專利名稱：：一種適用于對葡萄糖控制肽進(jìn)行控釋的可生物降解的微球組合物及其制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種可生物降解的聚合物微球，該微球包含可生物降解的聚合物載體，在該載體中包封有葡萄糖調(diào)節(jié)肽，所述微球能夠以可控的方式釋放葡萄糖調(diào)節(jié)肽；本發(fā)明還涉及所述微球的制備方法。
背景技術(shù)：
：在口服給藥后，多數(shù)蛋白類藥物和肽類藥物在胃部酸性環(huán)境中或是酶的降解作用下會失去其活性結(jié)構(gòu)。另外，它們通過胃粘膜或腸粘膜的吸收速率非常低。由于這些原因，蛋白類藥物或肽類藥物通常以非口服的途徑進(jìn)行給藥，即注射給藥。由于多數(shù)非口服給藥的蛋白類藥物或肽類藥物在體內(nèi)的半衰期短且生物利用度低，所以蛋白類藥物或肽類藥物的非口服給藥必須反復(fù)進(jìn)行。此外，在很多情況下，其給藥過程可能會持續(xù)很長時間例如數(shù)月。為避免此類問題，人們對緩釋制劑進(jìn)行了積極的研究，得到了其中包封有蛋白類藥物或肽類藥物的可生物降解的聚合物載體的使用，該聚合物載體可在其生物降解的過程中從中釋放出蛋白類藥物或肽類藥物(Heller,J.等人，Controlledreleaseofwater-solublemacromoleculesfrombioerodiblehydrogels，Biomaterials，4，262-266，1983;Langer，R.，Newmethodsofdrugdelivery,Science,249，1527-1533，1990;Langer,R.，Chem.Eng.Commun.，6，1-48，1980;Langer,R.S.和Peppas，N.A.，Biomaterials,2，201-214，1981;Heller,J.，CRCCrit.Rev.Ther.DrugCarrierSyst.，1(1)，39-90，1984;Holland,S丄；Tighe，B.J.和Gould,P.L.，J.ControlledRelease,155-180，1986)。目前，作為蛋白類藥物或肽類藥物的聚合物載體使用的脂肪族聚酯由于其生物相容性被認(rèn)可從而得到FDA的批準(zhǔn)使用。它們在藥物輸送或手術(shù)縫合方面被廣泛地用作載體。脂肪族聚酯的具體實例包括聚L-乳酸、聚乙醇酸、D-乳酸-乙醇酸共聚物、L-乳酸-乙醇酸共聚物、D，L-乳酸-乙醇酸共聚物(以下寫作"PLGA")、聚己內(nèi)酯、聚戊內(nèi)酯、聚羥基丁酸酯和聚羥基戊酸酯(Peppas,L.B.,Int.J.Pharm.，116，1-9，1995)。隨著近年來作為新型療法的高分子量肽或蛋白質(zhì)的發(fā)展，人們在以可控的方式將其從聚合物載體中釋放方面進(jìn)行了各種各樣的嘗試。然而包含包封有蛋白類藥物的聚酯微球的劑型存在著如下缺陷初期突釋效應(yīng)(initialburstreleaseeffect)、由于各種因素造成的一定時間內(nèi)的釋放速率不受控制、或是包封藥物的釋放不完全。例如，模型蛋白類藥物諸如牛血清白蛋白、溶菌酶等在開始階段會大量釋放，但顯示最終的釋放率約為50%(Crotts，G.和Park,T.G.，J.Control.Release,44，123-134，1997;Leonard,N.B.，Michael,L.H.，Lee，M.M.，J.Pharm.Sci.，84，707-712)。至于使用了其中包封有重組人生長激素的脂肪族聚酯載體的微球，其開始階段釋放的藥量為30%至50%,但微球中剩余的藥量為40%至60%(Yan,C,等人，J.Control-Release,32，231-241，1994;Kim,H.K.禾卩Park,T.G，Biotechnol.Bioeng.，65，659-667，1999)。藥物的初期突釋效應(yīng)歸因于聚集或者吸收于微球表面或孔隙的蛋白類藥物在開始階段通過迅速擴(kuò)散而釋放的事實。在微球的制備過程中，蛋白類藥物可能會在水和有機(jī)溶劑之間的界面發(fā)生變性，并因此形成導(dǎo)致不穩(wěn)定釋放的不可逆的聚集體。為避免蛋白類藥物的界面誘導(dǎo)變性，已經(jīng)報道了在微球的制備中使用表面活性劑(例如非離子型表面活性劑Tween、PluronicF68、Brij35等)和穩(wěn)定劑(例如甘露醇、明膠、海藻糖、羧甲基纖維素等)或是無水有機(jī)溶劑(Gombotz,W.R.;Healy,M.，Brown,L.，美國專利No.5019400)。為解決一定時間內(nèi)不可控的藥物釋放速率以及所包封的藥物釋放不完全的問題，近期的許多研究都與制備藥物緩釋微球的替代方法有關(guān)，此類方法包括以兩種或多種具有不同降解速率的聚合物按預(yù)定比例形成的混合物的形式將藥物進(jìn)行包封(Ravivarapu，H.B.;Burton,K,;Deluca，P.P.,EurJPharmBiopharm,50(2)，263-270，2000;韓國專利申請No.1998-0062142)或者是將兩種或多種分別在其中包封有藥物的具有不同降解速率的聚合物微球按預(yù)定比例進(jìn)行混合(美國專利No.4897268)，從而使藥物自微球中的初期釋放和持續(xù)釋放都能得到控制。然后在用常規(guī)方法制備的微球中，從具有高降解速率的聚合物中降解的產(chǎn)物(例如6乳酸和乙醇酸)降低了pH值，從而促進(jìn)了具有低降解速率的聚合物的降解，導(dǎo)致分別包封于各自的聚合物中的藥物的釋放速率與計算得到的釋放速率有著很大的不同。進(jìn)一步地，從制造工藝和經(jīng)濟(jì)的角度來看，為一種劑型制備兩種或多種微球都是不利的(韓國專利申請No.2000-0036178)。作為微球的制備技術(shù)，相分離法(美國專利No.4673595、韓國專利申請No.2007-0031304)、噴霧干燥法(韓國專利申請No.2003-0023130)以及有機(jī)溶劑蒸發(fā)法(美國專利No.4389330)是為人所共知的。在相分離法當(dāng)中，二氯甲垸溶劑與硅油、庚烯和乙醇共同使用，但它們?nèi)恳怀?，因此從?jīng)濟(jì)角度考慮是不利的。至于噴霧干燥法，由于其需要在高溫下(例如60。C或更高溫度)與有機(jī)溶劑一起對肽類藥物或蛋白藥物進(jìn)行噴霧干燥，可能引起肽類藥物或蛋白類藥物的變性。由于這些原因，有機(jī)溶劑蒸發(fā)法在制備肽類藥物或蛋白類藥物方面應(yīng)用最為廣泛。在該方法中，技術(shù)上最為重要的因素之一就是包封率(韓國專利申請No.2003-0081179)。因此，需要有一種微球制備方法滿足如下要求既沒有初期突釋效應(yīng)也不會使藥物釋放不完全；使得藥物進(jìn)行零級釋放；簡便易行且經(jīng)濟(jì)上有利；以及確保所包封的藥物具有高包封率和高穩(wěn)定性。葡萄糖調(diào)節(jié)肽屬于具有治療潛力的一組肽，可治療胰島素依賴型糖尿病、妊娠期糖尿病或非胰島素依賴型糖尿病、肥胖和脂代謝紊亂(美國專利No.6506724)。葡萄糖調(diào)節(jié)肽的實例包括Exendin-3、Exendin-4以及它們的同系物和激動劑；以及胰高血糖素、胰高血糖素樣肽(例如GLP-1、GLP-2)以及它們的同系物和激動劑(韓國專利申請No.2006-7015029)。從晰賜墨西哥毒晰(i/e/ofiferwaAorr/dw附)或希拉毒晰(//e/ocfe7n"w^e"wm)的唾液分泌物中分離出來的Exendin-4是一種由39個氨基酸殘基組成的具有生理活性的肽。Exendin-4會刺激胰島素自胰島p細(xì)胞中的分泌，降低升高的胰高血糖素分泌以及引起食欲下降，因此具有治療糖尿病和肥胖的用途(Eng.J.等人，1990;Raufman,J.P,，1992;Goeke，R.，1993;Thorens，B.，1993)。7為有效治療和預(yù)防糖尿病，人們對用于緩釋exendin-4的微球進(jìn)行了研究(韓國專利申請No.2006-7023921)。然而，常規(guī)方法較為復(fù)雜低效，這一點可通過以下幾個例子進(jìn)行證明相分離法當(dāng)中所使用并除去的大量有機(jī)溶劑、超聲方法中由于使用高能量造成的肽的降解以及使用多種輔料，這些輔料包括穩(wěn)定劑(例如糖)和釋放增強(qiáng)劑(例如無機(jī)酸和無機(jī)鹽)。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的是提供一種微球以滿足如下要求既沒有初期突釋效應(yīng)也不會使藥物釋放不完全；不論穩(wěn)定釋放時間的長短，使得藥物進(jìn)行零級釋放；其制備簡便易行且經(jīng)濟(jì)上有利；以及確保所包封的藥物具有高包封率和高穩(wěn)定性。本發(fā)明的目的還在于提供所述微球的制備方法，該方法既不使用有機(jī)溶劑和高能處理(如超聲破碎)，也不使用釋放促進(jìn)劑，且簡便易行。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了可生物降解的聚合物微球，所述微球包含可生物降解聚合物載體，在所述載體中包封有葡萄糖調(diào)節(jié)肽，所述微球能夠以可控的方式釋放葡萄糖調(diào)節(jié)肽。同樣地，本發(fā)明還提供了可生物降解的聚合物微球的制備方法。除了在其制備過程中簡便易行且經(jīng)濟(jì)上有利、以及確保所包封的藥物具有高包封率和高穩(wěn)定性外，本發(fā)明中的微球顯示能使藥物(例如exendin-4)進(jìn)行零級釋放，并因此使得藥物在體外和體內(nèi)得以在三周至四周的時間內(nèi)從中進(jìn)行穩(wěn)定的釋放，既沒有初期突釋效應(yīng)也不會使藥物釋放不完全。圖1表示通過本發(fā)明實施例1中的藥物分散方法制備的微球的體外釋放模式圖。圖2表示在本發(fā)明實施例4-8中制備的微球的體外釋放模式圖。圖3表示在對比例1和對比例2中制備的微球的體外釋放模式圖。圖4表示在實施例1-1中制備的微球的體內(nèi)釋放模式圖。圖5為由在實施例1-1中制備的微球所得到的exendin-4通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析得到的色譜圖。具體實施例方式下文對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明與對葡萄糖調(diào)節(jié)肽進(jìn)行控釋的可生物降解的聚合物微球有關(guān)，該微球包含可生物降解的聚合物載體，在所述載體中包封有葡萄糖調(diào)節(jié)肽。適用于本發(fā)明的葡萄糖調(diào)節(jié)肽的實例包括天然的、重組的或合成的exendin-3、exendin-4以及它們的同系物和激動劑；胰高血糖素、胰高血糖素樣肽(例如GLP-1、GLP-2)以及它們的同系物和激動劑。其中，優(yōu)選合成的exendin-3、exendin-4以及它們的同系物和激動劑。最優(yōu)選合成的exendin-4。所述微球中葡萄糖調(diào)節(jié)肽的含量隨給藥途徑、劑量和蛋白質(zhì)性質(zhì)而變化。適于用作可生物降解的聚合物載體的物質(zhì)為可生物降解的聚酯聚合物。當(dāng)用作微球的支架(scaffold)且其中含有葡萄糖調(diào)節(jié)肽時，可生物降解的聚酯聚合物逐漸地降解而釋放出葡萄糖調(diào)節(jié)肽。可生物降解的聚酯聚合物的實例包括但不限于聚L-乳酸、聚乙醇酸、D-乳酸-乙醇酸共聚物、L-乳酸-乙醇酸共聚物、D,L-乳酸-乙醇酸共聚物、聚己內(nèi)酯、聚戊內(nèi)酯、聚羥基丁酸酯和聚羥基戊酸酯。只要是可生物降解的聚酯聚合物在本領(lǐng)域中經(jīng)常使用，就不在本發(fā)明中對其使用強(qiáng)加以任何特別的限定。該聚合物優(yōu)選自于由下列物質(zhì)所組成的組聚L-乳酸、D-乳酸-乙醇酸共聚物(poly-D-lacticacid-co-glycolicacid)、L-乳酸-乙醇酸共聚物(poly-L-lacticacid-co-glycolicacid)、D，L-乳酸-乙醇酸共聚物(poly-D，L-lacticacid-co-glycolicacid,PLGA)以及這些物質(zhì)的組合。更為優(yōu)選D,L-乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)自身、或其與聚L-乳酸的組合°另外，本發(fā)明還與對葡萄糖調(diào)節(jié)肽進(jìn)行控釋的可生物降解的聚合物微球的制備方法有關(guān)?？缮锝到獾木酆衔镂⑶虻闹苽浞椒ò▽⒂袡C(jī)溶劑加入到聚合物中，得到聚合物溶液(步驟l);將葡萄糖調(diào)節(jié)肽分散于步驟1所述的聚合物溶液中，得到分散體(dispersion),然后將醇或醇與有機(jī)酸的混合物加入到該分散體中，得到分散有藥物的溶液(drug-dispersedsolution)(步驟2);以及由步驟2中所述的分散有藥物的溶液形成微球(步驟3)。該方法的詳細(xì)說明將逐步給出。首先，步驟1為制得聚合物溶液。在步驟1中，將聚合物溶解于有機(jī)溶劑中。該聚合物為可生物降解的，且可用作載體，優(yōu)選可生物降解的聚酯聚合物。只要是可生物降解的聚合物載體在其中具有高溶解度且可通過蒸發(fā)容易地將其除去，可以使用任何揮發(fā)性的有機(jī)溶劑而不作特別的限定。在本發(fā)明中，有機(jī)溶劑不僅起到用于溶解聚合物的增溶劑的作用，還起到將葡萄糖調(diào)節(jié)肽均勻分散于聚合物溶液的分散劑的作用。適用于本發(fā)明的有機(jī)溶劑的實例包括二氯甲垸、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、二甲亞砜、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯垸酮、二氧六環(huán)、四氫呋喃、乙酸乙酯、甲乙酮、乙腈以及這些物質(zhì)的組合，其中優(yōu)選二氯甲垸、乙酸乙酯和氯仿，最優(yōu)選二氯甲烷。然后，步驟2為制得分散有藥物的溶液。在步驟2中，將葡萄糖調(diào)節(jié)肽分散于所述的聚合物溶液中。該葡萄糖調(diào)節(jié)肽如上文所述。優(yōu)選加入合成的exendin-4以得到藥物分散體(adrugdispersion)。在該藥物分散體中，葡萄糖調(diào)節(jié)肽與所述聚合物的比例(w/w)選自足以溶解葡萄糖調(diào)節(jié)肽的范圍。然后，將醇單獨溶解于藥物分散體中，或者將醇與有機(jī)酸的組合溶解于藥物分散體中。醇和有機(jī)酸起到了增溶劑的作用，能夠溶解所述的聚合物和葡萄糖調(diào)節(jié)肽。可進(jìn)一步添加穩(wěn)定劑或表面活性劑。在本發(fā)明的方法中，以如下順序進(jìn)行藥物分散體的制備非常重要在聚合物中加入有機(jī)溶劑、加入葡萄糖調(diào)節(jié)肽、加入醇或醇與有機(jī)酸的10混合物。當(dāng)加入的順序發(fā)生改變時，即，當(dāng)在聚合物中加入有機(jī)溶劑以及醇或醇與有機(jī)酸的混合物之后，再將葡萄糖調(diào)節(jié)肽溶解；或是當(dāng)將葡萄糖調(diào)節(jié)肽在醇或醇與有機(jī)酸的混合物中形成的溶液加入到聚合物溶液中時，所得到的微球會顯示出不完全的釋放模式。本發(fā)明中有用的醇為甲醇、乙醇、異丙醇和丁醇，優(yōu)選甲醇，原因在于其對所述可生物降解的聚合物載體和葡萄糖調(diào)節(jié)肽的高溶解度。用于溶解藥物分散體的醇優(yōu)選使用盡可能少的用量，但必須足以溶解藥物分散體。可根據(jù)醇的種類確定用量。就甲醇而言，藥物分散體與醇的比例(v/v)的優(yōu)選范圍為1:1至6:1，更優(yōu)選3:1至4:1以完全溶解藥物分散體。另外，只要是能夠溶解所述的聚合物載體和葡萄糖調(diào)節(jié)肽，可以使用任何有機(jī)酸而不作特別的限定。適用于本發(fā)明的有機(jī)酸的實例包括草酸、草酰乙酸、富馬酸、蘋果酸、琥珀酸、乙酸、丁酸、軟脂酸、酒石酸、抗壞血酸、尿酸、磺酸、亞磺酸、甲酸、檸檬酸、異檸檬酸、a-酮戊二酸、琥珀酸以及核酸，優(yōu)選乙酸、甲酸及其組合。類似于醇，根據(jù)有機(jī)酸的種類確定有機(jī)酸的用量。只要添加劑能夠溶解藥物分散體并且可溶于用于藥物分散體的溶劑，就不對其強(qiáng)加任何特別的限定。例如可使用聚乙二醇(SolutolHS-15TM、TPGSTM、Gelucire)、油類(LabrafilTM、LabrasolTM、MediumChainTriglyceride(中鏈甘油三酯))、蛋白類(凝集素)、表面活性劑(N-甲基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、Tween、SpanTM、Cremophor、泊洛沙姆tm、Brij、Sunsoft818HTM)以及羥丙基甲基纖維素。其在增溶劑中的濃度范圍為0.01%至15%(w/v)，優(yōu)選0.1%至12.5%(w/v)。最后，步驟3為從步驟2中所述的分散有藥物的溶液中形成微球。通過將所述的分散有藥物的溶液在含有乳化劑的水溶液中進(jìn)行分散或是使用噴霧干燥機(jī)可實現(xiàn)微球的形成。當(dāng)將所述的分散有藥物的溶液在含有乳化劑的水溶液中進(jìn)行分散時，使用攪拌器和均質(zhì)機(jī)來形成微球，隨后將微球進(jìn)行干燥。本發(fā)明中有用的乳化劑可以是可分散于有機(jī)溶劑中的親油性乳化劑或者是可分散于水性溶劑中的親水性乳化劑。親水性乳化劑的實例包括Tween、Triton、Brij、聚乙烯吡咯垸酮和聚乙烯醇，優(yōu)選聚乙烯醇。所使用的乳化劑在有機(jī)溶劑中可以是飽和的或不飽和的。該有機(jī)溶劑優(yōu)選二氯甲烷、乙酸乙酯或氯仿，最優(yōu)選二氯甲垸。所述乳化劑在水溶液中的濃度范圍為0.01%至5.0%(w/v)，優(yōu)選0.5%至2%(w/v)。在該步驟中，可以通過冷凍干燥或真空干燥來進(jìn)行干燥。所得到的微球可通過冷凍干燥時的離心分離進(jìn)行收集，或者是在最終干燥以前通過真空干燥時的真空過濾系統(tǒng)進(jìn)行收集。根據(jù)本方法制備的微球為水包油(0/W)類型，其平均尺寸范圍為5pm至70^im，并優(yōu)選10pm至30nm，該尺寸范圍適于注射。通過控制油相的體積比，即，所述分散有藥物的溶液與溶解有乳化劑的水相的體積比，可以將顆粒尺寸設(shè)定為各種數(shù)值。就噴霧干燥而言，可通過從噴霧干燥機(jī)將所述分散有藥物的溶液噴霧的方法簡單地進(jìn)行微球的制備。為提高制備效率，在注入時，將噴霧干燥機(jī)的溫度設(shè)定為115。C至125°C，在噴出時，將溫度設(shè)定為80。C至90。C。其后經(jīng)噴霧干燥的微球可經(jīng)過另外的干燥過程如冷凍干燥或真空干燥以除去其中殘留的溶劑。進(jìn)一步地，本發(fā)明中的可生物降解的聚合物微球可通過包含如下步驟的方法進(jìn)行制備-將有機(jī)溶劑加入到聚合物中，得到聚合物溶液(步驟l);將步驟1中的聚合物溶液用含有表面活性劑的葡萄糖調(diào)節(jié)肽水溶液乳化，得到初級乳液(primaryemulsion)(步驟2');以及由步驟2'中所述的初級乳液形成微球(步驟3')。在步驟1中，將聚合物溶解于有機(jī)溶劑中。該聚合物為可生物降解的并可用作載體，優(yōu)選可生物降解的聚酯聚合物。只要是對于可生物降解的聚合物載體具有高溶解度并可通過蒸發(fā)容易地除去，可以使用任何揮發(fā)性溶劑而不作特別的限定。在本發(fā)明中，該有機(jī)溶劑不僅起到使聚合物溶解的增溶劑的作用，而且還起到將葡萄糖調(diào)節(jié)肽均勻分散于聚合物溶液的分散劑的作用。12適用于本發(fā)明的有機(jī)溶劑的實例包括二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、二甲亞砜、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二氧六環(huán)、四氫呋喃、乙酸乙酯、甲乙酮、乙腈以及這些物質(zhì)的組合，優(yōu)選二氯甲垸、乙酸乙酯和氯仿，最優(yōu)選二氯甲垸。在步驟2'中，將含有表面活性劑的葡萄糖調(diào)節(jié)肽水溶液加入到聚合物溶液中，隨后用攪拌器或均質(zhì)機(jī)進(jìn)行乳化以得到初級乳液。合成的exendin-4可作為優(yōu)選的葡萄糖調(diào)節(jié)肽進(jìn)行使用。在聚合物溶液中加入含有表面活性劑的葡萄糖調(diào)節(jié)肽水溶液，形成了水包油包水(W/0/W)類型的復(fù)乳(doubleemulsion)微球。在步驟2'中，只要是可將葡萄糖調(diào)節(jié)肽溶解于水溶液中，葡萄糖調(diào)節(jié)肽水溶液中可含有任何表面活性劑。在本發(fā)明中可用的表面活性劑的實例包括Tween、Triton、Brij、聚乙烯吡咯垸酮和聚乙烯醇?？赏ㄟ^如下步驟實現(xiàn)微球的形成將步驟2'中的初級乳液分散于含有乳化劑的水溶液中；用攪拌器或均質(zhì)機(jī)進(jìn)行攪拌，以及干燥。本發(fā)明中有用的乳化劑可以是可分散于有機(jī)溶劑中的親油性乳化劑或者是可分散于水性溶劑中的親水性乳化劑。親水性乳化劑的實例包括Tween、Triton、Brij、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇，優(yōu)選聚乙烯醇。所使用的乳化劑在有機(jī)溶劑中可以是飽和的或不飽和的。該有機(jī)溶劑優(yōu)選二氯甲烷、乙酸乙酯或氯仿，最優(yōu)選二氯甲垸。乳化劑在水溶液中的濃度范圍為0.01%至5.0%(w/v)，優(yōu)選0.5%至2%(w/v)。在該步驟中，可借助冷凍干燥或真空干燥來進(jìn)行干燥。所得到的微球可通過冷凍干燥時的離心分離進(jìn)行收集，或者是在最終干燥以前通過真空干燥時的真空過濾系統(tǒng)進(jìn)行收集。根據(jù)本發(fā)明制備的微球在以可控的方式釋放exendin-4方面是一種有用的試劑，其具有如下優(yōu)點既沒有初期突釋效應(yīng)也不會使藥物釋放不完全；保持exendin-4的零級釋放；由于其簡便的制備方法確保所包封的exendin-4具有高包封率和高穩(wěn)定性；以及在體外和體內(nèi)在三周或四周的時間內(nèi)從中穩(wěn)定地釋放exendin-4。實施例可通過下面的實施例更好地理解本發(fā)明，這些實施例是為闡明本發(fā)明而給出，不應(yīng)被理解為對本發(fā)明的限定。實施例1:根據(jù)聚合物種類與混合比例進(jìn)行微球的制備(水包油0/W型乳液)將300mg聚合物(Boehringerlngelheim)完全溶解于二氯甲烷中。將9mg的exendin-4(AmericanPeptide)分散于該聚合物溶液中得到exendin-4分散體。所使用的聚合物如表1所示，為一種聚合物產(chǎn)品或是兩種不同的聚合物產(chǎn)品以各種混合比例混合而成的混合物。向每種具有不同聚合物種類與混合比例的藥物分散體中加入預(yù)定量的甲醇(醇與藥物分散體的體積比為1:4)，得到分散有藥物的溶液。取10ml每種分散有藥物的溶液，使用250ml用二氯甲垸飽和的、1%(w/v)的聚乙烯醇水溶液，通過攪拌器或均質(zhì)機(jī)將其進(jìn)行乳化以形成微球。在室溫和大氣壓下攪拌數(shù)小時而將二氯甲烷緩慢地?fù)]發(fā)到空氣中的同時，將微球進(jìn)行固化。在離心分離之后，將由此收集到的微球用蒸餾水進(jìn)行洗滌，并在-70。C進(jìn)行冷凍，然后在室溫和50mTorr的壓力下，用advantage冷凍干燥機(jī)(VirTis，NY，U.S.A)進(jìn)行3天的冷凍干燥，從而得到能夠以可控的方式釋放exendin-4的水包油(0/W)型微球。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例2:根據(jù)醇與藥物分散體的比例進(jìn)行微球的制備(水包油0/W型乳液)將300mg聚合物(RG502H，Boehringerlngelheim)完全溶解于二氯甲烷中。將9mg的exendin-4(AmericanPeptide)分散于該聚合物溶液中得到exendin-4分散體。向該藥物分散體中加入預(yù)定量的甲醇(醇與藥物分散體的體積比為1:1至1:7，如表2所示)以得到分散有藥物的溶液。用與實施例1中相同的方式將其進(jìn)行乳化和干燥以得到微球。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>如表2所示，當(dāng)藥物分散體與甲醇的體積比為7以上時，無法形成溶液。實施例3:由含有添加劑的分散有藥物的溶液進(jìn)行微球的制備(水包油0/W型乳液)用與實施例1-1相同的方式制備微球，所不同的是將占溶液體積0.1%或12.5%的各種添加劑與分散有藥物的溶液進(jìn)行混合。在表3中總結(jié)了與溶液進(jìn)行混合的添加劑及其體積百分?jǐn)?shù)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>如表3所示，可將具有較寬濃度范圍的多種添加劑與分散有藥物的溶液進(jìn)行混合。實施例4:由未被有機(jī)溶劑飽和的乳化劑水溶液進(jìn)行微球的制備(水包油0/W型乳液)用與實施例1-1相同的方式制備微球，所不同的是將分散有藥物的溶液加入到250ml未被二氯甲烷飽和的聚乙烯醇的1%水溶液(w/v)中，并用攪拌器或均質(zhì)機(jī)乳化。實施例5:具有不同顆粒尺寸的微球的制備(水包油0/W型乳液)用與實施例1-1相同的方式制備微球，所不同的是用二氯甲烷飽和的聚乙烯醇的1%水溶液(w/v)與分散有藥物的溶液的體積比(即水相與油相的體積比)按照下表4所示進(jìn)行設(shè)定。表4實施例Exendin-4(mg)聚合物(mg)水相:油相(v/v)5-193001:155-21:305-31:60實施例6:用干燥法進(jìn)行微球的制備(水包油0/W型乳液)將在實施例1-1中通過在室溫和大氣壓下進(jìn)行數(shù)小時的攪拌將二氯甲垸逐漸揮發(fā)后固化得到的微球通過真空過濾系統(tǒng)進(jìn)行過濾，再用蒸餾水洗滌，然后在最終干燥前在室溫和50mTorr的壓力下用advantage干燥機(jī)(VirTis，NY，U.S.A)進(jìn)行3天的脫水。實施例7:用噴霧干燥法進(jìn)行微球的制備(水包油0/W型乳液)在實施例1-1中得到的分散有藥物的溶液未與乳化劑水溶液進(jìn)行混合，而是以每分鐘2.5ml的速率被注入噴霧干燥機(jī)(BuchiMini噴霧干燥機(jī)，B-290),同時，通過0.7mm的噴嘴以400Nl/h的速率進(jìn)行噴霧。將由此形成的微球在真空中進(jìn)行干燥，從而得到能夠穩(wěn)定釋放exendin-4的微球劑型。在注入時，將噴霧干燥機(jī)的溫度設(shè)定為120士2。C，而在噴出時，將溫度設(shè)定為85±2°C。實施例8:使用藥物水溶液進(jìn)行微球的制備(水包油包水W/0/W型乳液)將300mg聚合物(RG502H，BoehringerIngelheim)完全溶解于二氯甲垸中。向該聚合物溶液中加入exendin-4的水溶液，所述的exendin-4的水溶液通過將9mg的exendin-4(AmericanPeptide)溶解于0.3ml聚乙烯醇的0.5%水溶液(w/v)中而形成，然后用均質(zhì)機(jī)攪拌得到初級乳液。取10ml該初級乳液，使用250ml用二氯甲烷飽和的、聚乙烯醇的1%水溶液(w/v)，通過攪拌器或均質(zhì)機(jī)將其進(jìn)行乳化以形成微球。在室溫和大氣壓下攪拌數(shù)小時而將二氯甲垸緩慢地?fù)]發(fā)到空氣中的同時，將微球進(jìn)行固化。在離心分離之后，將由此收集到的微球用蒸餾水進(jìn)行洗滌，并在-70。C進(jìn)行冷凍，然后在室溫和50mTorr的壓力下，用advantage冷凍干燥機(jī)(VirTis，NY，U.S.A)進(jìn)行3天的冷凍干燥，從而得到能夠以可控的方式釋放exendin-4的水包油包水(W/0/W)型微球。對比例L沒有藥物分散步驟而進(jìn)行水包油(0/W)型微球的制備(1)向含有300mg聚合物(RG502H，BoehringerIngelheim)的二氯甲烷溶液中，加入相當(dāng)于二氯甲垸溶液體積的四分之一的甲醇，得到聚合物/二氯甲烷/甲醇溶液。以exendin-4與聚合物的重量比為9:300的比例，將exendin-4與聚合物/二氯甲烷/甲醇溶液進(jìn)行混合，得到未進(jìn)行藥物分散步驟的分散有藥物的溶液。用與實施例1中相同的方式由該分散有藥物的溶液制備微球。對比例2:沒有藥物分散步驟而進(jìn)行水包油(0/W)型微球的制備(2)用與實施例1相同的方式制備微球，所不同的是將9mg的exendin-4在0.2ml甲醇中形成的溶液加入到300mg聚合物(RG502H，BoehringerIngelheim)在0.8ml二氯甲烷中形成的溶液中，得到未進(jìn)行藥物分散步驟的分散有藥物的溶液。實驗例1:微球中Exendin-4的包封率取30mg每種在實施例l和實施例4-8中制備的其中包封有exendin-4的微球，在聚苯乙烯容器中將其充分溶解于0.5ml的DMSO，并向其中加入1.5ml蒸餾水，然后將其攪拌12小時以上，以將exendin-4提取進(jìn)入水相。將提取出的exendin-4進(jìn)行定量分析以計算包封率，包封率以實際包封量占理論包封量的百分比的方式表達(dá)。將計算結(jié)果在下面的表5中進(jìn)行總結(jié)。表5實施例包封率(％)1-1851-2861-3881-481l陽5831-6841-7804845-1855-2855陽384685793883如表5所示，計算得到的本發(fā)明中的微球，其包封率在80%以上。實驗例2:微球平均顆粒尺寸的測量取30mg每種在實施例l和實施例4-8中制備的其中包封有exendin-4的微球，將其分散于含有0.02%(v/v)Tween20的1L蒸餾水中，然后用粒度分析儀測量其平均顆粒尺寸。測量結(jié)果列于下面的表6中。表6實施例平均顆粒尺寸(pm)1-1221-2161-3181-4161-5191-6221-7214265-185-2255-365621759816如表6所示，根據(jù)本發(fā)明制備的微球其平均顆粒尺寸范圍為8nm至65pm，已經(jīng)小到足夠用于小尺寸注射針頭。18實驗例3:藥物自微球中的體外釋放在下面的條件下，對在實施例和比較例中制備的微球進(jìn)行exendin-4體外釋放的評價。將置于聚苯乙烯容器中的30mg微球分散于含有0.02%(v/v)Tween20的、1.5ml的PBS(磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.4)中。在37°C進(jìn)行保溫(incubation)期間，根據(jù)保溫時間將分散體進(jìn)行離心分離使微球沉淀。對上清液進(jìn)行exendin-4水平分析以測定exendin-4自微球中的釋放量。將沉淀出的微球再次分散于新鮮的PBS用于隨后的分析實驗。在圖l至圖3中繪制出exendin-4自微球中的釋放量(％)隨保溫時間的變化情況。圖1和圖2表示exendin-4自微球中的體外釋放量隨時間的變化情況，該微球通過本發(fā)明中的實施例1和實施例4-8中的exendin分散步驟制備得到；而圖3表示exendin-4自微球中的體外釋放量隨時間的變化情況，該微球由不包括exendin分散步驟的對比例l和對比例2制備得到。從圖1和圖2的曲線中可以明顯地看出，通過本發(fā)明中的exendin分散步驟制備的微球既沒有初期突釋(exendin-4在第一天釋放了3%)也不會釋放不完全，在21天內(nèi)持續(xù)進(jìn)行零級釋放。相反，如圖3所示，在沒有exendin分散步驟的情況下制備的微球顯示出釋放不完全的狀況，只有83%(對比例1)和49%(對比例2)的藥物在21天內(nèi)得到了釋放。因此，根據(jù)本發(fā)明制備的含有exendin-4的微球既沒有初期突釋也不會釋放不完全，并且在三周內(nèi)持續(xù)進(jìn)行exendin-4的零級釋放，所以其能夠有效地用作exendin-4的緩釋劑。實驗例4:微球的藥物動力學(xué)評價在下面的條件下，對在實施例和對比例中制備的微球進(jìn)行exendin-4體內(nèi)釋放和藥物動力學(xué)性質(zhì)的評價。將預(yù)定量的(對應(yīng)于140叫的exendin-4)在實施例1和實施例4-8以及對比例1和對比例2中制備的微球懸浮于含有1.5%的CMC、0.5%的Tween20和0.9%的NaCl的水溶液中，再將懸浮液對五只Sprague-Dawley大鼠進(jìn)行皮下注射，每只的劑量為0.2ml。隨后按預(yù)定的時間間隔采取大鼠的血樣，并用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)定量分析exendin-4的水平以測定exendin-4自微球中的釋放情況。圖4表示exendin-4自實施例1-1中制備的微球中體內(nèi)釋放的模式圖。從圖4的釋放模式圖中可以明顯地看出，根據(jù)本發(fā)明制備的微球既沒有初期突釋也不會釋放不完全，并且同體外實驗一樣，在20天的時間內(nèi)在實驗動物體內(nèi)持續(xù)進(jìn)行零級釋放。另夕卜，還用WinNonlin程序根據(jù)exendin-4釋放的測量結(jié)果計算出藥物動力學(xué)參數(shù)最高血濃度(Cmax)和0-14天的曲線下面積(AUC(M4天)。這些參數(shù)在下面的表7中進(jìn)行了總結(jié)。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>如表7所示，實施例1-1至1-7、實施例4、實施例5-1至5-3以及實施例6-8中的微球其計算得到的C自x和AUC值要高于對比例1和對比例2的值，這表明根據(jù)本發(fā)明制備的微球是極好的exendin-4控釋劑。因此，在圖4和表7數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明所提供的可生物降解的聚合物微球不僅具有極好的包封率，而且還能在2-4周的時間內(nèi)穩(wěn)定地完全釋放exendin-4而沒有滯后期。實驗例5:微球中Exendin-4的穩(wěn)定性分析將10mg實施例1-1中制備的含有exendin-4的微球置于聚苯乙烯容器并充分溶解于1ml的DMSO。將得到的溶液用碳酸氫銨稀釋五倍，然后用反相高效液相色譜進(jìn)行分析，觀察exendin-4的峰和保留時間。結(jié)果如圖5所示。圖5為從實施例1-1制備的微球中得到的exendin-4的色譜圖。如該色譜圖所示，可觀察到一個單獨的峰，并且其保留時間與對照樣品的保留時間相同。權(quán)利要求1.一種可生物降解的微球，所述微球能夠以可控的方式釋放葡萄糖調(diào)節(jié)肽，所述微球包含可生物降解的聚合物載體，在所述載體中包封有所述葡萄糖調(diào)節(jié)肽。2.如權(quán)利要求l所述的可生物降解的微球，其中，所述的葡萄糖調(diào)節(jié)肽選自于由合成的exendin-3、exendin-4以及它們的同系物和激動劑所組成的組。3.如權(quán)利要求2所述的可生物降解的微球，其中，所述的葡萄糖調(diào)節(jié)肽為exendin-4。4.如權(quán)利要求l所述的可生物降解的微球，其中，所述的可生物降解的聚合物選自于由下列物質(zhì)所組成的組聚L-乳酸、D-乳酸-乙醇酸共聚物、L-乳酸-乙醇酸共聚物和D，L-乳酸-乙醇酸共聚物。5.如權(quán)利要求4所述的可生物降解的微球，其中，所述的可生物降解的聚合物為D,L-乳酸-乙醇酸共聚物。6.—種制備如權(quán)利要求l所述的可生物降解的聚合物微球的方法，包括步驟l:將有機(jī)溶劑加入到聚合物中，得到聚合物溶液；步驟2:將葡萄糖調(diào)節(jié)肽分散于步驟1中所述的聚合物溶液中，得到藥物分散體，然后將醇或醇與有機(jī)酸的混合物加入到所述的藥物分散體中，得到分散有藥物的溶液；以及步驟3:由步驟2中所述的分散有藥物的溶液形成微球。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述的有機(jī)溶劑選自于由二氯甲烷、乙酸乙酯和氯仿所組成的組。8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，步驟2中所述的醇為甲醇。9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，按照所述醇與所述聚合物溶液的比例為1:1至1:6的比例使用步驟2中所述的醇。10.如權(quán)利要求6所述的方法，步驟2中所述的分散有藥物的溶液還包含添加劑。11.如權(quán)利要求IO所述的方法，其中，所述的添加劑選自于由下列物質(zhì)所組成的組聚乙二醇、Labrafil、Labrasol、中鏈甘油三酯、卵磷脂、N-甲基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯垸酮、羥丙基甲基纖維素、Tween、Span、Cremophor、泊洛沙姆、Brij禾卩Sunsoft818H。12.如權(quán)利要求IO所述的方法，其中，所述添加劑用量為所述溶液體積的0.01%至15%(w/v)。13.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述的步驟3通過如下步驟來進(jìn)行將步驟2中所述的分散有藥物的溶液分散于含有乳化劑的水溶液中；用攪拌器或均質(zhì)機(jī)形成所述微球；以及用冷凍干燥或真空干燥的方式將所述微球進(jìn)行干燥。14.如權(quán)利要求13中所述的方法，其中，所述的乳化劑選自于由Triton、Brij、聚乙烯吡咯垸酮和聚乙烯醇所組成的組。15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述的乳化劑在有機(jī)溶劑中達(dá)到飽和，所述的有機(jī)溶劑選自于由二氯甲垸、乙酸乙酯和氯仿所組成的組。16.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述的步驟3通過用噴霧干燥機(jī)將步驟2中所述的分散有藥物的溶液噴霧來進(jìn)行。17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，在注入時，將所述的噴霧干燥機(jī)的溫度設(shè)定為115°C至125°C，在噴出時，將溫度設(shè)定為80。C至90°C。18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述的噴霧干燥之后進(jìn)行另外的冷凍干燥或真空干燥。19.一種制備可生物降解的聚合物微球的方法，包括步驟l:將有機(jī)溶劑加入到聚合物中，得到聚合物溶液；步驟2':將步驟1中所述的聚合物溶液用含有表面活性劑的葡萄糖調(diào)節(jié)肽水溶液乳化，得到初級乳液；以及步驟3':將步驟2'中所述的初級乳液分散于含有乳化劑的水溶液中，再用攪拌器和均質(zhì)機(jī)攪拌形成所述微球，然后通過冷凍干燥或真空干燥對所述微球進(jìn)行干燥。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，步驟l中所述的有機(jī)溶劑選自于由二氯甲垸、乙酸乙酯和氯仿所組成的組。21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述的表面活性劑選自于由下列物質(zhì)所組成的組聚乙烯醇、聚乙二醇、Labrafil、Labrasol、中鏈甘油三酯、卵磷脂、N-甲基吡咯垸酮、聚乙烯吡咯垸酮、羥丙基甲基纖維素、Tween、Span、Cremophor、泊洛沙姆、Brij和Sunsoft818H。22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述的乳化劑選自于由Triton、Brij、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇所組成的組。23.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述的乳化劑在有機(jī)溶劑中達(dá)到飽和，所述的有機(jī)溶劑選自于由二氯甲烷、乙酸乙酯和氯仿所組成的組。24.根據(jù)權(quán)利要求6至23中任一項所述的方法制備的、用于葡萄糖調(diào)節(jié)肽控釋的可生物降解的聚合物微球。全文摘要本發(fā)明公開了一種能以可控方式釋放葡萄糖調(diào)節(jié)肽的可生物降解的微球，所述的微球包含可生物降解的聚合物載體，在該載體中包封有葡萄糖調(diào)節(jié)肽。本發(fā)明還公開了所述微球的制備方法。除了確保所包封藥物的高包封率和高穩(wěn)定性外，所述的微球既沒有初期突釋效應(yīng)也不會釋放不完全，并且能在長時間內(nèi)使藥物進(jìn)行零級釋放，因而改善了藥物的治療效果。文檔編號A61K9/52GK101657190SQ200880012327公開日2010年2月24日申請日期2008年4月18日優(yōu)先權(quán)日2007年4月19日發(fā)明者劉武姬,姜壽亨,孫美京,樸容滿,李圣熙,李建日,梁熙昌,郭賢姬,金泰亨,金炳文,金胤池申請人:東亞制藥株式會社