(yīng)用。這種 醫(yī)療上可接受和/或生物上或生理上可接受或相容性物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括但不限于， 可吸收和/或非可吸收的固體基質(zhì)物質(zhì)，如小腸粘膜下層(SIS)，例如，豬源的(和其他SIS源)；交聯(lián)的或非交聯(lián)的褐藻酸鹽、水解膠體、泡沫、膠原凝膠、膠原海綿、聚乙醇酸(PGA)的 網(wǎng)格、聚乳糖(PGL)網(wǎng)格、羊毛狀物(fleece)、泡沫敷料、生物粘合劑(例如，纖維蛋白膠和 纖維蛋白膠)和在一層或多層中的死的去上皮化皮膚等價(jià)物。纖維蛋白膠是一類手術(shù)密封劑，已經(jīng)用于各種臨床情況中。由于本領(lǐng)域技術(shù)人員 已經(jīng)具備這樣的技能，因此許多密封劑都適用于本發(fā)明方法適用的組合物中。然而，本發(fā)明 優(yōu)選的實(shí)施方式涉及與本文中所述的細(xì)胞一起使用纖維蛋白膠。當(dāng)在本文中使用術(shù)語(yǔ)“纖維蛋白膠”時(shí)，是指通過(guò)纖維蛋白聚合物在鈣離子存在下 發(fā)生交聯(lián)而形成的不溶性基質(zhì)。纖維蛋白膠可以由纖維蛋白原，或其衍生物或代謝物、纖維 蛋白(可溶性單體或聚合物)和/或其由構(gòu)成纖維蛋白基質(zhì)的生物組織或流體衍生的絡(luò)合 物而形成。另外，纖維蛋白膠可以由纖維蛋白原、或其衍生物或代謝物，或通過(guò)重組DNA技 術(shù)生產(chǎn)的纖維蛋白形成。纖維蛋白膠也可以通過(guò)纖維蛋白原和形成纖維蛋白膠的催化劑(如凝血酶和/或 因子X(jué)III)相互作用而形成。這一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言應(yīng)該理解，纖維蛋白原在催 化劑(如凝血酶)存在下發(fā)生蛋白水解而切開(kāi)并轉(zhuǎn)化成纖維蛋白單體。纖維蛋白單體隨后 可以形成聚合物，這種聚合物可以發(fā)生交聯(lián)而形成纖維蛋白膠基質(zhì)。纖維蛋白聚合物發(fā)生 交聯(lián)，可以通過(guò)存在催化劑如因子X(jué)III而得到增強(qiáng)。纖維蛋白膠形成的催化劑可以來(lái)自于 包含纖維蛋白原或凝血酶的血漿、冷沉淀物(cryoprecipitate)或其他血漿部分。另外，催 化劑可以通過(guò)重組DNA技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。凝塊的形成速率取決于與纖維蛋白原混合的凝血酶濃度。由于屬于酶依賴性反 應(yīng)，因此溫度越高(高達(dá)37°C )，凝塊形成速率越快。凝塊的拉伸強(qiáng)度取決于所用的纖維蛋 白原的濃度。纖維蛋白膠的用途和其制備和使用的方法描述于US 5，643，192中。US 5，643，192公開(kāi)了從單一供體提取纖維蛋白原和凝血酶組分，以及僅僅這些組分組合而用 作纖維蛋白膠。US 5，651，982描述了另一纖維蛋白膠的制備和使用方法。US 5，651，982， 提供了具有脂質(zhì)體的纖維蛋白膠而使用用作哺乳動(dòng)物中的局部密封劑。幾個(gè)出版物描述了纖維蛋白膠用于遞送治療藥物的用途。例如，US4，983，393公開(kāi) 了一種用作內(nèi)陰道插入物的組合物，含有瓊脂糖、瓊脂、鹽水溶液糖胺聚糖、膠原蛋白、纖維 蛋白和酶。另外，US 3，089，815公開(kāi)了一種可注射藥物制劑，包含纖維蛋白原和凝血酶，而 US 6，468，527公開(kāi)了一種纖維蛋白膠，其有利于向體內(nèi)的特異性位點(diǎn)遞送各種生物和非生 物藥物。這種方法能夠用于本發(fā)明的方法中。合適的聚合物載體包括由合成或天然聚合物，以及聚合物溶液形成的多孔網(wǎng)格或 海綿。基質(zhì)的一種形式是聚合物網(wǎng)格或海綿；其他形式是聚合物的水凝膠。能夠使用的天 然聚合物包括蛋白，如膠原蛋白，白蛋白和纖維蛋白；以及多糖如海藻酸鹽和透明質(zhì)酸的聚 合物。合成聚合物包括可生物降解的和非可生物降解的聚合物。可生物降解的聚合物的實(shí) 例包括羥基酸的聚合物，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、聚原 酸酯、聚酸酐、聚磷腈、及它們的組合。不可生物降解的聚合物包括聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯 酸酯、乙烯醋酸乙烯酯和聚乙烯醇。能夠形成離子或共價(jià)交聯(lián)水凝膠的(其是可延展的)聚合物用于包封細(xì)胞。水凝 膠是當(dāng)有機(jī)聚合物(天然的或合成的)經(jīng)由共價(jià)鍵、離子鍵或氫鍵交聯(lián)以產(chǎn)生用于使水分子陷入(捕獲，entrap)的三維開(kāi)放晶格結(jié)構(gòu)以形成凝膠時(shí)形成的一種物質(zhì)。能夠用于形成 水凝膠的物質(zhì)的實(shí)例包括多糖如褐藻酸鹽、聚磷腈和聚丙烯酸酯，其是離子交聯(lián)的，或嵌段 共聚物如Pluronics 或Tetronics ，其分別通過(guò)溫度或pH值發(fā)生交聯(lián)的聚環(huán)氧乙烷-聚 丙二醇嵌段共聚物。其他物質(zhì)包括蛋白如纖維蛋白、聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、透明質(zhì)酸和 膠原。一般而言，這些聚合物至少部分可溶于水性溶液中，如水、緩沖鹽水溶液、或水性 醇溶液，其具有帶電側(cè)基，或其單價(jià)離子鹽。具有酸性側(cè)基并能夠與正離子反應(yīng)的聚合物的 實(shí)例為聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(醋 酸乙烯酯)和磺化聚合物，如磺化聚苯乙烯。也可以使用具有酸性側(cè)基的共聚物，其由丙烯 酸或甲基丙烯酸和乙烯基醚單體或聚合物反應(yīng)而形成。酸性基團(tuán)的實(shí)例為羧酸基、磺酸基、 鹵化的(優(yōu)選氟化的)醇基、酚OH基和酸性O(shè)H基團(tuán)。具有堿性側(cè)基并能夠與陰離子反應(yīng) 的聚合物的實(shí)例為聚(乙烯基胺)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基咪唑)和一些亞氨基取 代的聚磷腈。聚合物的銨或季鹽也能夠由骨架氮或懸垂亞氨基形成。堿性側(cè)基的實(shí)例是氨 基和亞氨基。另外，本發(fā)明方法所使用的組合物可以包含至少一種其他治療藥物。例如，該 組合物可以包含一種輔助治療發(fā)炎或疼痛的止痛劑、另一種抗血管增生化合物、或防止 組合物治療處發(fā)生感染的抗感染藥物。更具體而言，有用的治療藥物的非限制性實(shí)例包 括以下治療藥物類別止痛藥，如非類固醇抗炎藥、鴉片受體激動(dòng)劑類和水楊酸酯類；抗 感染劑，如抗蠕蟲(chóng)藥(antihelmintics)、抗厭氧菌類藥(antianaerobics)、抗生素、氨基 糖苷抗生素、抗真菌抗生素、頭孢類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、混雜的(miscellaneous) β -內(nèi)酰胺類抗生素、青霉素抗生素、喹諾酮類抗生素、磺胺類抗生素、四環(huán)素類抗生素、抗 結(jié)核菌類藥、抗結(jié)核抗結(jié)核菌類藥(antituberculosis antimycobacterials)、抗原蟲(chóng)藥 (antiprotozoals)、抗皰抗原蟲(chóng)類藥(antimalarial antiprotozoals)、抗病毒藥劑、抗逆 轉(zhuǎn)錄酶病毒藥物、滅疥癬藥(scabicides)、抗炎劑、皮質(zhì)類固醇抗發(fā)炎劑、止癢劑/局部麻 醉劑、局部抗感染藥、抗真菌局部抗感染藥、抗病毒局部抗感染藥、電解和腎藥、如酸化劑、 堿化劑、利尿劑、碳酸酐酶抑制劑利尿劑、環(huán)利尿劑、滲透性利尿劑、保鉀利尿劑、噻嗪類利 尿劑、電解質(zhì)替代品、和排尿酸藥劑；酶，如胰腺酶和溶栓酶；消化系統(tǒng)藥物，如止瀉藥、胃 腸抗消炎藥、胃腸道抗發(fā)炎劑、抗酸抗抗?jié)儎⑽杆岜靡种苿┛箍節(jié)儎?、胃黏膜抗胃?瘍藥物、H2-阻斷劑抗胃潰瘍藥物、膽石溶解劑、消化劑、催吐劑、輕泄劑和大便軟化劑、和胃 腸蠕動(dòng)促動(dòng)力劑；全身麻醉劑，如吸入麻醉藥、鹵化吸入麻醉藥、靜脈麻醉藥、巴比妥靜脈麻 醉藥、苯二氮平靜脈注射麻醉劑、和鴉片激動(dòng)劑靜脈注射麻醉劑；激素和激素調(diào)節(jié)劑，如墮 胎藥、腎上腺劑、皮質(zhì)激素類腎上腺劑、雄激素類、抗-雄激素類、免疫生物劑、如免疫球蛋 白、免疫抑制劑、類毒素、和疫苗；局部麻醉劑，如酰胺局部麻醉劑和酯局部麻醉劑、肌骨骼 劑(musulokeletal agent)，如抗痛風(fēng)抗發(fā)炎藥物、皮質(zhì)激素類抗發(fā)炎劑、金化合物抗消炎 藥、免疫抑制抗消炎藥、非類固醇抗發(fā)炎藥(NSAIDs)、水楊酸抗發(fā)炎劑、礦物質(zhì)；以及維生 素，如維生素A、維生素B、維生素C、維生素D、維生素E和維生素K。與本發(fā)明一起可以在單一組合物中或作為組合療法使用的其他抗血管發(fā)生因子 的實(shí)例，包括但不限于，血小板因子4 ；魚(yú)精蛋白硫酸鹽；磺化甲殼素衍生物(由皇后蟹殼 制備)；磺化多糖肽聚糖絡(luò)合物(SP的-PG)(該化合物的功能可能由類固醇如雌激素，和他莫昔芬檸檬酸鹽的存在而增強(qiáng))；星形孢菌素；基質(zhì)代謝調(diào)節(jié)劑，包括例如，脯氨酸類似物、 順式羥脯氨酸、d，L_3，4-脫氫脯氨酸、硫代脯氨酸、α，α-聯(lián)吡啶、氨基丙腈富馬酸；4_丙 基-5-(4-吡啶基)-2 (3Η)-惡唑酮；甲氨蝶呤；米托蒽醌；肝素；干擾素；2-巨球蛋白-血 清；ChIMP-3 ；抑凝乳蛋白酶素；環(huán)糊精十四硫酸酯；Eponemycin ；喜樹(shù)堿；煙曲霉素；硫代 蘋(píng)果酸金鈉；抗膠原酶-血清；α -2-抗纖維蛋白溶素；比生群(國(guó)家癌癥研究所)；氯苯扎 利二鈉(N-O)-羧苯基-4-氯氨茴酸二鈉)、沙利度胺；Angostatic類固醇；AGM-1470 ；羧 基氨基咪唑；和金屬蛋白酶抑制劑如ΒΒ94。在某些實(shí)施方式中，其他治療藥劑可以是生長(zhǎng)因子或影響細(xì)胞分化和/或增殖的 其他分子。誘導(dǎo)最后分化狀態(tài)的生長(zhǎng)因子在本技術(shù)領(lǐng)域是公知的，并且可以選自這種已經(jīng) 證實(shí)誘導(dǎo)最后分化狀態(tài)的任何因子。適用于本文中所描述方法的生長(zhǎng)因子，在某些實(shí)施方 式中，可以是天然存在的生長(zhǎng)因子的變體或片段。適用于本發(fā)明方法且包含細(xì)胞的組合物可以包含細(xì)胞培養(yǎng)基組分，例如，培養(yǎng)基 介質(zhì)包含氨基酸、金屬、輔酶因子、以及小群落的其他細(xì)胞，例如，其中一些可以是由干細(xì)胞 隨后分化產(chǎn)生的。適用于本發(fā)明且包含細(xì)胞的組合物可以，例如，通過(guò)從培養(yǎng)基介質(zhì)沉積出受治療 者細(xì)胞并將其再懸浮于所需溶液或物質(zhì)中來(lái)制備。細(xì)胞可以在培養(yǎng)基介質(zhì)之外進(jìn)行沉淀和 /或變化，例如，通過(guò)離心、過(guò)濾、超濾等。組合物可以口服、非腸道、口腔、陰道、直腸、吸入、噴灑、舌下、肌肉注射、皮下注 射、局部外用、滴鼻、眼內(nèi)、腹腔注射、胸腔內(nèi)注射、靜脈注射、硬膜外腔注射、鞘內(nèi)注射、腦室 內(nèi)注射和通過(guò)注入關(guān)節(jié)給藥。細(xì)胞和/或化合物可以，例如使用眼滴、油膏、霜?jiǎng)?、凝膠、懸浮液、灌注等給予至 眼睛或眼瞼。在另一實(shí)施方式中，利用眼內(nèi)注射來(lái)治療眼病。在一種實(shí)施方式中，細(xì)胞和/ 或化合物可以玻璃體內(nèi)給藥，在另一實(shí)施方式中，采用視網(wǎng)膜下注射給藥，而在另一實(shí)施方 式中采用視網(wǎng)膜內(nèi)注射給藥，而在另一實(shí)施方式中，采用眼周注射給藥。在一種實(shí)施方式 中，細(xì)胞和/或化合物可以前房?jī)?nèi)注射向前房或玻璃體給藥，經(jīng)由手術(shù)期間連接于插入的 人工晶體植入的儲(chǔ)藥器完成。細(xì)胞和/或化合物可以采用賦形劑如甲基纖維素、羥丙基甲 基纖維素、羥丙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、中性聚(甲基)丙烯酸酯、和其他粘度增強(qiáng)劑進(jìn) 行配制。細(xì)胞和/或化合物可以在結(jié)膜或眼球筋膜囊(tenon囊)下注射、玻璃體內(nèi)注射、 或球后注射而注射到眼睛中。細(xì)胞和/或化合物可以采用緩釋藥物遞送系統(tǒng)，如聚合物、基 質(zhì)、微膠囊或由，例如，乙醇酸、乳酸酸、乙醇酸和乳酸的組合，脂質(zhì)體、硅酮、聚酸酐聚醋酸 乙烯酯單獨(dú)或與聚乙二醇等組合的其他遞送系統(tǒng)進(jìn)行給藥。遞送裝置能夠眼內(nèi)植入，例如， 在結(jié)膜下植入、在眼壁中植入、縫合到鞏膜來(lái)進(jìn)行長(zhǎng)期藥物遞送。引入方法可以另外通過(guò)不 可生物降解的裝置進(jìn)行提供。具體而言，細(xì)胞和/或化合物能夠經(jīng)由可植入的人工晶體給 藥。細(xì)胞和/或化合物能夠涂覆在人工晶體上，通過(guò)人工晶體進(jìn)行分散，或這二者同時(shí)采 用。適用于可注射使用的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液(其中水可溶的)或分散體和用 于現(xiàn)場(chǎng)制備無(wú)菌可注射溶液或分散體的無(wú)菌粉末。對(duì)于靜脈注射給藥，合適的載體包括生 理鹽水、抑菌水、克列莫佛EL(CREMOPHOREL) (BASF, Parsippany，N. J.)或磷酸鹽緩沖的鹽 水(PBS)。在所有情況下，組合物必須是無(wú)菌的且應(yīng)該是具有易于可注射性的程度的流體。在生產(chǎn)和儲(chǔ)存以及防微生物如細(xì)菌和真菌污染作用進(jìn)行保存的條件下應(yīng)該是穩(wěn)定的。載體 能夠是溶劑或包含，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)以及其 合適的混合物的分散體介質(zhì)。例如，通過(guò)使用涂層如卵磷脂，在分散體情況下通過(guò)維持所需 的粒徑和通過(guò)使用表面活性劑能夠維持合適的流度。防止微生物作用能夠通過(guò)各種抗細(xì)菌 和抗真菌劑，例如，尼泊金、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、水楊乙汞等實(shí)現(xiàn)。等滲劑，例如糖、多元 醇如甘露醇、山梨醇、氯化鈉，也能夠包含在組合物內(nèi)?？勺⑸涞慕M合物的延長(zhǎng)吸收能夠通 過(guò)在組合物內(nèi)包含延長(zhǎng)吸收的試劑如單硬脂酸鋁或白明膠而實(shí)現(xiàn)。無(wú)菌可注射溶液能夠通過(guò)將化合物和/或細(xì)胞按照所需用量與以上所列出的成 分中的一種或組合，按照所需，一起引入合適的溶劑中，接著過(guò)濾滅菌而進(jìn)行制備。一般而 言，分散體通過(guò)將多核苷酸引入無(wú)菌載體中而制備，其含有基本分散介質(zhì)和來(lái)自以上所列 出的那些中的所需其他成分。在制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末的情況下，合適的制備方 法包括，真空干燥和凍干，這能夠產(chǎn)生來(lái)自其先前過(guò)濾滅菌的溶液的活性成分加上任何另 外的所需成分的粉末?？诜M合物一般包括惰性稀釋劑或可食用載體。出于口服治療給藥的目的，化合 物或細(xì)胞能夠用賦形劑引入而以片劑、錠劑或膠囊劑，例如，明膠膠囊來(lái)使用?？诜M合物 也能夠采用用作漱口水的流體載體進(jìn)行制備。藥物相容性結(jié)合劑，和/或佐劑物質(zhì)能夠作 為組合物部分包括在內(nèi)。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等能夠包含任何以下成分，或類似性質(zhì)的 化合物粘合劑如微晶纖維素，樹(shù)膠黃芪膠或白明膠；賦形劑如淀粉或乳糖、崩解劑如褐藻 酸、PRIM0GEL、或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂或氫化植物油(Sterotes)；助流劑如膠狀二 氧化硅；甜味劑如乳糖或糖精；或調(diào)味劑如薄荷、水楊酸甲酯、或橙風(fēng)味劑。適用于鼻內(nèi)給藥且其中的載體是固體的制劑，包括粒徑為，例如約20 約500μπι 的粗粉，其給藥的方式中是采取鼻吸入，即，通過(guò)從儲(chǔ)存粉末的容器向上靠近鼻子而通過(guò)鼻 通道快速吸入。通過(guò)噴霧器給藥而其中載體是液體的合適制劑，包括藥物的水性或油性溶 液。通過(guò)吸入給藥，該化合物或細(xì)胞也能夠按照液滴或氣溶膠噴霧的形式從加壓容器或包 含合適推進(jìn)劑，例如，氣體如二氧化碳的分散器或噴霧器中來(lái)遞送。這種方法包括描述于 U. S. 6，468，798 中的那些。系統(tǒng)給藥也能夠通過(guò)穿透粘膜或穿透皮膚的方式。對(duì)于穿透粘膜或穿透皮膚給 藥，在制劑中使用適合于所滲透阻隔層的滲透劑。這種滲透劑一般在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，并 包括，例如，用于穿透粘膜給藥、洗滌劑、膽鹽、和夫西地酸衍生物。穿透粘膜給藥能夠通過(guò) 使用鼻噴霧劑、滴眼液或栓劑而完成。對(duì)于穿透皮膚給藥，活性化合物配制成油膏劑、軟膏 劑(salve)、凝膠劑或霜?jiǎng)?，這一般在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。技術(shù)人員能夠易于確定組合物中細(xì)胞、化合物和可選的載體的用量而根據(jù)本發(fā)明 的方法進(jìn)行給藥。在一種實(shí)施方式中，磷酸鹽緩沖鹽水中存在的任何添加劑(除了活性細(xì) 胞或化合物之外)的量為0.001% 50% (重量)溶液，而活性成分以微克至毫克級(jí)存在， 例如，約0. OOOlwt % 約5wt%，優(yōu)選約0. OOOlwt % 約Iwt %，更加優(yōu)選約0. 000Iwt % 約0. 05wt %或約0. OOlwt % 約20wt %，優(yōu)選約0. Olwt % 約IOwt %，且更加優(yōu)選約 0. 05Wt% 約5wt%。當(dāng)然，對(duì)于任何向動(dòng)物或人給藥的組合物，以及對(duì)于任何具體的給藥 方法，優(yōu)選由此進(jìn)行確定毒性，如通過(guò)在合適的動(dòng)物模型，例如，嚙齒動(dòng)物如小鼠中測(cè)梁致 命劑量(LD)和LD5tl ；以及組合物劑量，其中組分濃度和組合物給藥的定時(shí)，這都引起合適的響應(yīng)。這種決策，從技術(shù)人員所掌握的知識(shí)、本文中的公開(kāi)內(nèi)容和文中引述的文獻(xiàn)并不需要 過(guò)度實(shí)驗(yàn)就能完成。而且，對(duì)于按序給藥的時(shí)間能夠無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)就能確定。組合物中的細(xì)胞濃度可以為至少約5 X IO5個(gè)細(xì)胞/mL，至少約1 X IO6個(gè)細(xì)胞/mL， 至少約5 X IO6個(gè)細(xì)胞/mL，至少約IO7個(gè)細(xì)胞/mL，至少約2 X IO7個(gè)細(xì)胞/mL，至少約3 X IO7 個(gè)細(xì)胞/mL，或至少約5 X IO7細(xì)胞/mL?；衔锟梢园凑彰縿┝考s0. 001 2000mg/kg體重，且更優(yōu)選每劑量約0. 01 500mg/kg體重。重復(fù)的劑量可以按照由主治醫(yī)師開(kāi)具的方藥來(lái)給藥。本發(fā)明涉及組合使用細(xì)胞和中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物而治療或預(yù)防血管發(fā) 生相關(guān)的疾病。術(shù)語(yǔ)“與...組合”或“組合療法”或其變體是指細(xì)胞和化合物能夠同時(shí)給 藥，或在相同的組合物中或者在分開(kāi)的組合物(例如，彼此間隔約3分鐘)按照一定順序的 方式，或者按照這二者進(jìn)行，以及高達(dá)幾個(gè)小時(shí)、幾天或幾周的臨時(shí)間隔次序。這種組合治 療方法也可以包括不只一種單一的給藥方式。據(jù)設(shè)想，這種組合療法可以包括在另一種藥 物給藥之間多次給藥這種治療藥物。給藥之間的時(shí)間周期可以為幾秒(或更短)至幾個(gè)小 時(shí)或幾天，而這將取決于，例如，細(xì)胞或化合物的性質(zhì)(例如，效能、溶解度、生物利用度、半 衰期和動(dòng)力學(xué)分布)以及患者的病狀。在一種實(shí)施方式中，化合物在細(xì)胞給藥之前進(jìn)行給藥。這尤其就是如果藥物結(jié)合 VEGF或其受體的那種情況。在一種實(shí)施方式中，化合物在細(xì)胞給藥之前約1天，3天，5天， 7天，9天，或14天進(jìn)行給藥。本發(fā)明的方法可以與其他用于治療或預(yù)防眼病和/或與血管發(fā)生相關(guān)的疾病的 療法結(jié)合。這些其他療法的性質(zhì)將會(huì)取決于具體血管發(fā)生相關(guān)的疾病。例如，對(duì)于采用本 發(fā)明方法治療或預(yù)防黃斑變性，可以結(jié)合抗氧化劑和/或鋅補(bǔ)充劑，給予哌加他尼鈉(哌加 他尼)，采用US 6，942，655中定義的方法、類固醇療法和/或激光治療法(如￥化11(^1^ )。 對(duì)于癌癥，采用本發(fā)明方法的療法能夠與手術(shù)、放射療法和/或化療結(jié)合。實(shí)施例
以下本文通過(guò)以下非限制性實(shí)施例的方式并參照附圖進(jìn)行描述。
按照?qǐng)D1提供研究設(shè)計(jì)的總結(jié)。
材料和方法
明細(xì)清單
物種)(Macaca fascicularis)
品種(strain)食蟹猴(短尾猴，cynomolgus)
來(lái)源PCS優(yōu)選供應(yīng)商
年齡在治療開(kāi)始時(shí)為約1. 5至3. 5歲
體重范圍在治療開(kāi)始時(shí)為約2至4kg
組數(shù)7
動(dòng)物數(shù)量6只雄性/組和2只備用(總計(jì)44只)
飼養(yǎng)
當(dāng)可能時(shí)，將動(dòng)物分組0只或3只)飼養(yǎng)于不銹鋼的籠子中，籠子裝有條棍型地板和自動(dòng)灑水閥。每個(gè)籠子用指示項(xiàng)目、分組、動(dòng)物編號(hào)和刺標(biāo)(tattoo)的顏色編碼籠子卡清楚地標(biāo)記。
每只動(dòng)物通過(guò)永久性皮膚刺標(biāo)進(jìn)行唯一識(shí)別。動(dòng)物室溫和光周期的針對(duì)性條件如 下溫度24 士 3°C濕度50 士 20%光照周期 1 光照和12h黑暗(除了在指定的程序期間之外)。膳食材料除了在指定的程序期間之外，所有的動(dòng)物都獲得了標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證的顆粒狀商品化靈長(zhǎng) 類動(dòng)物的食物O050C全球認(rèn)證的20%靈長(zhǎng)類動(dòng)物蛋白質(zhì)飲食Harlan)，每天兩次。另外， 每只動(dòng)物每天按照以下任意組合而提供食物補(bǔ)充=Golden Banana Softy , Prima- Treat (5g規(guī)格)和/或新鮮水果或干果以及至少每周一次的I^rima-Foraging Crumbles ，作為 環(huán)境豐富計(jì)劃的部分。其他水果補(bǔ)充在麻醉恢復(fù)之后提供以刺激食欲并維持營(yíng)養(yǎng)。飲食中(如重金屬、黃曲霉毒素、有機(jī)磷、氯代烴類、PCB)污染物的最高允許濃度 通過(guò)廠商進(jìn)行控制和常規(guī)分析。市政自來(lái)水已經(jīng)過(guò)軟化并通過(guò)反滲透純化并暴露于紫外光 下，可以自由獲取(除了在指定的程序期間之外)?？梢哉J(rèn)為，在膳食材料中不存在能夠干 擾研究目的的已知污染物。組分配治療開(kāi)始之前，采用以滿足體重作為參數(shù)的基于計(jì)算機(jī)的隨機(jī)化程序?qū)?dòng)物分配 到治療組中(健康程度差的動(dòng)物未配到組中)(表1)細(xì)胞的制備從2007年6月25日每一主批次記錄(Master Batch Record) 3001 MES的雌性成 束猴(D. 0. B.，2005年3月12日)收集的15mL骨髓吸出物分離出猿猴骨髓祖細(xì)胞-食蟹猴 (smMPC-cyno)(在該實(shí)施例中也被稱為MPCs)。該骨髓吸出物懸浮液經(jīng)過(guò)菲柯?tīng)?Ficoll) 并沖洗而除去非成核細(xì)胞(紅血細(xì)胞)。成核細(xì)胞經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)隨后通過(guò)附著于CA 12抗體(也 已知為STR0-3抗體-參見(jiàn)WO 2006/108229)和磁性微珠(Dynalbeads)而分離。含抗體和 所連接的珠的細(xì)胞通過(guò)MPC-I磁體的磁場(chǎng)進(jìn)行陽(yáng)性選擇。陽(yáng)性選擇的細(xì)胞經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)并接種于T-燒瓶中在p. 0下的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在克隆 形成分析(CFU-F)中使用了預(yù)選擇、陽(yáng)性和陰性細(xì)胞。表1 動(dòng)物分配
權(quán)利要求
1.一種治療或預(yù)防受治療者中眼病的方法，所述方法包括向所述受治療者給予i)細(xì) 胞、和ii)中斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述眼病選自以下組成的組視網(wǎng)膜缺血、視網(wǎng) 膜炎癥、視網(wǎng)膜水腫、視網(wǎng)膜脫離、黃斑裂孔、牽引性視網(wǎng)膜病變、玻璃體積血、牽引性黃斑 病變、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、糖尿病性黃斑水腫、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、黃斑變性、角膜移植排 斥、新生血管性青光眼、晶體后纖維組織增生和/或虹膜潮紅。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述眼病是視網(wǎng)膜脫離、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、 早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變和/或黃斑變性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述黃斑變性是干性年齡相關(guān)的黃斑變性或濕 性年齡相關(guān)的黃斑變性。
5.一種治療或預(yù)防受治療者中與血管發(fā)生相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括向所述受 治療者給予i)細(xì)胞、和ii)中斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述與血管發(fā)生相關(guān)的疾病選自由以下組成 的組血管發(fā)生依賴性癌癥、良性腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、眼部血管發(fā)生病、奧斯 勒-韋伯綜合癥、心肌血管發(fā)生、斑塊內(nèi)血管新生、毛細(xì)血管擴(kuò)張、血友病性關(guān)節(jié)病、血管纖 維瘤、傷口肉芽形成、腸粘連、動(dòng)脈粥樣硬化、硬皮病、肥厚性瘢痕、貓抓病和幽門(mén)螺桿菌致 潰瘍。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞是干細(xì)胞，或其后代細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述干細(xì)胞獲自骨髓或眼睛。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述干細(xì)胞是間質(zhì)前體細(xì)胞 (MPC)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述間質(zhì)前體細(xì)胞是TNAP+、STR0-1+、VCAM-1+、 ΤΗΥ-Γ、STR0-2+、CD45+、CD146+、3G5+ 或它們的任意組合。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，至少一些所述STRO-Γ細(xì)胞是STR0-1氣
12.根據(jù)權(quán)利要求7至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述后代細(xì)胞通過(guò)體外培養(yǎng)間質(zhì) 前體細(xì)胞而獲得。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述化合物結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子和/或減少血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是VEGF-A、VEGF-B、 VEGF-C 和 / 或 VEGF-D。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是VEGF-A。
16.根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，減少血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子產(chǎn)生的 所述化合物結(jié)合缺氧誘導(dǎo)因子1 (HIF-I)和/或減少其產(chǎn)生。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述化合物結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子受體和/或減少其產(chǎn)生。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體選自VEGFR1、 VEGFR2 和 / 或 VEGFR3。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體是VEGFRl和/或 VEGFR2。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述化合物結(jié)合參與通過(guò)血管內(nèi) 皮生長(zhǎng)因子結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體而誘導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的分子和/或減少其產(chǎn)生。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述化合物是多肽。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述多肽是抗體、抗體相關(guān)的分子、和/或其中 任一種的片段。
23.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述化合物是多核苷酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述多核苷酸是一種反義多核苷酸、正義多核 苷酸、催化的多核苷酸、雙鏈體RNA分子、或編碼其中任一種或多種的多核苷酸。
25.根據(jù)權(quán)利要求1至M中任一項(xiàng)所述的方法，其中，至少一些所述細(xì)胞經(jīng)過(guò)遺傳修飾。
26.細(xì)胞和中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物在制造用于治療或預(yù)防受治療者中眼病的組 合療法的藥物中的用途。
27.細(xì)胞和中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物作為用于治療或預(yù)防受治療者中眼病的組合 療法中的藥物的用途。
28.細(xì)胞和中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物在生產(chǎn)用于治療或預(yù)防受治療者中血管發(fā)生 相關(guān)病癥的組合療法的藥物中的用途。
29.細(xì)胞和中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物作為用于治療或預(yù)防受治療者中血管發(fā)生相 關(guān)病癥的組合療法的藥物的用途。
30.一種組合物，包含細(xì)胞和中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物、以及可選的藥用載體。
31.一種試劑盒，包含細(xì)胞和中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物。
全文摘要
本發(fā)明關(guān)于通過(guò)涉及給予細(xì)胞和中斷VEGF-信號(hào)傳導(dǎo)的化合物的組合療法治療或預(yù)防眼病以及與血管發(fā)生有關(guān)疾病的方法。
文檔編號(hào)A61K35/28GK102076844SQ200980124979
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者西爾維烏·埃特斯庫(kù), 邁克爾·戴維·舒斯特 申請(qǐng)人:成血管細(xì)胞系統(tǒng)公司