專利名稱：腹水瘤細(xì)胞在制備骨癌痛模型的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及癌痛動物模型，尤其涉及Walker256腹水瘤細(xì)胞在 制備骨癌痛模型的用途。
背景技術(shù)：
癌痛即惡性腫瘤引起的疼痛，是臨床上常見的慢性病理性疼痛之一，其嚴(yán)重影響 患者的生活質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計資料表明，腫瘤患者中約有30-50%伴有輕到中度的疼痛，而在腫 瘤晚期或轉(zhuǎn)移性腫瘤患者中，約有75-95 %的患者因伴有嚴(yán)重的疼痛而需要接受治療。依據(jù) WHO倡導(dǎo)的對癌痛的三階梯療法，臨床實踐雖然取得了一定的成效，然而由于對癌痛機制認(rèn) 識的不足，加之由于各種藥物療法以及放療、化療等其他療法具有諸多如下毒副作用，如 成癮、耐受、免疫抑制、胃腸道反應(yīng)等，以及有些癌痛對這些療法不敏感，以至于仍有相當(dāng)一 部分的癌痛得不到有效控制。近年來，國際上相繼有股骨、脛骨、肱骨癌痛動物模型成功建立的報道，這些模型 中大部分是應(yīng)用NCTCM72纖維肉瘤細(xì)胞株、MRMT-I大鼠乳腺癌細(xì)胞株或者Walker256腹水 瘤細(xì)胞，為開展癌痛機制以及鎮(zhèn)痛藥物篩選提供了很有價值的工具。Walker256乳腺癌是一 種來源于孕白化鼠的乳腺組織自發(fā)性腫瘤，具有很強的骨侵襲和骨溶解作用。與體外培養(yǎng) 的細(xì)胞株相比，Walker256腹水瘤具有細(xì)胞傳代操作簡便的優(yōu)點，至今尚未見用Walker256 腹水瘤細(xì)胞制作動物跟骨癌痛模型的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種新的癌痛動物模型，具體涉及Walker256腹水瘤細(xì)胞在制 備骨癌痛模型的用途。尤其涉及Walker256腹水瘤細(xì)胞在制備跟骨癌痛或骨炎癥痛模型中 的用途。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供應(yīng)用Walker256腹水瘤制備的跟骨癌痛模型。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供應(yīng)用Walker256腹水瘤制備的骨炎癥痛模型。本發(fā)明提供的新的實驗動物模型有助于開展骨癌痛及相關(guān)研究。本發(fā)明通過下述方法制備所述的跟骨癌痛模型實驗動物麻醉以后，跟骨部位皮膚消毒，采用本領(lǐng)域常規(guī)方法技術(shù)將4X IO3 4X105ffalker256腹水瘤細(xì)胞置入實驗動物跟骨及周圍后，碘敷消毒，繼續(xù)飼養(yǎng)2 16天即 建成跟骨癌痛模型。本發(fā)明中，采用的實驗動物優(yōu)選為大鼠，更優(yōu)選SD或者Wistar雌性大鼠，體重 100 200 克。具體的，所述的大鼠經(jīng)8%水合氯醛麻醉后，跟骨部位皮膚以碘敷或70%酒精消 毒，將4X IO3 4X 105Walker256腹水瘤細(xì)胞緩慢置入脛骨骨髓腔后，碘敷消毒及周圍皮 膚，繼續(xù)飼養(yǎng)2 16天即建成脛骨炎癥痛模型。本發(fā)明中，所述的Walker256腹水瘤細(xì)胞使用PBS充分洗滌盡量去除多余的腹水成分，配制的腹水瘤細(xì)胞于冰浴上低溫放置，每次抽取時需充分搖勻，在2 3小時內(nèi)使用， 使保持腫瘤細(xì)胞活性。本發(fā)明中，按上述方法制備采用CFA制備骨炎癥痛模型。本發(fā)明對應(yīng)用Walker256腹水瘤制備的跟骨癌痛模型或骨炎癥痛模型進(jìn)行了行 為學(xué)指標(biāo)測試，包括輻射熱痛閾變化、機械性痛閾變化等相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果顯示，實驗鼠的行 為學(xué)指標(biāo)無明顯變化。本發(fā)明用Walker256腹水瘤細(xì)胞制得大鼠跟骨癌痛模型或骨炎癥痛模型。該根骨 癌痛模型將為骨癌痛的機制研究以及藥物鎮(zhèn)痛效果評價、藥物篩選提供有價值的實驗研究 工具和平臺，同時豐富了慢性疼痛實驗動物模型類型，具有重要的學(xué)術(shù)價值和應(yīng)用前景。


圖1為正常組大鼠和跟骨接種腫瘤組大鼠后跟的外觀。圖2為跟骨癌痛大鼠接種側(cè)后肢輻射熱痛閾變化情況。圖3為跟骨癌痛大鼠接種對側(cè)后肢腳掌熱痛閾變化情況。圖4為跟骨癌痛大鼠接種側(cè)后肢機械性痛閾變化情況。圖5為跟骨癌痛大鼠接種對側(cè)后肢機械性痛閾變化情況。圖6為接種不同數(shù)量Walker256腹水瘤后大鼠接種側(cè)后肢機械性痛閾變化情況。圖7為接種不同數(shù)量Walker256腹水瘤后大鼠接種對側(cè)后肢機械性痛閾變化情 況。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施案例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限 于此實施例11.材料和方法腫瘤細(xì)胞Walker256大鼠乳腺癌腹水瘤，由上海生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供；動物SD雌性大鼠，體重140 160克，由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供；主要儀器vonFrey hair (Stoelting, Wood Dale, Illinois,USA)；輻射熱測痛儀 (Model 390 Paw Stimulator Analgesia Meter, IITC/Life ScienceInstruments, USA)；造模方法模型組大鼠經(jīng)8%水合氯醛腹腔注射麻醉后，跟骨部位皮膚以碘敷或70%酒 精消毒，采用4號針頭跟骨鉆孔，然后換用吸有Walker256腹水瘤細(xì)胞的微量注射器，將 4 X IO3 4X 105Walker256腹水瘤細(xì)胞緩慢注射入脛骨骨髓腔內(nèi)，注射完畢后碘敷消毒針 孔及周圍皮膚，繼續(xù)飼養(yǎng)2 16天即建成脛骨炎癥痛模型。對照組往大鼠脛骨髓腔內(nèi)注射等體積的PBS，其余操作同模型組。2.行為學(xué)指標(biāo)測定分別于造模前及造模后用von Frey hair和輻射熱法測定機械痛閾值和熱痛閾值。熱痛閾值測定安靜環(huán)境中，室溫22士 1°C，熱痛覺過敏采用，大鼠置于底為光滑玻璃的有機玻璃格子內(nèi)，適應(yīng)20分鐘待大鼠安靜后，將強熱光束照射至大鼠腳掌中心皮 膚，引起大鼠縮爪反應(yīng)的時間為大鼠縮爪潛伏期(paw withdrawal latency，PWL)，輻射熱 強度設(shè)定在引起正常大鼠縮爪潛伏期為10 12秒，取3次算平均值，兩次間隔10分鐘，結(jié) 果以痛覺過敏分?jǐn)?shù)(=模型側(cè)縮爪潛伏期-正常側(cè)縮爪潛伏期)表示。為防止大鼠熱輻射 燙傷，將PWL的上限值(cut-off time)定為20秒。機械痛閾測定安靜環(huán)境中，室溫22士 1°C，大鼠置于底為網(wǎng)格的特制有機玻璃格 子Q6X20 X Hcm)內(nèi)，適應(yīng)20分鐘后，根據(jù)Dixon介紹的up-and-down法，將一系列von Frey 細(xì)絲(0. 4g，0. 6g，1. 4g，2. 0g, 4. 0g, 6. 0g, 8. 0g, 15. Og)按照一定的順序刺激大鼠腳掌 中部皮膚，觀察大鼠縮足反應(yīng)。每根細(xì)絲每次刺激時間為1 2秒，前后兩次不同刺激間隔 10分鐘，然后用軟件計算出50% von Frey反應(yīng)閾值作為機械性痛閾值。統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS11. 0軟件進(jìn)行方差分析，以P < 0. 05認(rèn)為差異有顯著性。結(jié)果顯示1)腫瘤和正常大鼠后跟外觀如圖1所示，接種腫瘤大鼠后跟可以觀察到明顯的紅 腫。2)行為學(xué)熱痛閾(如圖2、3所示)大鼠跟骨接種Walker256腹水瘤細(xì)胞后，接種側(cè)后肢 對輻射熱引起的縮爪潛伏期與正常組大鼠相比無顯著性差異(P > 0. 05)。與腫瘤接種側(cè)相 似，腫瘤接種對側(cè)縮爪潛伏期與正常組也無顯著性差異(P > 0. 05)。機械痛閾(如圖4所示)與正常組、PBS組大鼠相比，大鼠跟骨接種 4X103ffalker256腹水瘤細(xì)胞后第5天接種側(cè)后肢機械性痛閾顯著降低(P < 0. 01)，而后 逐漸減低，造模后第9天開始，后肢機械性痛閾一直維持在較低水平。而注射PBS組大鼠 后肢機械性痛閾在整個實驗過程中與正常組無顯著差異(P > 0.05)(如圖4所示)。這 種機械性痛覺超敏也出現(xiàn)在腫瘤接種對側(cè)后肢(如圖5所示)。而跟骨接種4X103和 4X105Walker245腹水瘤細(xì)胞組大鼠后肢機械性痛閾在觀察期間無顯著差異(P > 0. 05) (如圖6、7所示)。
權(quán)利要求
1.Walker256腹水瘤細(xì)胞在制備骨癌痛模型中的用途。
2.按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的骨癌痛模型是跟骨癌痛或骨炎癥痛 模型。
3.按權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述的骨癌痛模型按下述方法制備實驗動物 麻醉以后，跟骨部位皮膚消毒，采用常規(guī)方法技術(shù)將4X IO3 4X 105ffalker256腹水瘤細(xì)胞 置入實驗動物跟骨及周圍后，碘敷消毒，繼續(xù)飼養(yǎng)2 16天，建成跟骨癌痛模型。
4.按權(quán)利要求3所述的用途，其中所述的實驗動物為SD或Wistar雌性大鼠，體重 100 200 克。
5.按權(quán)利要求3所述的用途，其中所述的Walker256腹水瘤細(xì)胞用PBS洗滌去除多余 的腹水成分，于冰浴低溫放置。
6.按權(quán)利要求3所述的用途，其中所述的Walker256腹水瘤細(xì)胞抽取后2 3小時內(nèi)使用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及Walker256腹水瘤細(xì)胞在制備骨癌痛模型的用途。所述的骨癌痛模型包括跟骨癌痛或骨炎癥痛模型。本發(fā)明對制備的跟骨癌痛模型或骨炎癥痛模型進(jìn)行了行為學(xué)指標(biāo)測試，包括輻射熱痛閾變化、機械性痛閾變化等相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果顯示，實驗動物的行為學(xué)指標(biāo)無明顯變化。本發(fā)明制得骨癌痛模型將為骨癌痛的機制研究以及藥物鎮(zhèn)痛效果評價、藥物篩選提供有價值的實驗研究工具和平臺，同時豐富了慢性疼痛實驗動物模型類型，具有重要的學(xué)術(shù)價值和應(yīng)用前景。
文檔編號A61P29/00GK102068457SQ20091019923
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月20日
發(fā)明者毛應(yīng)啟梁, 王彥青 申請人:復(fù)旦大學(xué)