專利名稱：具有免疫刺激作用的可食用產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本本發(fā)明涉及可食用產(chǎn)品。更特別地，本發(fā)明涉及具有免疫刺激作用的可食用 產(chǎn)品，尤其是含有免疫刺激多糖的可食用產(chǎn)品，所述免疫刺激多糖是可以從多年生開花 (perennial flowering) MM (Alliaceae)才直―H白勺。
背景技術(shù)：
大多數(shù)成人每年會(huì)得兩次到五次感冒，嬰兒和學(xué)前兒童平均為四到八次。上呼吸 道(URT)感染如傷風(fēng)和流感連同胃腸(GI)感染是缺席工作或缺席上學(xué)的最重要理由。在 一生75年中，我們平均起來(lái)遭受超過(guò)200次普通感冒發(fā)作。這意味著如果每次感冒持續(xù)五 到七天，那么在我們的生命中我們花費(fèi)大約三年由于感冒的咳嗽和打噴嚏。因此，消費(fèi)者高 度需要和感興趣對(duì)這些急性感染的"自我預(yù)防"和"自我治療"。功能性食品成分領(lǐng)域的最近的興趣是使用免疫調(diào)節(jié)劑用于增強(qiáng)宿主防御應(yīng)答例 如提供抵抗普通感冒的更多保護(hù)。宿主防御應(yīng)答的重要部分是天然免疫系統(tǒng)。免疫系統(tǒng) 的天生性武器是迅速激活的抵抗病原體的首道防御。其中，它包括吞噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì) 胞(NK)。吞噬細(xì)胞例如嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可以產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygenspecies) (ROS)以殺死病原體例如真菌、細(xì)菌和病毒感染細(xì)胞。NK細(xì)胞可以殺死喪 失MHC類別I或者表達(dá)不充足量MHC類別I (這是腫瘤或病毒感染細(xì)胞中常見的事件)的 靶細(xì)胞。已知某些可食用產(chǎn)品或者食品具有免疫刺激性能。例如US-A-2005/0002962公 開了植物黑色素制劑例如紫錐花屬(Echinacea)、西洋參(American ginseng)、黑胡桃、綠 茶、銀膠菊(Partheniumintegrifolium)、高麗參、苜蓿芽、姜、白毛茛、紅三葉草、蒲公英、 黑升麻、甘草、甘菊、水飛雉、苜蓿、問(wèn)荊、黃芪、雷公根(gotu kola)、小白菊、纈草、山楂、迷 迭香、沙巴棕麻黃、巴西凈血樹(pau d' arco)、銀杏、蒜、貫葉連翹、雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)(常見的蘑菇)、雙孢子蘑菇褐色株(波塔貝拉(portabella)蘑菇)、香菇(什塔 克(shiitake)蘑菇)或者美味牛肝菌(Boletus edulis)(波爾奇尼(porcini)蘑菇)作 為免疫刺激組合物。Josling(2001)公開了含蒜素的蒜補(bǔ)充物可以防止健康的人志愿者免于普 通感冒(Josling(2001)Preventing the common cold with a garlicsupplement :a double-blind, placebo controlled survey。Advances inTherapy 18:189193)。蔥屬植 物例如蒜和洋蔥中存在的主要生物活性物質(zhì)是有機(jī)硫化合物例如蒜素，占蒜中有機(jī)硫化合 物總量的65到75%。一直需要新的或可替換的具有這類免疫刺激性能的食品。因此，本發(fā)明的一個(gè)目 的是提供這樣的可食用產(chǎn)品。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供用于制備這類具有這類免疫刺激 性能的食品的方法。意外地發(fā)現(xiàn)通過(guò)本發(fā)明的可食用產(chǎn)品可以實(shí)現(xiàn)該目的，該可食用產(chǎn)品包含免疫刺 激多糖，所述免疫刺激多糖是可以從多年生開花蔥科植物獲得的。
科技文獻(xiàn)公開了青蔥(greenonion) (Allium fistulosum)或者蒜(大蒜(Allium sativum))的冷水提取物兩者都具有抗炎的活性。這是基于脂多糖(LPS)激活巨噬細(xì) 胞對(duì)一氧化氮(NO)產(chǎn)生的抑制作用(Tsai TH, Tsai PJ, Ho SC(2005)Antioxidant and anti-inflammatory activities ofseveral commonly used spices)。然而，從來(lái) 有公 開過(guò)來(lái)自多年生開花蔥科植物的多糖的免疫的刺激性能。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了具有免疫刺激作用的可食用產(chǎn)品，所述產(chǎn)品含有 免疫刺激多糖，所述免疫刺激多糖是可以從多年生開花蔥科植物獲得的。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了用于制備本發(fā)明可食用產(chǎn)品的方法。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了組合物，其包含0.0001到25重量％的多糖，所述 多糖具有免疫刺激作用和具有> 3的平均聚合度。發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及包含多糖的可食用產(chǎn)品，所述多糖引起免疫刺激作用。 用于本產(chǎn)品的多糖可以源自于屬于多年生開花蔥科植物的植物。蔥科是一科草本多年牛開花棺物。它們是單子葉棺物,Asparagales目的一部分。 該科已經(jīng)被廣泛但非普遍識(shí)別；過(guò)去，所包括的植物常常被認(rèn)為屬于百合科(Liliaceae), 甚至是被某些植物學(xué)家。最重要的屬是蔥屬(Allium)，其包括若干重要的食用棺物包括洋蔥(洋 蔥(Allium c印a))、細(xì)香蔥(細(xì)香蔥(A. schoenoprasum)) > M (大蒜(A. sativum)禾口 A. scordoprasum)禾Π韭菜(韭蔥(A. porrum))。根據(jù)本發(fā)明，免疫刺激多糖優(yōu)選來(lái)自于蔥屬植物。特別優(yōu)選的是植物選自蔥 屬包括洋蔥(洋蔥(Allium cepa))、細(xì)香蔥(細(xì)香蔥(A. schoenoprasum))、蒜(大蒜 (A. sativum)和A. scordoprasum)和韭菜(韭蔥(A. porrum))。洋蔥和蒜是特別優(yōu)選的。可 以從蔥科植物分離免疫刺激多糖，通過(guò)包括下列的方法收獲植物、切碎植物特別是球莖、 勻漿或搗碎植物材料并將其(冷凍)干燥以形成干粉。隨后，用熱水優(yōu)選沸水對(duì)干粉進(jìn)行 提取，并(冷凍)干燥提取物。通過(guò)在80°C使用利用85%乙醇的兩個(gè)額外清洗步驟可以制 備多糖富集的提取物。免疫刺激多糖的特征可以在于它們的平均聚合度為> 3，優(yōu)選> 5，更優(yōu)選> 7，最 高達(dá)到1，000。根據(jù)本發(fā)明的可食用產(chǎn)品可以采取任何外形。特別地，它可以是液體或者可涂抹 的、可以以匙舀起的固體或者食品補(bǔ)充物。優(yōu)選產(chǎn)品是液體產(chǎn)品?？墒秤卯a(chǎn)品可以適當(dāng)?shù)夭扇±缦铝行问綔?、飲料、醬 (spread)、佐料(dressing)、甜品或者美乃滋(mayonnaise)。更優(yōu)選，可食用產(chǎn)品是飲料、 甜品或者醬。更優(yōu)選，可食用產(chǎn)品是飲料或者醬，尤其是水包油型乳劑形式的醬。本文中所 使用術(shù)語(yǔ)"醬(spread)“包括可涂抹的產(chǎn)品例如人造黃油、基于可涂抹的乳酪的產(chǎn)品和加 工干酪。最優(yōu)選，本產(chǎn)品是飲料。這樣的飲料典型地包含至少60wt%水和0-20wt%分散的 脂肪。優(yōu)選，這樣的飲料包含至少70wt%水和0-10wt%分散的脂肪。本文所使用的術(shù)語(yǔ)"免疫刺激"的意思是免疫系統(tǒng)的防御自身抵抗病原體例如真菌、細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、寄生蟲或者蛋白質(zhì)的活性或者能力得到提高。因此，免疫刺激 有助于增強(qiáng)人體的自然防護(hù)。若干試驗(yàn)可用于鑒定可以改變免疫性的組分。本發(fā)明人選擇 使用吞噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK)以幫助鑒定免疫刺激化合物，因?yàn)檫@些細(xì)胞是天然免 疫系統(tǒng)的一部分，其迅速地激活非特異性首道抵抗病原體的防御。吞噬細(xì)胞例如嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可以產(chǎn)生活性氧簇(ROS)以殺 死病原體例如真菌和細(xì)菌。成分對(duì)噬菌活性的作用可以在離體利用健康人志愿者的新鮮血 液與FITC標(biāo)記的大腸桿菌細(xì)菌溫育后進(jìn)行測(cè)量。吞噬細(xì)胞在粒細(xì)胞群中的百分比可以通 過(guò)流式細(xì)胞術(shù)確定。典型地，將結(jié)果根據(jù)脂多糖(LPS)的作用進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，其中脂多糖是眾 所周知的有效的免疫刺激參考化合物。在本發(fā)明中，> 40%的標(biāo)準(zhǔn)化吞噬粒細(xì)胞百分比被 認(rèn)為是顯著的免疫刺激作用。NK細(xì)胞可以殺死喪失MHC類別I或者表達(dá)不充足量MHC類別I (這是腫瘤或病毒 感染細(xì)胞中常見的事件)的靶細(xì)胞。成分對(duì)NK細(xì)胞活性的作用可以離體利用外周血單核細(xì) 胞(PBMC)進(jìn)行測(cè)量，其中所述外周血單核細(xì)胞分離自健康人志愿者的新鮮血液。在將PBMC 與成分預(yù)溫育后，通常添加預(yù)標(biāo)記的K562靶細(xì)胞，并在后續(xù)溫育之后可以添加碘化丙啶用 于檢測(cè)死細(xì)胞。死的靶細(xì)胞百分比可以利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行確定。典型地，將結(jié)果根據(jù)白 介素-2 (IL-2)的作用進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，其中白介素_2是眾所周知的有效的NK細(xì)胞刺激參考化 合物。在本發(fā)明中，> 17%的標(biāo)準(zhǔn)化NK細(xì)胞活性百分比被認(rèn)為是顯著的免疫刺激作用。根據(jù)本發(fā)明的可食用產(chǎn)品優(yōu)選包括其他營(yíng)養(yǎng)素、維生素和礦物質(zhì)以遞送有益健康 的營(yíng)養(yǎng)。適當(dāng)?shù)木S生素和礦物質(zhì)包括但是不局限于維生素A、維生素D、維生素E、維生素C、 硫胺素、核黃素、煙酸、維生素B6、葉酸、維生素B12 (氰鈷胺素)、生物素、泛酸、鈣、磷、鉀、 鐵、鋅、銅、碘、硒、鈉、鎂、錳、鉬、維生素K、鉻和其混合物。遞送維生素和礦物質(zhì)的優(yōu)選成分 包括但是不局限于磷酸鉀、磷酸鈣、氧化鎂、磷酸鎂、抗壞血酸、抗壞血酸鈉、維生素E乙酸 酯、煙酰胺、正磷酸鐵、泛酸鈣、氧化鋅、葡萄糖酸鋅、維生素A十六酸鹽、鹽酸吡哆醇、核黃 素、硫胺素一硝酸酯、生物素、葉酸、氯化鉻、碘化鉀、鉬酸鈉、硒酸鈉、phytonadond維生素 K)、膽鈣化醇(維生素D3)、硫酸錳和其混合物。優(yōu)選，本發(fā)明的產(chǎn)品包含至少10%或更多 的推薦日總量(“RDA")的維生素和礦物質(zhì)。本發(fā)明的產(chǎn)品可以進(jìn)一步包括肉、魚、肉和魚提取物、水果、干果、水果濃縮物、水 果提取物、果汁、茶(例如綠茶)、蔬菜、蔬菜提取物和濃縮物、堅(jiān)果、堅(jiān)果提取物、巧克力、面 包、醋、鹽、胡椒、可可粉、藥草(例如歐芹)、藥草提取物、香料(例如肉桂)、香料提取物、乳 化劑、酸性調(diào)節(jié)劑(例如磷酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸和其鹽)、類黃酮、防腐劑(例如乳酸、 EDTA、生育酚、苯甲酸鈉)、顏料(例如β-胡蘿卜素、番茄紅素、焦糖、胭脂紅)、纖維(例如 大豆)、膨松劑(例如碳酸氫鈉)、果膠、檸檬酸、酵母、鹽、甘油和其混合物。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明的可食用產(chǎn)品是通過(guò)將免疫刺激多糖添加至食品 例如在生產(chǎn)工藝期間而制備的。本發(fā)明的進(jìn)一步方面是獲得具有免疫刺激作用多糖的方法。基于植物的多糖由下 列組成大的不溶聚合物如細(xì)胞壁組分，小的可溶性寡糖如單體(例如葡萄糖)和二聚物 (例如纖維二糖)和大的可溶性多糖。特別地，預(yù)期從后者產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答，因?yàn)樗鼈冏?夠大的以引起免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，并且溶解度是相互作用的必要條件。為了富集基于植物的 材料的可溶性多糖，可以除去小的寡糖。這通常是通過(guò)重復(fù)溫醇(85%)清洗步驟完成的(Shiomi，N.，1992. New Phytologist 122，pp. 421-432.)，因?yàn)樾」烟窃诖妓芤褐芯哂幸?定溶解度，而聚合物則是不可溶的。隨后，將熱水提取應(yīng)用于殘余物以分離水溶性聚合物， 并將其從不溶性多糖中分離。在該步驟中，還除去了其他水不溶性組分。為了檢驗(yàn)糖類分 離的成功，測(cè)定全部糖類含量，其使用Dubois方法(Dubois Μ. et al, (1956)Colorimetric method for determination of sugars and related substances,Analytical Chemistry, 28 (3)，350-356)。對(duì)成功除去小寡糖的首次大致的觀察是通過(guò)平均聚合度獲得的，其中所 述平均聚合度是通過(guò)將在糖類還原性端基所得到的分析結(jié)果(DNSA方法)與通過(guò)Dubois 方法測(cè)定的糖類總含量進(jìn)行比較而測(cè)定的。小寡糖(例如單和二糖)的成功除去將給出高 平均DP值(例如至少高于2)。更精確的路線是通過(guò)尺寸排阻色譜法測(cè)定富集提取物的分 子量分布。本發(fā)明的進(jìn)一步方面是組合物，其包含0. 0001到25襯％的可從蔥科植物獲得的 并具有免疫刺激作用的多糖，所述多糖具有> 3、優(yōu)選> 5、更優(yōu)選> 7最高達(dá)到1，000的平 均聚合度。通過(guò)下列實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。在附圖中

圖1顯示5g/l多糖富集的蔥科 (蒜，A)提取物的尺寸排阻色譜，圖2顯示5g/l多糖富集的紅色洋蔥(red onion)⑶提取 物的尺寸排阻色譜，圖3顯示多糖富集的蒜提取物對(duì)人PBMC的自然殺傷細(xì)胞(NK)活性的 作用，圖4顯示多糖富集的紅色洋蔥對(duì)人PBMC的自然殺傷細(xì)胞(NK)活性的作用，圖5顯示多糖富集的蒜提取物對(duì)新鮮人血樣吞噬活性的作用，和圖6顯示多糖富集的紅色洋蔥提取物對(duì)新鮮人血樣吞噬活性的作用。實(shí)施例1用于獲f導(dǎo)可I用組合4勿白射是耳又稈序，所述可I用組合4勿包含富集白化蔥禾射是耳又 物(A 蒜，B 紅餼洋蔥)如下獲得多糖富集的蔥科提取物將25g蒜粉末(從StarwestBotanical Item#205230-51 獲得)或者紅色洋蔥(從 Euroma "vriesdroogrode ui” 獲得)用 200ml 85%乙醇(VWR Prolabo)水溶液在80°C清洗兩次持續(xù)2. 5小時(shí)，再用200ml 85%乙醇水溶 液在80°C清洗一次持續(xù)1.5小時(shí)。棄掉乙醇后，在熏柜(fuming cabinet)中干燥沉淀過(guò) 夜。通過(guò)加入200ml MilliQ水并煮沸3小時(shí)而提取多糖。室溫(RT)下2，OOOg離心20分 鐘后，將沉淀重懸浮在200ml MilliQ水中，并再煮沸3小時(shí)。收集第一和第二次提取的上 清液，凍干并在室溫下保存。從多糖富集的凍干提取物，制備在LAL水中的2% (m/m)懸浮 液，并在121°C高壓蒸氣滅菌15分鐘。將懸浮液在RT下2000g離心30分鐘。將上清液過(guò) 濾通過(guò)0. 2 μ m濾器，分成小份，并在_20°C下保存，直到在免疫檢驗(yàn)中使用。實(shí)施例2可ι用組合4勿的分析表征，^f^.πτ^μffl^m^^m^mmMMmim(A 蒜，B 紅餼洋蔥1糖類的定量根據(jù)Dubois方法測(cè)量樣品中糖類的總量(見上)。將50 μ 1測(cè)試樣品或標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(0-0. 3g/l葡萄糖)與20 μ 1 6g/l間苯二酚 (Aldrich)以及90 μ 1純H2SO4P. a. (Merck)混合。在80°C溫育20分鐘后，測(cè)量450nm處的 消光。通過(guò)葡萄糖校準(zhǔn)曲線的線性回歸計(jì)算糖類的量。
測(cè)定單糖組成將10g/l可食用組合物的溶液(該組合物含有多糖富集的蒜粉末(A)或紅色洋蔥 (B)提取物)用2M HCl水解以獲得單糖。水解是通過(guò)下列進(jìn)行的添加0. 2毫升37%鹽酸 至1毫升溶液中得到2M HCl的最終濃度，之后充分地混合和在95°C下在預(yù)熱水浴中溫育6 小時(shí)。在該溫育后，溶液冷卻降至RT，并在15600xg下離心10分鐘。利用IOM NaOH將上 清液的PH調(diào)節(jié)至3和7之間的pH，過(guò)濾除菌(0. 45微米)，并將0. 5毫升置于1毫升HPLC 小瓶中用于分析(LC-10AT，Shimadzu，日本)。注射兩種單糖樣品(10 μ 1)。為了校準(zhǔn)，注 射單糖(10 μ 1 lg/1濃度的溶液)(全部購(gòu)自Sigma-Aldrich)，使用自動(dòng)注射器SIL-10AD， Shimadzu,日本。硫酸(5mM, ρΗ2· 0)用作洗脫液和 Aminex ΗΡΧ_87Η(300χ 7. 8 毫米)柱在 65°C的溫度下以及0. 6毫升/分鐘的流速使用。使用二重確定折射率(RID-10A，Shimadzu， 日本)和UV 220納米和280納米(SPD-10A, Shimadzu,日本)。根據(jù)利用單糖的校準(zhǔn)，確定 存在于水解樣品中的單糖組成。聚合度的確定牛艮據(jù) Bernfeld(Bernfeld et al(1955)Amylase alpha and beta. Methodsin Enzymology, 1,149-158)方法測(cè)量樣品中多糖的分子數(shù)量。通過(guò)在60°C下，將1克DNSA溶 解在20毫升2M NaOH和50毫升水中制備3，5- 二硝基水楊酸(DNSA)試劑。獲得透明溶 液后，添加30g酒石酸鈉鉀，并調(diào)節(jié)體積到100毫升。將150 μ 1試驗(yàn)樣品或標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品 (0-25mmol/l葡萄糖)與150 μ IDNSA試劑混合。將三份50 μ 1樣品DNSA試劑混合物加到 96孔板。在80°C下加熱30分鐘并冷卻至室溫后，添加100 μ 1水，并測(cè)量相對(duì)于空白的540 納米處的吸光度。通過(guò)利用葡萄糖的校準(zhǔn)曲線的線性回歸計(jì)算多糖的分子數(shù)量。通過(guò)將糖類的量(g/kg樣品)除以分子數(shù)量(mol/kg樣品)，確定平均分子量(g/ mol) ο分子量分布的確定利用制備型尺寸排阻層析進(jìn)行分子量的分布，所述制備型空間排阻層析由具 有 P900 泵和 UV900 檢測(cè)器的 Acta explorer (GE Healthcare，瑞典)執(zhí)行。S印hacryl S200HR 被包裝在 XK100/1. 6 柱中，根據(jù)廠家指導(dǎo)(GEHealthcare note 52-2086-00)，利用 D-PBS (沒(méi)有 CaCl2 和 MgCl2) (GIBC0 BRL)作為緩沖劑，pH = 7. 0。利用D-PBS緩沖劑(沒(méi)有CaCl2和MgCl2)以流速1毫升/分鐘對(duì)柱進(jìn)行平衡。將 2毫升樣品或標(biāo)準(zhǔn)以流速0. 5毫升/分鐘裝載，并以0. 5毫升/分鐘進(jìn)行等度洗脫。對(duì)于80kD、50kD、25kD、12. 5kD、5kD和IkD的右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)，使用lg/Ι的濃度。對(duì)于多糖富集的蒜(A)或紅色洋蔥(B)提取物，使用在緩沖劑中的5g/l。收集在 樣品洗脫期間65毫升和180毫升之間的4. 8毫升級(jí)分。根據(jù)Dubois方法測(cè)量級(jí)分中糖類 的數(shù)量?？搔捎媒M合4勿(^^m^mm^(Α)或紅代祥蔥(B) mm)的表征可食用組合物(包含多糖富集的蒜(A)或紅色洋蔥(B)提取物)的糖類總數(shù)量， 單糖組成，聚合度和蛋白含量示于表1中。多糖富集的蒜(A)或紅色洋蔥(B)提取物的分 子量分布示于圖1和2中。提取物A的組成經(jīng)鑒定為高于95%的糖，不同的單糖(主要是 葡萄糖)，< 5%的可忽略水平蛋白質(zhì)，以及> 200的平均聚合度。提取物B，PS富集的紅色 洋蔥提取物的組成經(jīng)鑒定為糖類在64%和87%之間的范圍內(nèi)，同樣如同提取物A具有高水平的葡萄糖和未鑒定的糖，但是量不同，總蛋白在19 24%之間的范圍內(nèi)，平均聚合度為 6.9。通過(guò)尺寸排阻色譜，還清楚的是與紅色洋蔥提取物(在5kD和12kD之間)相比，酸提 取物的分子量分布在較高M(jìn)W處成峰(在50和12. 5kD之間)。兩種提取物都還含有少量的 高分子量寡糖(> 80kD)。表 1可食用組合物(包含多糖富集的蒜(A)或紅色洋蔥(B)提取物)的表征 實(shí)施例3多糖富集的蔥科提取物(Α 蒜，Β -Μ^ΜΜ )的自然殺傷細(xì)朐,(NK) mmim自然殺傷細(xì)胞(NK)活性的測(cè)定在肝素鈉管中從健康的志愿者獲得新鮮血液，并通過(guò)利用Ficoll-Paque的密度 梯度離心從血液分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。對(duì)PBMC進(jìn)行計(jì)數(shù)，并再懸浮在組織培養(yǎng)基 RPMI 1640 Complete中，濃度為5xl06個(gè)細(xì)胞/毫升，并在4°C儲(chǔ)備直到在流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞 毒性檢驗(yàn)中用作效應(yīng)細(xì)胞。赤型骨髓性白血病細(xì)胞系K562，一種NK敏感細(xì)胞系被用作靶細(xì) 胞。用PBS清洗K562細(xì)胞，計(jì)數(shù)和再懸浮在PBS中(濃度為5xl06個(gè)細(xì)胞/毫升)，之后在 5% CO2 37°C下用Iyg/毫升的染料羧基熒光素雙乙酸酯琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE)標(biāo)記30 分鐘。標(biāo)記后，利用PBS清洗細(xì)胞和再懸浮在RPMI Complete中(濃度為IOxIO4個(gè)細(xì)胞/ 毫升)，在黑暗中4°C下儲(chǔ)備直到使用。在37 0C (5 % CO2)，將PBMC與成分(一式三份)預(yù)溫育30分鐘。對(duì)照溫育由 PBS ( = NK細(xì)胞活性的基礎(chǔ)水平)或800IU/毫升白介素-2(IL-2)(=陽(yáng)性對(duì)照樣品)(平均數(shù)士sd，一式三份)組成。與成分預(yù)溫育后，添加靶細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞的比例= 25 1)并且在37°C (5% CO2)溫育120分鐘。在溫育以后、將細(xì)胞置于冰上持續(xù)1 5分 鐘后，添加碘化丙啶用于檢測(cè)死細(xì)胞。在Coulter FC500 MPL流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter， Miami,Fl,USA)上測(cè)量自然殺傷細(xì)胞活性。收集至少1000靶細(xì)胞的數(shù)據(jù)并且使用EXPO 32 程序分析。測(cè)定死亡靶細(xì)胞的百分比。將結(jié)果根據(jù)I L-2的作用進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。蔥科對(duì)NK細(xì)胞活件的調(diào)節(jié)在NK細(xì)胞活性檢驗(yàn)中以三種不同的濃度(0. 4-4-40 μ g/ml)測(cè)試包含多糖富集的 蒜提取物(A)的可食用組合物。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖3中。在NK細(xì)胞活性檢驗(yàn)中以四種 不同的濃度(0.4-4-40-400 μ g/ml)測(cè)試包含多糖富集的紅色洋蔥提取物(B)的可食用組 合物。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖4中。結(jié)果表示為利用每種樣品一式兩份進(jìn)行的一個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。NK細(xì)胞 活性報(bào)道為白介素-2的最大刺激的百分比，其中％標(biāo)準(zhǔn)化NK細(xì)胞> 17被認(rèn)為是免疫刺激 作用(=任意闕值)。結(jié)果顯示多糖富集的紅色洋蔥提取物(B)以400 μ g/ml的濃度刺激 分離自人血樣的PBMC的N K細(xì)胞活性。多糖富集的蒜提取物㈧在4和40 μ g/ml的濃度 下也是有效的。實(shí)施例4錯(cuò)龍_禾播·勿(A蒜，B -ΛΤ.ΡΜΜ )辭利用Orpegen Pharma (Heidelberg, Germany)的PhagOtest 試劑盒根據(jù)調(diào)整過(guò) 的規(guī)程測(cè)量吞噬活性。更具體的是在肝素鈉采血管(BD biosciences)中從健康人志愿者獲得新鮮血液。將30 μ 1 全血和5μ 1成分一式兩份地預(yù)溫育30分鐘，在聚丙烯96孔板中37°C下，水浴中。對(duì)照溫 育由下列組成PBS(=基礎(chǔ)吞噬活性)或lOOng/mL大腸桿菌脂多糖(LPS)(=陽(yáng)性對(duì)照樣 品)(平均士 sd，一式三份)。在預(yù)溫育步驟后，添加10 μ 1 FITC-標(biāo)記的大腸桿菌(血液 白細(xì)胞與大腸桿菌的比例為25 1)。6. 5分鐘后，停止在37°C的該溫育，通過(guò)加入50 μ 1 冰冷淬滅劑溶液。通過(guò)添加230 μ 1冰冷清洗緩沖液并在300g(4°C )離心3分鐘而將細(xì)胞 清洗3次。通過(guò)添加290 μ 1裂解緩沖液裂解紅細(xì)胞。在黑暗中室溫下溫育20分鐘后，在 300g(4°C)離心細(xì)胞5分鐘。將細(xì)胞重懸浮于150 μ 1清洗緩沖液中并用碘化丙啶染色。通 過(guò)、流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析(Coulter FC500 MPL flow cytometer,Beckman CoulterNederland BV，Mijdrecht)。根據(jù)FSC/SSC特征，使白細(xì)胞進(jìn)入單細(xì)胞和粒細(xì)胞群。確定在粒細(xì)胞群中 吞噬細(xì)胞的百分比。根據(jù)脂多糖(LPS)的作用，對(duì)這些結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。蔥科對(duì)吞噬活性的調(diào)節(jié)在吞噬活性檢驗(yàn)中測(cè)試兩種不同濃度的(29-290 μ g/ml)的包含多糖富集的蒜提 取物(A)的可食用組合物。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖5中。在吞噬活性檢驗(yàn)中測(cè)試四種不同濃 度的(0.29-2. 9-29-290 μ g/ml)的包含多糖富集的蒜提取物(A)的可食用組合物。該實(shí)驗(yàn) 的結(jié)果示于圖6中。結(jié)果表示為利用每種樣品一式兩份進(jìn)行的一個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。吞噬活 性報(bào)道為L(zhǎng)PS的最大刺激的百分比，其中％標(biāo)準(zhǔn)化吞噬粒細(xì)胞> 40%被認(rèn)為是免疫刺激作 用(=任意闕值)。結(jié)果顯示包含多糖估計(jì)的蒜提取物或多糖富集的紅色洋蔥提取物的可 食用組合物都能夠以290 μ g/ml的濃度刺激分離自新鮮人血液樣品的粒細(xì)胞的吞噬活性。
權(quán)利要求
具有免疫刺激作用的可食用產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包含免疫刺激多糖，所述免疫刺激多糖是可以從多年生開花蔥科植物獲得的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的可食用產(chǎn)品，其中，多糖是可從蔥屬植物獲得的。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的可食用產(chǎn)品，其中，所述植物選自蔥屬包括洋蔥(洋 蔥(Allium cepa))、細(xì)香蔥(細(xì)香蔥(A. schoenoprasum))、蒜(大蒜(A. sativum)和 A. scordoprasum)和韭菜(韭蔥(A. porrum))。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的可食用產(chǎn)品，其中，所述多糖是可從蒜或者洋蔥獲得的。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的可食用產(chǎn)品，其中，所述多糖的平均聚合度>3，優(yōu)選> 5，更優(yōu)選> 7，達(dá)到1，000。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的可食用產(chǎn)品，其中，所述免疫刺激多糖是可通過(guò)包含下 列步驟的方法獲得的收獲植物，切碎所述植物特別是球莖，以及制備不溶性材料的熱水提 取物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的可食用產(chǎn)品，其中，所述熱水提取物是通過(guò)額外的水不溶性材料 的清洗步驟富集的。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的可食用產(chǎn)品，其為液體形式的，例如湯、飲料、醬、佐料、 甜品或者美乃滋。
9.用于制備根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的可食用產(chǎn)品的方法，包含下列步驟(a)收獲植物，(b)切碎所述植物，特別是球莖，(c)制備不溶性材料的熱水提取物和(d)將所述提取物添加至可食用產(chǎn)品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用于制備可食用產(chǎn)品的方法，其中，所述方法包含一個(gè)或更多個(gè) 額外的清洗步驟。
11.組合物，其包含0.0001到25重量％的免疫刺激多糖，所述免疫刺激多糖可從蔥科 植物獲得并且具有免疫刺激作用，所述多糖的平均聚合度> 3，優(yōu)選> 5，更優(yōu)選> 7，最高 達(dá)到1,000。
全文摘要
提供了具有免疫刺激作用的可食用產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包含免疫刺激多糖，所述免疫刺激多糖是可以從多年生開花蔥科獲得的。還提供了用于制備此類可食用產(chǎn)品和組合物的方法，所述可食用產(chǎn)品和組合物包含0.0001到25重量％的多糖，所述多糖可從蔥科獲得并且具有免疫刺激作用。
文檔編號(hào)A61K38/00GK101903398SQ200880121384
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2008年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者J·A·范阿德里徹姆, J·H·科克, W·M·布洛姆, Y·E·多梅爾斯 申請(qǐng)人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司