專利名稱：基因活化鈦材及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種鈦材及其制備方法。
背景技術：
鈦材是常用的醫(yī)用金屬材料，由于其良好的生物相容性和機械性能，早在20世 紀中期就被用于醫(yī)用領域，并于70年代作為植入材料開始獲得廣泛應用。隨著生物技術 和生物醫(yī)學的發(fā)展，鈦材在人體植入體、替代裝置和人體器官等方面的應用獲得了重大突 破，主要是用作牙科植入體、人工關節(jié)及牙齒植入支架等(Mater Sci Forum， 2003 ;416 : 669-674.) CJ Mater Chem 2004 ;14 :2282-2290)。 鈦材屬于生物惰性生物材料，一方面，材料表面的生物惰性賦予鈦材良好生物
相容性。但是另一方面，這種惰性也使得鈦材的應用受到了挑戰(zhàn)，因為惰性的鈦材表面
與骨的結合是一種機械鎖合方式，植入后組織反應表現(xiàn)為非特異性和隨機性(Biomed
Pharmacother，2006，60(8) :365-369)，使得鈦材植入體不能與骨組織形成牢固的、長期穩(wěn)
定的結合，容易引發(fā)炎癥、移位等問題，導致植入失敗。因此，如何使鈦材表面具有生物活
性，改善鈦材的生物相容性和骨的結合能力，是鈦材研究設計中的首要問題。 目前，為提高鈦材表面生物活性，主要使用的是表面涂層、生化修飾等方法。研究
較多的涂層技術是在鈦材表面進行羥基磷灰石涂層。在鈦材表面形成一層生物活性的羥
基磷灰石可以提高鈦材種植體的表面活性。早在1991年，L. L. Hench等證實鈦材表面的羥
基磷灰石涂層能加強鈦植入體與宿主骨之間的固定作用，促使骨細胞向植入體生長(J Am
Ceram Soc 1991;74:1485-1510.)。而生化修飾是獲得具有活性的鈦材表面的另一有效途
徑。Le Gui 1 lou-Buf f e 1 loD等證實經RGD修飾的鈦材表更有利于成骨細胞的粘附、鋪展、分
化已經存活等生物學行為(Tissue Eng Part A. 2008， 14(8) :1445-55)。 這些方法在一定程度上改善了鈦材的生物相容性和骨結合能力，但是這些方法仍
不能使鈦材具有良好的骨誘導性能，鈦材難以主動的與機體結合并調控骨細胞粘附、增值、
遷移及分化等生物行為，使得鈦材無法具有與骨組織發(fā)生良好骨結合的能力。 殼聚糖是甲殼質經脫乙酰基而得到的一種天然陽離子多糖(pKa = 6.3)，具有可
降解性、良好的生物相容性及一定的抗菌等優(yōu)異性能，廣泛應用于組織工程、藥物釋放等領
域。pEGFP-hBMP2質粒是一種重組質粒，可在真核細胞內表達綠色熒光蛋白和骨形態(tài)發(fā)生蛋
白，綠色熒光蛋白用來監(jiān)控轉染效率，骨形態(tài)發(fā)生蛋白屬于骨誘導生長因子，可誘導骨源性
細胞向骨細胞生長，促進骨生成。殼聚糖與質粒pEGFP-hBMP2形成的多層膜可以在生理條
件下發(fā)生降解，使得質粒DNA或殼聚糖-質粒DNA顆粒在長時間內持續(xù)產生，維持質粒DNA
的濃度。生長在這種基因活化的鈦材表面的細胞(如骨髓基質干細胞)吸收復合顆粒后，
在較長的時間內使質粒DNA持續(xù)表達并合成功能蛋白——骨形態(tài)發(fā)生蛋白，原位誘導骨髓
基質干細胞向成骨細胞的生成，賦予鈦材主動與骨組織發(fā)生良好的骨結合能力。
發(fā)明內容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一是提供一種基因活化鈦材，具有良好的生物相容性 及骨誘導性能，能夠提高宿主骨細胞的轉染率，有效地調控基因釋放并增強細胞活力，誘導 骨細胞的生成，從而使鈦材本體能夠主動與骨組織發(fā)生良好結合。 本發(fā)明所述的基因活化鈦材，包括鈦材本體，鈦材本體表面由內向外依次間隔覆 有pEGFP-hBMP2質粒層和殼聚糖層形成活化層。 進一步，所述鈦材本體由醫(yī)用鈦材制得，所述活化層中pEGFP-hBMP2質粒層和殼 聚糖層的總層數(shù)為9-21層。 本發(fā)明的目的之二是提供制備所述基因活化鈦材的方法，包括如下步驟(l)將所 述鈦材本體浸于聚乙烯亞胺溶液中10-20分鐘后，用去離子水浸泡1-3次，每次1-2分鐘；
(2)將步驟(1)所得鈦材本體浸入含有質粒pEGFP-hBMP2的磷酸鹽緩沖液中 10-20分鐘后，用去離子水浸泡1-3次，每次1-2分鐘； (3)將步驟(2)所得鈦材本體浸于殼聚糖的乙酸溶液中10-20分鐘后，用去離子水 浸泡1-3次，每次1-2分鐘； (4)依次重復步驟(2)和步驟(3)，直至得到所需基因活化鈦材。 進一步，所述聚乙烯亞胺溶液中所含組分及相應組分在溶液中的濃度分別為氯
化鈉100-150mM和聚乙烯亞胺2-5mg/ml ; 進一步，所述含有質粒pEGFP-hBMP2的磷酸鹽緩沖液pH值為7. 4，質粒濃度為 0. l_lmg/ml ; 進一步，所述殼聚糖的乙酸溶液中，乙酸質量百分比為1_3%，殼聚糖濃度為 3_5mg/ml。 本發(fā)明的有益效果是 本發(fā)明的基因活化鈦材具有良好的生物相容性及骨誘導性能，能夠提高宿主骨細 胞的轉染率并有效調控基因釋放和增強細胞活力，誘導骨細胞的生成，從而使鈦材本體能 夠主動與骨組織發(fā)生良好結合，非常適合臨床應用。 本發(fā)明所述的制備基因活化鈦材的方法利用殼聚糖分子與質粒DNA之間的靜電 作用使殼聚糖層與質粒pEGFP-hBMP2層在鈦材表面依次沉積，不僅操作簡單，成本低廉， 而且實施容易，制得的基因活化鈦材能有效誘導骨源細胞向骨細胞的轉化并與骨組織牢固 的、長期穩(wěn)定的結合，本發(fā)明方法非常適合用于產業(yè)化應用。 本發(fā)明的其他優(yōu)點、目標和特征在某種程度上將在隨后的說明書中進行闡述，并 且在某種程度上，基于對下文的考察研究對本領域技術人員而言將是顯而易見的，或者可 以從本發(fā)明的實踐中得到教導。
附圖為實施例所得基因活化鈦材進行表面誘導大鼠骨髓間充質干細胞向骨細胞 轉化過程中，堿性磷酸酶的檢測結果，圖中，1-孔板，2-表面涂覆脂質體2000的孔板，3-表 面涂覆脂質體2000的鈦材，4-實施例所得基因活化鈦材，5-殼聚糖/DNA層狀組裝修飾的 鈦材；白色框為細胞在第七天時產生堿性磷酸酶的總量，黑色框為第十四天時細胞產生磷 酸酶的總量。
具體實施例方式以下將結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。應當理解，所選實施例僅為了
說明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍。
實施例 ①將鈦材本體浸于聚乙烯亞胺溶液中10分鐘，然后用去離子水浸泡1分鐘，再將 所得鈦材浸入含有質粒pEGFP-hBMP2的pH7. 4的磷酸鹽緩沖液中20分鐘，然后用去離子水 浸泡1分鐘；最后將鈦材浸于殼聚糖的乙酸溶液中，10分鐘后，用去離子水浸泡1分鐘；
②重復步驟①的操作直至在鈦材外表面形成pEGFP-hBMP2質粒層和殼聚糖層總 層數(shù)為15層的活化層，得所需基因活化鈦材。所述聚乙烯亞胺溶液以100-150mM氯化鈉溶 液為溶劑，溶液中聚乙烯亞胺濃度為2-5mg/ml 本實施例所述聚乙烯亞胺溶液中所含組分及相應組分在溶液中的濃度分別為氯
化鈉150mM和聚乙烯亞胺5mg/ml，所述磷酸鹽緩沖液中pEGFP-hBMP2質粒濃度為lmg/ml，
所述殼聚糖乙酸溶液中，乙酸質量百分比為1 % ，殼聚糖濃度為5mg/ml 。 本實施例中，聚乙烯亞胺溶液中，氯化鈉濃度為100-150mM、聚乙烯亞胺濃度
為2-5mg/ml均可，含有pEGFP-hBMP2質粒的磷酸鹽緩沖液的pH值為7. 4、質粒濃度為
0. l-lmg/ml均可，殼聚糖乙酸溶液中，乙酸質量百分比為l-3X、殼聚糖濃度為3-5mg/ml均可。 本實施例中，活化層中pEGFP-hBMP2質粒層和殼聚糖層總層數(shù)不低于五層皆可， 原因在于總層數(shù)大于5層的活化層，其結構才較為完善；殼聚糖與質粒pEGFP-hBMP2形成的 多層膜可以在生理條件下發(fā)生降解，使得質粒DNA(既質粒pEGFP-hBMP2)或殼聚糖-質粒 DNA顆粒在一定時間內持續(xù)產生，并維持一定濃度，鈦材表面經殼聚糖與質粒DNA層狀自組 裝修飾后，生長在這種基因活化鈦材表面的細胞(如骨髓基質干細胞)能夠吸收質粒DNA 或復合顆粒并在較長時間內使質粒DNA持續(xù)表達并合成功能蛋白——骨形態(tài)發(fā)生蛋白，原 位誘導骨髓基質干細胞向成骨細胞的生成，賦予鈦材主動與骨組織發(fā)生良好的骨結合，使 用者可以根據(jù)需要限定鈦材本體表面活化層的總層數(shù)，以實現(xiàn)特定時間內質粒DNA的持續(xù) 釋放，活化層總層數(shù)以9-21層最佳，原因在于9層以上的質粒DNA層數(shù)是能夠確保質粒DNA 的總含量，達到長時間持續(xù)釋放的目的，但過多層數(shù)可能導致質粒DNA在特定時間段釋放 過量或難于控制。 所述基因活化鈦材制備方法中，鈦材本體在聚乙烯亞胺溶液、磷酸鹽緩沖液以及 殼聚糖的乙酸溶液中的浸泡時間可分別為10-20分鐘，但并不表示本發(fā)明方法中，各溶液 浸泡階段的時間局限于10-20分鐘，浸泡的目的在于使質粒層及殼聚糖層能夠依次間隔附 著于鈦材本體的外表面，由于同層介質(聚陰離子或聚陽離子)的同性電荷排斥，理論上傾 向于形成單層結構，浸泡時間長，可使聚陰離子或聚陽離子層形成更充分，對鈦材表面覆蓋 更完整，形成的覆蓋層更平整，浸泡時間以質粒DNA層或者殼聚糖層能夠完整覆蓋鈦材表 面形成單層結構即可。 本實施例中，各溶液對鈦材的浸泡結束后，皆需采用去離子水進行浸泡洗滌，各階 段去離子水浸泡的次數(shù)均以1-3次為宜、去離子水浸泡時間均以每次l-3min為宜，原因在 于浸泡的主要目的是移除在同一層中可能形成雙層或多層聚陰離子或聚陽離子，以免它
5們導致后面鋪層結構不穩(wěn)定，但浸泡時間過長，則可能導致已形成的多層結構解離。
結果驗證 將本實施例所得基因活化鈦材進行表面誘導大鼠骨髓間充質干細胞 (mesenchymal stem cells, MSCs)向骨細胞轉化的鑒定 操作如下采用密度梯度離心法和差時貼壁法培養(yǎng)大鼠間充質干細胞(MSCs)，將 MSCs分別接種到孔板、表面涂覆脂質體2000的孔板、表面涂覆脂質體2000的鈦材、殼聚糖 /pGB修飾的基因活化鈦材以及殼聚糖/DNA層狀自組裝修飾的鈦材表面，細胞接種密度為 40000 cells/cm2 ;用DMEM培養(yǎng)基加10% (w/v)的新生牛血清進行培養(yǎng)，每3天換液一次； 細胞在基因活化鈦材表面接種分別培養(yǎng)7和14天后，以0. 25%胰酶消化，收集細胞，用1% Triton-X100裂解細胞，檢測細胞裂解液中堿性磷酸酶的表達量。 結果如附圖，從圖可知，細胞在基因活化鈦材的表面，第7天及14天產生堿性磷酸 酶的量均高于其它對照組，說明該基因活化的鈦材能夠更有利于促進間充干細胞向成骨細 胞的分化。 最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較 佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技 術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本 發(fā)明的權利要求范圍當中。
權利要求
一種基因活化鈦材，其特征在于包括鈦材本體，鈦材本體表面由內向外依次間隔覆有pEGFP-hBMP2質粒層和殼聚糖層形成活化層。
2. 根據(jù)權利要求l所述的基因活化鈦材，其特征在于所述鈦材本體由醫(yī)用鈦材制得， 所述活化層中pEGFP-hBMP2質粒層和殼聚糖層的總層數(shù)為9-21層。
3. 制備權利要求1所述的基因活化鈦材的方法，其特征在于包括如下步驟(1)將所述鈦材本體浸于聚乙烯亞胺溶液中10-20分鐘后，用去離子水浸泡1-3次，每次1-2分鐘；(2) 將步驟(1)所得鈦材本體浸入含有質粒pEGFP-hBMP2的磷酸鹽緩沖液中10-20分 鐘后，用去離子水浸泡1-3次，每次1-2分鐘；(3) 將步驟(2)所得鈦材本體浸于殼聚糖的乙酸溶液中10-20分鐘后，用去離子水浸泡 1-3次，每次1-2分鐘；(4) 依次重復步驟(2)和步驟(3)，直至得到所需基因活化鈦材。
4. 根據(jù)權利要求4所述的制備基因活化鈦材的方法，其特征在于所述聚乙烯亞胺溶 液中所含組分及相應組分在溶液中的濃度分別為氯化鈉100-150mM和聚乙烯亞胺2-5mg/ ml。
5. 根據(jù)權利要求5所述的制備基因活化鈦材的方法，其特征在于所述含有質粒 pEGFP-hBMP2的磷酸鹽緩沖液pH值為7. 4，質粒濃度為0. l-lmg/ml。
6. 根據(jù)權利要求6所述的制備基因活化鈦材的方法，其特征在于所述殼聚糖的乙酸 溶液中，乙酸質量百分比為1_3%，殼聚糖濃度為3-5mg/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因活化鈦材，包括鈦材本體，鈦材本體表面由內向外依次間隔覆有pEGFP-hBMP2質粒層和殼聚糖層形成活化層，所述基因活化鈦材具有良好的生物相容性及骨誘導性能，能夠提高宿主骨細胞的轉染率并有效調控基因釋放和增強細胞活力，誘導骨細胞的生成，從而使鈦材本體能夠主動與骨組織發(fā)生良好結合；本發(fā)明還提供了制備所述基因活化鈦材的方法，利用殼聚糖分子與質粒DNA之間的靜電作用使殼聚糖層與質粒pEGFP-hBMP2層在鈦材表面依次沉積，不僅操作簡單，成本低廉，而且實施容易，制得的基因活化鈦材能有效誘導骨源細胞向骨細胞的轉化并與骨組織牢固的、長期穩(wěn)定的結合，適合用于產業(yè)化運用。
文檔編號A61L27/34GK101745150SQ200910250890
公開日2010年6月23日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權日2009年12月31日
發(fā)明者羅忠, 胡燕, 蔡開勇 申請人:重慶大學