專利名稱：保守淋球菌表位的擬肽及應(yīng)用它們的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及淋病奈瑟球菌(#e/Mer2'a gooorr力oeae)的保守表位 的擬肽(peptide mimics)，這些表位在人血型抗原上沒有發(fā)現(xiàn)。本 發(fā)明也涉及應(yīng)用這些擬肽預(yù)防淋病傳染的方法和組合物。
背景技術(shù)：
性傳播疾病淋病作為最常報(bào)道的傳染病之一，造成世界范圍的危 險(xiǎn)。淋病是由一種革蘭氏陰性雙球菌淋病奈瑟球菌引起的。盡管該病 原體主要感染粘膜，但它能侵入組織并避開宿主的防御。淋病奈瑟球 菌是多種后遺癥的病原體。從男性及女性的無癥狀粘膜感染到明顯的 疾病綜合征。更嚴(yán)重的綜合征包括，例如，男性及女性中的傳播性淋 球菌感染("DGI")，以及女性中的輸卵管炎或盆腔炎疾病("PID，，)。 輸卵管炎或PID本身可導(dǎo)致長期的后遺癥，包括異位妊娠和不育。其 它重要的后遺癥(有時(shí)需要外科手術(shù))包括復(fù)發(fā)感染、慢性骨盆痛、 性交困難、骨盆內(nèi)粘連和其它炎性殘留物。
據(jù)估計(jì)，在美國，治療PID和相關(guān)異位妊娠和不育癥的直接和間 接費(fèi)用1984年總計(jì)達(dá)26億美元(53) 。 1990年，總的直接費(fèi)用估計(jì) 達(dá)21.8億美元，間接費(fèi)用為15.4億美元。假定通貨膨脹和PID的發(fā) 病率恒定，該疾病的總花費(fèi)預(yù)計(jì)在2000年將達(dá)80億美元(9)。
盡管在美國公共衛(wèi)生致力于控制淋球菌感染和有效抗生素治療的 應(yīng)用性，但每年疾病控制中心("CDC")仍報(bào)道有接近315000例淋 病U2)。所有淋病病例中有相當(dāng)比例發(fā)生在無癥狀感染個(gè)體中，他 們是群體內(nèi)大多數(shù)新病例的來源(6)?？股乜剐跃衷絹碓蕉嗟牧餍惺乖摳腥镜闹委煾訌?fù)雜(10, 11， 52)。
淋病奈瑟球菌具有多種毒力因子。該病原體的表面成分在附著并侵入宿主細(xì)胞中起重要作用，并為宿主免疫應(yīng)答提供潛在靶標(biāo)。淋球菌感染引發(fā)對(duì)表現(xiàn)為細(xì)菌表面暴露抗原的幾種成分的局部和全身性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，特別是菌毛、孔蛋白("Por")或蛋白I( "PI")、渾濁相關(guān)蛋白質(zhì)("0pa")或蛋白11、Rmp或蛋白III和脂寡糖("L0S")(7)。菌毛、0pa、 Por和L0S全都與附著和侵入宿主有關(guān)，其表面暴露區(qū)全都顯示相當(dāng)大的變異(26， 45， 46)。淋球菌表面成分的菌林內(nèi)和菌林間變異導(dǎo)致關(guān)于不同部位的組織特異性和生物再感染和持續(xù)毒力的潛能的假說。
在有癥狀和無癥狀患者中，淋球菌感染顯示能刺激抗淋球菌血清免疫球蛋白水平提高。外周體液應(yīng)答主要是IgG(大多數(shù)是亞類IgG3)，有較少量的IgM和IgA (13)。在數(shù)量上，抗體應(yīng)答主要針對(duì)菌毛、0pa蛋白和L0S。局部抗體存在于生殖器分泌物中，但含量減少(48)，可能是針對(duì)與血清中的不同的抗原靶(27)。分泌中存在的主要抗體類別也是IgG (主要是IgG3)，而不是分泌型IgA( "sIgA" ) (7)。也存在抗LOS抗體，但其量少于抗菌毛、Por和0pa的抗體。盡管感染淋病奈瑟球菌的患者可能顯示對(duì)多種淋球菌抗原的抗體應(yīng)答，但從傳播性感染(DGI)患者中分離的淋病奈瑟球菌對(duì)正常人血清("NHS，，)和大多數(shù)恢復(fù)期患者血清的殺菌作用有抗性(38)。這種血清抗性表型，稱為穩(wěn)定的血清抗性("SR"),可使生物能避開局部防御，穿過粘膜屏障，并通過血流傳播。
在傳代培養(yǎng)后，許多淋球菌菌林對(duì)NHS的殺傷成為表型敏感的或血清敏感的(38)。這些生物被稱為血清敏感的("SS，，)或不穩(wěn)定的血清抗性的。這些生物通常從局部炎癥重度表現(xiàn)或臨床明顯的PID的女性中分離。急性輸卵管炎，PID的病理相對(duì)疾病(由SS淋球菌引起)，極少發(fā)展為菌血癥或DGI。這提示由SS淋球菌引起的劇烈局部炎癥反應(yīng)可能足以包括感染并預(yù)防菌血癥，盡管要付出損傷局部組織的代價(jià)。SS淋球菌比SR淋球菌產(chǎn)生顯著多量的補(bǔ)體衍生的趨化肽C5a
6(16)。這可引起SS淋球菌產(chǎn)生的多形核白細(xì)胞("PMN，，)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
淋病奈瑟球菌的抗生素抗性林的發(fā)展使得這種感染的控制越來越困難。不充分治療淋球菌感染的潛能加速了對(duì)抗淋球菌疫苗的需要。淋球菌感染，特別是PID的嚴(yán)重并發(fā)癥的預(yù)防已經(jīng)是許多研究人員的目標(biāo)。但是，正在進(jìn)行的研發(fā)有效抗淋球菌疫苗的努力遇到許多困難。
應(yīng)用病原體的個(gè)體表面成分作為常規(guī)疫苗的靶標(biāo)的嘗試未獲成功，這是由于它們的抗原變異性。菌毛疫苗只對(duì)同源菌林(用來生產(chǎn)菌毛疫苗)感染有保護(hù)性，Por接種甚至在人體實(shí)驗(yàn)攻擊中也未成功。另外，淋病奈瑟球菌表現(xiàn)明顯的表型不均一性， 一般以103個(gè)生物中>1的頻率從一種抗原形式向另一種變換(49, 50 )，這使該生物的表面成為大多數(shù)疫苗方案的移動(dòng)目標(biāo)。盡管疫苗候選林引起抗體應(yīng)答，但產(chǎn)生的抗體和免疫應(yīng)答沒有廣泛的保護(hù)性。
L0S是淋病奈瑟球菌的一種重要的毒力決定因素。有相當(dāng)多的證據(jù)支持L0S作為針對(duì)淋病奈瑟球菌表面的殺菌抗體的主要靶標(biāo)的作用(2, 16, 18， 37， 47)。 L0S抗體具有幾個(gè)重要的功能殺細(xì)菌活性、通過經(jīng)典或旁路補(bǔ)體途徑的補(bǔ)體激活(2)，和調(diào)理素活性(16)。另外，L0S被認(rèn)為是誘導(dǎo)對(duì)同源和異源淋球菌的功能性抗體應(yīng)答的最有效的淋球菌抗原(51)。
單克隆抗體("mAb" ) 2C7 (30)檢測(cè)在淋球菌臨床分離株中似乎廣泛保守和表達(dá)的L0S衍生寡糖("OS")表位。糖類一般是不依賴T細(xì)胞的抗原。當(dāng)作為免疫原單獨(dú)施用時(shí)，它們通常只引起初級(jí)抗體應(yīng)答。另外，寡糖較小(<10糖單位)(19),可能需要其它的生物化學(xué)衍生使它們有免疫原性。因此，這些寡糖作為疫苗候選物的用途在幾個(gè)方面受到限制。
曾提出在疫苗中使用內(nèi)影像(internal i歸ge)決定條(36 )。利用mAb技術(shù)能生產(chǎn)針對(duì)病原體上目的表位的保護(hù)性抗體(Abl )。能純化特定抗體(Abl)，隨后作為免疫原，用來產(chǎn)生可能是病原體上原始表位的內(nèi)影像的抗獨(dú)特型抗體(Ab2)。;f艮據(jù)Jerne "網(wǎng)絡(luò)"理論(23)預(yù)測(cè)，用抗初級(jí)抗體(Abl)抗原
疫應(yīng)答。產(chǎn)生的抗-抗獨(dú)特型抗體(或Ab3)應(yīng)當(dāng)能與最初的初級(jí)抗原反應(yīng)。如果初級(jí)抗原是一種寡糖(因此預(yù)計(jì)可引起不依賴T細(xì)胞的免疫應(yīng)答)，則用Ab2 (蛋白質(zhì)相當(dāng)物)免疫可引發(fā)T細(xì)胞依賴的應(yīng)答。
已經(jīng)證明mAb 2C7的抗獨(dú)特位在小鼠和兔中產(chǎn)生抗L0S抗體，它們與補(bǔ)體一起是殺淋球菌的，來自該抗獨(dú)特型抗體免疫的動(dòng)物的血清也支持人PMN的調(diào)理素吞噬作用(20)。
也已經(jīng)顯示，通過與抗命名抗原的特異性抗體結(jié)合模擬命名抗原的合成肽也能引發(fā)針對(duì)命名抗原的免疫應(yīng)答(29, 24， 54)。
具有對(duì)可用于預(yù)防淋病的藥劑的需要，目的在于預(yù)防淋球菌輸卵
管炎---種可能與衰老和慢性骨盆痛有關(guān)的感染、不育癥和異位妊
娠(42)。另一個(gè)重要目的是預(yù)防生物從感染但無癥狀的宿主向另一個(gè)免疫性伴侶傳播。這是重要的，因?yàn)槟行院团灾兴辛懿〔±南喈?dāng)一部分是無癥狀的，而無癥狀感染的、性活躍的人可能是大多數(shù)新的感染的主要來源。因此， 一種只降低有癥狀淋病的嚴(yán)重性的淋球菌疫苗能引起較高比例的無癥狀/有癥狀病例，因此，這種疫苗可能促進(jìn)淋病的擴(kuò)散，除非也防止傳播(41)。
發(fā)明概述
本發(fā)明通過提供在人血型抗原中不存在的淋病奈瑟球菌的廣泛保守寡糖表位的擬肽，普遍解決了上述問題。也提供了生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的擬肽的方法。
根據(jù)本發(fā)明的擬肽在預(yù)防淋病奈瑟球菌感染的方法和組合物中有用。
附圖簡述


圖1顯示mAb 2C7與大腸桿菌克隆結(jié)合的Western印跡分析。7個(gè)單獨(dú)的大腸桿菌克隆(PEP1-PEP7 ) ( SEQ ID N0S: 1-7 )在含有100Mg/ml氨節(jié)青霉素的IMC培養(yǎng)基中生長，然后誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。制備每一個(gè)克隆的細(xì)菌裂解物，加樣到14% SDS-PAGE凝膠中，電泳后，用Biorad電泳轉(zhuǎn)移裝置(Biorad, Hercules CA)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到Immobilon PVDF轉(zhuǎn)移膜上。該膜用mAb 2C7 (A)或抗-石充氧還蛋白抗體(B )探查。一個(gè)不能結(jié)合mAb 2C7的陰性克隆作為對(duì)照[SEQ ID NO: 9〗。
圖2顯示由能結(jié)合mAb 2C7的7個(gè)大腸桿菌克隆得到的擬肽序列。
圖3顯示mAb 2C7與表達(dá)擬肽融合的大腸桿菌克隆結(jié)合的FACS分析。大腸桿菌克隆在含有100pg/ml氨節(jié)青霉素的IMC培養(yǎng)基中生長，然后誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。細(xì)菌細(xì)胞用1M氐聚甲醛固定，然后用mAb2C7染色，隨后用FITC-偶聯(lián)的抗小鼠IgG染色。 一個(gè)不能結(jié)合mAb 2C7的陰性克隆作為對(duì)照[SEQ ID NO: 9]。大腸桿菌克隆下面的數(shù)字代表與對(duì)照相比，結(jié)合mAb 2C7的群體的熒光強(qiáng)度中值；括號(hào)中的數(shù)字表示群體中細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(總?cè)后w=100%)。
圖4顯示表達(dá)融合肽的大腸桿菌克隆對(duì)mAb 2C7結(jié)合LOS的抑制。大腸桿菌克隆在含有100jug/ml氨節(jié)青霉素的IMC培養(yǎng)基中生長，然后誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。大腸桿菌細(xì)胞與mAb2C7溫育30分鐘，之后加樣到LOS包被的平板上。 一個(gè)不能結(jié)合mAb 2C7的陰性克隆作為對(duì)照[SEQ ID N0:9]。數(shù)據(jù)代表至少2次實(shí)驗(yàn)(雙孔)的平均值。PEP1克隆顯示mAb 2C7與LOS結(jié)合的最大抑制(66%) [SEQ ID NO: 1] 。 PEP7、PEP3、 PEP4、 PEP2、 PEP6和PEP5顯示結(jié)合抑制分別降低[分別為SEQ IDNO: 7， 3， 4， 2， 6和5]。
圖5顯示含有共有序列(DE-GLF) [SEQ ID N0:8]的肽對(duì)mAb 2C7結(jié)合LOS的抑制。數(shù)據(jù)代表3次實(shí)驗(yàn)(雙孔)的平均值土SE。肽PEP1以劑量反應(yīng)的方式抑制mAb 2C7與LOS的結(jié)合。
圖6顯示mAb 2C7與多抗原肽("MAP" ) MAPI的結(jié)合。
圖7顯示多抗原肽對(duì)mAb 2C7結(jié)合L0S的抑制。
圖8顯示小鼠中八MAPl(octa-MAPl)誘導(dǎo)的IgG抗-LOS抗體應(yīng)答。(A) 8只小鼠在第0天接受在弗氏佐劑中乳化的劑量為50jug的八MAP1，并在第21天再次接受。(B) 4只小鼠用純化的LOS免疫作為陽性對(duì)照。小鼠用弗氏佐劑免疫(C)或無關(guān)的八MAP對(duì)照肽(D)免
疫作為陰性對(duì)照。
圖9顯示所有免疫小鼠中的IgG抗-LOS抗體應(yīng)答。顯示所有小鼠(包括不表現(xiàn)應(yīng)答的動(dòng)物)的IgG抗-L0S抗體應(yīng)答(平均值土SE )。
圖IO只顯示應(yīng)答小鼠中的IgG抗-L0S抗體應(yīng)答?？贵w應(yīng)答定義為高于0. 4jug/ml的IgG抗-LOS(平均值土SE)(高于基線IgG抗-L0S水平4倍)。小鼠用八MAP1、 L0S、單獨(dú)的弗氏佐劑或無關(guān)的八MAP對(duì)照肽免疫。誘生的IgG抗-LOS抗體水平以濃度對(duì)時(shí)間作圖。
圖ll只顯示應(yīng)答小鼠中的IgM抗-L0S抗體應(yīng)答。小鼠用八MAP1、L0S、單獨(dú)的弗氏佐劑或無關(guān)的八MAP對(duì)照肽免疫。誘生的IgG抗-L0S抗體水平以濃度對(duì)時(shí)間作圖。
圖12顯示暴露于小鼠免疫血清(67。/。[150iil總反應(yīng)體積中的100
度為17%體積百分比])的淋球菌15253林及其lgtG突變體(2C7表位陰性)的存活率。細(xì)菌實(shí)驗(yàn)用(A)抗15M3林(陽性對(duì)照)和15253lgtG林(陰性對(duì)照)的mAb 2C7小鼠進(jìn)行(4) 。 25ng/ml mAb 2C7
(150jul總反應(yīng)混合物體積中l(wèi)OOpl)介導(dǎo)100%的15253林殺傷，不殺死l5253 lgtG株。(B)正常小鼠血清(20只小鼠血清的合并，IgG抗-L0S抗體的平均濃度為0. 1 p g/ml )不能殺死任一林。(C )釆自八MAPI免疫的單只小鼠的血清(含有5, 05 n g/ml IgG抗-LOS抗體，由第卜11周采的血合并)對(duì)15253林顯示92%的殺傷率(8°/。存活)，而l5253 lgtG林全部存活。(D)采自L0S免疫的單只小鼠的血清(含有21.Mjug/ml IgG抗-L0S抗體，由第7-11周采的血合并)不殺死15253株(179%存活)和15253 lgtG林(133%存活)。用陰性對(duì)照抗原(E)單獨(dú)的弗氏佐劑或(F)無關(guān)的八MAP對(duì)照肽免疫的單只小鼠不殺死任一林。圖l2對(duì)照包括不含抗體的補(bǔ)體來源(15253林137. 9%±1. 0%存活(不殺傷)，15253 lgtG突變體132. 5%±14. 3%存活
(不殺傷))。
圖13顯示IgG抗-LOS抗體濃度對(duì)淋病奈瑟球菌15253林殺傷率的圖。來自八MAP1免疫的3只小鼠中每一只的IgG抗-L0S抗體水平 對(duì)細(xì)菌百分殺傷率作圖。含有1.38、 2. 50和5.05pg/ml抗-LOS抗體 的小鼠血清對(duì)15253林分別顯示31%、 74%和92%的殺傷率。mAb 2C7 的殺傷率在5個(gè)分別的LOS抗體濃度處顯示，作為陽性對(duì)照。
發(fā)明詳述
定義
在此使用時(shí)，"抗體"是含有各兩條免疫球蛋白輕鏈和重鏈的完 整的免疫球蛋白分子。因此，抗體包括IgA、 IgG、 IgE、 IgD、 IgM型 (及其亞型)的完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的輕鏈可以是K或 入型。
在此使用時(shí)，"單克隆抗體，，是最初由單個(gè)克隆的抗體形成細(xì)胞 產(chǎn)生的單特異性抗體。
在此使用時(shí)，"免疫預(yù)防有效的"是指在正常個(gè)體中誘導(dǎo)足以保 護(hù)該患者在一定時(shí)間免受淋病奈瑟球菌感染的免疫應(yīng)答的能力。
在此使用時(shí)，"肽"是指一種線性或環(huán)狀氨基酸鏈，長度一般為 至少4個(gè)、少于50個(gè)氨基酸。
在此使用時(shí)，"擬肽"是指顯示與已知表位類似的免疫抗體結(jié)合 圖的一種肽。
擬肽及其在根據(jù)本發(fā)明的組合物和方法中的應(yīng)用 本發(fā)明涉及可與針對(duì)淋病奈瑟球菌保守寡糖表位的抗體免疫特異 性反應(yīng)的擬肽，該寡糖表位在人血型抗原中不存在。這些擬肽能以類 似于如美國專利5, 476,784和6, 099,839 (均在此引用作為參考)所 述的抗獨(dú)特型抗體的方式使用，作為一種替代抗原，引發(fā)針對(duì)淋病奈 瑟球菌寡糖表位的T細(xì)胞依賴的免疫應(yīng)答。
可以對(duì)未感染的個(gè)體施用這種擬肽，以誘導(dǎo)針對(duì)淋球菌生物或攜 帶該寡糖抗原的細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答。這種免疫應(yīng)答在性質(zhì)上可能 是免疫預(yù)防的，因?yàn)楫?dāng)受體接觸淋球菌生物或攜帶該寡糖抗原的細(xì)胞時(shí)，它將預(yù)防感染。
為了鑒定候選擬肽，可以根據(jù)抗體結(jié)合特異性篩查隨機(jī)肽庫。這 種篩查技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知。在一種方法中，可以利用在大 腸桿菌鞭毛上表達(dá)的隨機(jī)肽庫鑒定能與淋病奈瑟球菌保守寡糖表位結(jié)
合的肽，該寡糖表位在人血型抗原中不存在。例如，可以測(cè)定與mAb 2C7 的結(jié)合來鑒定候選擬肽。結(jié)合可以用Western印跡、流式細(xì)胞分析或 通過固相ELISA對(duì)mAb 2C7結(jié)合L0S的竟?fàn)巵肀碚鳌?br> 也可以利用抗體建模確定抗獨(dú)特位的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中對(duì)應(yīng)于 目的表位的免疫原性位點(diǎn)。這種分析可以得到關(guān)于免疫原性位點(diǎn)的三 維構(gòu)象的信息，這在免疫原性位點(diǎn)的擬肽設(shè)計(jì)中有用。
一旦鑒定并測(cè)序特異擬肽，即可通過本領(lǐng)域周知的方法合成生產(chǎn) 該擬肽。
為了引發(fā)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，也可以利用半抗原、利用佐劑、將擬 肽與載體蛋白連接、利用多抗原肽、將擬肽與補(bǔ)體蛋白偶聯(lián)或通過本
領(lǐng)域周知的其它方法修飾擬肽。
本發(fā)明優(yōu)選的藥用組合物類似于用其它舦免疫人的組合物。本發(fā) 明的擬肽一般懸浮于治療用無菌鹽水溶液中。可以用其它方式配制藥 用組合物，以控制活性成分的釋放，或延長它們?cè)诨颊呦到y(tǒng)中的存在。 許多合適的藥物輸送系統(tǒng)已知，包括，例如可植入藥物釋放系統(tǒng)、 水凝膠、羥甲基纖維素、微膠嚢、脂質(zhì)體、微乳劑、小球體等。
本發(fā)明的藥用組合物可以通過任何合適的方法施用，例如經(jīng)口 、 鼻內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或腸胃外施用。 一般優(yōu)選靜脈 內(nèi)(i. v.)或腸胃外施用。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，免疫預(yù)防有效量的本發(fā)明的擬肽尤其 取決于施用日程、所施用的擬肽的單位劑量、擬肽是否與其它治療劑 結(jié)合施用、免疫狀態(tài)和患者健康、所施用的擬肽的治療活性和治療醫(yī) 生的判斷。
為了更好地理解本發(fā)明，列出了下列實(shí)施例。這些實(shí)施例只是為 了說明，不應(yīng)視作以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
12I.編碼可特異結(jié)合mAb 2C7的肽的克隆的鑒定
A. 隨機(jī)肽展示
用FliTrxTM隨機(jī)肽庫(Invitrogen， Carlsbad CA)在大腸桿菌表 面表達(dá)隨機(jī)序列的肽(12-mer)。將編碼該肽庫的DNA插入編碼石充氧 還蛋白活性環(huán)的基因中，該基因本身插入鞭毛基因的非必需區(qū)中。該 融合肽的表達(dá)受載體FliTrx 中噬菌體入主要左側(cè)啟動(dòng)子(P,)的控 制。在該系統(tǒng)中，通過加入色氨酸誘導(dǎo)P"當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)，融合蛋白輸出， 并在細(xì)菌細(xì)胞表面裝配為鞭毛，準(zhǔn)備展示該肽。
B. 可結(jié)合mAb 2C7的肽的篩選
FliTrxTM肽庫(1. 77xl()8初級(jí)克隆)在含有100 n g/ml氨節(jié)青霉素 的IMC培養(yǎng)基(0. 2% w/v酪蛋白氨基酸、0. 5% w/v葡萄糖、42mM Na2HP04、 22mM KH2P04、 8. 5mM NaCl、 18. 7mM NH4C1和ImM MgCl2)中25匸生長 過夜。通過加入L-色氨酸至終濃度為100jag/ml，誘導(dǎo)融合肽的表達(dá)， 培養(yǎng)物在251C下生長6小時(shí)。然后將誘導(dǎo)的肽融合文庫與2C7 mAb-包被的平板(20yg/ml)溫育。溫育1小時(shí)后，平板用含有l(wèi)OOyg/ml 氨芐青霉素和1% cc-曱基甘露糖苷的IMC培養(yǎng)基洗滌5次。通過機(jī)械 剪切或者通過與從淋球菌15"3林制備的純化LOS (已知mAb 2C7表 位在15253林中表達(dá))竟?fàn)?，洗脫結(jié)合的大腸桿菌，然后在25。C下生 長過夜。在第5輪淘洗后，洗脫結(jié)合的大腸桿菌，并在25"C下平板接 種于含有100 |i g/ml氨節(jié)青霉素的RMG瓊脂上(2% w/v酪蛋白氨基酸、 0. 5%w/v葡萄糖、42mM Na2HP04、 22mM KH2P04、 8. 5mMNaC1、18. 7mMNH4Cl、 lmMMgCl2和1. 5%瓊脂)。選擇個(gè)別菌落通過Western印跡測(cè)定與mAb 2C7的結(jié)合(一種分泌mAb 2C7的雜交瘤細(xì)胞系被美國模式培養(yǎng)物保 藏中心["ATCC，，]保藏，分配的ATCC保藏號(hào)為HB-11859 )。
用包被于Mmm組織培養(yǎng)板上的mAb 2C7對(duì)該文庫進(jìn)行5輪正選擇， 或者首先用無關(guān)的IgG3 (Sigma， St. Louis， M0 )進(jìn)行負(fù)選擇1小時(shí)， 之后用mAb 2C7繼續(xù)進(jìn)行5輪正選擇。
隨機(jī)選擇107個(gè)菌落，利用Western印跡篩查其結(jié)合mAb 2C7的能力。鑒定出14個(gè)可結(jié)合mAb2C7的克隆。然后從陽性克隆中制備質(zhì) 粒DNA，利用可與位于插入肽的核苷酸序列5'和3'側(cè)的區(qū)域結(jié)合的 引物測(cè)序。鑒定出7個(gè)獨(dú)特克隆，如圖l和圖2所示[SEQIDNOS:l-7]。
C. 流式細(xì)胞分析
陽性大腸桿菌克隆在含有100jig/ml氨節(jié)青霉素的IMC培養(yǎng)基中 25X:生長過夜，然后誘導(dǎo)表達(dá)融合肽6小時(shí)。大腸桿菌細(xì)胞在水上用 0. 5%低聚甲搭固定IO分鐘。固定生物的200 jul等份以2000xg離心 10分鐘。棄去上清液，將沉淀重懸浮于含有mAb 2C7的封閉緩沖液(含 有100jLig/ml氨節(jié)青霉素、1%脫脂奶粉、150mM NaCl和1% a-甲基 甘露糖苷的IMC培養(yǎng)基)中。懸液在37C下溫育30分鐘，之后以2000xg 離心IO分鐘。用100 iu 1洗滌緩沖液(含有100jLig/ml氨千青霉素和 1% a-甲基甘露糖苷的IMC培養(yǎng)基)洗滌沉淀，然后重懸浮于含有 FITC-偶聯(lián)的抗小鼠IgG (Sigma， St. Louis, M0)的100pl封閉緩 沖液中?；旌衔镌?7X:下溫育30分鐘，之后以2000xg離心IO分鐘。 棄去上清液，用100 ju 1洗滌緩沖液洗滌沉淀，之后重懸浮于lml PBS 中。應(yīng)用CellQuest軟件(Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ ) 在FACS上分析該懸液。 一個(gè)不能結(jié)合mAb 2C7的陰性克隆作為對(duì)照。
觀察到大腸桿菌細(xì)胞與fflAb 2C7的結(jié)合從大腸桿菌克隆PEP3、 PEP4、 PEP6、 PEP5、 PEP2、 PEP7到PEP1依次增強(qiáng)(根據(jù)焚光強(qiáng)度中 值，"MFI" ) [SEQ ID N0S:3， 4， 6, 5, 2， 7， 1]。大腸桿菌克隆 PEP1顯示與mAb 2C7的最大結(jié)合(MFI-19. 81，與對(duì)照MFI-4. 91相比), 如圖3所示[SEQ ID NO:l]。
D. 抑制ELISA
陽性大腸桿菌克隆在含有100 n g/ml氨節(jié)青霉素的IMC培養(yǎng)基中 25'C生長過夜，然后誘導(dǎo)表達(dá)融合肽6小時(shí)。將培養(yǎng)物標(biāo)準(zhǔn)化為相同 的OD讀數(shù)(OD6。。nm=0. 7 ),加入1%脫脂奶粉、150mM NaCl和1% ct-曱基甘露糖苷，以阻斷非特異性結(jié)合。50jal等份的每種培養(yǎng)液與50 li 1 mAb 2C7 (終濃度20ng/ml)在37X:下溫育30分鐘，然后將100 ju 1混合液加樣到用從15253林制備的純化LOS ( 80 u g/ml )包被的微量板的孔中。孔在37tl下溫育1小時(shí)，然后洗滌。洗滌孔后，用與堿 性磷酸酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG檢測(cè)結(jié)合的mAb 2C7。一種不能結(jié)合mAb 2C7 的陰性克隆作為對(duì)照。
PEP1克隆顯示mAb 2C7與L0S結(jié)合的最大抑制(66%) [SEQ ID NO:l]。 PEP7、 PEP3、 PEP4、 PEP2、 PEP6和PEP5顯示結(jié)合抑制分別降 低，如圖4所示[SEQ IDN0S: 7， 3, 4, 2, 6， 5]。抑制ELISA結(jié)果與 流式細(xì)胞分析結(jié)果相關(guān)，因?yàn)镻EP1也顯示與mAb 2C7的最大結(jié)合。大 腸桿菌細(xì)胞與mAb 2C7的結(jié)合與大腸桿菌克隆抑制mAb 2C7結(jié)合L0S 的降低大致相關(guān)。
II.可與mAb 2C7結(jié)合的合成擬肽
合成(Boston Biomolecules， MA )了序列對(duì)應(yīng)于共有序列"DE—GLF，， 并包含兩個(gè)半胱氨酸側(cè)翼區(qū)(分別位于N-端和C-端的CGP-和-GPC殘 基)的一種合成肽(PEP1; IPVLDENGLFAP),用來通過抑制ELISA評(píng) 估與2C7mAb的特異性結(jié)合，并確定表征為疏氧還蛋白-融合蛋白的擬 肽是否保留不依賴于融合內(nèi)容的抗原性[SEQ ID NO:IO]。
加入半胱氨酸側(cè)翼區(qū)，估計(jì)擬肽的環(huán)化是否影響抗體結(jié)合。在這 些擬肽中，半胱氨酸殘基允許在它們之間形成二硫鍵，產(chǎn)生環(huán)形擬肽。 這些構(gòu)象限定的肽可能更加類似于它們所模擬的表位，因此可能更具 免疫原性。
將這些肽在封閉緩沖液(1%卵白蛋白，0.05%吐溫20, 0.5MNaCl 在PBS中)中稀釋，產(chǎn)生不同濃度(O.l、 0.5、 lmg/ml)的混合液。 每一濃度的50jul等份與50jalmAb2C7 (貯存濃度為2pg/ml，在封 閉緩沖液中稀釋)在37TC下溫育1小時(shí)，然后將100 jil混合液加樣 到用從l5253抹中制備的純化L0S ( 80 ju g/ml )包被的微量板的孔中。 孔在37C下溫育1小時(shí)，然后洗滌。洗滌孔后，用與堿性磷酸酶偶聯(lián) 的抗小鼠IgG檢測(cè)結(jié)合的mAb 2C7。從淋球菌15253株中制備的純化 L0S作為陽性對(duì)照。上述隨機(jī)肽庫系統(tǒng)產(chǎn)生的非反應(yīng)性15-mer肽序列 作為陰性對(duì)照肽[SEQ ID N0:9]。PEP1以劑量反應(yīng)方式抑制mAb 2C7與LOS的結(jié)^<對(duì)于濃度為0. 1、 0. 5、 1. Omg/ml的PEP1,百分抑制分別等于17%、 77%、 91%)，如圖5 所示。對(duì)照15-mer肽合成為環(huán)肽(*CKSNPIHIIKNRRNIPC* ) [SEQ ID N0:9]。這種陰性對(duì)照肽不能抑制2C7mAb與純化LOS包被的平板的結(jié) 合。
利用本領(lǐng)域周知的方法，如上所述的環(huán)狀擬肽可進(jìn)一步含有一條 或多條"尾"，用于偶聯(lián)第二種試劑，如佐劑或栽體蛋白。
III.提高擬肽的免疫原性
盡管小肽可能有免疫原性，但幾次研究報(bào)道，某些小肽可能缺乏 免疫原性而引起無效的免疫應(yīng)答(特別是體液應(yīng)答)(3, 43)。已經(jīng) 應(yīng)用許多策略來提高小肽的免疫原性。包括將肽與載體蛋白連接(54， 28， 54)，將肽與佐劑組合(21， 22)，使用多抗原肽(MAP )提供可 能具有更強(qiáng)免疫原性的較大構(gòu)型的結(jié)構(gòu)(39)，將肽與補(bǔ)體蛋白偶聯(lián) 增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答(15)。 A.多抗原肽合成
多抗原肽(MAP )法是一種將擬肽與樹枝狀矩陣的賴氨酸殘基結(jié)合 的技術(shù)(44， 8， 43)。肽與賴氨酸構(gòu)架(scaffold)的氨基連接，產(chǎn) 生一個(gè)大分子，它在復(fù)合物表面提供高密度的希望的肽表位。這種方 法能增強(qiáng)對(duì)肽的免疫應(yīng)答(39， 40)。
合成了 PEP1的多抗原肽和對(duì)照肽(Boston Biomolecules， MA)， 并通過直接和抑制ELISA測(cè)定了與mAb 2C7的結(jié)合。
進(jìn)行固相ELISA評(píng)估m(xù)Ab 2C7與多抗原肽的結(jié)合。對(duì)于直接ELISA， 用多抗原肽(ljig/孔)包被Immulon 1平板過夜，并與不同濃度的 mAb2C7反應(yīng)。對(duì)于抑制ELISA，平板用從淋病奈瑟球菌15253林制備 的純化L0S ( 80 ju g/ml ) 37t:包被3小時(shí)。肽(線性或MAP )用封閉緩 沖液(l。/。卵白蛋白，0. 05%吐溫20， 0. 5MNaCl在PBS中)稀釋，產(chǎn)生 不同濃度的混合物。每一濃度的50jul等份與50m1 mAb 2C7 (li存 濃度為0, 4jLig/ml，在封閉緩沖液中稀釋)在37C下溫育1小時(shí)，然后將100m 1混合液加樣到微量板的孔中，孔在37tl下溫育1小時(shí)， 然后洗滌?？紫礈旌?，用與堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG檢測(cè)結(jié)合的 mAb 2C7。從淋球菌15253林中制備的純化LOS在抑制ELISA中作為陽 性對(duì)照。
含有4種線性PEP1分子("四MAPI")或8種線性PEP1分子("八 MAPI")的PEP1的多抗原肽形式顯示與mAb 2C7強(qiáng)烈結(jié)合，而對(duì)照 MAP在直接ELISA中不顯示結(jié)合，如圖6所示。四MAPI和八MAPI兩 者都比線性PEP1更強(qiáng)地抑制mAb 2C7與LOS的結(jié)合，如圖7所示。四 MAPI和八MAP1兩者的半數(shù)最大抑制(IC5。)分別在1.26iuM和0.23 jnM處觀察到。線性PEP1的I"為55uM。這可能是由于MAPI與mAb 2C7結(jié)合的親和力提高。對(duì)照MAP不顯示明顯的抑制。
在小鼠+用八MAPl免疫誘導(dǎo)IgG抗-L0S抗體應(yīng)答，如圖8所示。 反應(yīng)圖見圖8 (A)，其中沒有明顯的IgG抗-LOS抗體應(yīng)答，直到第3 周時(shí)加強(qiáng)，表明八MAP1在應(yīng)答小鼠中引發(fā)T細(xì)胞依賴的免疫應(yīng)答。這 些結(jié)果證明了用擬肽(如八MAP1)免疫人類對(duì)抗淋病奈瑟球菌感染的 預(yù)言。
在圖8(A)中，8只小鼠在第O天接受在弗氏佐劑中乳化的劑量 為50ug的八MAP1，并在第21天再次接受。模擬2C7寡糖表位的八 MAP1在8只小鼠的3只中誘導(dǎo)IgG抗-L0S抗體。這3只小鼠中的IgG 抗-L0S應(yīng)答在第3周的第一次加強(qiáng)后顯著升高，在第7周達(dá)到高f測(cè) 量的下一時(shí)間)，之后降低。圖8 (B)顯示陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其中4只 小鼠用純化的LOS免疫。在這些小鼠中，IgG抗-LOS效價(jià)在第一次免 疫后最低程度地增加，在加強(qiáng)后升高。用弗氏佐劑(C)或無關(guān)的八 MAP對(duì)照肽(D)免疫的4只小鼠(均為陰性對(duì)照)引起較弱的或沒有 IgG抗-LOS應(yīng)答。圖9顯示了所有免疫小鼠(來自圖8所示的實(shí)驗(yàn)) 的平均IgG抗-L0S抗體應(yīng)答(平均值土SE，包括不表現(xiàn)應(yīng)答的動(dòng)物)。
圖10只顯示了應(yīng)答小鼠(來自圖8所示的實(shí)驗(yàn))的IgG抗-L0S 抗體應(yīng)答?？贵w應(yīng)答被定義為高于0. 4 p g/ml的IgG抗-L0S (平均值 ±SE)(高于基線IgG抗-L0S水平4倍)。在初次免疫后的第7周和第10周，八MAP1免疫的應(yīng)答小鼠產(chǎn)生高于(p<0. 001)陰性對(duì)照抗原 (單獨(dú)的弗氏佐劑或無關(guān)八MAP對(duì)照肽)誘發(fā)的抗體水平的IgG抗-LOS 抗體水平。
圖11只顯示了應(yīng)答小鼠(來自圖8所示的實(shí)驗(yàn))的IgM抗-LOS 抗體應(yīng)答。用八MAP1免疫、已經(jīng)產(chǎn)生IgG抗-LOS應(yīng)答的小鼠不能對(duì) 比陰性對(duì)照抗原免疫的小鼠更高的IgM抗-LOS水平應(yīng)答。用LOS (陽 性對(duì)照)免疫產(chǎn)生比八MAP 1或陰性對(duì)照抗原(單獨(dú)的弗氏佐劑或無關(guān) 八MAP對(duì)照肽)免疫的動(dòng)物更高的IgM抗-LOS抗體水平。 來自八MAP1免疫的小鼠的血清對(duì)淋病奈瑟球菌15253林顯示2C7特異 性補(bǔ)體介導(dǎo)的殺細(xì)菌活性，如圖12所示。圖12顯示了一張圖，顯示 暴露于小鼠免疫血清(67%體積百分比的小鼠免疫血清終濃度)加上加
淋病奈瑟球菌15253林及其lgtG突變體(2C7表位陰性)的存活率。 15253抹顯示2C7表位。15253 lgtG林含有破壞的脂寡糖(LOS ) 葡糖基轉(zhuǎn)移酶G等位基因，該酶可將葡萄糖(通過ct鍵)轉(zhuǎn)移到LOS 核心中的庚糖-2上(4) 。 lgtG基因座的破壞導(dǎo)致2C7表位表達(dá)的喪 失。
進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌測(cè)定來評(píng)估小鼠血清中補(bǔ)體介導(dǎo)的殺細(xì)菌活性 (11)。在該測(cè)定中，在人補(bǔ)體(17%終體積)存在下，小鼠血清(67% 終體積)(來自如下所述免疫的或未免疫的不同小鼠)與懸浮于Morse A培養(yǎng)基(33)中的大約2. 5xl(T個(gè)細(xì)菌溫育。然后在37。C下連續(xù)振 搖反應(yīng)混合物30分鐘。在0時(shí)間和30分鐘時(shí)將反應(yīng)混合物的等份接 種到巧克力瓊脂平板上。存活率表示為30分鐘時(shí)比0分鐘時(shí)平板上菌 落的百分增加。測(cè)定中高于100%的存活率表明30分鐘溫育期間的生 長。
用mAb 2C7作為對(duì)照，因?yàn)樗c加入的補(bǔ)體一起能殺死淋病奈瑟 球菌15253林，但不能殺死15253 lgtG突變林。如圖12(A)所示， mAb 2C7對(duì)攜帶2C7表位的淋球菌具有殺細(xì)菌活性。25 ji g/ml mAb 2C7 (總體積150 iu 1反應(yīng)混合物中的100 jLi 1 )介導(dǎo)15253林的100%殺傷，采自八MAP1免疫的單只小鼠的血清(含有5. 05 jug/ml IgG抗-L0S 抗體，由第7-11周采的血合并)對(duì)15253林顯示92%的殺傷率(8%存 活)，而15253 lgtG林全部存活，如圖12 (C)所示。
代表20只小鼠血清的集合的正常小鼠血清(IgG抗-L0S抗體的平 均濃度為0. ljLig/ml)不能殺死任一種菌林，如圖12(B)所示。不含 補(bǔ)體的對(duì)照小鼠血清對(duì)15253林顯示116. 1%±4. 7%的存活率(不殺傷), 對(duì)15253 lgtG突變體顯示123. 1°/。±3. 5%的存活率(不殺傷)。不含抗 體的補(bǔ)體來源對(duì)15253林顯示137. 9%±1. 0%的存活率(不殺傷)，對(duì) 15253 lgtG突變體顯示132. 5%±14. 3%的存活率(不殺傷)。
采自L0S免疫的單只小鼠的血清(含有21. 98 u g/ml IgG抗-L0S 抗體，由第7-11周采的血合并)不殺死15253林(179%存活)和15253 lgtG林(133%存活)，如圖l2 (D)所示。從用單獨(dú)的弗氏佐劑或無 關(guān)八MAP對(duì)照肽作為陰性對(duì)照抗原免疫的單只小鼠中采集的血清不殺 死任一菌林，分別如圖12 (E)和圖12 (F)所示。
從八MAP1免疫的小鼠中獲得的IgG抗-L0S抗血清對(duì)淋病奈瑟球 菌15253林顯示濃度依賴的殺傷，如圖13所示。
圖13顯示IgG抗-L0S抗體濃度對(duì)淋病奈瑟球菌15253林殺傷率 的圖。當(dāng)來自八MAP1免疫的3只小鼠中每一只的IgG抗-L0S抗血清 水平對(duì)細(xì)菌殺傷率作圖時(shí)，得到劑量-反應(yīng)圖(含有1. 38、 2. 50和5. 05 jig/ml抗-L0S抗體的小鼠血清對(duì)15253林分別顯示31°/。、 74%和92% 的殺傷率)。也在5個(gè)分別的L0S抗體濃度處顯示mAb2C7的殺傷率， 作為陽性對(duì)照。
B.偶聯(lián)A擬肽與補(bǔ)體蛋白C3d
預(yù)計(jì)通過與補(bǔ)體因子C3d偶聯(lián)，能進(jìn)一步提高淋球菌表位的擬肽 (如此處所述的八MAP1)的免疫原性。
大量研究證明了補(bǔ)體蛋白C3在誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答中的重要作用 (1， 5， 14， 17， 25， 32， 34和35 ) 。 C3缺乏的小鼠對(duì)T細(xì)胞依賴 的蛋白質(zhì)抗原如匙孔戚血藍(lán)蛋白("KLH")顯示降低的抗體應(yīng)答(34，35 )。補(bǔ)體受體1- ( CR1或CD35 )和補(bǔ)體受體2- ( CR2或CD21)缺乏 的小鼠具有降低的T細(xì)胞依賴的抗體應(yīng)答(l， 14， 3"。進(jìn)一步表明， 與雞蛋溶菌酶("HEL")共價(jià)連接的C3d引起增強(qiáng)的對(duì)HEL抗原的抗 體應(yīng)答(15 )。由3個(gè)拷貝C3d和1個(gè)拷貝HEL組成的融合蛋白免疫 的小鼠使得抗-HEL抗體應(yīng)答比單獨(dú)用HEL免疫的小鼠的抗體應(yīng)答提高 10000倍。該融合蛋白誘導(dǎo)的抗-HEL抗體應(yīng)答比在弗氏佐劑中乳化的 HEL誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答約高100倍。
八MAPI能與C3d偶聯(lián)，方法是將八MAPI DNA序列克隆到C3d融 合蛋白盒中，并用該構(gòu)件轉(zhuǎn)化表達(dá)系統(tǒng)。八MAP1-C3d融合蛋白于是能 得到表達(dá)、純化并用作免疫原。此外，按照本領(lǐng)域周知的方法，八 MAPI-C3d基因融合也能以DNA的形式用作DNA疫苗。
產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體(其顯示與本發(fā)明的擬肽類似的免疫反應(yīng)性)的 雜交瘤的實(shí)例有1993年3月26日在ATCC ( 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 U.S.A.)保藏、分配ATCC 保藏號(hào)HB 11311的細(xì)胞培養(yǎng)物。
分泌mAb 2C7(其顯示與本發(fā)明的擬肽類似的免疫反應(yīng)性)的雜交 瘤2C7的實(shí)例有1995年3月9日在ATCC保藏的命名為2C7的細(xì)胞培 養(yǎng)物。該培養(yǎng)物分配ATCC保藏號(hào)HB-11859。
盡管我們?cè)谏衔闹幸呀?jīng)描述了本發(fā)明的許多實(shí)施方案，但顯然我 們的基本結(jié)構(gòu)能夠改變，以提供應(yīng)用本發(fā)明的方法和組合物的其它實(shí) 施方案。因此，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的范圍將由附加的權(quán)利要求書所限 定，而不是由上文中以實(shí)施例的方式描述的具體實(shí)施方案所限定。
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26序列表
<110> Rice, Peter
<120>保守淋球菌表位的擬肽及應(yīng)用它們的方法和組合物
<130> BOS-3
<140> 待分配
<141> 2000-10-27
<150> 60/162491
<151> 1999-10-29
<160> 10
<170> Patentln version 3.0
<210> 1
<211> 12
<212〉 PRT
<213〉 人工/未知
<220>
<221> 肽
<222> (1)…(12)
<223> 合成構(gòu)建體
<400> 1
lie Pro Val Leu Asp Glu Asn Gly Leu Phe Ala Pro 15 10
<210〉 2
<211> 12
-<212> PRT
<213〉 人工/未知
<220〉 <221> 肽 <222> (1)..(12)
<223〉合成構(gòu)建體
<400> 2
Trp Gly Leu Asp Tyr Glu Arg Gly Asn Tyr Glu Glu 15 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT <213>人工/未知<220>
<221> 肽
<222> (1).-(12) <223>合成構(gòu)建體
<400> 3
Asp Ala Leu Ala Val Asp Gin Met Gly Arg Phe Gly 15 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213〉 人工/未知
<220>
<221> 肽
<222> (1) (12)
<223> 合成構(gòu)建體
<400> 4
Val Leu Val Gly Glu Lys Gly Leu Phe Glu Gly Gly 15 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工/未知
<220>
<221> 肽
<222〉 (1) .. (12)
<223> 合成構(gòu)建體
<權(quán)> 5
Glu Ala Leu Val Leu Asp Thr Asn Gly Leu Met Ser 15 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT <213>人工/未知
<220> <221> 肽 <222> (1)..(12)
<223> 合成構(gòu)建體<400> 6
Ala Asp Arg Thr GJUi Gly Leu Gly Trp Gly Ala Ser 1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工/未知
<220>
<221> 肽
<222> (1) (12) <223>合成構(gòu)建體
<400> 7
Glu Glu Val Gly Ser lie Leu Tyr Gly Leu Gly Gly 1 5 10
<210〉 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工/未知
<220〉
<221> 肽
<222> (3) - - (3)
<223> X-任一氨基酸
<220>
<221> 肽
<222> (1>..(6)
<223〉 合成構(gòu)建體
<400> 8
Asp Glu Xaa Gly Leu Phe
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工/未知
<220>
<221> 狀
<222〉 (1) .- (17)
<223〉 合成構(gòu)建體<憎> 9
Cys
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工/未知
<220>
<221> 肽
<222> (1) .. (15)
<223> 合成構(gòu)建體
<400> 10
Cys Gly Pro lie Pro Val Leu Glu1 5
Asn Gly Leu Phe Gly Pro Cys10 15
lie Lys Asn Arg Arg Asn lie10 15
A
s
y
o
y p
c 權(quán)利要求
1.在人血型抗原上沒有發(fā)現(xiàn)的保守淋球菌表位的一種擬肽，其中該擬肽能在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)對(duì)該保守淋球菌表位的免疫應(yīng)答。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的擬肽，其中該擬肽的氨基酸序列包含序列DE-GLF。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l的擬肽，其中免疫應(yīng)答是T細(xì)胞依賴的。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的擬肽，其中該擬肽的氨基酸序列在每一端都含有半胱氨酸殘基。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的擬肽，其中通過該序列每一端的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵形成環(huán)肽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的擬肽，其中該擬肽還含有至少一條用于與第二種試劑偶聯(lián)的尾。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的擬肽，其中第二種試劑是一種佐劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的擬肽，其中該擬肽還含有一種佐劑或載體蛋白。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的擬肽，其中該擬肽是一種多抗原肽的一部分。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的擬肽，其中該擬肽與淋球菌L0S竟?fàn)幗Y(jié)合單克隆抗體2C7。
11. 一種擬肽，它可免疫特異性結(jié)合一種可與淋病奈瑟球菌的寡糖表位結(jié)合的抗體，該寡糖表位在人血型抗原中不存在。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的擬肽，其中該擬肽能與單克隆抗體2C7結(jié)合。
13. 根據(jù)權(quán)利要求ll的擬肽，其中該擬肽能結(jié)合通過用一種抗獨(dú)特型單克隆抗體免疫動(dòng)物產(chǎn)生的單克隆抗體，或其片段，它由具有ATCC保藏的HB 11311的特征的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
14. 根據(jù)權(quán)利要求ll的擬肽，其中該擬肽是一種多抗原肽的一部分。
15. —種用于對(duì)抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的組合物，其含有免疫預(yù)防有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-3、 5-7、 9或11-14任一項(xiàng)的擬肽，
16. —種用于對(duì)抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的組合物，其含有免疫預(yù)防有效量的擬肽，該擬肽具有SEQ ID N0:1的肽序列。
17. —種用于對(duì)抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的組合物，其含有免疫預(yù)防有效量的擬肽，該擬肽具有SEQ ID N0:2的肽序列。
18. —種用于對(duì)抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的組合物，其含有免疫預(yù)防有效量的擬肽，該擬肽具有SEQ ID N0:3的肽序列。
19. 一種用于對(duì)抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的組合物，其含有免疫預(yù)防有效量的擬肽，該擬肽具有SEQ ID N0:4的肽序列。
20. —種用于對(duì)抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的組合物，其含有免疫預(yù)防有效量的擬肽，該擬肽具有SEQ ID N0:5的肽序列。
21. —種用于對(duì)抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的組合物，其含有免疫預(yù)防有效量的擬肽，該擬肽具有SEQ ID N0:6的肽序列。
22. —種用于對(duì)抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的組合物，其含有免疫預(yù)防有效量的擬肽，該擬肽具有SEQ ID NO: 7的肽序列。
23. —種用于對(duì)抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的組合物，其含有免疫預(yù)防有效量的擬肽，該擬肽具有SEQ ID N0:10的肽序列。
24. —種用于免疫哺乳動(dòng)物對(duì)抗淋病奈瑟球菌感染的方法，其包括對(duì)該哺乳動(dòng)物施用免疫預(yù)防有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的擬肽和藥學(xué)可接受的載體的步驟。
25. —種用于免疫哺乳動(dòng)物對(duì)抗淋病奈瑟球菌感染的方法，其包括對(duì)該哺乳動(dòng)物施用免疫預(yù)防有效量的根據(jù)權(quán)利要求11-14任一項(xiàng)的擬肽和藥學(xué)可接受的載體的步驟。
26. 根據(jù)權(quán)利要求1或11的擬肽，其中該擬肽與一種補(bǔ)體蛋白偶聯(lián)。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26的擬肽，其中該擬肽與補(bǔ)體蛋白C3d偶聯(lián)。
28. —種用于免疫哺乳動(dòng)物對(duì)抗淋病奈瑟球菌感染的方法，其包括對(duì)該哺乳動(dòng)物施用免疫預(yù)防有效量的根據(jù)權(quán)利要求27的擬肽和藥學(xué)可接受的栽體的步驟。
29. —種用于對(duì)抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的組合物，其含有免疫預(yù)防有效量的根據(jù)權(quán)利要求27的擬肽。
30. —種提高根據(jù)權(quán)利要求1或11的擬肽的抗原性的方法，包括將該擬肽與一種補(bǔ)體蛋白偶聯(lián)的步驟。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中該補(bǔ)體蛋白是C3d。
全文摘要
本發(fā)明涉及淋病奈瑟球菌的保守淋球菌表位的擬肽，該表位在人血型抗原上沒有發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明也涉及應(yīng)用這些擬肽預(yù)防淋病傳染的方法和組合物。
文檔編號(hào)A61K39/00GK101638433SQ20091013689
公開日2010年2月3日 申請(qǐng)日期2000年10月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月29日
發(fā)明者尤達(dá)馬斯·恩加姆佩蘇達(dá)多, 彼得·A·賴斯, 薩尼塔·古拉蒂 申請(qǐng)人:彼得·A·賴斯;尤達(dá)馬斯·恩加姆佩蘇達(dá)多;薩尼塔·古拉蒂