專利名稱：美容性治療皮膚老化的方法
美容性治療皮膚老化的方法本發(fā)明要求享受2008年3月31日提交的美國臨時申請序列號61/040,891的權(quán) 益，該申請通過引用并入本文中。在皮膚老化中，細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)之合成與其被基質(zhì)金屬 蛋白酶(matrixmetalloprotease，MMP)之降解的平衡發(fā)生失衡。這種失衡導致細胞外基 質(zhì)的過度降解，而這是皮膚老化的一個特征(Cauchard&Homebeck (2004) Vivant 5)。皮膚
老化涉及皺紋數(shù)量的增加以及加深，這是真皮中的大分子(如膠原蛋白和彈性蛋白)降解 的直接結(jié)果。在真皮中，氧自由基促進時間性老化(chronological aging)和光誘導之老化中發(fā) 生的MMP過度產(chǎn)生。此外，在暴露于日光的皮膚區(qū)域(如面部皮膚)中，還會產(chǎn)生UV 射線的其它有害效果，特別是不完全的膠原蛋白合成、皮膚色素沉著和日光性彈性組織 變性(其表現(xiàn)為皮膚彈性網(wǎng)絡(luò)(cutaneous elastic lattice)降解)。并且，體外研究已經(jīng)表 明，接受UV射線處理的皮膚成纖維細胞會過量產(chǎn)生MMP (Brennan等(2003) Photochem. Photobiol.78 43-48)。膠原酶1 和 3(MMP_1 和 MMP-13)與 MTl-MMP(MMP-14)降解膠原蛋白， 而明膠酶A和B(MMP_2和MMP-9)降解彈性蛋白。其它金屬蛋白酶如溶基質(zhì)蛋白酶 1 (MMP-3)既參與膠原蛋白降解也參與彈性蛋白降解。真皮成纖維細胞已經(jīng)用于皮膚老化治療的領(lǐng)域(Weiss等(2007) Dermatol Surg.33 263-8)。在深皺紋處注射自體真皮成纖維細胞(兩千萬個細胞/ml)的215名 受試者中可以觀察到膠原網(wǎng)絡(luò)增加。注射一年后，在80%的受試者中，皺紋的改善仍明 顯可見。齒齦成纖維細胞為間充質(zhì)細胞，其能夠在齒齦的軟結(jié)締組織內(nèi)部遷移、粘附和 增殖，從而保持齒齦組織的完整，所述齒齦組織暴露于諸多侵害，如機械壓力、細菌感 染或 pH 和溫度變化。在 Gogly 等(1997)Clin.OralInvest.l 147-152 ； Gogly 等(1998) Biochem.Pharmacal.56 144了_1454 以及 Ejeil 等(2OO3) J.Periodontol.74 I88-I95 中對齒齦 成纖維細胞有詳細的描述。取決于環(huán)境條件，齒齦成纖維細胞能夠調(diào)節(jié)其表型，并通過增殖、遷移、合成 基質(zhì)組分或基質(zhì)相關(guān)酶來進行響應(yīng)。齒齦成纖維細胞合成膠原蛋白(如I、III、V、VI、VII、XII型)、彈性纖維 (耐酸纖維、伸展纖維(elaunin)和彈性蛋白)、蛋白聚糖和糖胺聚糖(如飾膠蛋白聚糖 (decorin),雙糖鏈蛋白聚糖)和糖蛋白(如纖連蛋白、肌腱蛋白(tenascin))。同時，齒 齦成纖維細胞合成能夠降解大分子化合物的酶(基質(zhì)金屬蛋白酶；MMP)和抑制MMP活 性形式的酶(金屬蛋白酶抑制劑；TIMP)。因此，齒齦成纖維細胞是細胞外基質(zhì)重建的 重要參與者。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明源自于本發(fā)明人出乎意料的發(fā)現(xiàn)，即齒齦成纖維細胞比真皮成纖維細胞更適于抑制由UV處理的真皮成纖維細胞產(chǎn)生的MMP活性。因此，本發(fā)明涉及在個體中對皮膚老化進行美容性預防或治療的方法，其包括 向所述個體施用美容活性量的齒齦成纖維細胞來源的產(chǎn)品。本發(fā)明還涉及齒齦成纖維細胞來源的產(chǎn)品，其用于預防或治療(特別是美容性 預防或治療)個體中的皮膚老化。


圖1表示在如下培養(yǎng)基中MMP-9的量(縱軸，pg/100,000個細胞)未處理的人 真皮成纖維細胞(human dermal fibroblast，hDF) ； 7.5焦耳/cm2UV_A處理的人真皮成纖 維細胞ChDFil)；人齒齦成纖維細胞條件培養(yǎng)基中的hDFil(cmhGF)；人真皮成纖維細胞 條件培養(yǎng)基中的hDFil(cmhDF) ； 15焦耳/cm2UV_A處理的人真皮成纖維細胞(hDFi2)； 人齒齦成纖維細胞條件培養(yǎng)基中的hDFi2(cmhGF)；以及人真皮成纖維細胞條件培養(yǎng)基 中的 hDFi2 (cmhDF)。圖2表示在如下培養(yǎng)基中TIMP-I (縱軸，pg/ml/100,000個細胞)的濃度人 真皮成纖維細胞條件培養(yǎng)基(cmhDF)，以7.5焦耳/cm2 (hDFil)或15焦耳/cm2 (hDFi2) UV-A處理的人真皮成纖維細胞的培養(yǎng)基，或人齒齦成纖維細胞條件培養(yǎng)基(cmhGF)。圖3表示在如下培養(yǎng)基中MMP-9/TIMP-1復合物的濃度(縱軸，pg/ml/100,000 個細胞)的濃度未處理的人真皮成纖維細胞ChDF) ； 7.5焦耳/Cm2UV-A處理的人真 皮成纖維細胞(hDFil)；人齒齦成纖維細胞條件培養(yǎng)基中的hDFil (cmhGF)；人真皮成 纖維細胞條件培養(yǎng)基中的hDFil (cmhDF) ； 15焦耳/cm2UV_A處理的人真皮成纖維細胞 (hDFi2)；人齒齦成纖維細胞條件培養(yǎng)基中的hDFi2 (cmhGF)；以及人真皮成纖維細胞條 件培養(yǎng)基中的hDFi2 (cmhDF)。發(fā)明詳述本文中，“皮膚老化”涉及由于長期因素(如機械、氧化和/或光照脅迫)造成 的皮膚組分降解所引起的皮膚缺陷。特別地，皮膚老化可以是時間性老化和/或光老化的結(jié)果?！皶r間性老化”涉 及年齡引起的皮膚缺陷?！肮饫匣鄙婕坝捎谄つw暴露于光(特別是UV射線，更特別 地是UV-A射線)造成的皮膚缺陷。特別地，皮膚缺陷可以是皺紋或皮膚彈性喪失。所降解的皮膚組分可以是彈性 蛋白和/或膠原蛋白。本發(fā)明的方法可用于提高真皮內(nèi)這兩種組分的合成。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法用于預防或治療面部皮膚老化。優(yōu)選地，所述個體是哺乳動物，更優(yōu)選地是人。用于獲取、培養(yǎng)和保存齒齦成纖維細胞的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的， 特別是在Naveau等(2006) J.Periodontol.77 238-47 和 Gogly等(2007) Arterioscler.Thromb. Vasc.Biol.27 1984-90 中有所描述。有利地，齒齦成纖維細胞容易取樣和培養(yǎng)。此外，齒齦成纖維細胞擴增速率
尚ο優(yōu)選地，本發(fā)明方法中使用的齒齦成纖維細胞為自體的，即它們?nèi)∽詫⒁┯?齒齦成纖維細胞來源之產(chǎn)品的個體。
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有利地，齒齦成纖維細胞提供了幾乎無限來源的自體成纖維細胞。此外，在老 化的皮膚中，通常仍可獲得能進行培養(yǎng)的自體齒齦成纖維細胞，但是，相比之下，能進 行培養(yǎng)的自體真皮成纖維細胞的來源很少。然而，齒齦成纖維細胞也可以是同種異體的，即取自同一物種的另一個體，或 者是異種的，即取自另一物種的另一個體。本文中，“齒齦成纖維細胞來源的產(chǎn)品”涉及能夠從齒齦成纖維細胞本身獲得 的任何產(chǎn)品，或者含有齒齦成纖維細胞分泌物的任何產(chǎn)品。例如，優(yōu)選地，齒齦成纖維 細胞來源的產(chǎn)品選自齒齦成纖維細胞全細胞、齒齦成纖維細胞培養(yǎng)物、齒齦成纖維細胞 提取物和齒齦成纖維細胞條件培養(yǎng)基。齒齦成纖維細胞提取物可以通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何細胞破碎方法獲得。齒齦成纖維細胞條件培養(yǎng)基涉及齒齦成纖維細胞接觸過的任何培養(yǎng)基，例如液 體細胞培養(yǎng)基，特別是接觸足以使齒齦成纖維細胞在培養(yǎng)基中進行分泌的時間。齒齦成纖維細胞來源之產(chǎn)品的施用(優(yōu)選在臨近待處理之皮膚區(qū)域的部位)可 以通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方法進行。但是，優(yōu)選局部或通過皮內(nèi)注射施用齒齦成 纖維細胞來源的產(chǎn)品。這樣的施用途徑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，在Weiss等(2007) Dermatol.Surg.33 263-8 中有清楚的描述。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括下列步驟-從個體中獲取齒齦成纖維細胞；-培養(yǎng)所述齒齦成纖維細胞；-從所培養(yǎng)的齒齦成纖維細胞獲得齒齦成纖維細胞來源的產(chǎn)品；-將所述齒齦成纖維細胞來源的產(chǎn)品施用于個體。所有引用的參考文獻都通過引用并入本文中。
實施例方法1.細胞培養(yǎng)從健康患者(20-30歲)的齒齦和真皮外植體中獲得5種人齒齦成纖維細胞(hGF) 和3種真皮成纖維細胞ChDF)培養(yǎng)物。建立原代外植體培養(yǎng)物，使用第3 5代。制備hGF或hDF條件培養(yǎng)基從鋪滿hGF和hDF培養(yǎng)物的75cm2培養(yǎng)瓶中棄去培養(yǎng)基(DMEM/FCS)。然后， 加入24mlDMEM，24小時后回收。繼而，將條件培養(yǎng)基凍存?zhèn)溆?。細胞的制備將來自兩個鋪滿的25cm2培養(yǎng)瓶中的hDF接種到3個12孔培養(yǎng)板中。當細胞 鋪滿后(每孔150,000個細胞)，兩個培養(yǎng)板分別用7.5和15焦耳/cm2的UVA照射，第 3個板用作對照，以檢查未經(jīng)照射時不存在MMP-9。照射后，更換培養(yǎng)基。對于每個培養(yǎng)瓶，加入下列培養(yǎng)基-向4個孔中僅加入DMEM(每孔Iml)-向4個孔中加入hGF條件培養(yǎng)基(每孔Iml)-向4個孔中加入hDF條件培養(yǎng)基(每孔Iml)
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24小時后收集培養(yǎng)基，分裝并保存在-80°C，以備進一步的蛋白質(zhì)分泌物分 析。將細胞固定于孔中，用GIEMSA染色。2.MMP-9 和 TIMP-1 分泌分析明膠酶譜分析(MMP-9)對20μ1培養(yǎng)基進行明膠酶譜分析。為了利于鑒定MMP類型，將10μ1 pro-MMP-9 (92kDa)禾口 10 μ 1 pro-MMP-2 (72kDa) (IOng) (BC058 和 BC057 ； ABCys)在同 一凝膠上跑膠。此外，將與APMA(2mM)于37°C —起孵育1小時的10 μ 1 pro-MMP-9 平行跑膠，以指示MMP-9的位置。點印跡(MMP-9 和 TIMP-1)將10 μ 1培養(yǎng)基施加到硝酸纖維素膜上。然后，用1/500稀釋的抗ΜΜΡ_9(游離 形式)和抗TIMP-K分別為ΙΜ37和ΙΜ32 ； Calbiochem)的小鼠單克隆第一抗體處理膜。 用 TBS/Tween(50mMTris，150mMNaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)清洗后，將過氧化物 酶標記的山羊抗小鼠第二抗體(1/1000，DC08L ； Calbiochem)與膜一起孵育1小時。利 用KodakBiomax MR膠片使免疫反應(yīng)蛋白顯影。使用Image J軟件(Image J ； http:/rsb.info. nih.gov/ij7index.html)對印跡的尺寸(表面面積)和灰度進行分析。通過與IOpg MMP-9 或TIMP-I標準品(分別為PF140和PF019 ； Calbiochem)進行比較來確定濃度。利用ELISA(DMP900 和 DTMlOO ； R&D Systems)進行游離 MMP-9 和 TIMP-1 的補充定量分析。使用配對Student，s t_檢驗進行不同實驗之間的統(tǒng)計學分析。3.MMP-9/TIMP-1 復合物測定使用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(ELISA) (DY1449 ； R&D Systems)對總的人 MMP-9/TIMP-1復合物進行定量。結(jié)果1.來自人齒齦成纖維細胞的條件培養(yǎng)基抑制來自UV照射之人真皮成纖維細胞的 MMP-9。圖1顯示人真皮成纖維細胞(hDF)不產(chǎn)生MMP-9，而經(jīng)過7.5焦耳/cm2 (hDFil) 或15焦耳/cm2 (hDFi2) UV-A的照射時除外。人齒齦成纖維細胞條件培養(yǎng)基(cmhGF)使 UV處理的真皮成纖維細胞的MMP-9產(chǎn)生減少了 50%，而人真皮成纖維細胞條件培養(yǎng)基 (cmhDF)僅使MMP-9產(chǎn)生減少了 15%。2.人齒齦成纖維細胞比人真皮成纖維細胞產(chǎn)生更多的TIMP-1 (MMP-9組織抑制 因子)。圖2顯示，無論照射與否，hGF條件培養(yǎng)基都比hDF條件培養(yǎng)基含有的TIMP-I 至少多3倍。3.在人齒齦成纖維細胞存在下，MMP-9/TIMP-1復合物的量增加。圖3顯示，在cmhGF存在下TIMP-1/MMP-9復合物的量是cmhDF存在下的兩倍。
權(quán)利要求
1.在個體中對皮膚老化進行美容性預防或治療的方法，其包括對所述個體施用美容 活性量的齒齦成纖維細胞來源的產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中皮膚老化是時間性老化和/或光老化的結(jié)果。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其用于美容性預防或治療皺紋或皮膚彈性喪失。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其用于預防或治療面部皮膚老化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其用于增加真皮中彈性蛋白和/或膠原 蛋白的合成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述齒齦成纖維細胞來源的產(chǎn)品局 部施用或通過真皮內(nèi)注射施用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述齒齦成纖維細胞來源的產(chǎn)品選 自齒齦成纖維細胞全細胞、齒齦成纖維細胞培養(yǎng)物、齒齦成纖維細胞提取物和齒齦成纖 維細胞條件培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述齒齦成纖維細胞來源的產(chǎn)品從 取自所述個體的齒齦成纖維細胞中獲取。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法，其包括-從所述個體中獲取齒齦成纖維細胞；-培養(yǎng)所述齒齦成纖維細胞；-從所培養(yǎng)的齒齦成纖維細胞獲得齒齦成纖維細胞來源的產(chǎn)品；-將所述齒齦成纖維細胞來源的產(chǎn)品施用于所述個體。
全文摘要
本發(fā)明涉及在個體中對皮膚老化進行美容性預防或治療的方法，包括對所述個體施用美容活性量的齒齦成纖維細胞來源的產(chǎn)品。
文檔編號A61K8/98GK102014866SQ200980115587
公開日2011年4月13日 申請日期2009年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月31日
發(fā)明者伯納德·庫隆布, 安托萬·拉豐, 布魯諾·戈利 申請人:瘢痕細胞治療公司