含有肺炎鏈球菌莢膜多糖綴合物的疫苗的制作方法

文檔序號：1144845閱讀：1061來源：國知局

專利名稱：含有肺炎鏈球菌莢膜多糖綴合物的疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及改進的肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)疫苗。
背景技術：
不到2歲的兒童對大多數(shù)多糖疫苗不產(chǎn)生免疫應答，所以一直以來必須通過與蛋白載體進行化學綴合使多糖具有免疫原性。將作為非T細胞依賴性抗原的多糖與作為T細胞依賴性抗原的蛋白偶聯(lián)賦予多糖T細胞依賴性特性，包括同種型轉換、親和力成熟和記憶誘導。然而，重復給予多糖_蛋白綴合物或將多糖_蛋白綴合物聯(lián)合成多價疫苗存在某些問題.例如，已有報道指出，在一定劑量范圍內測試了使用破傷風類毒素(TT)作為蛋白載體的乙型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)多糖(PRP)疫苗，該疫苗與(游離的)TT和肺炎鏈球菌多糖-TT綴合疫苗按照標準嬰兒(infant)免疫程序同時免疫。當肺炎鏈球菌疫苗的劑量增加時，對Hib綴合疫苗的PRP多糖部分的免疫應答降低，這表明很可能是通過使用相同載體蛋白引起的多糖免疫干擾(Dagan等，Infect Immun. (1998) ；66 2093-2098)。還已證實載體-蛋白劑量對蛋白本身的體液免疫應答的影響是多方面的。據(jù)報道，在人類嬰兒中增加四價破傷風類毒素綴合物的劑量會導致對破傷風載體的應答下降 (Dagan等，出處同上)。對于聯(lián)合疫苗的這些效應，傳統(tǒng)分析一直認為是載體誘導的表位抑制，這一點還沒有完全弄清楚，但一般認為是由過量的載體蛋白引起的(Fattom，vaccine 11:126(1999))。這似乎導致針對載體蛋白的B細胞和針對多糖的B細胞競爭Th細胞。如果針對載體蛋白的B細胞占優(yōu)勢，則沒有足夠的Th細胞可用于為多糖特異性B細胞提供必需的輔助。然而，觀察到的免疫效果一直不一致，載體蛋白的總量在某些情況下增加免疫應答，而在另一些情況下卻降低免疫應答。因此，將多種多糖綴合物組合成單一有效的疫苗制劑仍有技術難度。肺炎鏈球菌為革蘭氏陽性細菌，可導致相當高的發(fā)病率和死亡率(尤其是對年紀小的人和上年紀的人)，引起諸如肺炎、菌血癥和腦膜炎等侵襲性疾病以及與定居相關的疾病，如急性中耳炎。在美國，60歲以上的人患肺炎鏈球菌性肺炎的比例估計為十萬分之三至十萬分之八。其中的20%病例會引發(fā)菌血癥，其它則表現(xiàn)為例如腦膜炎，即便采用抗生素治療死亡率也接近30%。肺炎鏈球菌被賦予血清型特異性的化學連接的多糖包裹。已知有90種肺炎鏈球菌血清型，莢膜是肺炎鏈球菌毒力的主要決定因素，因為莢膜不但保護細菌內表面不受補體影響，而且其本身是弱免疫原性的。多糖是非T細胞依賴性抗原，不能被加工或呈遞到 MHC分子上，從而不能與T細胞相互作用。但它們能通過一種涉及B細胞表面受體交聯(lián)的替代機制來刺激免疫系統(tǒng)。一些實驗表明，對侵襲性肺炎鏈球菌疾病的防護作用與莢膜特異性抗體最為相關，且該防護作用具有血清型特異性。肺炎鏈球菌是嬰兒和兒童侵襲性細菌疾病以及中耳炎最常見的致病因素。同樣，老年人對肺炎鏈球菌疫苗的應答較弱[Roghmarm等，(1987)，J. Gerontol. 42 265-270]，因此，在該人群中細菌性肺炎的發(fā)病率升高[Verghese和Berk, (1983) Medicine(Baltimore)62。肺炎鏈球菌引起的主要臨床癥狀是公知的，并在所有的標準醫(yī)學教科書中有論述(Fedson DS, Muscher DM.載于Plotkin SA, OrensteinffA 編輯，Vaccines.第 4 版.PhiladelphiaWB Saunders Co，2004a :529_588)。例如，侵入性肺炎鏈球菌疾病 (IPD)的定義是可由血液或其它通常無菌的部位分離出肺炎鏈球菌的任何感染(Musher DM. Streptococcus pneumoniae. In Mandell GL, Bennett JE, DoNn R(編輯)· Principles and Practice of Infectious diseases (第 5 版)· New York, Churchill Livingstone, 2001,2128-2147頁)。慢性阻塞性肺病(COPD)被認為包括幾種常常同時存在的病癥 (氣管阻塞、慢性支氣管炎、細支氣管炎或小氣道病變和肺氣腫)。COPD惡化或加重時，患者常常出現(xiàn)呼吸困難加重，咳嗽增多現(xiàn)象并伴有粘液痰或膿痰(Wilson，Eur Respir J2001 17 =995-1007)。COPD在生理學上被定義為在患有慢性支氣管炎和/或肺氣腫的患
W^tilPlS (Standardsfor the diagnosis and care of patients with chronic obstructive pulmonarydiseases. American Thoracic Society. Am J Respir Crit Care Med. 1995 年 11 月；152 (5 Pt 2) :S77_121)。COPD 的惡化經(jīng) 常由細菌(例如肺炎鏈球菌)感染引起(Sethi S，Murphy TF. Bacterial infection in chronicobstructive pulmonary diseases in 2000 -.a state-of-the-art review. ClinMicrobiol Rev. 2001 年 4 月；14(2) :336_63)。因此，本發(fā)明的目的是開發(fā)一種多血清型肺炎鏈球菌多糖綴合疫苗的改良制劑。附圖簡述

圖1在老年獼猴(Rhesus monkeys)中的綴合物免疫原性(post-II抗PS IgG水平)。顯示老年獼猴(Rhesus monkeys)中的11價綴合物免疫原性的條形圖。淺色條代表用在磷酸鋁佐劑中的11價綴合物2次接種后的GMC。深色條代表用在佐劑C中的11價綴合物2次接種后的GMC。圖2綴合物在老年獼猴中的免疫原性(post-II抗PS3記憶B細胞頻率)。顯示用在佐劑C或磷酸鋁佐劑中的11價綴合物接種后針對PS3的記憶B細胞的條形圖。圖3在Balb/c小鼠中的PS19F免疫原性(post-Ill IgG水平)。顯示Balb/C小鼠中4價非綴合型多糖和4價dPly綴合物的抗多糖19F免疫原性的條形圖。圖4在Balb/c小鼠中的PS22F免疫原性(post-Ill IgG水平)。顯示Balb/C小鼠中4價非綴合型多糖和4價PhtD綴合物的抗多糖22F免疫原性的條形圖。圖5血清抗-PS IgG水平。顯示Balb/C小鼠中的抗22F IgG應答的條形圖。圖6在Balb/c小鼠中的抗-22F調理吞噬效價。顯示Balb/C小鼠中的抗22F調理吞噬效價的條形圖。圖7在幼齡C57B1小鼠中用新佐劑或AlPD4免疫3次后誘導的IgG應答的比較。比較在C57B1幼齡小鼠中用以不同佐劑配制的13價綴合疫苗免疫后誘導的IgG應答的條形圖。條棒與右欄中所示的順序相同。圖8在獼猴中PhtD和dPly蛋白組合對19F型肺定居的保護效力。顯示不同疫苗組合在猴肺炎模型中的保護效力的條形圖。歸類為“死亡”的猴子包括若不給予抗生素治療會死亡的猴子。圖9血清抗-PhtD IgG應答。顯示Balb/c小鼠中用22F_PhtD或22F_AH_PhtD綴合物免疫后的抗PhtD IgG應答的條形圖。圖10在小鼠中抗4型肺炎鏈球菌挑戰(zhàn)的保護作用。在小鼠中用22F_PhtD或 22F-AH-PhtD免疫后的抗4型肺炎鏈球菌挑戰(zhàn)的保護作用。圖11在用PhtD免疫后和用抗血清型3多糖的抗體被動免疫后對用肺炎鏈球菌菌株3/43的致死性挑戰(zhàn)的保護作用。圖12在用PhtD免疫后和用抗血清型1多糖的抗體被動免疫后對用肺炎鏈球菌菌株1/57的致死性挑戰(zhàn)的保護作用。發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種含有10種或10種以上(例如11種、12種、13種、14種或15種或以上)莢膜糖的肺炎鏈球菌改良疫苗，所述莢膜糖來自不同肺炎鏈球菌血清型而且綴合 2種或2種以上載體蛋白，其中所述疫苗含有綴合白喉類毒素或CRM197的血清型19F莢膜糖，以及2-8種選自不同血清型的而且綴合D蛋白的肺炎鏈球菌莢膜糖。就本發(fā)明而言，“免疫人類宿主以抵御COPD惡化”或“治療或預防COPD惡化”或“降低COPD惡化程度”是指COPD惡化的發(fā)生率或發(fā)生速率下降(例如速率下降0. 1%,0. 5%, 1%、2%、5%、10%、20%或以上)，或者減輕如上定義的COPD惡化的嚴重程度，例如在用本發(fā)明的組合物或疫苗免疫的患者組中。通常，本發(fā)明的肺炎鏈球菌疫苗含有莢膜糖抗原(優(yōu)選綴合型)，其中所述糖來源于至少10種肺炎鏈球菌血清型。肺炎鏈球菌莢膜糖的數(shù)量可在10種不同血清型(或“V”，價)至23種不同血清型(23v)的范圍內。在一個實施方案中，有10、11、12、13、14或15種不同血清型。在本發(fā)明的另一個實施方案中，疫苗可含有綴合型肺炎鏈球菌糖和非綴合型肺炎鏈球菌糖。優(yōu)選糖血清型的總數(shù)少于或等于23。例如，本發(fā)明可包含10種綴合型血清型和13種非綴合型糖。類似的是，疫苗可分別含有11、12、13、14、15或16種綴合型糖以及 12、11、10、9、8或7種非綴合型糖。術語“選自不同的血清型”是指綴合D蛋白的莢膜糖來自非19F的肺炎鏈球菌血清型。本發(fā)明的免疫原性組合物包含2-8種、2-7種、2-6種、2-5種、3-5種、4-5種、2_4 種、2-3種、3-4種或2種、3種、4種、5種、6種、7種或8種莢膜糖綴合物，其中D蛋白是載體蛋白。例如，得自血清型1、3、4、5、6六、68、7卩、叭、14、18(、19六、19卩、22 或23卩的糖綴合D 蛋白。例如，選自血清型 1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F* 23F 的 2-8 種、2-7 種、2-6種、2-5種、3-5種、4-5種、2-4種、2-3種、3-4種或2種、3種、4種、5種、6種、7種或 8種糖綴合至D蛋白。在一個實施方案中，得自至少血清型1和3、1和4、1和5、1和6A、1和6B、1和7、 1 禾口 9V、1 禾口 14、1 禾口 22F、1 禾口 23F、3 禾口 4、3 禾口 5、3 禾口 6A、3 禾口 6B、3 禾口 7F、3 禾口 9V、3 禾口 14、3 和 22F、3 禾口 23F、4 禾口 5、4 禾口 6A、4 禾口 6B、4 禾口 7F、4 禾口 9V、4 禾口 14、4 禾口 22F、4 禾口 23F、5 禾口 6A、 5 禾口 6B、5 禾口 7F、5 禾口 9V、5 禾口 14、5 禾口 22F、5 禾口 23F、6A 禾口 6B、6A 禾口 7F、6A 禾口 9V、6A 禾口 14、6A 和 22F、6A 禾口 23F、6B 禾口 7F、6B 禾口 9V、6B 禾口 14、6B 禾口 22F、6B 禾口 23F、7F 禾口 9V、7F 禾口 14、7F 和 22F、7F 和 23F、9V 和 14、9V 和 22F、9V 和 23F、14 和 22F、14 和 23F 或 22F 和 23F 的糖綴合至D蛋白。在一個實施方案中，得自至少血清型1、3和4 ；1,3和5 ；1,3和6A ；1,3和6B ；1,3 禾口 7F ；1、3 禾口 9V ；1、3 禾口 14 ；3、4 禾口 7F ；3、4 禾口 5 ；3、4 禾口 7F ；3、4 禾口 9V ；3、4 禾口 14 ；4、5 禾口 7F ； 4、5 禾口 9V ；4、5，禾口 14 ；5、7F 禾口 9V ；5、7F 禾口 14 ；7F、9V 禾口 14 ； 1、3、4 禾口 5 ；3、4、5 禾口 7F ；4、5、7F 和 9V ；4、5、7F 禾口 14 ；4、5、9V 禾口 14 ；4、7F、9V 禾口 14 ；5、7F、9V 禾口 14 ；或 4、5、7F、9V 禾口 14 的糖
綴合至D蛋白。在一個實施方案中，一半或少部分存在于本發(fā)明的免疫原性組合物中的莢膜糖綴合物包含D蛋白作為載體蛋白。例如，在10價肺炎鏈球菌疫苗中，得自不同血清型的2種、 3種、4種或5種莢膜糖綴合D蛋白。例如，在11價肺炎鏈球菌疫苗中，得自不同血清型的2 種、3種、4種或5種莢膜糖綴合D蛋白。例如，在12價肺炎鏈球菌疫苗中，得自不同血清型的2種、3種、4種、5種或6種莢膜糖綴合D蛋白。例如，在13價肺炎鏈球菌疫苗中，得自不同血清型的2種、3種、4種、5種或6種莢膜糖綴合D蛋白。例如，在14價肺炎鏈球菌疫苗中，得自不同血清型的2種、3種、4種、5種、6種或7種莢膜糖綴合D蛋白。例如，在15價肺炎鏈球菌疫苗中，得自不同血清型的2種、3種、4種、5種、6種或7種莢膜糖綴合D蛋白。例如，在16價肺炎鏈球菌疫苗中，得自不同血清型的2種、3種、4種、5種、6種、7種或8種莢膜糖綴合D蛋白。例如，在17價肺炎鏈球菌疫苗中，得自不同血清型的2種、3種、4種、 5種、6種、7種或8種莢膜糖綴合D蛋白。例如，在18價肺炎鏈球菌疫苗中，得自不同血清型的2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種或9種莢膜糖綴合D蛋白。例如，在19價肺炎鏈球菌疫苗中，得自不同血清型的2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種或9種莢膜糖綴合D蛋白。任選地，綴合D蛋白的血清型選自上述群。在一個實施方案中，本發(fā)明的多價肺炎鏈球菌疫苗選自以下血清型1、2、3、4、5、 6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F,但要認識到的是，根據(jù)疫苗的接受者的年齡和將給予疫苗的地理位置，可以用1種或2種其它血清型替代，例如，可將血清型6A納入以上血清型清單中。例如，10價疫苗可含有血清型1、4、5、6B、 7F、9V、14、18C、19F和23F的多糖。11價疫苗還可以包含血清型3的糖。12價或13價兒科(嬰兒)疫苗還可以包括補加血清型6A和19A、或6A和22F、或19A和22F、或6A和15、或19A和15、或22F和15的10價或11價制劑，而13價老年疫苗可以包括補加血清型19A 和22F、8和12F、或8和15、或8和19A、或8和22F、或12F和15、或12F和19A、或12F和 22F、或15和19A、或15和22F的11價制劑。14價兒科疫苗可包括補加血清型3、6A、19A 和 22F ；血清型 6A、8、19A 和 22F ；血清型 6A、12F、19A 和 22F ；血清型 6A、15、19A 和 22F ；血清型3、8、19A禾口 22F ；血清型3、12F、19A和22F ；血清型3、15、19A和22F ；血清型3、6A、8和 22F ；血清型3、6A、12F和22F ；或血清型3、6A、15和22F的上述10價制劑。在一個實施方案中，組合物包含來源于血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和 23F(優(yōu)選綴合型)的莢膜糖。在本發(fā)明的又一個實施方案中，包含至少11種糖抗原(優(yōu)選綴合型)，例如來源于血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的莢膜糖。在本發(fā)明的又一個實施方案中，包含至少12種或13種糖抗原，例如疫苗可含有來源于血清型1、3、4、5、 6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F 和 23F 的莢膜糖，或者來源于血清型 1、3、4、5、6B、7F、9V、14、 18C、19A、19F、22F和23F的莢膜糖，但本發(fā)明還包括其它糖抗原，例如23價(例如血清型 1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F)。
本發(fā)明的免疫原性組合物可含有流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)的D 蛋白(PD)(參見例如EP 0594610圖9)。流感嗜血桿菌是中耳炎的關鍵致病生物，本發(fā)明人已表明，將該蛋白納入肺炎鏈球菌疫苗中將提供針對流感嗜血桿菌相關的中耳炎的保護 (Pyrmula等，Lancet 367 ；740-748 (2006)) 一方面，PD作為一種或多種糖的載體蛋白存在。另一方面，D蛋白可作為游離蛋白存在于疫苗組合物中。又一方面，D蛋白作為載體蛋白和游離蛋白這二者存在。D蛋白可用作全長蛋白或片段(W00056360)。又一方面，D蛋白作為大部分糖的載體蛋白存在，例如6、7、8、9種或更多種的糖可與D蛋白綴合。在該方面， D蛋白也可作為游離蛋白存在。本發(fā)明的疫苗含有2種或更多種不同類型的載體蛋白。每類載體蛋白均可用作1 種以上的糖的載體，所述糖可為相同的或不同的。例如，血清型3和4可綴合相同載體蛋白，或者綴合同一載體蛋白分子，或者綴合相同載體蛋白的不同分子。在一個實施方案中， 2種或2種以上的不同的糖可與相同載體蛋白綴合，或者綴合同一載體蛋白分子，或者綴合相同載體蛋白的不同分子。除了總是綴合DT或CRM 197 (優(yōu)選DT)的血清型19F的糖以外，每種肺炎鏈球菌莢膜糖都可與獨立地選自以下的載體蛋白綴合TT、DT、CRM197、TT的片段C、PhtD, PhtDE 融合蛋白(尤其是在W001/98334和WO 03/54007中描述的那些)、解毒的肺炎鏈球菌溶血素和D蛋白。以下提供了可用于本發(fā)明綴合物的蛋白載體的更完整例舉說明。如果蛋白載體與組合物中的2種或2種以上的糖相同，則該糖可與同一蛋白載體分子綴合(載體分子具有2個以上與其綴合的不同糖)[參見例如WO 04/083251]?；蛘撸?所述糖可各自獨立地綴合不同的蛋白載體分子(每個蛋白載體分子均僅具有1類與其綴合的糖)。與本發(fā)明的免疫原性組合物中存在的綴合物中的一種或多種肺炎鏈球菌莢膜糖綴合的載體蛋白任選地為聚組氨酸三聯(lián)體家族(Pht)蛋白成員、其片段或融合蛋白。PhtA、 PhtB、PhtD或PhtE蛋白可具有與WO 00/37105或WO 00/39299中公開的序列(例如與 W000/37105 中關于 PhtD 的 SEQ ID NO :4 的氨基酸序列 1-838 或 21-838)共有 80%、85%、 90%,95%,98%,99%^； 100%同一性的氨基酸序列。例如，融合蛋白由PhtA、PhtB、PhtD、 PhtE中的2、3或4種的全長或片段組成。融合蛋白的實例為PhtA/B、PhtA/D、PhtA/E、PhtB/ A、PhtB/D、PhtB/E、PhtD/A、PhtD/B、PhtD/E、PhtE/A、PhtE/B 和 PhtE/D，其中所述蛋白在 N 末端與首先提到的連接(參見例如W001/98334)。在使用Pht蛋白片段(獨立存在或作為融合蛋白的一部分)時，每個片段任選地含有一個或多個組氨酸三聯(lián)體基序和/或這些多肽的卷曲螺旋區(qū)。組氨酸三聯(lián)體基序是多肽的一部分，具有序列HxxHxH，其中H為組氨酸，χ為非組氨酸的氨基酸。卷曲螺旋區(qū)是 Lupus，A等，(1991) Science 252 ；1162-1164通過“Coils”算法預測的區(qū)域。在一個實施方案中，該片段或每個片段含有一個或多個組氨酸三聯(lián)體基序以及至少一個卷曲螺旋區(qū)。在一個實施方案中，該片段或每個片段恰好含有或至少含有2個、3個、4個或5個組氨酸三聯(lián) 體基序(任選地，在2個或多個三聯(lián)體之間具有天然Pht序列，或者具有三聯(lián)體內序列，該三聯(lián)體內序列與天然肺炎鏈球菌三聯(lián)體內Pht序列一例如示于W000/37105的SEQ ID NO 4的三聯(lián)體內PhtD序列超過50%、60%、70%、80%、90%或100%相同)。在一個實施方案中，該片段或每個片段恰好含有或至少含有2、3或4個卷曲螺旋區(qū)。在一個實施方案中，本文公開的Pht蛋白包括具有連接的信號序列的全長蛋白、信號肽(例如在N-末端的20個氫基酸)已被去除的成熟全長蛋白、Pht蛋白的天然變體和Pht蛋白的免疫原性片段(例如上述片段，或含有WO 00/37105中的氨基酸序列(SEQ ID NO 4、6、8或10)或WO 00/39299 中的氨基酸序列(SEQ ID NO 2、4、6、8、10或14)的至少15個或20個連續(xù)氨基酸的多肽，其中所述多肽能夠激發(fā)對W000/37105或W000/39299中所述氨基酸序列特異性的免疫應答)。具體地說，本文使用的術語“PhtD”包括具有連接的信號序列的全長蛋白、信號肽 (例如在N-末端的20個氨基酸)已被去除的成熟全長蛋白、PhtD的天然變體和PhtD的免疫原性片段(例如上述片段，或含有W000/37105或W000/39299中的PhtD氨基酸序列的至少15個或20個連續(xù)氨基酸的多肽，其中所述多肽能夠激發(fā)對W000/37105或W000/39299 中所述PhtD氨基酸序列(例如WO 00/37105中針對PhtD的SEQ ID NO 4或WO 00/39299 中針對PhtD的SEQ ID NO 14)特異性的免疫應答)。以上提及的所有形式的PhtD都可以用于本發(fā)明。如果蛋白載體與組合物中的2種或2種以上的糖相同，則糖可與同一蛋白載體分子綴合(載體分子具有2個以上與其綴合的不同糖)[參見例如WO 04/083251]?；蛘撸?述糖可各自獨立綴合不同的蛋白載體分子(每個蛋白載體分子均僅具有1類與其綴合的糖)?？捎糜诒景l(fā)明的載體蛋白的實例為DT(白喉類毒素)；TT(破傷風類毒素)或TT 的 C 片段；DT CRM197(DT 突變體)，其它 DT 點突變，例如 CRM176、CRM228、CRM 45(Uchida 等，J. Biol. Chem. 218 ；3838-3844，1973) ；CRM 9、CRM 45、CRM102、CRM 103 禾口 CRM107 以及由 Nicholls 禾口 Youle 在 Genetically Engineered Toxins, Frankel 編輯，Maecel Dekker Inc, 1992中描述的其它突變；Glu-148缺失或突變?yōu)锳sp、Gln或Ser，和/或Ala 158缺失或突變?yōu)镚ly，以及在US 4709017或US 4950740中公開的其它突變；Lys 516、 Lys 526、Phe 530和/或Lys 534中至少一個或多個殘基的突變，以及在US 5917017或 US6455673中公開的其它突變；或者在US 5843711中公開的片段；肺炎鏈球菌性肺炎鏈球菌溶血素(Kuo等，(1995) Infect Immun 63 ;2706_13)，包括以某些方式解毒的ply，例如 dPLY-GMBS(W004081515、PCT/EP2005/010258)或 dPLY-甲醛、PhtX,包括 PhtA、PhtB, PhtD、PhtE以及Pht蛋白的融合體，例如PhtDE融合體、PhtBE融合體(W0 01/98334和 WO 03/54007)、(Pht A-E詳述于下文)；OMPC(腦膜炎球菌外膜蛋白-通常由腦膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis)血清群B提取-EP0372501) ；PorB(得自腦膜炎奈瑟氏球菌)；PD(流感嗜血桿菌D蛋白-參見例如EP 0 594 610 B)或其免疫學功能等同物；合成月太(EP0378881、EP0427347)；熱激蛋白(W0 93/17712、WO 94/03208)；百日咳蛋白(W0 98/58668,EP0471177)；細胞因子；淋巴因子；生長因子或激素(W0 91/01146)；含有來自多種病原體衍生抗原的多個人⑶4+T細胞表位的人工蛋白(Falugi等，(2001)Eur J Immunol 31 ;3816-3824)，例如 N19 蛋白(Baraldoi 等，(2004) Infect Immun 72 ；4884-7)；肺炎鏈球菌表面蛋白PspA(W) 02/091998)；鐵吸收蛋白(W001/72337)；艱難梭菌(C. difficile)的毒素 A 或 B(W0 00/61761)。Nurkka 等，Pediatric Infectious Disease Journal. 23(11) :1008_14，2004 年 11月描述了 11價肺炎鏈球菌疫苗，其所有血清型均綴合PD。然而，本發(fā)明人已表明，相比于綴合PD的19F，用具有綴合DT的19F的綴合物誘導的抗體的調理吞噬活性得到改善。另外，本發(fā)明人已表明，用綴合DT的19F觀察到對19A的更大交叉反應性。因此，本發(fā)明組合物的特征在于血清型19F與DT或CRM 197綴合。一方面，血清型19F與DT綴合。免疫原性組合物的其它糖血清型可全部與一種或多種不是DT的載體蛋白綴合(即僅有19F綴合 DT)，或者可以在不是DT的一種或多種載體蛋白和DT本身之間分攤(split)。在一個實施方案中，19F與DT或CRM 197綴合，所有其它血清型綴合PD。在又一個實施方案中，19F綴合DT或CRM 197，其它血清型在PD和TT或者DT或CRM 197之間分攤。在又一個實施方案中，19F與DT或CRM 197綴合，僅1種糖綴合TT。在該實施方案的一方面，所述1種糖為18C 或12F。在又一個實施方案中，19F與DT或CRM197綴合，僅2種糖與TT綴合。在又一個實施方案中，19F與DT或CRM 197綴合，其它血清型在PD、TT和DT或CRM 197之間分攤。在又一個實施方案中，19F與DT或CRM 197綴合，其它血清型在PD、TT和肺炎鏈球菌溶血素之間分攤。在又一個實施方案中，19F與DT或CRM 197綴合，其它血清型在PD、TT和CRM 197 之間分攤。在又一個實施方案中，19F與DT或CRM 197綴合，其它血清型在PD、TT、肺炎鏈球菌溶血素和任選的PhtD或PhtD/E融合蛋白之間分攤。在又一個實施方案中，19F與DT 或CRM 197綴合，19A與肺炎鏈球菌溶血素或TT綴合，還有1種(2種或3種)糖綴合TT，還有1種糖綴合PhtD或PhtD/E，所有其余的糖綴合PD。在又一個實施方案中，19F與DT或 CRM 197綴合，19A與肺炎鏈球菌溶血素綴合，還有1種(2種或3種)糖綴合TT，還有1種糖綴合肺炎鏈球菌溶血素，還有2種糖綴合PhtD或PhtD/E，所有其余的糖綴合PD。術語“糖”在整個本說明書中可指多糖或寡糖，并包括這二者。多糖分離自細菌，并可以在某種程度上通過已知方法(參見例如EP497524和EP497525)并優(yōu)選地通過微流化調整大小?？蓪Χ嗵钦{整大小，以便降低多糖樣品的粘度和/或改善綴合產(chǎn)物的過濾性。寡糖具有數(shù)量較少的重復單元(通常5-30個重復單元)，并通常為水解的多糖。肺炎鏈球菌的莢膜多糖包含可含有達8個糖殘基的重復寡糖單元。關于關鍵肺炎鏈球菌血清型的寡糖單元的綜述,參見JONES，Christopher. Vaccine based on the cell surface carbohydrates ofpathogenic bacteria. An. Acad. Bras. C/eWC.，2005 年 6 月，第 77卷，第2冊，293-324頁，表II，ISSN 0001-3765。在一個實施方案中，莢膜糖抗原可為全長多糖，但是在其它實施方案中其可為一個寡糖單元，或者比重復寡糖單元的天然長度的糖鏈短。在一個實施方案中，疫苗中存在的所有糖都是多糖。全長多糖可被“調整大小”，即它們的大小可通過多種方法減小，例如酸解處理；過氧化氫處理；通過emulsiflex 調整大小，然后經(jīng)過氧化氫處理，以產(chǎn)生寡糖片段；或者微流化。本發(fā)明人還注意到，本技術的核心是使用易于生產(chǎn)綴合物的寡糖。本發(fā)明人已發(fā) 現(xiàn)，通過使用天然型或略微減少的多糖綴合物，可實現(xiàn)一個或多個以下優(yōu)勢1)具有高免疫原性的可過濾的綴合物，2)可改變綴合物中多糖與蛋白的比率，使得綴合物中多糖與蛋白的比率(重量/重量)可增加(其可影響載體的抑制作用)，3)易于水解的免疫原性綴合物可通過使用較大的糖進行綴合來使其穩(wěn)定。使用較大的多糖可與綴合物載體更多交聯(lián)，從而可減少由綴合物釋放游離糖。在先有技術中描述的綴合疫苗傾向于在綴合前解聚多糖，以便改善綴合。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，保持較大大小糖的糖綴合疫苗可提供抵御肺炎鏈球菌疾病的良好免疫應答。本發(fā)明的免疫原性組合物因此可以包含一種或多種糖綴合物，其中在綴合前每種糖的平均大小(例如重均分子量；Mw)在80kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa或IOOOkDa以上。在一個實施方案中，本發(fā)明的一種或多種糖綴合物具有的綴合前糖平均大小為 50-1600、80-1400、100-1000、150-500 或 200_400kDa (注意，在平均大小為 Mw 時，‘kDa，單位在此應當用‘ X 103’替代)。在一個實施方案中，綴合后的綴合物應可容易地通過0. 2 μ m 濾器過濾，使得與過濾前樣品相比在過濾后獲得50%、60%、70%、80%、90%或95%以上
的產(chǎn)量。就本發(fā)明而言，“天然(型)多糖”是指未經(jīng)處理(例如純化后)的糖，處理的目的是減小糖的大小。在常規(guī)純化工藝中多糖的大小可被輕微減小，這樣的糖仍是天然型。只要多糖經(jīng)過調整大小的工藝，該多糖就不被認為是天然多糖。天然多糖的大小例如為 250kDa-2, 000kDa、400kDa-l, 500kDa、750kDa_l，250kDa、300kDa-600kDa、500kDa-l, OOOkDa 或l，000kDa-l，500kDa，不同的血清型具有不同的天然多糖大小，這是技術人員知曉的。就本發(fā)明而言，“以至多x2的因數(shù)調整大小”是指糖經(jīng)過處理，目的是降低糖大小，但仍保持超過天然多糖大小的一半的大小。x3、x4等等以相同的方式解釋，即對糖進行處理，以減小多糖的大小，但保持其大小在天然多糖大小的1/3、1/4等等以上。在本發(fā)明的一方面，免疫原性組合物包含至少10種血清型的綴合載體蛋白的肺炎鏈球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9種或每種肺炎鏈球菌糖為天然多糖。在本發(fā)明的一方面，免疫原性組合物包含來自至少10種血清型的綴合載體蛋白的肺炎鏈球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9種或每種肺炎鏈球菌糖的大小調整為x2、 x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或xlO的大小。在該方面的一個實施方案中，大部分糖，例如6、7、 8種或更多種的糖為x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或xlO的大小。糖的分子量或平均分子量(或大小)在本文是指在綴合前檢測的糖的重均分子量 (Mw)，通過MALLS來檢測。MALLS技術在本領域眾所周知，通常如實施例2所述進行。就肺炎鏈球菌糖的MALLS分析而言，可組合使用兩種柱子(TSKG6000和5000PWxl)，并用水洗脫糖。用光散射檢測器(例如配有IOmW 488nm氬激光器的Wyatt Dawn DSP)和干涉儀折射計 (inferometricrefractometer)(例如裝備PlOO 光電元件和 498nm紅光過濾的WyattOtiIab DSP)檢測糖。在一個實施方案中，肺炎鏈球菌糖為天然多糖，或者為在常規(guī)提取步驟中己經(jīng)減小了大小的天然多糖。在一個實施方案中，通過機械裂解，例如通過微流化或超聲，調整肺炎鏈球菌糖的大小。微流化和超聲具有充分減小較大天然多糖大小從而提供可過濾綴合物的優(yōu)點。調整大小以不超過x20、xl0、x8、x6、x5、x4、x3或x2的因數(shù)進行。在一個實施方案中，免疫原性組合物包含肺炎鏈球菌綴合物，該綴合物由天然多糖和以不超過x20的因數(shù)調整大小的糖的混合物制備。在該實施方案的一個方面，大部分糖，例如6種、7種、8種或更多種糖的大小為至多x2、x3、x4、x5或x6大小。在一個實施方案中，肺炎鏈球菌糖通過接頭(如雙功能接頭)與載體蛋白綴合。任選地，接頭為異雙功能接頭或同雙功能接頭，具有例如1個反應性氨基和1個反應性羧基、2 個反應性氨基或者2個反應性羧基。例如，接頭具有4-20個、4-12個、5-10個碳原子?？赡?的接頭是ADH。其它接頭包括B-丙酰胺基(W0 00/10599)、硝基苯-乙胺(Gever等，(1979) Med. Microbiol. Immunol. 165 ；171-288)、鹵代燒基鹵(US4057685)、糖苷鍵(US4673574、US4808700)、己烷二胺和6-氨基己酸(US4459286)。在一個實施方案中，ADH用作綴合血清型18C的糖的接頭。在一個實施方案中，ADH用作綴合血清型22F的糖的接頭。在本發(fā)明的免疫原性組合物中存在的糖綴合物可用任何己知的偶聯(lián)技術制備。綴合方法可依賴于用四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(CDAP)活化糖而形成氰酸酯。由此，活化的糖可直接或經(jīng)由間隔臂(接頭)基團偶聯(lián)至載體蛋白上的氨基。例如，間隔臂可以是胱胺或半胱胺，以得到硫醇化多糖，硫醇化多糖可經(jīng)由與馬來酰亞胺活化的載體蛋白 (例如使用GMBS)或鹵乙酰載體蛋白(例如使用碘乙酰亞胺[例如乙基碘乙酰亞胺HCl]或 N-琥珀酰亞胺基溴乙酸鹽或SIAB、或SIA、或SBAP)反應后所獲得的硫醚鍵與載體偶聯(lián)。優(yōu) 選地，氰酸酯(任選地以CDAP化學法制備)可與己二胺或ADH偶聯(lián)，并采用碳二亞胺(例如EDAC或EDC)化學法經(jīng)蛋白載體上的羧基使氨基衍化糖與載體蛋白綴合。這樣的綴合物描述于 PCT 公開申請 WO 93/15760 (Uniformed Services University)以及 WO 95/08348 和 WO 96/29094。其它的合適技術使用碳二亞胺、酰胼、活化酯、降冰片烷(norborane)、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。許多都描述于WO 98/42721。綴合可涉及羰基接頭，其可如下形成糖的游離羥基先與CDI反應(Bethell等，J. Biol. Chem. 1979，254 ； 2572-4，Hearn等，J. Chromatogr. 1981. 218 ;509_18)，再與蛋白反應，形成氨基甲酸酯鍵。該過程可涉及異頭末端還原成伯羥基，任選保護/去保護伯羥基，伯羥基與CDI反應形成 CDI氨基甲酸酯中間體，然后將CDI氨基甲酸酯中間體與蛋白的氨基偶聯(lián)。綴合物也可通過如US 4365170 (Jennings)和 US 4673574 (Anderson)所述的直接還原胺化法制備。其它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508。進一步的方法涉及通過碳二亞胺縮合(Chu C.等，Infect. Immunity，1983 245 256)，例如使用EDAC，將溴化氰(或CDAP)活化的、被己二酸二酰胼(ADH)衍生化的糖與蛋白載體偶聯(lián)。在一個實施方案中，糖上的羥基(優(yōu)選活化的羥基，例如被活化以制備氰酸酯的羥基[例如使用CDAP])直接或間接(通過接頭)與蛋白的氨基或羧基連接。當存在接頭時，糖上的羥基優(yōu)選地與接頭上的氨基連接，例如通過使用CDAP綴合。接頭如ADH中的其余氨基可綴合蛋白上的羧酸基團，例如通過使用碳二亞胺化學，例如通過使用EDAC。在一個實施方案中，肺炎鏈球菌莢膜糖在接頭與載體蛋白綴合之前先與接頭綴合。或者，接頭可在與糖綴合之前與載體綴合。還可以使用技術組合，一些糖-蛋白綴合物通過CDAP制備，一些通過還原胺化法制備。通常，蛋白載體上可用于偶聯(lián)/綴合的化學基團的類型如下A)羧基(例如經(jīng)天冬氨酸或谷氨酸)。在一個實施方案中，該基團直接與糖上的氨基連接，或者用碳二亞胺化學(例如用EDAC)與接頭上的氨基連接。B)氨基(例如經(jīng)由賴氨酸)。在一個實施方案中，該基團直接與糖上的羧基連接，或者用碳二亞胺化學(例如用EDAC)與接頭上的羧基連接。在另一個實施方案中，該基團直接與糖上用CDAP或CNBr活化的羥基連接，或者與接頭上的這些基團連接；與具有醛基的糖或接頭連接；與具有琥珀酰亞胺酯基團的糖或接頭連接。C)巰基(例如經(jīng)由半胱氨酸)。在一個實施方案中，該基團與溴乙酰糖或氯乙酰糖連接，或者用馬來酰亞胺化學與接頭連接。在一個實施方案中，該基團用雙偶氮聯(lián)苯胺(bis diazobenzidine)活化 / 改性。D)羥基(例如經(jīng)由酪氨酸)。在一個實施方案中，該基團用雙二重氮聯(lián)苯胺活化 /改性。E)咪唑基(例如經(jīng)由組氨酸)。在一個實施方案中，該基團用雙二重氮聯(lián)苯胺活化/改性。F)胍基(例如經(jīng)由精氨酸)。G)吲哚基(例如經(jīng)由色氨酸)。在糖上，能夠用于偶聯(lián)的通常是以下基團0H、COOH或NH2。醛基能夠在本領域已知的不同處理后產(chǎn)生，所述處理例如高碘酸鹽、酸解、過氧化氫等。直接偶聯(lián)法糖-OH+CNBr或 CDAP-----> 氰酸酯 +NH2-Prot——> 綴合物糖-醛+NH2-Prot——> 席夫堿+NaCNBH3——> 綴合物糖-C00H+NH2-Prot+EDAC——>綴合物糖-NH2+C00H-Prot+EDAC——>綴合物通過間隔臂(接頭)間接偶聯(lián)的方法糖-OH+ CNBr 或 CDAP —— > 氰酸酉旨 +NH2----NH2---->
糖——NH2+C00H-Prot+EDAC-----> 綴合物糖-OH+CNBr或 CDAP——> 氰酸酯 +NH2-----SH-----> 糖——SH+SH-Prot (具
有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或是通過例如SPDP將蛋白的氨基改性后獲得的)——> 糖-S-S-Prot糖-OH+CNBr或CDAP-—>氰酸酯+NH2——SH------->糖——SH+馬來酰亞
胺-Prot (氨基的改性物)> 綴合物糖-OH+CNBr或 CDAP-—> 氰酸酯 +NH2-----SH-—> 糖-SH+ 鹵代乙酰化-Prot——>
綴合物糖-C00H+EDAC+NH2-----NH2—> 糖-----NH2+EDAC+C00H_Pr。t——> 綴合物糖-C00H+EDAC+NH2——SH----->糖——SH+SH-Prot (具有暴露的半胱氨酸的天
然蛋白，或是通過例如SPDP將蛋白的氨基改性后獲得的)——> 糖-S-S-Prot糖-C00H+EDAC+NH2——SH----->糖——SH+馬來酰亞胺-Prot (氨基的改性
物)> 綴合物糖-C00H+EDAC+NH2——SH>糖-SH+商代乙酰化-Prot——> 綴合物糖-醛+NH2-----NH2—> 糖一NH2+EDAC+C00H-Prot——> 綴合物注意除了以上的EDAC，還可以使用任何合適的碳二亞胺?？傊?，通?？梢杂糜谂c糖偶合的蛋白載體化學基團的類型是氨基(例如賴氨酸殘基上的)、C00H基團(例如天冬氨酸和谷氨酸殘基上的)和SH基團(如果能夠獲得的話) (例如半胱氨酸殘基上的)。優(yōu)選地，載體蛋白與肺炎鏈球菌糖的比率在1 5至5 1之間，例如1 0.5至 4 1、1 1 至 3. 5 1,1. 2 1 至 3 1,1. 5 1 至 2. 5 1 ；例如在 1 2 至 2. 5 1 之間；在1 1至2 1(重量/重量)之間。在一個實施方案中，大部分綴合物，例如6種、7種、8種、9種或更多種綴合物，具有大于1 1的載體蛋白與糖的比率，例如1.1 1、 1. 2 1,1. 3 1,1. 4 1,1. 5 1 或 1. 6 1。在一個實施方案中，使用CDAP和EDAC使至少一種肺炎鏈球菌糖經(jīng)接頭與載體蛋白綴合。例如，可使用如上所述的CDAP和EDAC使18C或22F經(jīng)接頭(例如在其末端具有兩個酰胼基團的那些接頭，例如ADH)與蛋白綴合。在使用接頭時，CDAP可用于使糖與接頭綴合，然后可使用EDAC使接頭與蛋白綴合，或者可首先使用EDAC使接頭與蛋白綴合，此后可使用CDAP使接頭與糖綴合。通常，本發(fā)明的免疫原性組合物的各糖綴合物的含量可在0. l-20yg、I-IOyg或 1-3 μ g糖之間。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物含有為0. 1-20 μ g,0. 5-10 μ g, 0.5-5yg或l-3yg糖劑量的各肺炎鏈球菌莢膜糖。在一個實施方案中，莢膜糖可以不同劑量存在，例如某些莢膜糖可以約或恰好1 μ g的劑量存在，或者某些莢膜糖可以約或恰好 3yg的劑量存在。在一個實施方案中，血清型3、18C和19F(或者4、18C和19F)的糖以高于其它糖的劑量存在。在該實施方案的一個方面，血清型3、18C和19F (或4、18C和19F) 以近似或恰好3 μ g的劑量存在，而免疫原性組合物中的其它糖以近似或恰好1 μ g的劑量存在。“約”或“近似”就本發(fā)明而言定義為在給定值的10%左右。在一個實施方案中，至少一種肺炎鏈球菌莢膜糖與載體蛋白直接綴合(例如使用上述的一種化學方法)。優(yōu)選地，至少一種肺炎鏈球菌莢膜糖通過CDAP直接綴合。在一個實施方案中，大部分莢膜糖，例如5種、6種、7種、8種、9種或更多種，通過CDAP與載體蛋白直接連接(參見 WO 95/08348 和 WO 96/29094)。免疫原性組合物可包含肺炎鏈球菌蛋白，本文稱為本發(fā)明的肺炎鏈球菌蛋白。這些蛋白可用作載體蛋白，或者可作為游離蛋白存在，或者可作為載體蛋白和游離蛋白這二者存在。本發(fā)明的肺炎鏈球菌蛋白或者為表面暴露的(至少在肺炎鏈球菌部分生命周期當中)，或者為由肺炎鏈球菌分泌或釋放的蛋白。優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白選自以下類別，例如具有LXXC的II型信號序列基序的蛋白(其中X為任何氨基酸，例如聚組氨酸三聯(lián)體家族 (PhtX))、膽堿結合蛋白(CbpX)、具有I型信號序列基序的蛋白(例如SplOl)、具有LPXTG 基序的蛋白(其中X為任何氨基酸，例如Spl28、Spl30)和毒素(例如Ply)。這些類別(或基序)中的優(yōu)選實例為以下蛋白或其免疫學功能等效物。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物含有至少一種蛋白，所述蛋白選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(Phtx)、膽堿結合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)、肺炎鏈球菌溶血素(Ply)、PspA, PsaA, Spl28、SplOl、Spl30、Spl25和Spl33。在又一個實施方案中，免疫原性組合物含有2 種或更多種蛋白，所述蛋白選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結合蛋白家族(CbpX)、 CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)、肺炎鏈球菌溶血素(Ply)、PspA, PsaA和Spl28。在又一個實施方案中，免疫原性組合物含有2種或多種蛋白，所述蛋白選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結合蛋白家族(CbpX)、 CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)、肺炎鏈球菌溶血素(Ply)和Spl28。
Pht (聚組氨酸三聯(lián)體)家族包括蛋白PhtA、PhtB、PhtD和PhtE。該家族具有以下特征脂質化序列；由脯氨酸富集區(qū)和幾個組氨酸三聯(lián)體分隔開的兩個結構域，可能涉及金屬或核苷的結合或酶活性；(3-5)卷曲螺旋區(qū)；保守的N-末端和異源的C末端。它存在于已測試的所有肺炎鏈球菌菌株中。同源蛋白已在其它鏈球菌和奈瑟氏球菌屬中發(fā)現(xiàn)。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的Pht蛋白為PhtD。然而，要理解的是，術語Pht A、B、D 和E是指具有在以下引用文獻中公開的序列的蛋白，以及其天然(和人工制備的)變體，所述變體與參比蛋白具有至少90%的序列同源性。優(yōu)選至少95%相同，最優(yōu)選至少97%相同。對于PhtX蛋白而言，PhtA在WO 98/18930中公開，也稱作Sp36。如上所述，其是聚組氨酸三聯(lián)體家族蛋白，并具有II型信號基序LXXC。PhtD在WO 00/37105中公開，也稱為Sp036D。如上所述，它也是聚組氨酸三聯(lián)體家族蛋白，并具有II型LXXC信號基序。 PhtB在WO 00/37105中公開，也稱為Sp036B。PhtB家族的另一成員是C3-降解多肽，在WO 00/17370中公開。該蛋白也來自聚組氨酸三聯(lián)體家族，并具有II型LXXC信號基序。優(yōu) 選的免疫功能等效物為在W098/18930中公開的蛋白Sp42。PhtB截短物(約79kD)在WO 99/15675中公開，它也被認為是PhtX家族成員。PhtE在WO 00/30299中公開，稱作BVH-3。當本文提到任何Pht蛋白時，意味著可使用Pht蛋白的免疫原性片段或其融合體。例如，提到的PhtX包括來自任何Pht蛋白的免疫原性片段或其融合體。提到PhtD或PhtB也就提到了可見于例如WO 0198334的PhtDE或PhtBE融合體。肺炎鏈球菌溶血素是一種具有獨特的溶細胞(溶血)作用和補體活化活性的多功能毒素(Rubins 等，Am. Respi. Cit Care Med，153 1339-1346 (1996))。該毒素不由肺炎鏈球菌分泌，而是在肺炎鏈球菌于自溶素影響下裂解時釋放。其作用包括例如刺激人體單核細胞產(chǎn)生炎性細胞因子，抑制人體呼吸上皮纖毛顫動，降低嗜中性粒細胞的殺菌活性和遷移性。肺炎鏈球菌溶血素最明顯的作用在于紅細胞裂解方面，該作用涉及與膽固醇結合。因為肺炎鏈球菌溶血素是一種毒素，因此在其可以體內給藥前必須脫毒(即以適于保護的劑量提供時對人無毒)。在本領域已知野生型或天然肺炎鏈球菌溶血素的表達和克隆。參見例如Walker 等(Infect Immun，55 1184-1189 (1987)) ,Mitchell 等(Biochim Biophys Acta, 1007:67-72(1989)和 Mitchell 等(NAR，18 :4010 (1990))。Ply 的脫毒可以用化學方法進行，例如進行福爾馬林或戊二醛處理或二者的組合(W0 04081515，PCT/EP2005/010258)。這些方法在本領域眾所周知用于多種毒素?；蛘?，Ply可以用基因方法脫毒。因此，本發(fā)明包括肺炎鏈球菌蛋白衍生物，該衍生物可為例如突變蛋白。術語“突變的”在本文用于指已使用公知的定點誘變技術或任何其它常規(guī)方法缺失、增加或取代一個或多個氨基酸的分子。例如如上所述，突變型ply蛋白可以被改變，以使其生物失活，但仍保持其致免疫表位，參見例如 WO 90/06951，Berry 等，(Infect Immun，67 :981_985 (1999))和 W099/03884。要理解的是，此處所用的術語“Ply”是指適于醫(yī)用的突變或脫毒的(即無毒的) 肺炎鏈球菌溶血素。關于膽堿結合蛋白家族(CbpX)，該家族的成員最初被鑒定為能用膽堿親和層析純化的肺炎鏈球菌蛋白。所有膽堿結合蛋白都非共價結合于細胞壁磷壁酸和膜結合脂磷壁酸的磷酸膽堿部分。雖然該蛋白質的確切性質(氨基酸序列、長度等)可以不同，但整個家族具有數(shù)個在結構上相同的區(qū)域。一般來說，膽堿結合蛋白包含N末端區(qū)(N)、保守重復區(qū)(Rl和/或R2)、脯氨酸富集區(qū)(P)和保守的膽堿結合區(qū)(C)，該膽堿結合區(qū)由多個重復序列組成，約占該蛋白的一半。本申請中所用的術語“膽堿結合蛋白家族(CbpX) ”選自W097/41151 中所鑒定的膽堿結合蛋白、PbeA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA公開于W097/41151。 CbpD 和 CbpG 公開于 W000/29434。PspC 公開于 W097/09994。PbcA 公開于 W098/21337。SpsA 為TO 98/39450中公開的膽堿結合蛋白。該膽堿結合蛋白優(yōu)選地選自CbpA、PbcA、SpsA和 PspC0另一個優(yōu)選的實施方案為CbpX截短物，其中“CbpX”如上文定義，“截短物”指缺少 50%或更多的膽堿結合區(qū)(C)的CbpX蛋白。優(yōu)選這樣的蛋白質沒有整個膽堿結合區(qū)。更優(yōu)選這樣的蛋白截短物沒有(i)膽堿結合區(qū)和(ii)沒有該蛋白質的N末端一半的一部分但至少保留一個重復區(qū)(Rl或R2)。更優(yōu)選該截短物具有兩個重復區(qū)(Rl和R2)。這些優(yōu) 選的實施方案的實例是在W099/51266或W099/51188中舉例說明的NRlxR2和RlxR2，但是，其它沒有相似的膽堿結合區(qū)的膽堿結合蛋白也包含在本發(fā)明的范圍內。LytX家族是與細胞裂解有關的膜結合蛋白。N末端結構域包含膽堿結合域，但是， LytX家族并不具有在上述CbpA家族中發(fā)現(xiàn)的所有特征，因此，對于本發(fā)明來說，LytX家族被認為不同于CbpX家族。與CbpX家族相比，LytX的C末端結構域包含LytX蛋白家族的催化域。該家族包含LytA、B和C。對于LytX家族而言，LytA公開于Ronda等，Eur J Biochem, 164 :621_624 (1987)。LytB 公開于 W098/18930，也被稱為 Sp46。LytC 也公開于 WO 98/18930，也被稱為Sp91。該家族的優(yōu)選成員為LytC。另一個優(yōu)選的實施方案為LytX截短物，其中“LytX”在上文定義，“截短物”指沒有50%或更多膽堿結合區(qū)的LytX蛋白。優(yōu)選地，這樣的蛋白質沒有整個膽堿結合區(qū)。本發(fā)明的又一個優(yōu)選實施方案為CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)。優(yōu)選地，該蛋白包含CbpX的NRlxR2 (或RlxR2)和LytX的C末端部分(Cterm，即沒有膽堿結合域) (例如 LytCCterm 或 Sp91Cterm)。更優(yōu)選地，CbpX 選自 CbpA、PbcA、SpsA 和 PspC。更優(yōu)選地，其為CbpA。優(yōu)選地，Lytx為LytC(也被稱為Sp91)。本發(fā)明的另一個實施方案為PspA 或PsaA截短物，其沒有膽堿結合域(C)，并與LytX —起表達為融合蛋白。優(yōu)選地，LytX為 LytC0PsaA和PspA這二者在本領域都是已知的。例如，Berry和Paton，Infect Immun 1996年12月；64(12) :5255_62已描述了 PsaA和其跨膜缺失變體。例如US 5804193、WO 92/14488和WO 99/53940公開了 PspA和其跨膜缺失變體。Spl28和Spl30公開于W000/76540。Spl25是帶有細胞壁錨定基序LPXTG (其中X 為任何氨基酸)的肺炎鏈球菌表面蛋白的實例。已發(fā)現(xiàn)具有此基序的這類肺炎鏈球菌表面蛋白中的任何蛋白在本發(fā)明范圍內都是有用的，因此將其視為本發(fā)明的另一種蛋白。Spl25 本身公開于WO 98/18930，也稱為ZmpB-鋅金屬蛋白酶。SplOl公開于WO 98/06734(其中它的索引為#y85993)。其特征為I型信號序列。Spl33公開于WO 98/06734(其中它的索引為#y85992)。其也以I型信號序列為特征?？砂诼?lián)合疫苗(尤其是用于預防中耳炎的聯(lián)合疫苗)中的優(yōu)選的卡他莫拉菌(Moraxella catarrhal is)蛋白抗原的實例為0MP106 [W097/41731 (Antex)和 WO 96/34960 (PMC) ] ；0MP21 或其片段(W00018910) ； LbpA 和 / 或 LbpB [W0 98/55606 (PMC)]； TbpA 和 / 或 TbpBDWO 97/13785 和 WO 97/32980(PMC)] ；CopB[Helminen ME 等，(1993)Infect. Immun. 61 2003-2010] ；UspAl 和 / 或 UspA2[W0 93/03761 (德克薩斯大學)]； OmpCD ；HasR(PCT/EP99/03824) ；PiIQ (PCT/EP99/03823) ；0MP85(PCT/EP00/01468)； lipo06(GB 9917977. 2) ；IipolO(GB 9918208. 1) ；Iipol 1 (GB 9918302. 2) ；lipol8(GB 9918038.2) ；P6 (PCT/EP99/03038) ；D15 (PCT/EP99/03822) ；OmplAl(PCT/EP99/06781)； Hly3(PCT/EP99/03257)；和OmpE?？砂诼?lián)合疫苗(尤其是用于預防中耳炎的聯(lián)合疫苗) 中的不可分型流感嗜血桿菌抗原或其片段的實例包括絲束蛋白[(US 5766608-俄亥俄州研究基金會)]和含有來自其的肽的融合體[例如LBl (f)肽融合體；US 5843464 (OSU)或WO 99/64067] ；0MP26[W0 97/01638 (Cortecs) ] ；P6 [EP281673 (紐約州立大學)]；TbpA 和 / 或 TbpB；Hia；Hsf ；Hin47 ；Hif ；Hmwl ；Hmw2 ；Hmw3 ；Hmw4 ；Hap ；D15(WO 94/12641) ；P2 ；和 P5(WO 94/26304)。本發(fā)明的蛋白也可以進行有益的組合。所述組合的是指免疫原性組合物包含來自以下組合中的所有蛋白，其或者為載體蛋白，或者為游離蛋白，或者為二者的混合物。例如，在后文陳述的兩種蛋白的組合中，兩種蛋白都可以用作載體蛋白，或者兩種蛋白都可以作為游離蛋白存在，或者兩種蛋白都可以作為載體蛋白和游離蛋白存在，或者一個可作為載體蛋白和游離蛋白存在，而另一個僅作為載體蛋白或僅作為游離蛋白存在。當給出3種蛋白的組合時，存在類似的可能性。優(yōu)選的組合包括但不限于 PhtD+NRlxR2、PhtD+NRlxR2_Sp9ICterm 嵌合蛋白或融合蛋白、PhtD+Ply、PhtD+Spl28、 PhtD+PsaA、PhtD+PspA、PhtA+NRlxR2、Ph tA+NRlxR2_Sp9 ICterm 嵌合蛋白或融合蛋白、 PhtA+Ply、PhtA+Spl28、PhtA+PsaA、PhtA+PspA、NRlxR2+LytC、NRlxR2+PspA、NRlxR2+PsaA、 NRlxR2+Spl28、 RlxR2+LytC、 RlxR2+PspA、 RlxR2+PsaA、 RlxR2+Spl28、 RlxR2+PhtD、 RlxR2+PhtA。優(yōu)選地，NRlxR2(或RlxR2)來自CbpA或PspC。更優(yōu)選地，其來自CbpA。其它組合包括3種蛋白組合，例如PhtD+NRlxR2+Ply以及PhtA+NRlxR2+PhtD。在一個實施方案中，疫苗組合物包含解毒的肺炎鏈球菌溶血素以及PhtD或PhtDE作為載體蛋白。在又一個實施方案中，疫苗組合物包含解毒的肺炎鏈球菌溶血素以及PhtD或PhtDE作為游離蛋白。本發(fā)明還提供含有本發(fā)明的免疫原性組合物和藥學上可接受的賦形劑的疫苗。本發(fā)明的疫苗可被佐劑化，尤其是在計劃用于老年人群而且用于嬰幼兒人群時。適宜的佐劑包括鋁鹽，例如氫氧化鋁凝膠或磷酸鋁或明礬，而且可以為鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽或鋅鹽，或者可為?；野彼峄蝓；?、陽離子或陰離子衍生化糖或聚磷腈的不溶性混懸液。優(yōu)選選擇為THl型應答的優(yōu)先誘導物的佐劑。這些高水平的Thl型細胞因子傾向于支持誘導針對給定抗原的細胞介導的免疫應答，而高水平的Th2型細胞因子傾向于支持誘導針對抗原的體液免疫應答。Thl和Th2型免疫應答的區(qū)別不是絕對的。實際上，個體將支持被描述為以Thl 為主或以Th2為主的免疫應答。然而，經(jīng)常便利地根據(jù)Mosmarm和Coffman在鼠⑶4+ve T細胞克隆中所述來考慮細胞因子家族(Mosmann，Τ. R.和Coffman，R. L. (1989)THl and TH2 cells :different patterns of lymphokine secretion lead to different functionalproperties. (Annual Review of Immunology, 7,145-173 頁)。傳統(tǒng)上，Thl 型應答與T淋巴細胞生產(chǎn)INF- γ和IL-2細胞因子有關。經(jīng)常與Thl型免疫應答的誘導直接相關的其它細胞因子不由T細胞產(chǎn)生，例如IL-12。相比之下，Th2型應答與IL-4、IL-5、 IL-6、IL-IO的分泌有關。主要促進Thl應答的適宜佐劑系統(tǒng)包括單磷酰脂質A或其衍生物，尤其是3-脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|A(3D-MPL)(關于其制備參見GB2220211A)；以及單磷酰脂質A、優(yōu)選的3-脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|A連同鋁鹽(例如磷酸鋁或氫氧化鋁)或水包油乳劑的組合。在這些組合中，抗原和3D-MPL包含在相同的顆粒結構中，允許更有效地傳遞抗原性和免疫刺激性信號。研究表明，3D-MPL能夠進一步增強明礬吸附抗原的免疫原性 [Thoelen 等，Vaccine (1998) 16 :708_14 ；EP689454-B1]。增強的系統(tǒng)包括單磷酰脂質A和皂苷衍生物的組合，尤其是如在WO 94/00153中公開的QS21和3D-MPL的組合，或者如在W096/33739中公開的較少反應原性的組合物，其中QS21用膽固醇猝滅。在WO 95/17210中描述了一種特別有效的佐劑制劑，其包含在水包油乳劑中的QS21、3D-MPL和生育酚。在一個實施方案中，免疫原性組合物另外含有皂苷，其可為QS21。制劑還可以包含水包油乳劑和生育酚(W0 95/17210)。含有寡核苷酸的未甲基化CpG (W0 96/02555)和其它免疫調節(jié)性寡核苷酸(W00226757和W003507822)也是THl應答的優(yōu)先誘導物，適用于本發(fā)明。具體的佐劑選自金屬鹽、水包油乳劑、Toll樣受體激動劑(尤其是Toll樣受體2 激動劑、Toll樣受體3激動劑、Toll樣受體4激動劑、Toll樣受體7激動劑、Toll樣受體 8激動劑和Toll樣受體9激動劑)、皂苷或其組合?？捎糜诒景l(fā)明的疫苗組合物的佐劑為革蘭氏陰性細菌菌株的小泡或外膜囊泡制備物，例如由W002/09746教導的那些-尤其是腦膜炎奈瑟氏球菌小泡。小泡的佐劑特性可通過在其表面上保留LOS (脂寡糖)(例如通過用低濃度去污劑[例如0-0. 脫氧膽酸鹽] 提取)而改善。LOS可通過W002/09746所論述的msbB(-)或htrB(-)突變解毒。佐劑特性還可以通過保留腦膜炎球菌小泡的PorB(和任選地去除PorA)而改善。佐劑特性還可以通過截短腦膜炎球菌小泡上的LOS的外核糖結構而改善-例如經(jīng)由W02004/014417所論述的 IgtB (-)突變?；蛘?，前述LOS (例如分離自msbB (-)和/或IgtB (-)菌株)可被純化并用作本發(fā)明組合物中的佐劑?？捎糜诒景l(fā)明組合物的其它佐劑可選自皂苷、脂質A或其衍生物、免疫刺激性寡核苷酸、烷基氨基葡糖苷磷酸酯、水包油乳劑或其組合。進一步優(yōu)選的佐劑為與另一種佐劑組合的金屬鹽。優(yōu)選佐劑為Toll樣受體激動劑，尤其是Toll樣受體2、3、4、7、8或9的激動劑，或皂苷，尤其是Qs21。進一步優(yōu)選佐劑系統(tǒng)包括前面所列的兩種或多種佐劑。具體而言，組合優(yōu)選地包含皂苷(尤其是Qs21)佐劑和/或Toll樣受體9激動劑，例如含有CpG的免疫刺激性寡核苷酸。其它優(yōu)選組合包含皂苷(尤其是QS21)和Toll樣受體4激動劑，例如單磷酰脂質A或其3脫酰衍生物3D-MPL，或皂苷(尤其是QS21)和Toll樣受體4配體，例如烷基氨基葡糖苷磷酸酯。特別優(yōu)選的佐劑為3D-MPL和QS21的組合(EP 0 671 948 Bi)、含有3D-MPL和 QS21的水包油乳劑(W0 95/17210,WO 98/56414)或者與其它載體一起配制的3D-MPL (EP 0 689 454 Bi)。其它優(yōu)選的佐劑系統(tǒng)包含如在US6558670、US6544518中描述的3D MPL、QS21 和CpG寡核苷酸的組合。在一個實施方案中，佐劑為(或包含)Toll樣受體(TLR)4配體，優(yōu)選激動劑，例如脂質A衍生物，尤其是單磷酰脂質A，或者更具體地說為3脫酰單磷酰脂質A (3D-MPL)。3D-MPL可得自北美葛蘭素史克生物制品公司(GlaxoSmithKlineBiologicals North America)，主要促進具有IFN-g (Thl)表型的CD4+T細胞反應。其可依據(jù)GB 2 220211A中公開的方法生產(chǎn)。在化學上，3D-MPL是具有3、4、5或6條?；湹?-脫酰單磷酰脂質A的混合物。優(yōu)選地在本發(fā)明的組合物中使用小顆粒3D-MPL。小顆粒3D-MPL的粒徑使得其可通過0. 22 μ m濾器除菌過濾。在國際專利申請?zhí)朩094/21292中描述了這些制備物。脂質A的合成衍生物是已知的，并被認為是TLR4激動劑，其包括但不限于0M174(2-脫氧-6-0-[2_脫氧-2_[(R)_3-十二酰氧十四?；被鵠_4-0_膦酰基-β -D-吡喃葡糖基]-2- [ (R) -3-羥基十四?；被鵠_ α -D-吡喃葡糖基二氫磷酸酯)， (W0 95/14026)OM 294 DP (3S，9R) _3_[ (R)-十二酰氧十四?；被鵠_4_ 氧-5-氮雜-9(R)-[(R)_3-羥基十四?；被鵠癸-1，10-二醇，1，10-雙(二氫磷酸酯)，(W0 99/64301和 WO 00/0462)OM 197 MP-Ac DP (3S_，9R) _3_[ (R)-十二酰氧十四酰基氨基]_4_ 氧 _5_ 氮雜-9- [ (R) -3-羥基十四?；被鵠癸-1，10- 二醇，1- 二氫磷酸酯10- (6-氨基己酸酯)(W0 01/46127)其它可用的TLR4配體是烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)，如在W09850399或 US6303347中公開的那些(還公開了用于制備AGP的方法)，或如在US6764840中所公開的 AGP的藥學上可接受的鹽。有些AGP是TLR4激動劑，而有些是TLR4拮抗劑。兩者都被認為可用作佐劑。另一個用于本發(fā)明的優(yōu)選免疫刺激劑是Quil A及其衍生物。QuilA是從南美奎拉雅屬皂樹(Quilaja Saponaria Molina)中分離出來的皂苷制劑，并且由Dalsgaard等在 1974 年首次描述為具有佐劑活性(“Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung，44 卷，Springer Verlag，Berlin, 243-254 頁)。通過 HPLC 已經(jīng)分離了 Quil A的純化片段，其保留了佐劑活性，沒有與Quil A相關的毒性(EP 0 362278)，例如 QS7和QS21 (也稱為QA7和QA21)。QS-21是來源于奎拉雅屬皂樹樹皮的天然皂苷，其誘導 ⑶8+細胞毒性T細胞(CTL)、Thl細胞和主要的IgG2a抗體反應，在本發(fā)明背景下為優(yōu)選皂苷。已經(jīng)描述了特別優(yōu)選的具體QS21制劑，這些制劑還包括固醇(TO96/33739)。本發(fā)明的皂苷形成部分可以是獨立的膠束形式、混合的膠束(優(yōu)選地但不是獨有地具有膽汁鹽)形式，或者當用膽固醇和脂質制備時可以是ISCOM基質(EP 0 109 942 Bi)、脂質體或相關膠體結構的形式，如似螺旋形或環(huán)形多聚體復合物或者油脂/分層的結構和薄片，或者是水包油乳劑形式(例如WO 95/17210)。皂苷可優(yōu)選地與金屬鹽結合，諸如氫氧化鋁或磷酸鋁(W0 98/15287)。優(yōu)選地，皂苷以脂質體、ISCOM或水包油乳劑的形式存在。增強的系統(tǒng)包括單磷酰脂質A(或解毒的脂質A)和皂苷衍生物的的組合，尤其是如在WO 94/00153中公開的QS21和3D-MPL的組合，或如在WO 96/33739中公開的其中QS21 用膽固醇猝滅的較少反應原性的組合物。在WO 95/17210中描述了一種特別有效的佐劑制劑，其在水包油乳劑中包含生育酚，有或沒有QS21和/或3D-MPL。在一個實施方案中，免疫原性組合物另外含有皂苷，其可為QS21。還可以使用免疫刺激性寡核苷酸或任何其它的Toll樣受體(TLR)9激動劑。用于本發(fā)明佐劑或疫苗的優(yōu)選寡核苷酸為包含CpG的寡核苷酸，優(yōu)選地包含兩個或更多個二核苷酸CpG基序，這些基序由至少三個、更優(yōu)選地至少六個或更多個核苷酸分隔。CpG基序是胞嘧啶核苷酸后接鳥嘌呤核苷酸。本發(fā)明的CpG寡核苷酸通常是脫氧核苷酸。在一個優(yōu) 選的實施方案中，寡核苷酸內核苷酸間是二硫代磷酸酯鍵，或者更優(yōu)選硫代磷酸酯鍵，但磷酸二酯鍵和其它核苷酸間鍵也在本發(fā)明范圍內。還包括在本發(fā)明范圍內的是具有混合的核苷酸間鍵的寡核苷酸。用于生產(chǎn)硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于US 5，666， 153、US 5，278，302 和 WO 95/26204。優(yōu)選的寡核苷酸的實例具有以下序列。這些序列優(yōu)選地包含硫代磷酸酯修飾的核苷酸間鍵。OLIGO 1(SEQ ID NO 1) :TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)OLIGO 2 (SEQ ID NO 2) :TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG1758)OLIGO 3 (SEQ ID NO 3) :ACC GAT GAC GTC GCC GGT GACGGC ACC ACGOLIGO 4 (SEQ ID NO 4) :TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTCGTT (CpG 2006)OLIGO 5 (SEQ ID NO 5) :TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)OLIGO 6 (SEQ ID NO 6) :TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G(CpG 5456)備選的CpG寡核苷酸可包含以上的優(yōu)選序列，因為它們具有序列內無關緊要的缺失或添加。本發(fā)明所用的CpG寡核苷酸可通過本領城已知的任一方法合成(例如參見EP 468520)。為方便起見，這些寡核苷酸可利用自動合成儀合成。佐劑可為水包油乳劑，或者可以包含與其它佐劑組合的水包油乳劑。乳劑系統(tǒng)的油相優(yōu)選地含有可代謝油。術語可代謝油的含義在本領域眾所周知?？纱x的可被定義為 “能夠通過代謝轉化的”(道蘭氏圖解醫(yī)學詞典，W. B. Sanders Company，第25版，(1974))。所述油可為任何植物油、魚油、動物油或合成油，其對接受者無毒，能夠通過代謝轉化。堅果、種子和谷物是常見的植物油來源。合成油也是本發(fā)明的一部分，可包括市售油，例如 NEOBEE 等。鯊烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯)是不飽和油，大量存在于鯊魚肝油中，少量存在于橄欖油、麥胚芽油、米糠油和酵母中，是用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的油。鯊烯是可代謝油，其依據(jù)于以下事實其是膽固醇生物合成的中間體(默克索引，第10版，編目流水號8619)。母育酚(例如維生素E)也經(jīng)常用于油性乳劑佐劑(EP 0 382 271B1 ；US5667784 ； WO 95/17210)。用于本發(fā)明的油性乳劑(優(yōu)選水包油乳劑)的母育酚可以如EP 0 382 271 Bl所述配制，因為母育酚可為母育酚液滴分散液，任選地含有乳化劑，優(yōu)選直徑低于1 μ m。或者，母育酚可與另一種油聯(lián)合使用，以形成油性乳劑的油相。本文描述了可與母育酚聯(lián)合使用的油性乳劑的實例，例如上述可代謝油。業(yè)已表明，水包油乳劑佐劑本身可用作佐劑組合物(EP 0 399843B)，水包油乳劑和其它活性物質的組合也已被描述為疫苗佐劑(W0 95/17210 ；WO 98/56414 ；WO 99/12565 ；WO 99/11241)。已表述了其它油性乳劑佐劑，例如油包水乳劑(US 5,422, 109 ； EP 0 480 982 B2)和水包油包水乳劑(US 5, 424, 067 ； EP 0 480 981 B)。所有這些都構成了優(yōu)選的油性乳劑系統(tǒng)(尤其是在摻入母育酚時)，以形成本發(fā)明的佐劑和組合物。最優(yōu)選的油性乳劑(例如水包油乳劑)還包含乳化劑，例如吐溫80和/或固醇，例如膽固醇。優(yōu)選的油性乳劑(任選地水包油乳劑)含有可代謝的無毒性油，例如角鯊烷、鯊烯或生育酚，例如α生育酚(和優(yōu)選鯊烯和α生育酚這二者)，以及任選的乳化劑(或表面活性劑)，例如吐溫80。還可以包括固醇(優(yōu)選膽固醇)。生產(chǎn)水包油乳劑的方法是本領域技術人員熟知的。一般來說，該方法包括將含母育酚的油相與表面活性劑如PBS/吐溫80 溶液混合，然后用勻漿器進行勻漿，對本領域技術人員應顯而易見的是，包括將混合物兩次通過注射器針頭的方法應適于勻化小體積液體。同樣地，本領域技術人員可修改在微射流儀(M110S微流體機器，最多為50個通道，在 6巴的最大壓力輸入下2分鐘的時間段(輸出壓力為約850巴))中的乳化方法，以產(chǎn)生更小體積或更大體積的乳劑。該修改可通過常規(guī)實驗完成，包括測量所得乳劑，直到得到具有所需直徑的油滴的制劑。在水包油乳劑中，油和乳化劑應處于水性載體中。水性載體可為例如磷酸緩沖鹽水。在穩(wěn)定的水包油乳劑中存在的油滴大小，按光子相關光譜學測量，優(yōu)選小于1微米，可基本上在30-600納米的范圍內，優(yōu)選大致約30-500納米直徑，最優(yōu)選大致150-500 納米直徑，尤其是約150納米直徑。在這點上，以數(shù)目計80%的油滴應在優(yōu)選的范圍內，更優(yōu)選以數(shù)目計超過90%的油滴在優(yōu)選的范圍內，而最優(yōu)選以數(shù)目計超過95%的油滴在所定義的大小范圍內。按照常規(guī)，本發(fā)明的油性乳劑中存在的組分量為0. 5-20%或2-10%的油(總劑量體積)，例如鯊烯；且如果有α生育酚則為2-10%;以及0.3-3%的表面活性劑，如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。優(yōu)選油(例如鯊烯)母育酚(例如α-生育酚)的比率等于或小于1，因為這樣提供了更穩(wěn)定的乳劑。諸如吐溫80或司盤85的乳化劑也可以以約的水平存在。在某些情況下，本發(fā)明的疫苗還包含有穩(wěn)定劑可能是有利的。優(yōu)選的乳劑系統(tǒng)的實例描述于WO 95/17210、WO 99/11241和WO 99/12565，其公開了基于鯊烯、α生育酚和吐溫80的乳劑佐劑，其任選地與免疫刺激劑QS21和/或3D-MPL 一起配制。因此，在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的佐劑可另外含有其它的免疫刺激劑，例如LPS或其衍生物，和/或皂苷。其它免疫刺激劑的實例描述于本文和“Vaccine Design-The Subunit and Adjuvant Approach，，1995, Pharmaceutical Biotechnology, 第 6 卷，Powell, Μ. F.禾口 Newman，Μ. J.編輯，Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X。在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明的佐劑和免疫原性組合物包含在上述油性乳劑中的皂苷 (優(yōu)選QS21)和/或LPS衍生物(優(yōu)選3D-MPL)，任選地具有固醇(優(yōu)選膽固醇)。另外，油性乳劑(優(yōu)選水包油乳劑)可含有司盤85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。含有水包油乳劑、固醇和皂苷的佐劑描述于WO 99/12565。通常，對于人類給藥而言，皂苷(優(yōu)選QS21)和/或LPS衍生物(優(yōu)選3D-MPL)在人類免疫原性組合物劑量中以1 μ g-200 μ g/劑存在，例如10-100 μ g/劑，優(yōu)選10 μ g_50 μ g/ 劑。通常，油性乳劑(優(yōu)選水包油乳劑)包含2-10%可代謝油。優(yōu)選地，其包含2-10%鯊烯、2-10% α生育酚和0.3-3% (優(yōu)選0.4-2%)乳化劑(優(yōu)選吐溫80[聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯])。在鯊烯和α生育酚這二者均存在時，優(yōu)選鯊烯與α生育酚的比率等于或小于1，因為這提供了更穩(wěn)定的乳劑。司盤85 (山梨糖醇酐三油酸酯)也可以在用于本發(fā) 明的乳劑中以0. 5-1 %的水平存在。在某些情況下，本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗還包含穩(wěn)定劑可能是有利的，所述穩(wěn)定劑例如為其它乳化劑/表面活性劑，包括辛酸(默克索引第10版，編目流水號1739)，其中特別優(yōu)選三辛酸甘油酯。在含有鯊烯和皂苷(優(yōu)選QS21)時，制劑還包含固醇(優(yōu)選膽固醇)是有益的，因為這能夠降低乳劑中的總油量。這可使得生產(chǎn)成本降低，接種的總體舒適性改善，還定量和定性地改善了所獲免疫應答，例如改善了 IFN-Y生產(chǎn)。因此，本發(fā)明的佐劑系統(tǒng)通常包含比率在200 1-300 1范圍內的可代謝油皂苷(重量/重量)，還可以以“低油”形式使用本發(fā)明，其優(yōu)選的范圍為1 1-200 1，優(yōu)選20 1-100 1，最優(yōu)選大體上為48 1，該疫苗保持了所有組分的有益佐劑特性，同時顯著減少了反應原性。因此，特別優(yōu)選的實施方案具有的鯊烯QS21(重量/重量)比率在1 1-250 1的范圍內，還優(yōu)選的范圍為 20 1-200 1，優(yōu)選20 1-100 1，最優(yōu)選大體上為48 1。優(yōu)選地，還包括按照本文所述的皂苷固醇的比率存在固醇(最優(yōu)選膽固醇)。本發(fā)明的乳劑系統(tǒng)優(yōu)選具有在亞微米范圍內的小油滴大小。最優(yōu)選地，油滴大小為直徑120-750nm，最優(yōu)選直徑120_600nm。特別有效的佐劑制劑(用于在本發(fā)明的免疫原性組合物中與A1P04最終組合)包括皂苷(優(yōu)選QS21)、LPS衍生物(優(yōu)選3D-MPL)和油性乳劑(優(yōu)選鯊烯和α生育酚的水包油乳劑)，其描述于WO 95/17210或WO 99/12565 (尤其是在實施例2表1中的佐劑制劑 11)。TLR 2激動劑的實例包括肽聚糖或脂蛋白。咪唑并喹啉，例如咪喹莫特和雷西莫特，是已知的TLR7激動劑。單鏈RNA也是已知的TLR激動劑(在人中的TLR8和在小鼠中的TLR7)，而雙鏈RNA和聚合IC (聚肌苷酸-聚胞嘧啶核苷酸，其為市售的病毒RNA的合成模擬物)是TLR 3激動劑的示例。3D-MPL是TLR4激動劑的實例，而CPG是TLR9激動劑的實例。免疫原性組合物可以包含吸附在金屬鹽上的抗原和免疫刺激物。其中抗原和免疫刺激物3-脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|A(3D-MPL)吸附到相同顆粒上的基于鋁的疫苗制劑描述于EP 0 576 478 Bi、EP 0 689 454B1和EP 0 633 784 Bi。那么，在這些情況下，抗原首先吸附到鋁鹽上，之后將免疫刺激劑3D-MPL吸附到相同鋁鹽顆粒上。這些方法首先包括在水浴中通過超聲懸浮3D-MPL，直至顆粒達到80-500nm的大小。通常，抗原于室溫攪拌1小時吸附到鋁鹽上。然后將3D-MPL懸浮液加入至吸附抗原，制劑于室溫溫育1小時，然后保持于4°C，直至使用。在另一種方法中，免疫刺激物和抗原在單獨的金屬顆粒上，如在EP 1126876中所述。改善的方法包括將免疫刺激物吸附到金屬鹽顆粒上，接著將抗原吸附到另一種金屬鹽顆粒上，之后混合單獨的金屬顆粒，以形成疫苗。用于本發(fā)明的佐劑可為包含免疫刺激物的佐劑組合物，其吸附到金屬鹽顆粒上，特征在于金屬鹽顆?；緵]有其它抗原。此外，疫苗由本發(fā)明提供，特征在于免疫刺激物吸附到基本沒有其它抗原的金屬鹽顆粒上，以及特征在于吸附抗原的金屬鹽顆?；緵]有其它免疫刺激物。因此，本發(fā)明提供含有免疫刺激物的佐劑制劑，其已吸附到金屬鹽顆粒上，特征在于組合物基本沒有其它抗原。此外，該佐劑制劑可為中間體，如果使用這樣的佐劑，則其是生產(chǎn)疫苗所必需的。因此，提供一種生產(chǎn)疫苗的方法，包括將為一種或多種吸附到金屬顆粒上的免疫刺激物的佐劑組合物與抗原混合。優(yōu)選地，抗原可預先吸附到金屬鹽上。所述金屬鹽可與吸附到免疫刺激物上的金屬鹽相同或相似。優(yōu)選地，金屬鹽為鋁鹽，例如磷酸鋁或
27氫氧化鋁。本發(fā)明還提供一種疫苗組合物，其含有吸附到第一種金屬鹽顆粒上的免疫刺激物和吸附到金屬鹽上的抗原，其特征在于第一種和第二種金屬鹽顆粒為單獨的顆粒。本文描述的LPS或LOS衍生物或突變或脂質A衍生物設計得比天然脂多糖毒性低(例如3D-MPL)，就本文描述的這些部分的任何用途而言是可互換的等效物。它們可為如上所述的TLR4配體。其它這樣的衍生物描述于W0020786737、W09850399、W00134617、 W00212258、W003065806。在一個實施方案中，用于本發(fā)明的組合物的佐劑包含脂質體載體(通過已知技術由磷脂(例如二油酰磷脂酰膽堿[D0PC])和任選的固醇[例如膽固醇]制備)。這些脂質體載體可攜帶脂質A衍生物[例如3D-MPL-參見上文]和/或皂苷(例如QS21-參見上文)。在一個實施方案中，佐劑含有(每0. 5mL劑量)0. l-10mg、0. 2_7mg、0· 3_5mg、0· 4_2mg 或 0. 5-lmg(例如 0· 4-0. 6mg、0. 9-1. lmg、0. 5mg 或 lmg)磷脂(例如 DOPC) ；0. 025-2. 5mg、 0. 05-1. 5mg、0. 075-0. 75mg、0. 1-0. 3mg 或 0. 125-0. 25mg(例如 0. 2-0. 3mg、0. 1-0. 15mg、 0. 25mg 或 0. 125mg)固醇(例如膽固醇)；5-60 μ g、10-50 μ g 或 20-30 μ g(例如 5-15 μ g、 40-50 μ g、10 μ g、20 μ g、30 μ g、40 μ g 或 50 μ g)月旨質 A 衍生物(例如 3D-MPL)；以及 5-60 μ g、10-50 μ g 或 20-30 μ g(例如 5-15μ g、40-50y g、10y g、20y g、30y g、40y g 或 50 μ g)皂苷(例如QS21)。該佐劑尤其適合于老年疫苗制劑。在一個實施方案中，含有此佐劑的疫苗組合物包含來源于至少以下所有血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并還可以包含來自血清型3、6A、19A和22F的一種或多種糖綴合物)，其中在人類接種者中針對一種或多種(或全部)疫苗組分4、68、抓、14、18(、19 和23F誘導的GMC抗體效價不明顯劣于Prevnar 疫苗誘導的抗體效價。在一個實施方案中，用于本發(fā)明組合物的佐劑包含由可代謝油(例如鯊烯)、乳化劑(例如吐溫80)和任選的母育酚(例如α生育酚)制備的水包油乳劑。在一個實施方案中，佐劑含有(每 0. 5mL 劑量)0· 5-15mg、l-13mg、2-llmg、4-8mg 或 5_6mg(例如 2_3mg、 5-6mg 或 10-1 lmg)可代謝油(例如鯊烯)；0. I-IOmg,0. 3_8mg、0. 6_6mg、0. 9-5mg、l_4mg 或2-3mg(例如0. 9-1. lmg、2-3mg或4_5mg)乳化劑(例如吐溫80)；和任選的0. 5_20mg、 l-15mg、2-12mg、4-10mg、5-7mg(例如 ll-13mg、5-6mg 或 2-3mg)母育酚(例如 α 生育酚)。該佐劑任選地還可以包含5-60 μ gU0-50 μ g或20-30 μ g (例如5_15 μ g、 40-50 μ g、10 μ g、20 μ g、30 μ g、40 μ g 或 50 μ g)脂質 A 衍生物(例如 3D-MPL)。這些佐劑尤其適合于嬰兒或老年疫苗制劑。在一個實施方案中，含有此佐劑的疫苗組合物包含來源于至少以下所有血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、 7F(并還可以包含來自血清型3、6A、19A和22F的一種或多種糖綴合物)，其中在人類接種者中針對一種或多種(或全部)疫苗組分4、68、抓、14、18(、19 和23F誘導的GMC抗體效價不明顯劣于Prevnar 疫苗誘導的抗體效價。該佐劑任選地可含有0. 025-2. 5mg、0. 05-1. 5mg、0. 075-0. 75mg、0. 1-0. 3mg 或 0. 125-0. 25mg(例如 0. 2-0. 3mg、0. 1-0. 15mg、0. 25mg 或 0. 125mg)固醇(例如膽固醇)； 5-60 μ g、10-50 μ g 或 20-30 μ g(例如 5-15μ g、40-50y g、10y g、20y g、30y g、40y g 或 50 μ g)脂質 A 衍生物(例如 3D-MPL)；禾口 5-60 μ g、10—50 μ g 或 20—30 μ g (例如 5-15 μ g、40-50μ g、10y g、20y g、30y g、40y g 或 50μ g)皂苷(例如 QS21)。該佐劑尤其適合于老年疫苗制劑。在一個實施方案中，含有此佐劑的疫苗組合物包含來源于至少以下所有血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并還可以包含來自血清型3、6A、19A和22F的一種或多種糖綴合物)，其中在人類接種者中針對一種或多種(或全部)疫苗組分4、6B、9V、14、18C、19F和23F誘導的GMC抗體效價不明顯劣于Prevnar 疫苗誘導的抗體效價。在一個實施方案中，用于本發(fā)明組合物的佐劑包含磷酸鋁和脂質A衍生物(例如 3D-MPL)。該佐劑可包含(每 0. 5mL 劑量)100-750 μ g、200-500 μ g 或 300-400 μ g 為磷酸鋁的 Al，和 5-60μ g、10-50y g或20-30μ g (例如 5-15 μ g、40_50 μ g、10 μ g、20 μ g、30 μ g、 40 μ g或50 μ g)脂質A衍生物(例如3D-MPL)。該佐劑尤其適合于老年或嬰兒疫苗制劑。在一個實施方案中，含有此佐劑的疫苗組合物包含來源于至少以下所有血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、 7F(并還可以包含來自血清型3、6A、19A和22F的一種或多種糖綴合物)，其中在人類接種者中針對一種或多種(或全部)疫苗組分4、68、抓、14、18(、19 和23F誘導的GMC抗體效價不明顯劣于Prevnar 疫苗誘導的抗體效價。通過將含有本發(fā)明的免疫原性組合物的疫苗制備物經(jīng)系統(tǒng)或粘膜途徑給藥，所述疫苗可用于保護或治療對感染易感的哺乳動物。這些給藥可包括經(jīng)肌內(IM)、腹膜內 (IP)、皮內(ID)或皮下(SC)途徑注射；或經(jīng)粘膜給予至口 /消化道、呼吸道、泌尿生殖道。優(yōu)選鼻內(IN)給予疫苗治療肺炎或中耳炎(由于能更有效地阻止肺炎鏈球菌的鼻咽攜帶，因此能在其最早期減弱感染)。盡管本發(fā)明的疫苗可作為單劑給予，但其組分也可以同時或在不同時間一起共給予(例如肺炎鏈球菌糖綴合物可單獨給予、同時給予或在給予疫苗的任何細菌蛋白組分之后1-2周給予，用于彼此之間免疫應答的最佳協(xié)調)。對于共給予或同時給予，任選的Thl佐劑可存在于任意的或全部的不同給藥中。除了單一給藥途徑之外，還可使用2種不同的給藥途徑。例如，糖或糖綴合物可IM(或ID)給予，細菌蛋白可IN(或 ID)給予。另外，本發(fā)明的疫苗可IM給予初次劑量，IN給予加強劑量。疫苗中的蛋白抗原的含量通常在1-100 μ g的范圍內，任選地為5-50 μ g，例如在 5-25 μ g的范圍內。在初始接種后，受試者可接受1次或數(shù)次足夠間隔的加強免疫。疫苗制劑一般描述于Vaccine Design ( "The subunit and adjuvantapproach" (Powell M. F.禾口 Newman M. J.編輯)(1995)Plenum Press NewYork)。在脂質體中的囊化描述于Fullerton，美國專利4，235，877。本發(fā)明的疫苗可以溶液或凍干形式儲存。優(yōu)選地，溶液在例如蔗糖或乳糖的糖存在下凍干。更進一步優(yōu)選它們被凍干，并在使用前臨時重配。凍干可產(chǎn)生更穩(wěn)定的組合物 (疫苗)，并可能在存在3D-MPL及不存在基于鋁的佐劑的情況下產(chǎn)生更高的抗體效價。在本發(fā)明的一個方面，提供一種疫苗藥盒，其包括含有本發(fā)明的免疫原性組合物 (任選地為凍干形式)的小瓶，并還包括含有本文所述佐劑的小瓶?？深A見的是，在本發(fā)明的該方面，佐劑將用于重配凍干的免疫原性組合物。盡管本發(fā)明的疫苗可通過任何途徑給予，但將所述疫苗給予到皮膚中(ID)構成了本發(fā)明的一個實施方案。人皮膚含有外“角狀”表皮，叫做角質層，其覆蓋表皮。在此表皮下面是叫做真皮的層，其又覆蓋皮下組織。研究者已表明，將疫苗注射到皮膚中，尤其是真皮中，刺激免疫應答，其還可能與許多其它優(yōu)勢有關。用本文所述疫苗皮內接種構成了本發(fā)明的優(yōu)選特征。皮內注射的常規(guī)技術“芒圖操作(mantoux procedure) ”包括下述步驟清潔皮膚，然后伸出一只手，使小號針(26-31號)的斜面朝上，以10-15°的角度將針插入。一旦針斜面被插入，就降低針管并前推，同時輕壓使其在皮膚下抬高。然后將液體非常緩慢地注入，這樣便在皮膚表面上形成一個大包或腫塊，接著緩慢抽出針。近來，已描述了特別設計用于皮內或通過皮膚給予液體制劑的裝置，例如在WO 99/34850 和 EP 1092444 中描述的裝置，以及例如在 WO 01/13977、US 5, 480, 381, US 5，599，302、US 5，334，144、US5, 993，412、US 5，649，912、US 5，569，189、US 5，704，911、US 5，383，851、US 5，893，397、US 5，466，220、US 5,339，163、US 5，312，335、US5, 503，627、US 5, 064, 413,US 5, 520, 639,US 4, 596, 556,US 4, 790, 824,US 4, 941, 880,US 4，940，460、WO 97/37705和WO 97/13537中描述的噴射注射裝置。疫苗制劑的真皮內給藥替代方法可包括常規(guī)注射器和針，或設計用于固體疫苗的彈道式給藥(ballistic)的裝置(W099/27961)，或透皮貼劑(W0 97/48440 ；WO 98/28037)；或皮膚表面給藥(經(jīng)真皮或經(jīng)皮傳送，WO 98/20734 ；WO 98/28037)。當本發(fā)明的疫苗給予皮膚時，或更具體地說給予到真皮中時，疫苗為小液體體積，具體地說為約0. 05ml至0. 2ml的體積。本發(fā)明皮膚或皮內疫苗中的抗原含量可類似于肌內注射疫苗中存在的常規(guī)劑量 (參見上文)。然而，皮膚或皮內疫苗的一個特點是制劑可以為“低劑量”。因此，“低劑量”疫苗中的蛋白抗原優(yōu)選地以低至每劑0. 1-10 μ g、優(yōu)選地每劑0. 1-5 μ g存在；存在的糖(優(yōu) 選綴合型)抗原可以為每劑0. 01-1 μ g糖、優(yōu)選0. 01-0. 5 μ g糖。此處所用的術語“皮內傳送”是指將疫苗給至皮膚的真皮區(qū)域。然而，疫苗不一定僅定位于真皮內。真皮層是距離人體皮膚表面約1. Omm至約2. Omm的皮層，但個體之間和機體的不同部位之間存在一定量的差異。一般地說，預計疫苗可以通過進入皮膚表面下1.5mm 達到真皮層。真皮位于在表面的角質層和表皮與下面的皮下層之間。根據(jù)給藥模式，可以使疫苗最終僅存在于或主要存在于真皮內，或最終可分布于表皮和真皮內。本發(fā)明還通過加入綴合形式的流感嗜血桿菌蛋白(如D蛋白)提供預防或減輕流感嗜血桿菌所致中耳炎的改良疫苗。另外，本發(fā)明還通過向本發(fā)明的肺炎鏈球菌綴合組合物加入為游離蛋白或綴合蛋白的一種或兩種肺炎鏈球菌蛋白，提供在嬰兒中預防或減輕肺炎鏈球菌感染(例如中耳炎)的改良疫苗。所述肺炎鏈球菌游離蛋白可與用作載體蛋白的任何肺炎鏈球菌蛋白相同或不同。一種或多種卡他莫拉菌(Moraxella catarrhal is)蛋白抗原也可以游離形式或綴合形式包含在聯(lián)合疫苗中。因此，本發(fā)明為在嬰兒中激發(fā)抵御中耳炎的(保護性)免疫應答的改良方法。在另一個實施方案中，本發(fā)明為通過給予安全有效量的本發(fā)明疫苗[兒科疫苗]，在嬰兒(在本發(fā)明背景下定義為0-2歲)中激發(fā)(保護性)免疫應答的改良方法。此外，本發(fā)明的實施方案包括提供用于藥物的本發(fā)明的抗原性肺炎鏈球菌綴合組合物以及本發(fā) 明的肺炎鏈球菌綴合物在制造用于預防(或治療)肺炎鏈球菌疾病的藥物中的用途。在又一個實施方案中，本發(fā)明為一種改良方法，該方法通過給予安全有效量的本發(fā)明疫苗(優(yōu)選地連同一種或兩種作為游離或綴合蛋白存在的肺炎鏈球菌蛋白)，在老年人群(在本發(fā)明背景下患者如果為50歲或以上，通常超過55歲，更通常超過60歲，則被視為老年人)中激發(fā)(保護性)免疫應答，所述游離的肺炎鏈球菌蛋白可與用作載體蛋白的任何肺炎鏈球菌蛋白相同或不同。本發(fā)明的又一方面是免疫人類宿主抵御肺炎鏈球菌和任選流感嗜血桿菌感染所致疾病的方法，該方法包括給予宿主免疫保護劑量的本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗或藥盒。本發(fā)明的又一方面為用于治療或預防肺炎鏈球菌和任選流感嗜血桿菌感染所致疾病的本發(fā)明免疫原性組合物。本發(fā)明的又一方面為本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗或藥盒在制造藥物中的用途，所述藥物用于治療或預防由肺炎鏈球菌和任選的流感嗜血桿菌感染所致疾病。在所有情況下，本發(fā)明人使用的術語“包含”、“含有”和“包括”均可任選用術語 “由......組成”、“......組成為”替換。涉及本發(fā)明的“疫苗組合物”的本文的實施方案也適用于與本發(fā)明的“免疫原性組合物”相關的實施方案，反之亦然。在本專利說明書中提及的所有參考文獻或專利申請都通過引用結合到本文中。為了可更好地理解本發(fā)明，提供以下實施例。這些實施例僅是為了闡述目的，無意以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1:D蛋白的表達流感嗜血桿菌D蛋白用于D蛋白表達的遺傳構建起始物質編碼D蛋白的DNAD蛋白在所有血清型以及不能分型的流感嗜血桿菌菌株中都高度保守。含有整個D蛋白基因編碼DNA序列的載體pHIC348由A. Forsgren博士，Department of Medical Microbiology,University of Lund,Malmo General Hospital,Malm0，Sweden 處獲得。 D 蛋白的 DNA 序列由 Janson 等，(1991) Infect. Immun. 59 119-125 發(fā)表。表達載體pMGl表達載體pMGl為pBR322衍生物(Gross等，1985)，其中導入了來源于噬菌體λ 的控制元件，該控制元件用于外源插入基因的轉錄和翻譯(Shatzman等，1983)。此外，氨芐青霉素抗性基因被替換成卡那霉素抗性基因。大腸桿菌菌株AR58用預先在SA500衍生物(galE: :ΤΝ10, λ Kil_cI857 Δ HI)中生長的Pl噬菌體原液轉導N99產(chǎn)生大腸桿菌菌株AR58。N99和SA500為大腸桿菌K12菌株，得自國立衛(wèi)生研究所的Martin Rosenberg博士實驗室。表達載體pMGl為生產(chǎn)D蛋白，將編碼該蛋白的DNA克隆到表達載體pMGl中。該質粒使用λ噬菌體DNA的信號來驅動插入的外源基因的轉錄和翻譯。該載體含有啟動子PL、操縱子OL和2個可用位點(NutL和NutR)，從而在提供N蛋白時緩解轉錄極性效應(Gross等，1985)。將含有PL啟動子的載體引入一種大腸桿菌溶原性宿主，以穩(wěn)定質粒DNA。溶原性宿主菌株含有整合到基因組中的復制缺陷型λ噬菌體DNA(ShatZman等，1983)。染色體中的λ噬菌體DNA可引導el阻抑蛋白的合成，cl蛋白結合載體的OL阻抑物，阻止RNA聚合酶與PL 啟動子結合，從而防止插入基因轉錄。表達菌株AR58的cl基因含有溫度敏感性突變，使得可通過溫度變化來調控PL引導的轉錄，即提高培養(yǎng)溫度可使阻抑物失活，并開始合成外源蛋白。該表達系統(tǒng)可使外源蛋白(尤其是可能對細胞有毒性的那些外源蛋白)受控合成 (Shimataka 禾口 Rosenberg,1981)。大腸桿菌菌株AR58用于產(chǎn)生D蛋白載體的AR58溶原性大腸桿菌菌株為標準NIH大腸桿菌K12菌株N99(F-Su_galK2，lacZ—thr—)的衍生物。它含有缺陷型溶原性入噬菌體(galE::TN10, XKil_cI857AHl)。Kil_表型防止宿主停止合成大分子。cI857突變賦予cl阻抑物溫度敏感性損傷。ΔHl缺失去除λ噬菌體的右側操縱子以及宿主的bio、uvr3和chlA基因座。用預先在SA500衍生物(galE: : iO，lambdaKil_cI857AHl)中生長的Pl噬菌體原液轉導 N99產(chǎn)生AR58菌株。由于galE基因附近存在編碼四環(huán)素抗性的TNlO轉座子，因而可利用四環(huán)素對N99中缺陷型溶菌原的導入情況進行選擇。載體pMGMDPPrD的構建使用含有流感病毒非結構Sl蛋白編碼基因的pMGl載體(pMGNSI)構建 pMGMDPPrD。利用在5 ‘和3 ‘端分別含有NcoI與XbaI限制位點的PCR引物經(jīng)PCR由 PHIC348 載體(Janson 等，19991，Infect. Immun. 59 119-125)擴增 D 蛋白基因。然后將 Ncol/Xbal片段引入到pMGNSI的NcoI與XbaI之間，由此產(chǎn)生含有NSl蛋白的N端81個氨基酸并后接PD蛋白的融合蛋白。該載體稱為pMGNSlPrD?；谏鲜鰳嫿w產(chǎn)生用于D蛋白表達的最終構建體。從pMGNSlPrD中去除BamHI/ BamHI片段。該DNA水解反應去除除前3個N端殘基之外的NSl編碼區(qū)。在該載體重新連接時，產(chǎn)生編碼具有在WO 07/71711實施例1第44頁中所示序列的融合蛋白的基因D蛋白不含有前導肽或通常連接有脂鏈的N端半胱氨酸。因此，該蛋白不會被分泌到周質中，也不會被脂化，而是以可溶形式保留在細胞質中。通過于37°C熱激將最終構建體pMG-MDPPrD導入到AR58宿主菌株中。在卡那霉素存在下選擇含有質粒的細菌。用選定的內切核酸酶消化分離的質粒DNA來證實編碼DNA插入序列的D蛋白的存在。重組的大腸桿菌菌株稱為E⑶4。D蛋白的表達處于λ &啟動子/(^操縱子控制之下。宿主菌株AR58的基因組中含有溫度敏感性cl基因，該基因在低溫下可通過與A結合來阻斷由λ &啟動的表達。一旦溫度提高，cl就由釋放，D蛋白得以表達。小規(guī)模制備在發(fā)酵結束時，可將細胞濃縮并冷凍。如下進行收集細胞的提取和D蛋白純化。將冷凍的細胞培養(yǎng)物解凍，并重懸于細胞裂解液(檸檬酸鹽緩沖液，PH 6.0)中，使最終OD65tl = 60。使該懸浮液兩次流經(jīng)P = IOOObar的高壓勻漿器。通過離心澄清細胞培養(yǎng)物勻漿，并過濾去除細胞碎片。在第一個純化步驟中，將過濾的裂解物上樣于陽離子交換層析柱(SP Sepharose Fast Flow)。PD可通過離子作用與凝膠基質結合，并可通過增加洗脫緩沖液的離子強度的步驟洗脫PD。在第二個純化步驟中，雜質保留在陰離子交換基質(Q SepharoseFast Flow)上。 PD未結合到凝膠上，并可收集在流出物中。兩個柱層析步驟均利用OD監(jiān)測分部收集物。通過超濾濃縮含有純化的D蛋白的陰離子交換柱層析的流出物。最后，使含有D蛋白的超濾保留物通過0. 2 μ m膜。大規(guī)模制備如下進行收集細胞的提取和D蛋白的純化。冷卻收集的培養(yǎng)液，然后使其直接通過約800bar壓力的高壓勻漿器2次。在第一個純化步驟中，稀釋細胞培養(yǎng)物勻漿，然后將其上樣于陽離子交換層析柱 (SP Sepharose Big beads) 0 PD通過離子作用結合凝膠基質，通過增加洗脫緩沖液的離子強度的步驟洗脫PD，并過濾。在第二個純化步驟中，雜質保留在陰離子交換基質(Q SepharoseFast Flow)上。 PD未結合到凝膠上，并可收集在流出物中。兩個柱層析步驟均利用OD監(jiān)測分部收集物。通過超濾濃縮并滲濾含有純化的D 蛋白的陰離子交換柱層析的流出物。最后，使含有D蛋白的超濾保留物通過0. 2 μ m膜。實施例lb =PhtD的表達PhtD蛋白是肺炎鏈球菌組氨酸三聯(lián)體(Pht)蛋白家族的成員，其特征在于存在組氨酸三聯(lián)體(HXXHXH基序)。PhtD是838個氨基酸的分子，具有5個組氨酸三聯(lián)體(參見 MedImmune WO 00/37105 SEQ IDNO :4 的氨基酸序列和 SEQ ID NO :5 的 DNA 序列)。PhtD 還在中部(氨基酸位置348-380)含有富集脯氨酸的區(qū)域。PhtD具有20個氨基酸的N末端信號序列和LXXC基序。遺傳構建體使用攜帶ρ λ啟動子的自制pTCMP14載體將成熟的MedlmmimePhtD蛋白(由氨基酸21至氨基酸838)的基因序列重組轉移到大腸桿菌中。大腸桿菌宿主菌株為AR58，其攜帶CI857熱敏感性阻抑物，允許熱誘導啟動子。實施聚合酶鏈式反應，以由Medlmmime質粒擴增phtD基因(攜帶肺炎鏈球菌菌株Norway 4 (血清型4)的phtD基因-如在W000/37105中所述的SEQ ID NO :5)。使用僅 PhtD基因特異性的引物擴增兩個片段中的phtD基因。引物攜帶NdeI和KpnI限制位點或 KpnI和XbaI限制位點。這些引物不與該載體的任何核苷酸雜交，而是僅與phtD特異性基因序列雜交。使用攜帶NdeI限制位點的第一個引物插入人工ATG起始密碼子。然后將產(chǎn) 生的PCR產(chǎn)物插入到pGEM-T克隆載體(Promega)中，并測試DNA序列。然后使用標準技術在TCMP14表達載體中實現(xiàn)片段亞克隆，并將載體轉化入AR58大腸桿菌中。PhtD 純化如下實現(xiàn)PhtD純化□在卡那霉素存在下大腸桿菌細胞的生長于30°C生長30小時，然后于39. 5°C溫育18小時?！踉谧鳛榈鞍酌敢种苿┑?mM EDTA和2mM PMSF存在下以OD士 115由完整培養(yǎng)物破碎大腸桿菌細胞Rannie，2次通過，lOOObar?！跤谑覝?20°C )用膨脹床模式Streamline Q XL層析去除抗原捕獲物和細胞碎片；柱子用 NaCl 150mM+Empigen 0. 25% pH 6. 5洗滌，并用 NaCI 400mM+Empigen 0.25% 的 25mM磷酸鉀緩沖液pH 7. 4溶液洗脫?！跤?Sartobran 150 濾器(0. 45+0. 2 μ m)過濾?！踉?mM咪唑存在下于4°C抗原結合在螯合Zn++的S印harose FFIMAC層析柱pH 7. 4上；該柱用5mM咪唑和1 % Empigen洗滌，并用50mM咪唑洗脫，二者均在25mM磷酸鉀緩沖液pH8. 0中?！跻躁栯x子模式在Fractogel EMD DEAE pH 8. O (25mM磷酸鉀)上于4°C進行弱陰離子交換層析；該柱用140mM NaCl洗滌，并用200mM NaCl洗脫，同時雜質(蛋白和DNA) 仍吸附在交換劑上?！跤?0kDa膜以2mM磷酸鈉/鉀pH 7. 15濃縮和超濾。□純化的原液(bulk)經(jīng)0. 2 μ m Millipak-20濾器除菌過濾。實施例Ic 肺炎鏈球菌溶血素的表達如在W02004/081515和W02006/032499中所述制備和解毒肺炎鏈球菌性肺炎鏈球菌溶血素。實施例2 綴合物的制備在本領域眾所周知如何制備純化的肺炎鏈球菌多糖。就這些實施例而言，多糖基本如EP072513所述制備，或者通過緊密相關的方法制備。在綴合前，多糖可通過如下所述的微流化調整大小?；罨团悸?lián)條件對每一種多糖都是特異性的。這些條件在表1中給出。將調整過大小的多糖(PS5、6B和23F除外)溶解在2M NaCUO. 2M NaCl或注射用水(WFI)中。評估所有血清型的最佳多糖濃度。除血清型18C之外的所有血清型都如下詳述與載體蛋白直接綴合。產(chǎn)生2種替代血清型22F綴合物，1種直接綴合，1種通過ADH接頭綴合。將100mg/ml CDAP在乙腈或乙腈/水50% /50%溶液中的母液(CDAP/PS比率為 0. 5-1. 5mg/mg PS)加入多糖溶液。1. 5分鐘后，加入0. 2M-0. 3M NaOH,以獲得特定活化pH。在此pH于25°C在3分鐘內進行多糖的活化。將純化的蛋白(D蛋白、PhtD、肺炎鏈球菌溶血素或DT)(其量取決于初始PS/載體蛋白的比值)加入活化的多糖中，在該特定pH于pH調節(jié)下進行偶聯(lián)反應達2小時(取決于血清型)。為了猝滅未反應的氰酸酯基團，然后將2M 甘氨酸溶液加入混合物。調節(jié)PH至猝滅pH(pH 9.0)。于25°C攪拌溶液30分鐘，然后在持續(xù)的緩慢攪拌下于2-8°C過夜。18C 的制備18C經(jīng)接頭己二酸二酰胼(ADH)與載體蛋白連接。多糖血清型18C在綴合前被微流化。用EDAC衍生化破傷風類毒素為衍生化破傷風類毒素，用0. 2M NaCl將純化的TT稀釋至25mg/ml，加入ADH間隔臂，以便達到0.2M終濃度。當間隔臂完全溶解時，將pH調節(jié)至6.2。然后加入EDACd-乙基-3- (3- 二甲基-氨基丙基)碳二亞胺)，以達到0. 02M終濃度，在pH調節(jié)下攪拌混合物1小時。通過于25°C增加pH至9. 0達至少30分鐘終止縮合反應。然后滲濾衍化TT (IOkDa CO膜)，以便去除殘余的ADH和EDAC試劑。最后除菌過濾TTah原液，直至偶聯(lián)步驟，并儲存于-70°C。TTah與PS 18C的化學偶聯(lián)詳細的綴合參數(shù)可見于表1。以限定的濃度用水稀釋2g微流化PS，并通過加入NaCl粉末調節(jié)至2M NaCl。加入CDAP溶液(100mg/ml，在50/50體積/體積乙腈/WFI中新鮮制備)，以達到適宜的CDAP/PS比率。加入0. 3M NaOH將pH升高至活化pH 9.0,并將pH穩(wěn)定在此值直至加入TTAH。3分鐘后，加入衍化TTah (20mg/ml的0. 2M NaCl溶液)，以使TTAH/PS比率達到2 ；將PH調節(jié)至偶聯(lián)pH 9.0。在pH調節(jié)下靜置溶液1小時。為了猝滅反應，向混合物PS/TTah/CDAP中加入2M甘氨酸溶液。調節(jié)pH 至猝滅 pH (pH 9. 0)。溶液于25°C攪拌30分鐘，然后在連續(xù)緩慢攪拌下于2_8°C靜置過夜。PS22F，_PhtD 綴合物在用于該糖的第二種綴合方法(第一種為表1所示的直接PS22_PhtD綴合方法) 中，22F與載體蛋白經(jīng)接頭己二酸二酰胼(ADH)連接。多糖血清型22F在綴合前被微流化。PS 22F 衍生化活化和偶聯(lián)在連續(xù)攪拌下于25°C在控溫水浴中進行。稀釋微流化的PS22F，以獲得在0. 2M NaCl中6mg/ml的最終PS濃度，用0. IN HCl 將該溶液調節(jié)至PH 6. 05 士 0. 2。加入CDAP溶液(100mg/ml,在50/50的乙腈/WFI中新鮮制備)，以達到適宜的 CDAP/PS比率(1. 5/1重量/重量)。通過加入0. 5M NaOH將pH升高至活化pH 9. 00 士0. 05，并穩(wěn)定此pH值直至加入 ADH。3分鐘后，加入ADH，以達到適宜的ADH/PS比率(8. 9/1重量/重量)；將pH調節(jié) 至偶聯(lián)pH 9. O。在pH調節(jié)下靜置溶液1小時。濃縮并滲濾PSah衍生物。偶聯(lián)向PS22Fah衍生物加入10mg/ml在0. 2M NaCl中的PhtD,以便達到4/1 (重量/ 重量)的PhtD/PSZZFAH比率。用HCl將pH調節(jié)至5. O士0.05。在10分鐘內(250 μ 1/分鐘)手動加入 EDAC 溶液(20mg/ml 的 0. IM Tris-HCl 溶液，pH 7. 5)，以達到 Img EDAC/mg PSZZFa^所獲溶液在攪拌和pH調節(jié)下于25°C溫育150分鐘(盡管也可以使用60分鐘)。通過加入IM Tris-HCl pH 7.5(1/10終體積)中和溶液，并于25°C靜置30分鐘。在S印hacryl S400HR上洗脫前，使用5 μ m Minisart濾器澄清綴合物。獲得的綴合物的最終PhtD/PS比率為4/1 (重量/重量)，游離PS含量在1 %以下，抗原性(a-PS/α-PS)為 36. 3 %，抗 PhtD 抗原性為 7. 4 %。用 Lowry 法和 Resorcinol 法檢測蛋白和多糖的比率，用夾心ELISA測定抗原性。綴合物的純化
使用用0. 15M NaCl (對于18C為S500HR)平衡的S印hacrylS400HR凝膠過濾柱，通過凝膠過濾純化綴合物，以去除小分子(包括DMAP)和非綴合型PS和蛋白?；诜磻M分的不同分子量大小，首先洗脫出PS-PD、PS-TT、PS-PhtD、PS-肺炎鏈球菌溶血素或PS-DT綴合物，之后洗脫出游離PS，然后洗脫出游離PD或游離DT，最后洗脫出DMAP和其它鹽(NaCl、甘氨酸)。含有綴合物的級分通過UV28tlnm檢測。按照其Kd合并級分，除菌過濾(0.22μπι)，并儲存于+2_8°C。測定綴合制備物中的PS/蛋白比率。PS肺炎鏈球菌-D蛋白/TT/DT/PhtD/Ply綴合物的特異件活化/偶聯(lián)/粹滅條件其中出現(xiàn)在行標題中的“ μ fluid”表示糖在綴合前通過微流化調整大小。微流化后的糖的大小在表2中給出。表IPS m^mm -D蛋白/TT/DT/PhtD/PlV綴合物的特異件活化/偶聯(lián)/魁備件備注pHa、C、q分別對應于活化pH、偶聯(lián)pH和猝滅pH。鑒定對每一綴合物進行鑒定，它們都符合表2中描述的標準。用Resorcinol檢測法檢測多糖含量(μ g/ml)，用Lowry檢測法檢測蛋白含量(yg/ml)。用濃度比值確定最終的 PS/PD比值(重量/重量)。游離多糖含量(％ )將綴合物與α -載體蛋白抗體和飽和硫酸銨溫育，之后離心，得到上清液，確定該上清液保持于4°C或在37°C儲存7天時綴合物的游離多糖含量。用α -PS/ α -PS ELISA定量上清液中的游離多糖。沒有綴合物也通過α -載體蛋白 / a -PS ELISA 控制。抗原性用夾心型ELISA分析同一綴合物的抗原性，其中捕獲抗體和檢測抗體分別為 α-PS禾口 α-蛋白。游離蛋白含量(％ )在純化步驟中非綴合的載體蛋白可與綴合物分離。游離的殘余蛋白的含量使用大小排阻層析(TSK 5000-PWXL)繼之以UV檢測(214nm)來測定。洗脫條件允許分開游離載體蛋白與綴合物。然后相對于校準曲線(由0至50μ g/ml載體蛋白)測定綴合物原液中的游離蛋白含量。游離載體蛋白％如下獲得％游離載體=(游離載體(μ g/ml)/(通過 Lowry法檢測的對應載體蛋白的總濃度(μ g/ml)*100% )。穩(wěn)定性對于保持于4 °C和于37 °C儲存7天的綴合物，用HPLC-SEC凝膠過濾(TSK 5000-PWXL)檢測分子量分布(Kav)和穩(wěn)定性。10/11/13/14價特征在表2中給出(參見其下的注釋)。蛋白綴合物可吸附到磷酸鋁上，并合并，以形成最終疫苗。
表2-綴合物的表征 *天然PS微流化后的PS大小未調整大小的多糖ND-未測定通過混合血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F綴合物(例如以每份人劑量分別l、3、l、l、l、l、l、3、3、lyg糖的劑量)制備10價疫苗。通過又加入表5的血清型3綴合物(例如以每份人劑量Iyg糖)制備11價疫苗。通過又加入以上的血清型19A和22F 綴合物(22F直接連接至PhtD，或者通過ADH接頭連接)[例如以每份人劑量各3 μ g糖的劑量]制備13價疫苗?？梢酝ㄟ^又加入以上的血清型6A綴合物[例如以每份人劑量Iyg 糖的劑量]制備14價疫苗。實施例3 在本發(fā)明的免疫原性組合物中包含流感嗜血桿菌D蛋白證明可對急性中耳炎(AOM)提供增強的保護作用研究設計研究使用IlPn-PD 疫苗，其含有血清型 1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F 和 23F，
每種血清型均綴合流感嗜血桿菌的D蛋白(參閱實施例4中的表5)。將受試者隨機分為 2組，以在約3、4、5和12-15月齡時接受4劑IlPn-PD疫苗或Havrix。所有受試者都在 3、4和5月齡時伴隨接受GSK生物制品公司的Infanrix-hexa(DTPa-HBV-IPV/Hib)疫苗。 Infanrix-hexa是在給藥前混合的Pediarix和Hib的組合。在給予第3劑疫苗后2周開始 “依照方案”的隨訪效力分析，并持續(xù)至24-27月齡。在選定的受試者亞組中評價肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的鼻咽攜帶情況。如果孩子生病、耳痛、鼓膜自發(fā)穿孔或自發(fā)耳溢液，則建議孩子的雙親咨詢研究
39者。如果研究者懷疑存在A0M，則立即將孩子轉移至耳鼻喉(ENT)專業(yè)醫(yī)師處進行確診。A0M的臨床診斷基于目測鼓膜外觀(即發(fā)紅、膨脹、失去光反射)或存在中耳液體滲漏(通過簡易耳鏡或氣式耳鏡或通過顯微鏡證實)。另外，必須存在以下幾項體征或癥狀中的至少兩種耳痛、耳溢液、聽力喪失、發(fā)燒、嗜睡、過敏、食欲不振、嘔吐或腹瀉。如果ENT 專業(yè)醫(yī)師證實臨床診斷結果，則通過鼓膜穿刺術收集中耳液的標本進行細菌學測試。對于因復發(fā)疾病就診的受試者，如果自前一次發(fā)病開始已過去了 30天以上，則認為已經(jīng)發(fā)生了新的A0M。另外，如果分離的細菌/血清型不同于先前的分離株，則A0M被認為是新細菌感染，無論兩個連續(xù)感染之間的間隔是多少。試驗結果招募了總共4968名嬰兒，llPn-PD組中2489名，對照組中2479名。兩組之間的個人背景特征或風險因素沒有顯著差異。臨床表現(xiàn)和A0M病例定義在試驗方案的跟蹤隨訪期當中，在llPn-PD組中記錄到總共333件臨床A0M，在對照組中記錄到499件。表3提供了 llPn-PD疫苗和先前在芬蘭測試的兩種7價疫苗(Eskola等，N Engl J Med 2001 ;344 :403-409 和 Kilpi 等，Clin Infect Dis2003 37 1155-64)抗任何 A0M和由不同肺炎鏈球菌血清型、流感嗜血桿菌、NTHi和卡他莫拉菌(M. catarrhal is)所致的A0M的保護效力。采用llPn-PD，統(tǒng)計學顯著性和臨床相關性降低至整體A0M疾病負荷的33.6%，與病因無關(表3)。對于llPn-PD疫苗中包含的所有11種肺炎鏈球菌血清型的抗A0M的整體效力為 57. 6% (表 3)。該研究的另一個重要發(fā)現(xiàn)是llPn-PD疫苗對由流感嗜血桿菌引起的A0M提供了 35. 6%的保護作用(具體地說由NTHi提供了 35. 3%的保護作用)。該發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義，因為在肺炎鏈球菌綴合疫苗時代(vaccine era)流感嗜血桿菌為A0M的主要原因的的重要性增加。與抗A0M提供的保護作用相一致，在生命的第2年，在加強劑量后llPn-PD 疫苗還減少了鼻咽攜帶流感嗜血桿菌。這些發(fā)現(xiàn)與先前在芬蘭的觀察結果相反，在芬蘭，對于兩種7價肺炎鏈球菌綴合疫苗，觀察到歸因于流感嗜血桿菌的A0M增加，(Eskola等和 Kilpi等)，以病因取代為證。在抗Hi引起的A0M的保護作用與抗載體D蛋白的抗體水平之間沒有明確的關系，因為在無Hi A0M的llPn-PD接種者中的初免后抗PD IgG抗體濃度，與在效力隨訪期當中發(fā)生至少一次Hi A0M的llPn-PD接種者中的初免后抗PD IgG抗體水平基本相同。然而，盡管在疫苗的生物學影響和初免后IgG抗PD免疫原性之間不能建立關聯(lián)，但可以合理地認為，在流感嗜血桿菌菌株之間高度保守的PD載體蛋白在很大程度上誘導抗Hi的保護作用。對A0M疾病的作用伴隨著對鼻咽攜帶的作用，后一作用對于疫苗血清型肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的程度相似(圖1)。在PD綴合物接種者中流感嗜血桿菌的鼻咽攜帶情況的這種下降支持以下假設PD綴合疫苗具有抗流感嗜血桿菌的直接保護作用，即便這種保護效力與通過ELISA檢測的抗PD IgG免疫應答不能聯(lián)系在一起。在以下的試驗中，使用栗鼠中耳炎模型和用該實施例的11價制劑或實施例2的10 價疫苗(另參見表1和2以及其下的說明)免疫的嬰兒的血清合并液。相對于免疫前血清合并液，兩種合并液誘導的患有中耳炎的動物百分率顯著減少。在10價和11價免疫合并液之間沒有顯著差異。這表明兩種疫苗在該模型中誘導抗不能分型的流感嗜血桿菌所致中耳炎的保護作用的潛力相似。使用的ELISA測定22F抑制ELISA方法基本上基于Cone印cion和Frasch在2001年所提出的測定，并由 Henckaerts 等，2006, Clinical and Vaccine Immunology 13 :356_360 報道。簡而言之，純化的肺炎鏈球菌多糖與甲基化人血清白蛋白混合，并于4°C過夜吸附到Nunc Maxisorp (Roskilde, DK)高結合微量滴定板。該板用10%胎牛血清(FBS)的PBS溶液在攪拌下于室溫封閉1小時。血清樣品用含10% FBSUOug/mL細胞壁多糖(SSI)和2 y g/ mL肺炎鏈球菌多糖血清型22F(ATCC)的PBS稀釋，并在微量滴定板上用相同緩沖液進一步稀釋。以相同方式處理內標并加入每塊板，內標在89-SF中使用血清型特異性IgG濃度相對于標準血清89-SF校準。在洗滌后，使用綴合過氧化物酶的抗人IgG單克隆抗體(Stratech Scientific Ltd.，Soham, UK)檢測結合抗體，所述單克隆抗體用10% FBS(在PBS中)稀釋，并在攪拌下于室溫溫育1小時。使用現(xiàn)成的單組分四甲基聯(lián)苯胺過氧化物酶免疫測定底物試劑盒(BioRad, Hercules, CA，US)在暗室中于室溫顯色。用H2S04 0. 18M終止反應，于450nm讀取光密度。通過參比內標血清曲線的限定限度內的光密度點計算樣品中血清型特異性IgG濃度g/mL)，該內標血清曲線通過用SoftMax Pro (Molecular Devices, Sunnyvale,CA)軟件計算的4參數(shù)邏輯斯蒂對數(shù)方程建立。在考慮檢測限度和定量限度的情況下，對所有血清型的ELSIA截取值都為0. 05 u g/mL IgG。調理吞噬測定在2003年6月的WHO磋商會上，推薦使用如Romero-Steiner等，Clin Diagn Lab Immunol 2003 10 (6) 1019-1024頁陳述的0PA測定。該方案用于在以下測試中測試血清型的0PA活性。綴合物的制備在研究llPn-PD&Di-001和llPn-PD&Di_007中，包括3種11價疫苗制劑(表4)，其中3 y g的19F多糖綴合白喉類毒素(19F-DT)，而不是1 y g多糖綴合D蛋白(19F-PD)。用于研究llPn-PD、llPn-PD&Di-001和llPn-PD&Di_007的綴合參數(shù)分別公開于表5、6禾口 7。在用這些19F-DT制劑初免后1個月的抗肺炎鏈球菌抗體應答和抗血清型19F的 0PA活性分別示于表8和9。表10顯示了在23價非綴合型多糖加強接種之前和之后達到 0. 2 u g/mL閾值的受試者的22F-ELISA抗體濃度和百分率。已表明用這些19F-DT制劑誘導的抗體的調理吞噬活性被明顯改善，這由初免接種后1個月較高的血清陽性率(調理吞噬效價彡1 8)和0PA GMT得以證實(表9)。在 23價非綴合型多糖加強接種之后1個月，19F抗體的調理吞噬活性仍顯著好于用19F-DT制劑初免的兒童(表11)。表12提供了與連續(xù)第4劑尸revwar 相比較，在預先用19F-DT或19F-PD綴合物初免的學步兒童中，在llPn-PD加強劑量之后的免疫原性數(shù)據(jù)。已知在美國引入Prewar 后報告的成就，在血清型19F綴合DT載體蛋白時，抗血清型19F的改善的調理吞噬活性可能對候選疫苗有利。表13提供了 19F-DT綴合物相對于交叉反應性血清型19A的ELISA和0PA數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)19F-DT相對于19A誘導低但顯著的0PA活性。表4在臨床研究中使用的肺炎鏈球菌綴合疫苗制劑表5PS肺炎H車球菌D蛋白/TT/DT綴合物的特異t牛活仆,/偶聯(lián)/粹滅條件表6用于llPn-PD&Di-OOl研究的PS肺炎鏈球菌D蛋白/DT綴合物的特異件活化 /偶聯(lián)/粹滅條件表7用于llPn-PD&Di-007研究的PS肺炎鏈球菌D蛋白/DT綴合物的特異性活化 /偶聯(lián)/粹滅條件 r在表4中提供不同制劑的組成。表9 在用 1 ii g 19F_PD、3 ii g 19F-DT 或 Prevnar (2 u g 19F-CRM)初免接種后 1 個月19F0PA效價彡1 8的受試者百分率和19F 0PAGMT(總實驗組) r在表4中提供不同制劑的組成。表10 在用 1 ii g 19F-PD、3 ii g 19F-DT 或 Prevnar (2 u g 19F-CRM)初免接種的兒童中于23價非綴合型多糖加強接種之前和之后1個月19F抗體濃度> 0. 20 u g/ml的受試 r在表4中提供不同制劑的組成。表11 在用 1 y g 19F-PD、3 ii g 19F-DT 或 Prevnar (2 u g 19F-CRM)初免接種的兒童中于23價非綴合型多糖加強接種之前和之后1個月19F 0PA效價 8的受試者百分率和19F OPA GMT (總實驗組) r在表4中提供不同制劑的組成。表12 在用 1 ii g 19F-PD、3 ii g 19F-DT 或 Prevnar (2 u g 19F-CRM)初免接種的兒童中于IlPn-PD或Prevnar加強接種后1個月抗體濃度≥0. 2 μ g/mL、0PA≥1 8的受試
者百分率和抗19F肺炎鏈球菌的GMC/GMT (總實驗組) Γ在表4中提供不同制劑的組成。表13 在用 1 μ gl9F-PD、3 μ g 19F-DT 或 Prevnar (2 μ g 19F-CRM)初免接種后 1 個月抗體濃度彡0. 2μ g/mL、0PA彡1 8的受試者百分率和抗19A肺炎鏈球菌的GMC/GMT (總
實驗組) Γ在表4中提供不同制劑的組成。實施例5 在預臨床模型中的佐劑試驗對老年獼猴中的肺炎鏈球菌11價多糖綴合物的免疫原性的影響為優(yōu)化在老年群體中針對綴合型肺炎鏈球菌疫苗激發(fā)的應答，GSK配制了一種具有新型佐劑一佐劑C的11價多糖(PS)綴合疫苗制劑，參見下文。在0-28天用500 μ 1吸附到315 μ g A1P04上的11價PS綴合物或與佐劑C混合的11價PS綴合物肌內注射(IM)免疫5只老年獼猴(14-28歲)的組別。在兩種疫苗制劑中，11價PS綴合物均由以下綴合物組成PS1_PD、PS3-PD、 PS4-PD、PS5-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-PD、PS19F-PD、PS23F-DT 和 PS6B-DT。所用疫苗為按照表6條件(實施例4)綴合型人用疫苗劑量的1/5劑量(每人用劑量每種糖5 μ g，6B除外[10 μ g])，只有19F按照以下CDAP方法條件制備調整大小后的糖為9mg/ ml、PD 為 5mg/ml、初始 PD/PS 比率為 1. 2/1、CDAP 濃度為 0. 75mg/mg PS, pHa = phc = pHq 9. 0/9. 0/9. 0，偶聯(lián)時間為60分鐘。定量在第42天收集的血清中的抗PS ELISA IgG水平和調理吞噬效價。通過 Elispot由在第42天收集的外周血細胞檢測抗PS3記憶B細胞頻率。按照下文所示結果，相對于具有A1P04的綴合物，佐劑C在老年猴子中顯著改善 11價PS綴合物的免疫原性。新佐劑增強針對PS的IgG應答(圖1)和調理吞噬抗體效價 (表14)。還有支持性證據(jù)表明使用佐劑C增強了 PS3特異性記憶B細胞的頻率(圖2)。表14，在老年獼猴中的綴合物免疫原性(第II劑后的調理吞噬效價)
54 B 細胞 Elispot測定的原則依賴于以下事實在與CpG培養(yǎng)5天后記憶B細胞在體外成熟為漿細胞。體外產(chǎn)生的抗原特異性漿細胞可易于檢測，并因此使用B細胞elispot測定計數(shù)。特異性漿細胞數(shù)反映出在培養(yǎng)開始時的記憶B細胞頻率。簡而言之，體外產(chǎn)生的漿細胞在用抗原包被的培養(yǎng)板中溫育?？乖禺愋詽{細胞形成抗體/抗原斑點，其通過常規(guī)免疫_酶促方法檢測，并作為記憶B細胞計數(shù)。在本研究中，多糖已用于包被培養(yǎng)板，以便計數(shù)對應的記憶B細胞。結果表示為1百萬記憶B細胞中 PS特異性記憶B細胞的頻率。研究表明，佐劑C能夠減輕已知的PS3加強能力(boostability)問題(參見關于肺炎鏈球菌和肺炎鏈球菌疾病的第5屆國際討論會，2006年4月2-6日，Alice Springs, Central Australia，抗血清型3肺炎鏈球菌綴合物的免疫應答的特異性。Schuerman L， Prymula R, Poolman J. Abstract book 245 頁，P010. 06)。實施例6，解毒的肺炎鏈球菌溶血素(dPly)作為蛋白載體在幼齡Balb/c小鼠中增強PS 19F的免疫原性的有效性于O、14和28天用50 μ 1的4價普通PS或4價dPly綴合PS ( 二者均與佐劑C混合)IM免疫40只雌性Balb/c小鼠(4周齡)的組別。兩種疫苗制劑均由0. 1μ g (糖量)以下各PS組成PS8、PS12F、PS19F和PS22F。定量在第42天收集的血清的抗PS ELISA IgG水平。與用普通PS免疫的小鼠相比，在給予4價dPly綴合物的小鼠中，抗PS19F應答 (作為圖3的實例顯示)被強烈增強。對于抗PS8、12F和22F IgG應答，觀察到相同的改善 (未顯示數(shù)據(jù))。實施例7，肺炎鏈球菌組氨酸三聯(lián)體D蛋白(PhtD)作為蛋白載體在幼齡Balb/c小鼠中增強PS 22F的免疫原性的有效性于0、14和28天用50 μ 1的4價普通PS或4價PhtD綴合PS ( 二者均與佐劑C混合)IM免疫40只雌性Balb/c小鼠(4周齡)的組別。兩種疫苗制劑均由0. 1μ g (糖量)以下各PS組成PS8、PS12F、PS19F和PS22F。定量在第42天收集的血清的抗PS ELISA IgG水平。與用普通PS免疫的小鼠相比，在給予4價PhtD綴合物的小鼠中，抗PS22F應答 (作為圖4的實例顯示)被強烈增強。對于抗PS8、12F和19F IgG應答，觀察到相同的改善 (未顯示數(shù)據(jù))。實施例8，含有19A_dPly和22F_PhtD的13-價PS綴合物在老年C57B1小鼠中的免疫原性于0、14和28天用50 μ 1的11價PS綴合物或13價PS綴合物(二者均與佐劑C 混合)IM免疫30只老年C57B1小鼠(> 69周齡)的組別(參見下文)。11價疫苗制劑由以下綴合物中的每一種的0. Iyg糖組成PS 1-PD、PS3_PD、 PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT 和 PS23F-PD(參見表1和表2下討論的關于11價疫苗的說明)。13價疫苗制劑還包含0. 1 μ g PS19A-dPly 和PS22F-PhtD綴合物(參見表1和表2下討論的關于13價疫苗的說明[使用直接綴合的22F])。在第2組和第4組中，肺炎鏈球菌溶血素載體用GMBS處理解毒，在第3組和第5 組中其用甲醛進行(W004/81515中描述的方法)。在第2組和第3組中，PhtD用于綴合PS 22F，在第4組和第5組中，使用PhtD_E融合體(W0 03/054007的構建體VP147)。在第6組中，19A與白喉類毒素綴合，22F與D蛋白綴合。評價在第42天收集的各血清的抗PS19A和22F ELISA IgG水平。檢測合并血清針對其它PS產(chǎn)生的ELISA IgG應答。小鼠血清學檢測程序使用下文描述的程序評價在第42天收集的血清的抗PS19AELISA IgG水平用純化的肺炎鏈球菌PS型19A (10 μ g/ml)的PBS緩沖液于37°C包被微量滴定板 2 小時。用 NaCl 0. 9% mM-Tween 20 0. 05%洗滌板 4 次。血清與 50 μ g/ml CPS (體積 / 體積)的PBS 0. 05% Tween 20溶液于37°C溫育1小時。將血清加至微孔，并以PBS-BSA 0. 05% Tween 0. 05%連續(xù)稀釋(兩倍稀釋步驟)。將板在攪拌下于室溫溫育30分鐘。如上洗滌板，加入抗小鼠IgG-過氧化物酶綴合物(稀釋成1/2500)，將板于室溫溫育30分鐘。在洗滌后，將底物(4mg OPDA在IOml檸檬酸鹽0. IM pH 4. 5和5 μ 1 H2O2中的溶液)加入每個孔達15分鐘。通過加入HCllN終止反應。使用分光光度計讀取490-620nm的吸光度。顯色與血清中存在的抗體量成正比。
通過比較參比曲線確定血清樣品中存在的抗PS19A IgG的水平，并以μ g/ml表示。由加入的已知量的血清的ELISA結果產(chǎn)生每塊板的參比曲線。使用下文描述的程序，評價在第42天收集的血清的抗-PS22FELISA IgG水平用純化的肺炎鏈球菌PS型22F (10 μ g/ml)的PBS緩沖液于37°C包被微量滴定板2 小時。用NaCl 0. 9% mM-Tween 200. 05%洗滌板4次。血清與50 μ g/ml CPS (體積/體積) 的PBS 0. 05% Tween 20溶液于37°C溫育1小時。將血清加至微孔，并以PBS-BSA 0. 05% Tween 0. 05 %連續(xù)稀釋(兩倍稀釋步驟)。將板在攪拌下于室溫溫育30分鐘。如上洗滌板，加入抗小鼠IgG-過氧化物酶綴合物(稀釋成1/2500)，將板于室溫溫育30分鐘。在洗滌后，將底物(4mg OPDA在IOml檸檬酸鹽0. IM pH 4. 5和5 μ 1 H2O2中的溶液)加入每個孔達15分鐘。通過加入HCllN終止反應。使用分光光度計讀取490-620nm的吸光度。顯色與血清中存在的抗體量成正比。通過比較在每塊板上加入的參比曲線血清，來確定未知血清中存在的抗PS22F IgG的水平，并以μ g/ml表示。按照相同的程序了解針對所有其它血清型的免疫應答，只是合并小鼠的血清。在13價綴合疫苗制劑中給予的19A_dPly和22F_PhtD在老年C57B1小鼠中顯示出免疫原性(表15)。與用11價制劑免疫的小鼠相比，在給予13價制劑的小鼠中針對其它 PS誘導的免疫應答沒有受到負面影響。表15，在老年C57B1小鼠中的PS免疫原性(第III劑后的IgG水平) NR-沒有檢測到實驗結果小鼠OPA檢測稈序將血清樣品于56°C加熱45分鐘，以失活任何其余的內源補體。對96孔圓底微量滴定板的每個孔，以25 μ 1 OPA緩沖液(HBSS-14. 4%失活的FBS) 2倍連續(xù)稀釋每個1 2 稀釋的血清樣品的25 μ 1等份試樣。隨后，將25 μ 1例如4/2/1比率(體積/體積/體積) 的活化的HL-60細胞(1 X IO7個細胞/ml)、新鮮融化的肺炎鏈球菌工作種子和新鮮融化的幼兔補體的混合物加至稀釋的血清，以產(chǎn)生50 μ 1的終體積。將測定板于37°C軌道振蕩 (210rpm)溫育2小時，以促進吞噬過程。通過將微量滴定板放置在冰上至少1分鐘終止反應。然后將所述板的每個孔的20 μ 1等份試樣轉移至96孔平底微量滴定板的相應孔中，并將50 μ ITodd-Hewitt Broth-0. 9%瓊脂加入每個孔。于37°C和5% CO2中過夜溫育后，使用自動化成像分析系統(tǒng)(KS 400，Zeiss, Oberkochen, Germany)計數(shù)瓊脂中出現(xiàn)的肺炎鏈球菌菌落。無血清樣品的8個孔用作細菌對照，以確定每個孔的肺炎鏈球菌數(shù)目。確定對照孔的平均CFU數(shù)，并用于計算每個血清樣品的殺死活性。以能夠促進50%的肺炎鏈球菌殺死的血清稀釋度的倒數(shù)來確定血清樣品的OPA效價。使用4參數(shù)曲線擬合分析計算調理吞噬效價。調理吞噬測定的結果示于圖13和14。實施例9，含19A_dPly和22F_PhtD的13價PS綴合物在幼齡Balb/c小鼠中的免疫原性于0、14和28天用50 μ 1的11價PS綴合物或13價PS綴合物(二者均與佐劑C 混合)IM免疫30只幼齡Balb/c小鼠(4周齡)的組別(參見下文)。11價疫苗制劑由以下綴合物中的每一種的0. 1 μ g糖組成PS1_PD、PS3-PD、 PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT 和 PS23F-PD(參見表1和表2下討論的關于11價疫苗的說明)。13價疫苗制劑還包含0. 1 μ g PS19A-dPly 和PS22F-PhtD綴合物(參見表1和表2下討論的關于13價疫苗的說明[使用直接綴合型 22F])。在第2組和第4組中，肺炎鏈球菌溶血素載體用GMBS處理解毒，在第3組和第5組中其用甲醛進行(在W004/81515中描述的方法)。在第2組和第3組中，PhtD用于綴合 PS 22F，在第4組和第5組中，使用PhtD_E融合體(W0 03/054007的構建體VP147)。在第 6組中，19A與白喉類毒素綴合，22F與D蛋白綴合。定量在第42天收集的各血清的抗PS19A和22F ELISA IgG水平。檢測合并血清針對其它PS產(chǎn)生的ELISA IgG應答。在13價綴合疫苗制劑中，給予的19A_dPly和22F_PhtD在幼齡Balb/c小鼠中顯示出免疫原性(表16)。與用11價制劑免疫的小鼠相比，在給予13價制劑的小鼠中針對其它PS誘導的免疫應答沒有受到負面影響。如在實施例8中所述進行ELISA檢測。表16，在幼齡Balb/c小鼠中的PS免疫原性(在第III劑后的IgG水平)
NR-沒有測定到實驗結果小鼠OPA稈序將血清樣品于56°C加熱45分鐘，以失活任何其余的內源補體。對96孔圓底微量滴定板的每個孔，以25 μ 1 OPA緩沖液(HBSS-14. 4%失活的FBS) 2倍連續(xù)稀釋每個1 2 稀釋的血清樣品的25 μ 1等份試樣。隨后，將25 μ 1例如4/2/1比率(體積/體積/體積) 的活化的HL-60細胞(1 X IO7個細胞/ml)、新鮮融化的肺炎鏈球菌工作種子和新鮮融化的幼兔補體的混合物加至稀釋的血清，以產(chǎn)生50 μ 1的終體積。將測定板于37°C軌道振蕩 (210rpm)溫育2小時，以促進吞噬過程。通過將微量滴定板放置在冰上至少1分鐘終止反應。然后將所述板的每個孔的20 μ 1等份試樣轉移至96孔平底微量滴定板的相應孔中，并將50 μ ITodd-Hewitt Broth-0. 9%瓊脂加入每個孔。于37°C和5% CO2中過夜溫育后，使用自動化成像分析系統(tǒng)(KS 400，Zeiss, Oberkochen, Germany)計數(shù)瓊脂中出現(xiàn)的肺炎鏈球菌菌落。無血清樣品的8個孔用作細菌對照，以確定每個孔的肺炎鏈球菌數(shù)目。確定對照孔的平均CFU數(shù)，并用于計算每個血清樣品的殺死活性。以能夠促進50%的肺炎鏈球菌殺死的血清稀釋度的倒數(shù)確定血清樣品的OPA效價。使用4參數(shù)曲線擬合分析計算調理吞噬效價。結果示于圖15和16。鋁制劑結果含有19A_dPly和22F_PhtD的13價PS綴合物在幼齡Balb/c小鼠中的免疫原性于第0、14和28天用50 μ 1 11-價PS綴合物或13價PS綴合物IM免疫40只幼齡Balb/c小鼠(4周齡)的組別，二者均吸附在AlPO4上。同時給予Infanrix Hexa011價疫苗制劑組成為0. 1 μ g糖的各以下綴合物PS1_PD、PS3-PD、PS4-PD、 PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS 14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT 和 PS23F-PD (參見表 1和在表2下討論的關于11價疫苗的說明)。13-價疫苗制劑還包含0. 1 μ g PS19A-dPly 和PS22F-PhtD綴合物(參見表1和在表2下討論的關于13價疫苗的說明[使用直接綴合型22F])。在第2組和第4組，肺炎鏈球菌溶血素載體用GMBS處理解毒，在第3組和第5組中其用甲醛進行。在第2組和第3組中，PhtD用于綴合PS 22F，在第4組和第5組中，使用 PhtD_E融合體(W0 03/054007的構建體VP147)。在第6組中，19A與白喉類毒素綴合，22F 與D蛋白綴合。檢測在第42天收集的個體血清中的抗PS19A和22F ELISA IgG水平和調理吞噬效價。檢測合并的血清中針對其它PS的ELISA IgG應答。顯示了在13價綴合疫苗制劑中給予的19A_dPly和22F_PhtD在幼齡Balb/c小鼠中的免疫原性和誘導的調理吞噬效價(表17和圖19-20)。相比于用11價制劑免疫的那些小鼠，在給予13價制劑的小鼠中針對其它PS誘導的免疫應答沒有受到負面影響。使用調理吞噬測定評價血清，結果示于圖19和20。
61
OFl小鼠(4周齡)的組別，二者均吸附在A1P04上。同時給予Infanrix Hexa011價疫苗制劑由以下綴合物中的每一種的0. 1 μ g糖組成PS1_PD、PS3-PD、 PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT 和 PS23F-PD(參見表1和在表2下討論的關于11價疫苗的說明)。13-價疫苗制劑還包含0. 1 μ gPS19A-dPly 和PS22F-PhtD綴合物(參見表1和在表2下討論的關于13價疫苗的說明[使用直接綴合型22F])。在第2組和第4組，肺炎鏈球菌溶血素載體用GMBS處理解毒，在第3組和第5組中其用甲醛(在WO 04/81515中描述的方法)進行。在第2組和第3組中，PhtD用于綴合 PS 22F，在第4組和第5組中，使用PhtD_E融合體(W0 03/054007的構建體VP147)。在第 6組中，19A與白喉類毒素綴合，22F與D蛋白綴合。檢測在第42天收集的個體血清中的抗PS19A和22F ELISA IgG水平和調理吞噬效價。檢測合并的血清中針對其它PS的ELISA IgG應答。顯示了在13價綴合疫苗制劑中給予的19A_dPly和22F_PhtD在幼齡OFl小鼠中的免疫原性和誘導的調理吞噬效價(表18和圖21-22)。相比于用11價制劑免疫的那些小鼠，在給予13價制劑的小鼠中針對其它PS誘導的免疫應答沒有受到負面影響。還通過調理吞噬測定評價血清，結果示于圖21和22。含物在豚鼠中的免疫原性價PS綴合物(二者均與佐劑
C混合)IM免疫20只幼齡豚鼠(Hartley Strain ；5周齡)的組別(參見下文)。11價疫苗制劑由以下綴合物中的每一種的0. 25 μ g糖組成PS1_PD、PS3-PD、 PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT 和 PS23F-PD(參見表1和表2下討論的關于11價疫苗的說明)。13價疫苗制劑還包含0. 1 μ g PS19A-dPly 和PS22F-PhtD綴合物(參見表1和表2下討論的關于13價疫苗的說明[使用直接綴合型 22F])。在第2組和第4組中，肺炎鏈球菌溶血素載體用GMBS處理解毒，在第3組和第5組中其用甲醛進行。在第2組和第3組中，PhtD用于綴合PS 22F，在第4組和第5組中，使用 PhtD E融合體(W0 03/054007的構建體VP147)。在第6組中，19A與白喉類毒素綴合，22F 與D蛋白綴合。使用以下方法評價在第42天收集的各血清的抗PS19A和22FELISA IgG水平。檢測合并血清針對其它PS產(chǎn)生的ELISA IgG應答。豚鼠血清學稈序:使用下文描述的程序評價在第42天收集的血清的抗PS19AELISA IgG水平用純化的肺炎鏈球菌PS型19A (10 μ g/ml)的PBS緩沖液于37°C包被微量滴定板2 小時。用NaCl 0. 9% mM-Tween 200. 05%洗滌板4次。血清與50 μ g/ml CPS (體積/體積) 的PBS 0. 05% Tween 20溶液于37°C溫育1小時。將血清加至微孔，并以PBS-BSA 0. 05% Tween 0. 05 %連續(xù)稀釋(兩倍稀釋步驟)。將板在攪拌下于室溫溫育30分鐘。如上洗滌板，加入抗豚鼠IgG-過氧化物酶綴合物(稀釋成1/1000)，將板于室溫溫育30分鐘。在洗滌后，將底物(4mg OPDA在IOml檸檬酸鹽0. IM pH 4. 5和5 μ 1 H2O2中的溶液)加入每個孔達15分鐘。通過加入HCllN終止反應。使用分光光度計讀取490-620nm的吸光度。顯色與血清中存在的抗體量成正比。通過比較在每塊板上加入的參比曲線血清，來確定未知血清中存在的抗PS19A IgG的水平，并以μ g/ml表示。使用下文描述的程序定量在第42天收集的血清的抗PS22FELISA IgG水平用純化的肺炎鏈球菌PS型22F(10 μ g/ml)的PBS緩沖液于37°C包被微量滴定板2小時。用NaCl 0. 9% mM-Tween 200. 05%洗滌板4次。血清與50 μ g/ml CPS (體積/ 體積)的PBS 0. 05% Tween 20溶液于37°C溫育1小時。將血清加至微孔，并以PBS-BSA 0. 05% Tween 0. 05 %連續(xù)稀釋(兩倍稀釋步驟)。將板在攪拌下于室溫溫育30分鐘。如上洗滌板，加入抗豚鼠IgG過氧化物酶綴合物(稀釋成1/1000)，將板于室溫溫育30分鐘。在洗滌后，將底物(4mg OPDA在IOml檸檬酸鹽0. IM pH 4. 5和5 μ 1 H2O2中的溶液)加入每個孔達15分鐘。通過加入HCllN終止反應。使用分光光度計讀取490-620am的吸光度。顯色與血清中存在的抗體量成正比。通過比較在每塊板上加入的參比曲線血清，來確定未知血清中存在的抗PS22F IgG的水平，并以μ g/ml表示。按照相同的程序了解針對所有其它血清型的免疫應答，只是合并豚鼠的血清。表19，在豚鼠中的PS免疫原性(在第III劑后的IgG水平) 還使用調理吞噬測定測試血清，結果示于圖17和18。實施例11 制劑的制備和測試a)制備以下制劑(使用表1的13價疫苗和表5的血清型3_參見在表2下論述的關于14價疫苗的說明[使用直接綴合型22F或ADH接頭綴合型22F])。如下文所示將糖與磷酸鋁和3D-MPL —起配制。
b)上述的相同糖制劑用以下各佐劑佐劑化
-在下表中顯示了每500 μ1劑量的乳劑組分的濃度。
佐劑Al佐劑A2佐劑A3
成分250 μ 1 o/w乳劑 125 μ 1 o/w乳齊[J 50 μ 1 o/w乳劑
α生育酚11. 88mg5. 94mg2.38mg
鯊烯10. 7mg5. 35mg2.14mg
吐溫804. 85mg2. 43mg0. 97mg
佐劑A4佐劑A5佐劑A6佐劑A7
成分250 μ 1 o/w250 μ 1 o/w乳125 μ 1 (Vw乳50 μ 1 o/
乳劑劑劑乳劑
α生育酚11. 88mg11. 88mg5. 94mg2. 38mg
鯊烯10. 7mg10. 7mg5. 35mg2. 14mg
吐溫804. 85mg4. 85mg2. 43mg0. 97mg
3D-MPL50 μ g25 μ g25 μ g10 μ gc)所述糖還用兩種基于脂質體的佐劑配制佐劑Bl的組成定性定量(每0. 5mL劑量)脂質體-DOPC Img-膽固醇0.25mg3DMPL 50 μ gQS21 50 μ gKH2PO41 3. 124mg 緩沖劑Na2HPO41 0. 290mg 緩沖劑NaCl 2. 922mg(IOOmM)足夠量的WFI調到(ad) 0. 5ml溶劑pH 6. 11.總 PO4 濃度=5OmM佐劑B2的組成定性定量(每0. 5mL劑量)脂質體-DOPC 0. 5mg-膽固醇0.125mg3DMPL 25 μ gQS21 25 μ gKH2PO41 3. 124mg 緩沖劑Na2HPO41 0. 29Omg 緩沖劑NaCl 2. 922mg(IOOmM)足夠量的WFI調到0. 5ml溶劑pH 6. 1d)所述糖還用佐劑C配制(參見上文使用該佐劑的其它組合物)定性定量(每0. 5mL劑量)水包油乳劑50μ1-鯊烯2. 136mg- α 生育酚 2. 372mg-吐溫 80 0. 97mg-膽固醇0. Img3DMPL 50 μ gQS21 50 μ gKH2PO41 0.470mg 緩沖劑
Na2HPO41 0. 219mg 緩沖劑NaCl 4. 003mg(137mM)KCl 0. IOlmg(2. 7mM)足夠量的WFl調到0. 5ml溶劑pH 6. 8實施例12，綴合化學對22F_PhtD綴合物在Balb/c小鼠中的免疫原性的影響于0、14和 28 天用含有 PS 1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和 23F (劑量對于PS 4、18C、19A、19F和22F為0. 3 μ g糖/綴合物，對于其它PS為0. 1 μ g糖/綴合物) 的13價PS制劑通過肌內注射(IM)途徑免疫30只雌性Balb/c小鼠的組別。PS 18C與破傷風類毒素綴合，19F與白喉類毒素綴合，19A與甲醛解毒的Ply綴合， 22F與PhtD綴合，其它PS與PD綴合。比較由通過直接CDAP化學制備的22F-PhtD或22F_AH_PhtD (ADH衍化PS)構成的兩種制劑。參見實施例2、表1和表2下關于用22F直接綴合或經(jīng)由ADH間隔臂制備的13 價疫苗特征的說明。疫苗制劑補加佐劑C。檢測在第42天收集的血清的抗PS22F ELISA IgG水平和調理吞噬效價。就IgG水平(圖5)和調理吞噬效價(圖6)這二者而言，22F-AH-PhtD顯示出遠強于22F-PhtD的免疫原性。實施例13，新佐劑對肺炎鏈球菌莢膜PS綴合物的免疫原性的影響于0、14和 28 天用含有 PS 1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和 23F (劑量對于PS 4、18C、19A、19F和22F為0. 3 μ g/綴合物，對于其它PS為0. 1 μ g/綴合物)的13 價PS制劑通過IM途徑免疫40只幼齡C57B1小鼠的組別。 PS 18C與破傷風類毒素綴合，19F與白喉類毒素綴合，19A與甲醛解毒的Ply綴合， 22F與PhtD綴合，其它PS與PD綴合。參見實施例2、表1和表2下關于用直接綴合型22F 制備的13價疫苗特征的說明。比較補加AlPO4、佐劑Al、佐劑A4或佐劑A5的4種制劑。檢測在第42天收集的和每組合并的血清的抗PS、Ply、PhtD和PD ELISA IgG水平。計算每種抗原的以下比率用測試的新佐劑誘導的IgG水平/用AlPO4誘導的IgG水平。與經(jīng)典的AlPO4制劑相比，測試的所有新佐劑將針對血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、 14、18C、19A、19F和22F綴合物的免疫應答提升至少2倍(圖7)。在該實驗中沒有獲得針對血清型23F的可信應答。實施例14，在猴子肺炎鏈球菌性肺炎模型中PhtD/解毒Ply組合物的保護效力每組6只獼猴(3-8歲)，所選用的獼猴預先存在最低抗19F的抗體水平，于0 和 28 天用 11 價 PS綴合物(即 Iyg PS 1、3、5、6B、7F、9V、14 和 23F，3 μ g PS 4、18C 和 19F[糖])或PhtD (IOyg)+甲醛解毒的Ply (10 μ g)或PhtD/E融合蛋白(IOyg)+甲醛解毒的Ply (IOyg)或單獨的佐劑肌內注射進行免疫。PS 18C與破傷風類毒素綴合，19F與白喉類毒素綴合，其它PS與PD綴合。參見實施例2、表1和表2下關于11價疫苗特征的說明。所有疫苗制劑均補加佐劑C。在第42天將19F型肺炎鏈球菌(5. 108cfu)接種在右肺中。計數(shù)在挑戰(zhàn)后第1、3 和7天收集的支氣管肺泡灌洗液的菌落。結果表示為在挑戰(zhàn)后第7天每組的死亡動物數(shù)、鏈球菌的肺定居動物數(shù)或鏈球菌清除的動物數(shù)。如在圖8中所示，與單獨的佐劑組相比，用11價綴合物和PhtD+dPly組合物(ρ <0. 12，F(xiàn)isher確切檢驗)獲得了接近于統(tǒng)計學顯著性的良好保護作用(盡管使用的動物數(shù)少)。實施例15，綴合化學對杭PhtD mm.mmM 22F-PhtD綴合物i秀導的4型祧戰(zhàn) 的保護效力的影響在第0和14天用3 μ g 22F-PhtD (通過直接CDAP化學制備)或22F_AH_PhtD (ADH 衍化PS)或單獨的佐劑肌內注射免疫20只雌性OFl小鼠的組別。兩種單價22F綴合物均通過實施例2的方法制備(另參見表1和表2)。每種制劑均補加佐劑C。檢測在第28天收集的血清的抗PhtD ELISA IgG水平。在第29天用5. IO6Cfu的4型肺炎鏈球菌(即測試的疫苗制劑中存在的PS未包含的肺炎鏈球菌血清型)鼻內給予挑戰(zhàn)小鼠。監(jiān)測誘導的死亡率，直至挑戰(zhàn)后的第10天。圖9中的結果表明，與22F-PhtD相比，22F_AH_PhtD誘導顯著較高的抗PhtD IgG 應答。這反映為相比于22F-PhtD，其抗4型挑戰(zhàn)的保護作用更好，如圖10所示。棚列16，船·禾口舶X仔種{刪牛免碰■碰以小鼠致死肺炎鏈球菌挑戰(zhàn)模型評價針對PhtD和莢膜多糖的免疫應答之間的潛在協(xié)同性。用PhtD肌內注射免疫小鼠3次(第0、14和28天)。在細菌挑戰(zhàn)前1小時，將抗多糖抗體被動轉移至小鼠(ΙΡ，200μ1)。跟蹤由肺炎鏈球菌誘導的致死性，直至挑戰(zhàn)后8 或11天。在本文提出針對兩種肺炎鏈球菌菌株(血清型3和血清型1)的保護作用的協(xié)同性。肺炎鏈球菌菌株3/43挑戰(zhàn)模型在該實驗中，用吸附在AlPO4上的PhtD免疫OFl小鼠，并在用肺炎鏈球菌血清型 3 (Spn 3/43)挑戰(zhàn)前1小時被動轉移1. 25 μ g抗PS3豚鼠抗體。結果示于圖11。在僅接受PBS的小鼠中觀測到70%致死性。在接受抗PS3抗體的小鼠組別或用PhtD免疫的小鼠組別中觀測到中等保護作用。在綜合性分別針對PhtD和 PS3的主動免疫和被動免疫的小鼠中獲得導致幾乎完全保護作用的協(xié)同性。肺炎鏈球菌血清型1/57挑戰(zhàn)模型在該實驗中，用以THl佐劑佐劑化的PhtD免疫OFl小鼠，并在用肺炎鏈球菌血清型1 (Spn 1/57)挑戰(zhàn)前1小時被動轉移抗PSl豚鼠抗體。結果示于圖12。在接受THl佐劑的小鼠(主動免疫)和僅接受PBS的小鼠(被動免疫)中觀測到高致死性。在接受抗PSl抗體的小鼠組別(55%存活作用)或用PhtD免疫的小鼠組別(25%存活作用)中觀測到中等保護作用。在組合分別針對PhtD和PSl的主動免疫和被動免疫的小鼠中獲得導致幾乎完全保護作用的協(xié)同性。這些數(shù)據(jù)支持針對肺炎鏈球菌蛋白(即PhtD)和莢膜多糖的免疫應答在抗肺炎鏈球菌感染的保護機制中的協(xié)同作用。實施例17肺炎鏈球菌PS-TT和PS-DT綴合物對針對11價制劑中其余的肺炎鏈球
71菌PS-PD綴合物的免疫應答的影響在小鼠和豚鼠免疫原性模型中比較含有11種PS-PD綴合物的制劑和含有7種 PS-PD、2 種 PS-TT (PS 6B 和 23F)和 2 種 PS-DT (PS 18C 和 19F)綴合物的制劑。用1/10人用劑量的疫苗(0. 1 μ g PS)肌內注射免疫小鼠3次。在第42天收集血液樣品，通過ELISA檢測針對每種多糖的免疫應答。用1/4人用劑量的疫苗(0. 25 yg PS)肌內注射免疫豚鼠3次。同時給予Infanrix Hexa,以便模擬人用情況。在第42天收集血液樣品，通過ELISA檢測針對每種多糖的免疫應答。實驗編號N° SPNl 15 (pirns 20040304)小鼠實驗編號N° SPNl 16 (pirns 20040308)豚鼠在與Il-V PD制劑相比時，在小鼠和豚鼠中均觀察到含有綴合TT(PS 6B和23F)和 DT (PS 18C和19F)的兩種多糖的制劑中針對綴合PD的大部分多糖的免疫應答增加。對于 PS 1、4、5、9V和14以及對于PS 1、7F和14，這些差異在小鼠和豚鼠中分別均具有統(tǒng)計學顯
性思ο
權利要求
一種含有來自不同肺炎鏈球菌血清型的9種或9種以上、10種或10種以上、11種或11種以上、13種或13種以上或者14種或14種以上莢膜糖的肺炎鏈球菌免疫原性組合物，所述莢膜糖綴合2種或2種以上的不同載體蛋白，其中所述組合物包含綴合白喉類毒素(DT)或CRM197的血清型19F莢膜糖和2-9種選自不同血清型的綴合D蛋白的莢膜糖。
2.權利要求1的免疫原性組合物，其中19F是所述組合物中唯一綴合白喉類毒素(DT) 或CRM197的糖。
3.權利要求1的免疫原性組合物，其中血清型19F綴合白喉類毒素。
4.權利要求1-3中任一項的免疫原性組合物，其中3、4或5種莢膜糖綴合D蛋白。
5.權利要求1-4中任一項的免疫原性組合物，其中血清型4糖綴合D蛋白。
6.權利要求1-5中任一項的免疫原性組合物，其中血清型5糖綴合D蛋白。
7.權利要求1-6中任一項的免疫原性組合物，其中血清型7F糖綴合D蛋白。
8.權利要求1-7中任一項的免疫原性組合物，其中血清型9V糖綴合D蛋白。
9.權利要求1-8中任一項的免疫原性組合物，其中血清型14糖綴合D蛋白。
10.權利要求1-9中任一項的免疫原性組合物，其中血清型22F糖綴合D蛋白。
11.權利要求1-10中任一項的免疫原性組合物，其中血清型23F糖綴合D蛋白。
12.權利要求1-11中任一項的免疫原性組合物，其中小部分莢膜糖綴合物包含D蛋白作為載體蛋白。
13.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，其中19F莢膜糖直接綴合載體蛋白。
14.權利要求1-12中任一項的免疫原性組合物，其中19F莢膜糖經(jīng)接頭綴合載體蛋白。
15.權利要求14的免疫原性組合物，其中所述接頭是雙功能型的。
16.權利要求14或15的免疫原性組合物，其中所述接頭為ADH。
17.權利要求14、15或16的免疫原性組合物，其中優(yōu)選使用EDAC通過碳二亞胺化學使所述接頭與載體蛋白連接。
18.權利要求14-17中任一項的免疫原性組合物，其中所述糖與接頭綴合，然后載體蛋白與接頭綴合。
19.權利要求14-17中任一項的免疫原性組合物，其中所述載體蛋白與接頭綴合，然后糖與接頭綴合。
20.任一前述權利要求的免疫原性組合物，其中使用CDAP化學使19F糖綴合載體蛋白或接頭。
21.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，其中載體蛋白與19F糖的比率在5 1至 1 5 (重量/重量)之間、4 1至1 1(重量/重量)之間或2 1至1 1(重量/ 重量)之間，或1.5 1至1.4 1(重量/重量)之間。
22.任一前述權利要求的免疫原性組合物，其中19F糖的平均大小(例如Mw)在IOOkDa 以上。
23.權利要求22的免疫原性組合物，其中19F糖的平均大小(例如Mw)在100_750kDa 之間、110-500kDa 之間、120-250kDa 之間或 125_150kDa 之間。
24.權利要求22或23的免疫原性組合物，其中19F糖為天然多糖，或者為不超過x5因數(shù)調整大小的19F糖。
25.權利要求22、23或24的免疫原性組合物，其中19F糖已通過微流化調整大小。
26.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，其中19F糖綴合物的劑量在l-10yg、 l-5yg或l-3yg糖之間。
27.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含2種不同的載體蛋白。
28.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含3種、4種、5種或6種不同的載體蛋白。
29.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，其中一種或多種或全部的載體蛋白選自 DT、CRM 197、TT、C 片段、dPly、PhtA, PhyB, PhtD, PhtE, PhtDE OmpC, PorB 和流感嗜血桿菌D蛋白。
30.權利要求29的免疫原性組合物，其中一種載體蛋白是TT。
31.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物包含綴合TT的莢膜糖18C，任選18C是所述組合物中唯一綴合破傷風類毒素(TT)的糖。
32.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，其中18C莢膜糖直接綴合載體蛋白。
33.權利要求1-32中任一項的免疫原性組合物，其中18C莢膜糖經(jīng)接頭綴合載體蛋白。
34.權利要求33的免疫原性組合物，其中所述接頭是雙功能型的。
35.權利要求33或34的免疫原性組合物，其中所述接頭為ADH。
36.權利要求33、34或35的免疫原性組合物，其中優(yōu)選使用EDAC通過碳二亞胺化學使所述接頭與載體蛋白連接。
37.權利要求33-36中任一項的免疫原性組合物，其中所述糖綴合接頭，然后載體蛋白與接頭綴合。
38.權利要求33-36中任一項的免疫原性組合物，其中所述載體蛋白綴合接頭，然后糖綴合接頭。
39.任一前述權利要求的免疫原性組合物，其中使用CDAP化學使18C糖綴合載體蛋白或接頭。
40.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，其中使用還原胺化使18C糖綴合載體蛋白或接頭。
41.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，其中載體蛋白與18C糖的比率在0.5 1 至5 1(重量/重量)之間、1 1至4 1(重量/重量)之間、1.5 1至3 1 (重量 /重量)之間，或2 1至2.5 1(重量/重量)之間。
42.任一前述權利要求的免疫原性組合物，其中18C糖的平均大小(例如Mw)在50kDa 以上。
43.權利要求42的免疫原性組合物，其中18C糖的平均大小(例如Mw)在50_500kDa 之間、60-400kDa 之間、70_300kDa 之間、75_200kDa 之間或 80-IOOkDa 之間。
44.權利要求43的免疫原性組合物，其中18C糖或者為天然多糖，或者18C糖的大小為不超過x5的因數(shù)的大小。
45.權利要求42、43或44的免疫原性組合物，其中18C糖已通過微流化調整大小。
46.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，其中18C糖綴合物的劑量在l-10yg、 l-5yg或l-3yg糖之間。
47.權利要求46的免疫原性組合物，其中18C糖綴合物的劑量為3yg糖。
48.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，其中存在血清型6B的莢膜糖綴合物，但所述綴合物不綴合DT和/或CRM197。
49.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，其中存在血清型23F的莢膜糖綴合物，但所述綴合物不綴合DT和/或CRM197。
50.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，其中至少血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、 18CU9F和23F以綴合糖存在。
51.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還包含以綴合糖存在的血清型3。
52.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還包含血清型6A和 /或15(綴合莢膜糖)。
53.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還包含血清型 19A (綴合莢膜糖)。
54.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還包含血清型 22F (綴合莢膜糖)。
55.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還包含血清型8(綴合莢膜糖)。
56.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還包含血清型 12F (綴合莢膜糖)。
57.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含平均糖大小 (例如 Mw)在 IOO-IOOOkDa 之間、200-800kDa 之間、250_600kDa 之間或者 300_400kDa 之間的血清型1 (糖綴合物)。
58.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含平均糖大小 (例如Mw)在50-500kDa之間、60_300kDa之間、70_200kDa之間或者75_125kDa之間的血清型4(糖綴合物)。
59.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含平均糖大小 (例如 Mw)在 IOO-IOOOkDa 之間、200-700kDa 之間、300_500kDa 之間或者 350_450kDa 之間的血清型5 (糖綴合物)。
60.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含平均糖大小 (例如Mw)在500-1600kDa之間、750-1500kDa之間或者1000_1400kDa之間的血清型6B (糖綴合物)。
61.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含平均糖大小 (例如 Mw)在 50-1000kDa 之間、100-750kDa 之間、150-500kDa 之間或者 200-300kDa 之間的血清型7F (糖綴合物)。
62.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含平均糖大小 (例如 Mw)在 50-1000kDa 之間、100-750kDa 之間、150-500kDa 之間、200-400kDa 之間或者 250-300kDa之間的血清型9V (糖綴合物)。
63.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含平均糖大小 (例如 Mw)在 50-1000kDa 之間、100_750kDa 之間、150_500kDa 之間或者 200_250kDa 之間的血清型14(糖綴合物)。
64.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含平均糖大小 (例如 Mw)在 500-1500kDa 之間、700-1300kDa 之間、800-1100kDa 之間或者 900-1000kDa 之間的血清型23F (糖綴合物)。
65.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含平均糖大小(例如 Mw)在 50-800kDa 之間、110_700kDa 之間、110_300kDa 之間、120_200kDa 之間、 130-180kDa之間或者140_160kDa之間的血清型19A (糖綴合物)。
66.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含平均糖大小(例如 Mw)在 50-800kDa 之間、110_700kDa 之間、110_300kDa 之間、120_200kDa 之間、 130-180kDa之間或者150_170kDa之間的血清型22F (糖綴合物)。
67.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含平均糖大小 (例如Mw)在500-1600kDa之間或者1100_1540kDa之間的血清型6A (糖綴合物)。
68.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含平均糖大小(例如 Mw)在 50-IOOOkDa 之間、60_800kDa 之間、70_600kDa 之間、80_400kDa 之間、 100-300kDa之間或者150_250kDa之間的血清型3 (糖綴合物)。
69.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含作為天然糖的血清型5、6B和23F。
70.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，其中莢膜糖綴合物的劑量在1-10μ g糖/ 綴合物之間、1-5 μ g糖/綴合物之間或1-3 μ g糖/綴合物之間。
71.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含為3μ g糖/綴合物劑量的血清型4、18C和19F的綴合物。
72.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含為2μ g糖/綴合物劑量的血清型1、5、6B、7F、9V、14和23F的綴合物。
73.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含為2μ g糖/綴合物劑量的血清型6A和/或3的綴合物。
74.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含為5μ g糖/綴合物劑量的血清型19A和/或22F的綴合物。
75.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還含有血清型不同于綴合型糖的非綴合型肺炎鏈球菌糖，使得綴合型和非綴合型糖的血清型的數(shù)量低于或等于23。
76.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還含有一種或多種非綴合型或綴合型肺炎鏈球菌蛋白。
77.權利要求76的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有一種或多種非綴合型肺炎鏈球菌蛋白。
78.權利要求76或77的免疫原性組合物，其中所述一種或多種肺炎鏈球菌蛋白選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、解毒肺炎鏈球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、 SplOl、Spl30、Spl25 和 Spl33。
79.任一項前述權利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還含有佐劑。
80.權利要求79的免疫原性組合物，其中所述佐劑為Thl應答的優(yōu)先誘導物。
81.權利要求79或80的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含一種或多種選自QS21、 MPL 或免疫刺激性寡核苷酸的組分。
82.權利要求79-81中任一項的免疫原性組合物，其中所述佐劑包括QS21和MPL。
83.權利要求79的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含脂質體載體。
84.權利要求83的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)0.I-IOmg, 0. 2-7mg、0. 3-5mg、0. 4_2mg 或 0. 5_lmg (例如 0· 4-0. 6mg、0. 9-1. lmg、0. 5mg 或 lmg)磷脂(例如 D0PC)。
85.權利要求83或84的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)0. 025-2. 5mg、0. 05-1. 5mg、0. 075-0. 75mg、0. 1-0. 3mg 或 0. 125-0. 25mg(例如 0. 2-0. 3mg、0. 1-0. 15mg、0. 25mg 或 0. 125mg)固醇(例如膽固醇)。
86.權利要求83-85中任一項的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)5-60 μ g、10-50 μ g 或 20-30 μ g(例如 5-15μ g、40-50y g、10y g、20y g、30y g、40y g 或50 μ g)脂質A衍生物(例如3D-MPL)。
87.權利要求83-86中任一項的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)5-60 μ g、10-50 μ g 或 20-30 μ g(例如 5-15μ g、40-50y g、10y g、20y g、30y g、40y g ^ 50 μ g)皂苷(例如 QS21)。
88.權利要求79的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有水包油乳劑。
89.權利要求88的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)0.5-15mg、 l-13mg、2-llmg、4-8mg 或 5_6mg(例如 2-3mg、5_6mg 或 10-1 lmg)可代謝油(例如鯊烯)。
90.權利要求88或89的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)0. l-10mg、0. 3-8mg、0. 6_6mg、0. 9-5mg、l_4mg 或 2_3mg(例如 0. 9-1. lmg、2_3mg 或 4-5mg)乳化劑(例如吐溫80)。
91.權利要求88-90中任一項的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)0. 5-20mg、l-15mg、2-12mg、4-10mg、5-7mg(例如 ll-13mg、5_6mg 或 2_3mg)母育酚(例如α生育酚)。
92.權利要求88-91中任一項的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)5-60 μ g、10-50 μ g 或 20-30 μ g(例如 5-15μ g、40-50y g、10y g、20y g、30y g、40y g 或50 μ g)脂質A衍生物(例如3D-MPL)。
93.權利要求88-92中任一項的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL 劑量)0· 025-2. 5mg、0. 05-1. 5mg、0. 075-0. 75mg、0. 1-0. 3mg 或 0. 125-0. 25mg(例如 0. 2-0. 3mg、0. 1-0. 15mg、0. 25mg 或 0. 125mg)固醇(例如膽固醇)。
94.權利要求88-93中任一項的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)5-60 μ g、10-50 μ g 或 20-30 μ g(例如 5-15μ g、40-50y g、10y g、20y g、30y g、40y g ^ 50 μ g)皂苷(例如 QS21)。
95.權利要求79的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有金屬鹽和脂質A衍生物。
96.權利要求95的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)作為磷酸鋁的 100-750 μ g、200-500 μ g 或 300-400 μ g Al。
97.權利要求95或96的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)5-60 μ g、10-50 μ g 或 20-30 μ g(例如 5-15μ g、40-50y g、10y g、20y g、30y g、40y g或50 μ g)脂質A衍生物(例如3D-MPL)。
98.一種疫苗藥盒，所述疫苗藥盒含有權利要求1-78中任一項的免疫原性組合物，以及含有同時或序貫使用的權利要求80-97中任一項定義的佐劑。
99.一種疫苗，所述疫苗含有權利要求1-97中任一項的免疫原性組合物和藥學上可接受的賦形劑。
100.一種用于制備權利要求99的疫苗的方法，所述方法包括將權利要求1-97中任一項的免疫原性組合物與藥學上可接受的賦形劑混合的步驟。
101.一種免疫人類宿主以抵御肺炎鏈球菌感染性疾病的方法，所述方法包括給予宿主免疫保護劑量的權利要求1-97中任一項的免疫原性組合物或權利要求99的疫苗。
102.權利要求101的方法，其中所述人類宿主為老年人，所述疾病為肺炎或侵襲性肺炎鏈球菌疾病(IPD)中的任一種或這二者。
103.權利要求101或102的方法，其中所述人類宿主為老年人，所述疾病為惡化的慢性阻塞性肺病(COPD)。
104.權利要求101的方法，其中所述人類宿主為嬰兒，所述疾病為中耳炎。
105.權利要求101或104的方法，其中所述人類宿主為嬰兒，所述疾病為腦膜炎和/或菌血癥。
106.權利要求101、104或105的方法，其中所述人類宿主為嬰兒，所述疾病為肺炎和/或結膜炎。
107.權利要求1-97的免疫原性組合物或權利要求99的疫苗，其用于預防或治療肺炎鏈球菌感染性疾病。
108.權利要求1-97的免疫原性組合物或權利要求99的疫苗在制備用于治療或預防肺炎鏈球菌感染性疾病的藥物中的用途。
109.權利要求108的用途，其中所述疾病為老年人的肺炎或侵襲性肺炎鏈球菌疾病 (IPD)中的任一種或這二者。
110.權利要求108或109的用途，其中所述疾病為老年人的惡化慢性阻塞性肺病 (COPD)。
111.權利要求108的用途，其中所述疾病為嬰兒中耳炎。
112.權利要求108或111的用途，其中所述疾病為嬰兒的腦膜炎和/或菌血癥。
113.權利要求108、111或112的用途，其中所述疾病為嬰兒的肺炎和/或結膜炎。
114.一種在嬰兒激發(fā)抵御中耳炎的保護性免疫應答的方法，所述方法包括作為單獨組分或聯(lián)合組分序貫或同時給予(i)權利要求1-97中任一項的免疫原性組合物或疫苗，和 (ii)來自流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)的D蛋白，所述D蛋白可為游離型和/ 或綴合型。
115.一種在嬰兒激發(fā)抵御肺炎鏈球菌的保護性免疫應答的方法，所述方法給予任一項前述權利要求的免疫原性組合物或疫苗。
116.一種在老年人激發(fā)抵御肺炎鏈球菌的保護性免疫應答的方法，所述方法聯(lián)合、序貫或同時給予(i)任一項前述權利要求的免疫原性組合物或疫苗，(ii) 一種或多種選自 PhtX家族和肺炎鏈球菌溶血素的肺炎鏈球菌表面蛋白。
117.—種在嬰兒激發(fā)抵御中耳炎的保護性免疫應答的方法，所述方法給予任一項前述權利要求的免疫原性組合物或疫苗。
118.—種在嬰兒激發(fā)抵御中耳炎的保護性免疫應答的方法，所述方法序貫或同時給予作為單獨或組合組分的(i)任一項前述權利要求的疫苗，(ii) 一種或多種選自PhtX家族和肺炎鏈球菌溶血素的肺炎鏈球菌表面蛋白。
119.權利要求1-97的免疫原性組合物或權利要求99的疫苗，其包含來源于至少以下所有血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F，其中在人類接種者中針對一種或多種疫苗組分4、6B、9V、14、18C、19F和23F誘導的GMC抗體效價不顯著低于Prevnar 疫苗誘導的效價。
120.權利要求119的免疫原性組合物，其中在人類接種者中針對血清型4誘導的GMC 抗體效價不顯著低于Prevnar 疫苗誘導的效價。
121.權利要求119或120的免疫原性組合物，其中在人類接種者中針對血清型6B誘導的GMC抗體效價不顯著低于Prevnar 疫苗誘導的效價。
122.權利要求119-121中任一項的免疫原性組合物，其中在人類接種者中針對血清型 9V誘導的GMC抗體效價不顯著低于Prevnar 疫苗誘導的效價。
123.權利要求119-122中任一項的免疫原性組合物，其中在人類接種者中針對血清型 14誘導的GMC抗體效價不顯著低于Prevnar 疫苗誘導的效價。
124.權利要求119-123中任一項的免疫原性組合物，其中在人類接種者中針對血清型 18C誘導的GMC抗體效價不顯著低于Prevnar 疫苗誘導的效價。
125.權利要求119-124中任一項的免疫原性組合物，其中在人類接種者中針對血清型 19F誘導的GMC抗體效價不顯著低于Prevnar 疫苗誘導的效價。
126.權利要求119-125中任一項的免疫原性組合物，其中在人類接種者中針對血清型 23F誘導的GMC抗體效價不顯著低于Prevnar 疫苗誘導的效價。
127.權利要求119-126中任一項的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有血清型 3糖綴合物。
128.權利要求119-127中任一項的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有血清型 6A糖綴合物。
129.權利要求119-128中任一項的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有血清型 19A糖綴合物。
130.權利要求119-129中任一項的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有血清型 22F糖綴合物。
全文摘要
本發(fā)明屬于肺炎鏈球菌莢膜糖綴合疫苗領域。具體地說，本發(fā)明提供的多價肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)免疫原性組合物含有與2種或2種以上的不同載體蛋白綴合的、來自不同肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)血清型的多種綴合型莢膜糖，其中所述組合物包含綴合白喉類毒素(DT)或CRM197的血清型19F莢膜糖，任選19F是組合物中唯一綴合白喉類毒素(DT)或CRM197的糖。
文檔編號A61P31/04GK101883583SQ200880105100
公開日2010年11月10日申請日期2008年6月24日優(yōu)先權日2007年6月26日
發(fā)明者J·普爾曼, P·V·赫爾曼, R·L·比曼斯申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司

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