專利名稱：免疫原性組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包含C4bp結(jié)構(gòu)域和抗原的免疫原性病毒載體組合物和疫苗，并涉及 其用于提供增強的T細胞應答的方法。
背景技術：
疫苗接種已被證明是預防疾病(特別是感染性疾病)的最有效手段之一。大多數(shù) 疫苗通過誘導針對相關病原體感染具有保護作用的抗體來起作用。然而，許多新疫苗靶向 免疫系統(tǒng)的細胞免疫分支并通過誘導效應T細胞和記憶T細胞來起作用。這些可以靶向細 胞內(nèi)的病原體和腫瘤。目前正在開發(fā)可用于預防或治療的許多新的誘導T細胞的疫苗。通過疫苗接種來誘導T細胞可用于多種方面。除了降低疫苗接種者的患病風險以 外，它們還可用于獲得性轉(zhuǎn)移操作中以降低這些細胞的受者感染或患病的風險。它們也可 用于診斷。日益廣泛使用的誘導免疫應答的方法是將目的抗原或表位克隆到載體中。載體 可以是質(zhì)粒、細菌或病毒。質(zhì)粒DNA疫苗正在蓬勃發(fā)展，多種病毒載體似乎也可用于疫苗 接種。這包括痘病毒例如經(jīng)修飾的安卡拉痘苗病毒(modified vaccinia virus Ankara, MVA)，禽疸病毒載體例如雞痘病毒、金絲雀痘病毒和ALVAC，皰疹病毒載體(包括單純皰疹 病毒和CMV)，甲病毒和腺病毒。可由改進載體靶向的疾病包括但不限于瘧疾、結(jié)核病、HIV/AIDS、HCV、HBV、HSV, HPV、CMV、由莢膜細菌(如肺炎球菌)引起的疾病、寄生蟲疾病(如利什曼病)以及多種腫 瘤和癌癥(如淋巴瘤、白血病、黑素瘤、腎癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌和結(jié)直腸癌)。瘧疾仍然是世界上對公眾健康的最大挑戰(zhàn)之一。每年，惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)感染影響了超過5億人，導致1 2百萬個體死亡1A開發(fā)有效的疫苗仍然 是安全且成本低廉地控制這種疾病的重要目標。對瘧疾感染血液階段的免疫主要是由抗體介導的，其針對裂殖子表面抗原(包括 裂殖子表面蛋白-I(MSP-I))等保護性應答的靶標3’4。MSP-I被合成為190 230kDa的 多肽，其在侵入紅細胞過程中經(jīng)歷蛋白水解加工5。42kDa的C端(MSP-I42)最終被切割成 33kDa和19kDa的片段(分別稱為MSP-I33和MSP-I19)，其中只有MSP-I19仍與裂殖子表面結(jié) 合6。MSP-I42是血液階段瘧疾疫苗最重要的候選抗原，并能在小鼠和猴子中誘導保護性應 答，這主要依賴于在感染瘧疾時存在針對MSP-I19的高效價抗體應答7_9。針對MSP-I33的抗 體應答是非保護性的“1’11。T細胞應答對血液階段免疫的作用尚未闡明12。就MSP-I42來說，已報道在多種瘧 原蟲的MSP-I33中具有CD4+T細胞的表位，這可能為針對MSP-I19的保護性抗體應答提供T 細胞協(xié)助"’13。識別MSP-I33 (而非MSP-I19)中表位的⑶4+T細胞還能夠控制過繼轉(zhuǎn)移有致 命性約氏瘧原蟲(P.yoelii)的免疫缺陷小鼠的生長14’15。在對半免疫兒童的研究中，已發(fā) 現(xiàn)針對MSP-I的細胞應答與保護有關3，類似地，將小鼠或人類志愿者反復暴露于極低劑量 的血液階段寄生蟲誘導了特征在于細胞應答而非抗體應答的保護性免疫16’17。CDS+T細胞不參與約氏瘧原蟲模型中的血液階段免疫18。然而，針對約氏瘧原蟲MSP-I的T細胞應答 可以保護免受肝臟階段寄生蟲19，這是因為MSP-I在晚期紅細胞外裂殖體中表達2°。因此， MSP-I是多階段疫苗誘導免疫的靶標。傳統(tǒng)上，對血液階段瘧疾疫苗的開發(fā)關注于“重組蛋白加佐劑(recombinant protein-in adjuvant) ”的制劑。這需要在動物模型中多次免疫以誘導保護性水平的抗體 應答，并且對此類候選疫苗的臨床試驗仍不樂觀4。重組蛋白疫苗受到其固有難題的阻礙 i)對大量正確折疊蛋白質(zhì)的可靠的純化；以及ii)配制在與人體相容的有效佐劑中。已開 發(fā)了用于異源“初免_加強”方案中的病毒疫苗載體，以誘導靶向細胞內(nèi)病原體的CD8+和 CD4+T細胞應答21。這規(guī)避了上述難題，并具有表達大抗原構(gòu)建體的更大能力。復制缺陷型 痘病毒(例如MVA22)或新近的腺病毒(例如AdHu523)已表現(xiàn)出用作人類預防性疫苗的適當 的安全性，并在小鼠模型中顯示出抗御紅前期(紅細胞前期)瘧疾的良好功效24’25。誘導強 有力的細胞免疫應答連同抗體應答是可能增強血液階段瘧疾疫苗之功效的一種策略。補體蛋白C4b結(jié)合蛋白(C4bp)是血液循環(huán)中補體途徑的可溶性抑制劑26。 W02005/014654描述了小鼠C4bpa鏈(mC4bp)的核心結(jié)構(gòu)域作為分子佐劑，當其與病原體 抗原融合時可增強抗體應答。該文獻公開了與mC4bp融合的重組約氏瘧原蟲MSP-I19用鹽 水施用時具有高的免疫原性，并且相比于將抗原與弗氏佐劑一起注射，其在小鼠中誘導了 保護水平更高的抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于新的出人意料的發(fā)現(xiàn)，即T細胞對包含病毒載體的免疫原性組合物和 疫苗的應答可通過在編碼目的抗原的免疫原性載體中包含編碼C4bp結(jié)構(gòu)域的核酸序列來 加強?，F(xiàn)有技術描述了小鼠C4bp核心結(jié)構(gòu)域與單體抗原的融合物，并指出其引發(fā)強的 抗體應答。通過使用C4bp融合蛋白的針對抗體應答的現(xiàn)有技術無法預期到本發(fā)明中CD4和 CD8 T細胞針對免疫原性病毒組合物和疫苗之應答的顯著增強。事實上，存在大量的可增強 抗體應答但不能增強⑶8 T細胞應答的佐劑，例如明礬(Alum)、Montanide、MF59。因此，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了包含病毒載體的免疫原性組合物，所述載體 包含編碼C4bp結(jié)構(gòu)域或者其變體或片段的核酸序列和編碼目的抗原的核酸。優(yōu)選地，所述核酸是DNA或RNA。優(yōu)選地，所述編碼C4bp結(jié)構(gòu)域的核酸與編碼目的抗原的核酸在同一讀碼框內(nèi)。顯然，C4bp結(jié)構(gòu)域可源自哺乳動物或非哺乳動物的C4bp蛋白或其片段。本發(fā)明顯然還可包括使用編碼C4bp核心之衍生物的核酸。這些衍生物包括其突 變體，其可包含氨基酸缺失、添加(尤其是添加半胱氨酸殘基)或替換、通過融合C4bp家族 不同成員的組成部分而形成的雜合或嵌合分子、和/或環(huán)狀排列的蛋白支架，以維持本文 所述的T細胞增強性質(zhì)。本發(fā)明還可以使用基于對多個物種C4bp核心序列之比對的人工C4bp共有序列。 此類嵌合分子的一個極有可能的實例在下面圖6a中給出。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，編碼本發(fā)明產(chǎn)物之C4bp組分的核酸編碼C4bp核心蛋白的α鏈。在這樣的一個實施方案中，編碼C4bp核心的核酸編碼由人C4bp (如圖6a 中所示)或其同源物之對應殘基組成的肽，或者是編碼人C4bp或其同源物之至少47個氨 基酸片段的核酸。多種哺乳動物C4bp蛋白的肽序列是本領域可獲得的。這包括人C4bp核心蛋白。 本領域還可獲得人C4bp核心蛋白的多種同源物。有兩種類型的同源物直系同源物和旁系 同源物。直系同源物定義為不同生物間的同源基因，即所述基因在物種形成中有共同的祖 先。旁系同源物定義為同一生物中源自基因、染色體或基因組復制的同源基因，即所述基因 的共同祖先在前次物種形成事件后出現(xiàn)。例如，檢索GenBank和原始基因組記錄(raw genomic trace)以及EST (表達序列 標簽)數(shù)據(jù)庫顯示，哺乳動物C4bp核心同源蛋白存在于包括黑猩猩、恒河猴、兔、大鼠、狗、 馬、小鼠、豚鼠、豬和牛的物種中。圖6a的比對中已包括人C4bp的旁系同源物和直系同源 物?？梢钥闯觯?9個序列具有高度相似性，但在C末端有較大程度的變化?？墒?用諸如BLAST等常用檢索程序通過檢索DNA或蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫來鑒定另外的C4bp核心 蛋白。當編碼來自期望哺乳動物來源之C4bp蛋白的核酸不能在數(shù)據(jù)庫中獲得時，可使 用本領域中成熟的常規(guī)克隆方法來獲得。從本質(zhì)上說，此類技術包括使用編碼已有C4bp核 心蛋白之一的核酸作為探針來釣取并確定來自其它目標物種的C4bp結(jié)構(gòu)域序列。多種技 術可用于此目的，例如使用合適來源的基因組DNA或mRNA (例如，來自胚胎或者活躍分裂分 化的或腫瘤細胞)進行基因的PCR擴增和克隆，或通過以下方法來實現(xiàn)，其包括從哺乳動物 獲得cDNA文庫(例如，來自上述來源之一的cDNA文庫)，使用已知的C4bp核酸在中等到高 嚴謹條件下(例如，0. 03M氯化鈉以及0. 03M檸檬酸鈉，約50°C至約60°C )探測所述文庫， 并釣取編碼全部或部分該哺乳動物C4bp蛋白的cDNA。當獲得部分cDNA時，可通過引物延 伸技術來確定全長編碼序列。還可使用編碼C4bp核心及其片段之變體的核酸。所述變體與野生型哺乳動物 C4bp核心或其片段的氨基酸序列優(yōu)選具有至少70%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90% (例如至少95% )或最優(yōu)選至少98%的序列同一性。一方面，C4bp核心是包含以下氨基酸的核心圖6a所示的人C4bp的第12位甘氨 酸，第28位丙氨酸，第29、34、36和41位亮氨酸，第32位酪氨酸和第33位賴氨酸，以及優(yōu) 選地第6位和第18位的兩個半胱氨酸殘基。理想地，所述變體維持這些殘基之間的相對間距。以上具體指出的同一性程度將針對圖6a中所示的任一序列?？赏ㄟ^GAP算法來確定序列同一性程度，所述GAP算法是本領域廣泛使用的算法 "Wisconsin 軟件包，，的一部分，其可從 Accelrys (原 GeneticsComputer Group, Madison, Wisconsin)獲得。GAP使用了 Needleman andWunsch算法來比對兩個完整序列，其使匹配 數(shù)最大化并且使空位數(shù)最小化。GAP可用于比對長度相似的密切相關的短序列，并因此適于 確定序列是否滿足上述同一性水平。GAP可使用默認參數(shù)。編碼哺乳動物C4bp核心蛋白之合成變體的核酸包括帶有一個或多個氨基酸替 換、缺失或插入或者C-或N-端添加的核酸。尤其會考慮替換。替換包括保守性替換。保守性替換的實例包括涉及相似氨基酸組(常稱作DayhofT組)的替換。如下所示
權(quán)利要求
包含病毒載體的免疫原性組合物，所述載體包含編碼C4bp結(jié)構(gòu)域或者其變體或片段的核酸序列以及編碼目的抗原的核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中所述編碼C4bp結(jié)構(gòu)域的核酸與所述編碼目 的抗原的核酸在同一讀碼框內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的免疫原性組合物，其中所編碼的C4bp結(jié)構(gòu)域選自圖 6或圖7中所示的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的免疫原性組合物，其中所述C4bp結(jié)構(gòu)域和目的抗原 表達成融合蛋白。
5.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的免疫原性組合物，其中所述病毒載體選自痘病毒載體例如 經(jīng)修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)，禽痘病毒載體例如雞痘病毒、金絲雀痘病毒或ALVAC，皰 疹病毒載體(包括單純皰疹病毒和CMV)，甲病毒載體和腺病毒載體。
6.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的免疫原性組合物，其中所述病毒載體是痘病毒載體或腺病 毒載體。
7.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的免疫原性組合物，其中所述抗原是瘧疾抗原。
8.根據(jù)權(quán)利要求7或8的免疫原性組合物，其中所述抗原是ME-TRAP、CSP、MSP-1或其 片段，或AMAl。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的免疫原性組合物，其中所述抗原是血液階段瘧疾抗原。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的免疫原性組合物，其與一種或多種可藥用介質(zhì)、載 體、稀釋劑或佐劑混合。
11.包含權(quán)利要求1至10中任一項的免疫原性組合物的疫苗。
12.產(chǎn)品、組合或試劑盒，其包含a)初免組合物，其包含第一病毒載體以及至少一種病原體或腫瘤抗原，所述病毒載體 還包含編碼C4bp結(jié)構(gòu)域或者其變體或片段的核酸；和b)加強組合物，其包含第二病毒載體以及至少一種與初免組合物之病原體或腫瘤抗 原相同的病原體或腫瘤抗原，所述第二病毒載體與所述第一病毒載體不同并且還包含編碼 C4bp結(jié)構(gòu)域的核酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的產(chǎn)品、組合或試劑盒，其中所述編碼C4bp結(jié)構(gòu)域的核酸與所述 編碼目的抗原的核酸在同一讀碼框內(nèi)。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的產(chǎn)品、組合或試劑盒，其中所編碼的C4bp結(jié)構(gòu)域選自圖6 或圖7中所示的氨基酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求12至14中任一項的產(chǎn)品、組合或試劑盒，其中每一載體中的所述 C4bp結(jié)構(gòu)域和目的抗原表達成融合蛋白。
16.根據(jù)權(quán)利要求12至15中任一項的產(chǎn)品、組合或試劑盒，其中每一病毒載體選自痘 病毒載體例如經(jīng)修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)，禽痘病毒載體例如雞痘病毒、金絲雀痘病毒 或ALVAC，皰疹病毒載體(包括單純皰疹病毒和CMV)，甲病毒載體或腺病毒載體。
17.根據(jù)權(quán)利要求12至16中任一項的產(chǎn)品、組合或試劑盒，其中所述第一病毒載體是 腺病毒載體。
18.根據(jù)權(quán)利要求12至17中任一項的產(chǎn)品、組合或試劑盒，其中所述第二病毒載體是痘病毒載體。
19.根據(jù)權(quán)利要求12至18中任一項的產(chǎn)品、組合或試劑盒，其中所述抗原是瘧疾抗原。
20.病毒載體，其包含編碼C4bp結(jié)構(gòu)域或者其變體或片段的核酸序列以及編碼目的抗 原的核酸。
21.權(quán)利要求20的病毒載體，其中所述編碼C4bp結(jié)構(gòu)域的核酸與所述編碼目的抗原的 核酸在同一讀碼框內(nèi)。
22.權(quán)利要求20或21的病毒載體，其中所編碼的C4bp結(jié)構(gòu)域選自圖6或圖7中所示 的氨基酸序列。
23.權(quán)利要求20至22中任一項的病毒載體，其中所述C4bp結(jié)構(gòu)域和目的抗原表達成融合蛋白。
24.權(quán)利要求20至23中任一項的病毒載體，其中所述病毒載體選自痘病毒載體例如經(jīng) 修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)，禽痘病毒載體例如雞痘病毒、金絲雀痘病毒或ALVAC，皰疹 病毒載體(包括單純皰疹病毒和CMV)，甲病毒載體或腺病毒載體。
25.權(quán)利要求20至24中任一項的病毒載體，其中所述病毒載體是痘病毒載體或腺病毒 載體。
26.權(quán)利要求20至25中任一項的病毒載體，其中所述抗原是瘧疾抗原
27.權(quán)利要求20至26中任一項的病毒載體，其用作免疫原性組合物或疫苗。
28.根據(jù)權(quán)利要求20至26中任一項的病毒載體在制備用于預防或治療瘧疾之免疫原 性組合物或疫苗中的用途。
29.根據(jù)權(quán)利要求20至26中任一項的病毒載體，其用于制備用于預防或治療瘧疾之免 疫原性組合物或疫苗。
30.免疫個體的方法，其通過施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的至少一種 免疫原性組合物來實現(xiàn)。
31.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中使用異源初免_加強方案來免疫所述個體。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中形成第一單位劑量的所述免疫原性組合物或疫苗包 含腺病毒載體。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或32的方法，其中形成第二單位劑量的所述免疫原性組合物或疫苗包含痘病毒載體。
34.根據(jù)權(quán)利要求31至33中任一項的方法，其中施用所述第一和第二單位劑量之間的 時間間隔為2 8周。
35.根據(jù)權(quán)利要求12至19中任一項的產(chǎn)品、組合或試劑盒用于在受試者中產(chǎn)生針對病 原體或腫瘤之至少一種靶抗原的保護性T細胞應答的用途。
36.權(quán)利要求1至10中任一項的免疫原性組合物，其用作疫苗。
37.權(quán)利要求6至10中任一項的免疫原性組合物，其用于治療或預防瘧疾。
全文摘要
包含病毒載體的免疫原性組合物，所述載體包含編碼C4bp結(jié)構(gòu)域或者其變體或片段的核酸序列以及編碼目的抗原的核酸序列。
文檔編號A61K39/00GK101959420SQ200880016422
公開日2011年1月26日 申請日期2008年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月10日
發(fā)明者西蒙·德拉佩, 費爾加爾·伊爾, 阿德里安·伊爾 申請人:Isis創(chuàng)新有限公司;艾馬克西奧公司