專利名稱：：一種組織工程化鼓膜細(xì)胞支架的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種構(gòu)建組織工程化鼓膜的膜性基質(zhì)(細(xì)胞支架)材料及其制備方法，更具體的，本發(fā)明涉及一種新的膠原-殼聚糖膜的制備，利用該材料可以在體外接種角朊細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，從而為構(gòu)建組織工程化鼓膜提供細(xì)胞支架。
背景技術(shù)：
：鼓膜是聽覺器官中重要的傳音結(jié)構(gòu)之一，它使作用于鼓膜的聲壓傳至卵圓窗膜時(shí)提高了17倍，另外，完整的鼓膜_聽骨鏈傳音系統(tǒng)還可以保證聲波對(duì)卵圓窗的單向傳音功能，從而提高聽覺敏感度。鼓膜是厚度僅為0.1毫米的膜狀結(jié)構(gòu)，一面暴露于外界，一面朝向呼吸道黏膜襯里的鼓室，覆蓋在容易產(chǎn)生化膿性炎癥的含氣空腔上，所以很容易受到損傷導(dǎo)致穿孔，鼓膜組織結(jié)構(gòu)的異常，如鼓膜鈣化、瘢痕、穿孔等，均可影響鼓膜的正常傳音功能。鼓膜穿孔是耳科臨床上的常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重的鼓膜穿孔導(dǎo)致的聽力損失甚至可以高達(dá)50分貝[1]。鼓膜長期穿孔，還可引發(fā)一系列的病理改變，包括聽力下降、言語發(fā)育遲緩、慢性耳瘺及膽脂瘤形成等，需要進(jìn)一步治療[2]。常用的治療方法是鼓室成形術(shù)，臨床上多選用自體顳骨骨膜、顳肌筋膜或耳屏軟骨膜封閉穿孔。雖然取得一定療效，但功能恢復(fù)和遠(yuǎn)期效果仍不理想[3'4]。Maning發(fā)現(xiàn)，近期的手術(shù)成功率為78%，但僅52%能恢復(fù)為有功能的中耳腔結(jié)構(gòu)。Gianoli等曾有92X成功率的報(bào)道，但經(jīng)過嚴(yán)格的2年期隨訪，降至38X。鼓膜的強(qiáng)度及張力主要由放射狀纖維維持，而研究發(fā)現(xiàn)大部分的穿孔愈合是"假膜愈合"，即僅有上皮層和粘膜層，代替中間纖維層的僅為少量無正常結(jié)構(gòu)的小纖維束[5]。由于與鼓膜組織結(jié)構(gòu)存在差異，獲取自體材料時(shí)對(duì)機(jī)體的損傷和自體材料不足等原因，促使我們期待利用組織工程學(xué)技術(shù)來解決上述問題，避免患者不必要的損傷，提高聽功能恢復(fù)的遠(yuǎn)期療效。目前有報(bào)道利用異種生物合成移植物，如無細(xì)胞性真皮移植物(AlloDerm)、膠原膜、透明質(zhì)酸為主的生物可吸收膜在臨床上或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中作為鼓膜移植物應(yīng)用[6—8]。但尚未見具有細(xì)胞成分的真正意義上的組織工程化鼓膜構(gòu)建及應(yīng)用的研究報(bào)道。鼓膜與皮服具有相似的組織結(jié)構(gòu)同樣具有包括外側(cè)角質(zhì)層及下面顆粒層、棘剌層和基底層的復(fù)層鱗狀上皮，鼓膜中間的纖維組織層對(duì)應(yīng)表皮的真皮層，均由由結(jié)締組織組成，主要細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。鼓膜組織不含有毛囊及汗腺等皮膚附屬器(構(gòu)建皮膚附屬器是現(xiàn)代組織工程皮膚難以攻克的難點(diǎn))，故組織工程化鼓膜的構(gòu)建在可行性和實(shí)用性方面更具有優(yōu)勢(shì)。組織工程化鼓膜的構(gòu)建必須具備2個(gè)基本條件足夠數(shù)量的形態(tài)功能正常的種子細(xì)胞和適當(dāng)?shù)募?xì)胞外支架——膜性基質(zhì)。組織工程皮膚構(gòu)建與應(yīng)用研究的已有成就，為種子細(xì)胞的獲取提供了充分的技術(shù)支持，而我們要解決的難點(diǎn)就是支架的構(gòu)建。組織工程支架材料為種子細(xì)胞提供了適合其生長、基質(zhì)合成及發(fā)揮其他功能的生物學(xué)環(huán)境，是細(xì)胞附著的基本框架，并在移植時(shí)作為細(xì)胞的載體[9—12]。理想的組織工程鼓膜細(xì)胞支架基質(zhì)必須具有如下特征①良好的理化特性即滿足生物材料的一般要求，如無毒性、不致畸等，還要利于種子細(xì)胞黏附、生長和分化；②良好的生物相容性；③良好的生物降解性降解速率應(yīng)與組織細(xì)胞生長速率在時(shí)間_空間上相3適配，降解時(shí)間應(yīng)能根據(jù)組織生長特性進(jìn)行人為調(diào)控或自我調(diào)整；④具有三維立體多孔結(jié)構(gòu)基質(zhì)材料應(yīng)可加工成三維立體結(jié)構(gòu)，孔隙率最好達(dá)到90%以上，具有較高的面積/體積比，為組織和細(xì)胞生長提供足夠的空間和交換通道；⑤良好的可塑性和機(jī)械強(qiáng)度基質(zhì)材料應(yīng)可預(yù)先制作成一定的形狀，并具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，為新生組織提供支撐，并保持一定時(shí)間直至新生組織具有自身生物力學(xué)特征；⑥良好的支架-細(xì)胞界面材料應(yīng)能提供良好的支架-細(xì)胞作用界面，利于細(xì)胞黏附、生長，更重要的是能激活細(xì)胞特異基因表達(dá)，維持細(xì)胞正常表型。參考文獻(xiàn)1.MehtaRP，RosowskiJJ，VossSE，et.Determinantsofhearinglossinperforationsofthetympanicmembrane.Otology&Neurotology.2006，27(2):136-43.2.FaganP，PatelN.Aholeinthedrum.Anoverviewoftympanicmembraneperforations.AustFamPhysician.2002，31:707-10.3.MerchantSN，McKennaMJ，RosowskiJJ.Currentstatusandfuturechallengesoftympanoplasty.EurArchOtorhinolaryngol.1998，255:221_8.4.AggarwalR，SaeedSR，GreenKJ.Myringoplasty.JLaryngolOtol.2006，120(6):429-32.5.孫建軍。鼓膜修復(fù)的外科技術(shù)。中國醫(yī)學(xué)文摘耳鼻咽喉科學(xué)。2006,21(6):332-4.6.SpiegelJH，Kessler幾.Tympanicmembraneperforationrepairwithacellularporcinesubmucosa.Otology緒eurotology.2005，26(4):563-6.7.0zturkK，YamanH，CihatA葡dukM，et.EffectivenessofMeroGelhyaluronicacidontympanicmembran印erforations.Acta0to_Laryngologica.2006，126(11):1158-63.8.WeberDE，SemaanMT，WasmanJK，et..Tissue-engineeredcalciumalginatepatchesintherepairofchronicchinchillatympanicmembraneperforations.Laryngoscope.2006，116(5):700-4.9.S叩pDM，BoyceST.Engineeredskinsubstitutes-practicesandpotentials.ClinDermatol.2005;23(4):403-12.10.FreymanTM，YannasIV，GibsonLJ.Cellularmaterialsasporousscaffoldsfortissueengineeringprogressinmaterials.Science,2001，46:273_82ll.RaymundE.Horch，JiirgenKopp，etal.Tissueengineeringofculturedskinsubstitutes.J.Cell.Mol.Med.2005，9:592-60812.ClarkRA，GhoshK，TonnesenMG.Tissueengineeringforcutaneouswounds.JInvestDermatol.2007，127(5):1018-29
發(fā)明內(nèi)容為了提供合適的組織工程化鼓膜支架材料，本發(fā)明通過烘干法制備了膠原_殼聚糖膜，制備過程簡便，其中1型膠原占混合物重量的90%，75_95%脫乙酰的殼聚糖占混合物重量的10%。本發(fā)明利用這種復(fù)合膜作為組織工程化鼓膜構(gòu)建的細(xì)胞支架，發(fā)現(xiàn)其適合鼓膜上皮角朊細(xì)胞和成纖維細(xì)胞生長、增殖，且能夠保持成纖維細(xì)胞良好的膠原分泌功能。本發(fā)明為進(jìn)一步構(gòu)建組織工程化鼓膜奠定了基礎(chǔ)。參照下面對(duì)本發(fā)明例示性實(shí)施方案和其中包括的實(shí)施例的詳細(xì)描述，可容易地理解本發(fā)明。作為聲明，應(yīng)理解為上述的說明僅是例示性和說明性的，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員當(dāng)然可根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)理論和技術(shù)改變下面的方案。圖l膠原-殼聚糖膜呈白色、半透明狀，具有一定彈性的組織，并有一定的抗拉力，適于手術(shù)操作。圖2DAPI標(biāo)記的傳代鼓膜上皮層角朊細(xì)胞接種于膜表面，48小時(shí)大部分細(xì)胞貼壁呈鵝卵石樣。(X200)圖3DAPI標(biāo)記的傳代鼓膜上皮層角朊細(xì)胞接種于膜表面，4天后細(xì)胞數(shù)量開始增多，并有集落形成。(X200)圖4DAPI標(biāo)記的傳代鼓膜上皮層角朊細(xì)胞接種于膜表面，10天細(xì)胞接近鋪滿培養(yǎng)皿的底部，呈現(xiàn)典型的鋪路石狀。(X200)圖5免疫熒光染色顯示膠原-殼聚糖膜上鼓膜角朊細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)角蛋白(CK)，一抗CK(l:50)、二抗FITC(1:200)，綠色熒光為陽性表達(dá)，藍(lán)色熒光為核復(fù)染(Ho33342)。X200圖6培養(yǎng)皿中鼓膜角朊細(xì)胞的核增殖性抗原(PCNA)表達(dá)。X200圖7膠原-殼聚糖膜上角朊細(xì)胞的核增殖性抗原(PCNA)表達(dá)。X200圖8培養(yǎng)皿中鼓膜角朊細(xì)胞核增殖性抗原(PCNA)表達(dá)的熒光強(qiáng)度測定。圖9膠原-殼聚糖膜上角朊細(xì)胞核增殖性抗原(PCNA)表達(dá)的熒光強(qiáng)度測定。圖10接種鼓膜上皮層角朊細(xì)胞8天的膜石蠟切片，HE染色。X400圖11DAPI標(biāo)記的傳代鼓膜成纖維細(xì)胞接種于膜表面，3h即可見細(xì)胞貼壁呈梭形或星狀。(X200)圖12DAPI標(biāo)記的傳代鼓膜成纖維細(xì)胞接種于膜表面，48小時(shí)細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞變長。(X200)圖13DAPI標(biāo)記的傳代鼓膜成纖維細(xì)胞接種于膜表面，6天細(xì)胞形態(tài)為長梭形，細(xì)胞集落彼此融合接近長滿單層。(X200)圖14免疫熒光染色顯示膠原_殼聚糖膜上鼓膜成纖維細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)膜波形蛋白(Vim)，一抗Vim(l:50)、二抗cy3(1:200)，紅色熒光為陽性表達(dá)，藍(lán)色熒光為核復(fù)染(Ho33342)。X200圖15培養(yǎng)皿中鼓膜成纖維細(xì)胞的核增殖性抗原(PCNA)表達(dá)。X200圖16膠原-殼聚糖膜上成纖維細(xì)胞的核增殖性抗原(PCNA)表達(dá)。X200圖17培養(yǎng)皿中鼓膜成纖維細(xì)胞核增殖性抗原(PCNA)表達(dá)的熒光強(qiáng)度測定。圖18膠原-殼聚糖膜上成纖維細(xì)胞核增殖性抗原(PCNA)表達(dá)的熒光強(qiáng)度測定。圖19接種鼓膜成纖維細(xì)胞5天膜的石蠟切片，HE染色。X400圖20接種鼓膜纖維層成纖維細(xì)胞4天膜的掃描電鏡觀察具體實(shí)施例方式1、鼠尾膠原的提取取成年大鼠鼠尾，去除尾上皮膚，將肌腱與肌肉及其它組織分開；將肌腱在70X乙醇中浸泡20min，切碎，用去離子水沖洗；轉(zhuǎn)移至稀乙酸(1:1000)溶液中，每根鼠尾用250ml乙酸溶液，4。C保持48h;4000r/min離心30min，取上清；加入0.lmol/LNaOH，按6:1體積比混合，中和乙酸，1500r/min離心5min獲取沉淀。2、配制2%的乙酸溶液；分別將膠原、75%脫乙酰的殼聚糖制成1%的分散液；將兩種分散液按照9:l的比例混合，4t:下恒速攪拌2h，再用磁力攪拌5小時(shí)；移入離心管，配平，4t:下2000轉(zhuǎn)/分離心5min，去除分散液中的氣泡；將配制好的分散液倒入特制模具中，放置于4(TC恒溫烤箱中，24h烘干。試驗(yàn)?zāi)z原-殼聚糖膜構(gòu)建及在組織工程化鼓膜中的應(yīng)用材料與方法—.主要試劑及儀器DKSFM角朊細(xì)胞無血清培養(yǎng)液、新生牛血清、DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)；Cy3(GoatantiRabbitIgG)、FITC(Goatanti-mouseIgG)、PCNA增殖細(xì)胞核抗原(mouseantirate)、Hoachest33342(Sigma公司)；細(xì)胞膜波形蛋白Vimentin抗體(Rabbitantirate)、角蛋白Keratin抗體(mouseantirate)(博士德生物公司)；羥脯氨酸測試盒(南京建成生物工程研究所)。H皿d倒置顯微鏡(德國)；超凈工作臺(tái)JDJ-203(蘇州凈化設(shè)備廠);SAWYO二氧化碳培養(yǎng)箱(日本);01卿usBX60熒光顯微鏡(日本);01卿usFV1000型激光共聚焦熒光顯微鏡(日本)。二.方法1.膠原-殼聚糖膜的制備(如前所述)2.膠原_殼聚糖膜表面的細(xì)胞種植(1)膠原-殼聚糖膜的準(zhǔn)備配制lmo1/LNaOH溶液，反復(fù)浸泡烘干的膠原-殼聚糖膜，將膜的ffl值調(diào)至7.27.4之間，75%酒精浸泡消毒30min，超凈工作臺(tái)內(nèi)用含雙抗的D-Hank's液反復(fù)清洗5遍以上，最后將膜平整放入24孔板，每孔加入適量DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清，37t:、5XC02培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜、備用。(2)鼓膜角朊細(xì)胞的種植取處于對(duì)數(shù)生長期的已標(biāo)記的第2-3代角質(zhì)形成細(xì)胞懸液，吸盡舊的培養(yǎng)基，加入胰蛋白酶-EDTA消化液37t:消化約10min，鏡下觀察細(xì)胞收縮、變圓，加入FB培養(yǎng)液，用吸管將細(xì)胞全部吹打下來，將細(xì)胞懸液移入離心管，室溫下1500rp/m離心5min。棄去上清，加入DKSFM培養(yǎng)基，吹打成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1X106個(gè)/ml。取出孵育過夜的膜，吸盡孵育用的培養(yǎng)基，每孔加入細(xì)胞懸液0.3ml。放入371\5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后增添DKSFM培養(yǎng)液1.5ml，48h后換液繼續(xù)培養(yǎng)，以后每隔2天換液一次。(3)鼓膜成纖維細(xì)胞的種植取處于對(duì)數(shù)生長期的DAPI標(biāo)記的第4代鼓膜成纖維細(xì)胞，棄去舊培養(yǎng)基，加入5ml0.25%的胰蛋白酶溶液，371:孵育10min，鏡下觀察細(xì)胞由長梭形變呈圓形，棄去胰蛋白酶液，加入FB培養(yǎng)液，用吸管將細(xì)胞全部吹打下來，將細(xì)胞懸液移入離心管，室溫下1500rpm，離心5min。棄去上清，加入FB培養(yǎng)液，再次吹打，使之形成單細(xì)胞懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至4X107ml。取出孵育過夜的膜，吸盡孵育用的培養(yǎng)基，每孔加入細(xì)胞懸液0.3ml。放入37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后增添FB培養(yǎng)液1.5ml，24h后換液繼續(xù)培養(yǎng)，以后每隔2天換液一次。3.角蛋白(keratin)、細(xì)胞膜波形蛋白(vimentin)及核增殖性抗原PCNA免疫組化熒光染色(1)將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液吸出。(2)用Hank's溶液洗滌2次，每次2min。(3)加入4X的多聚甲醛溶液，固定30min。(4)用PBS洗滌3次，每次5min。(5)加入0.1%TritonX-100處理20min。(6)5%goatse進(jìn)封閉1小時(shí)。(7)加入一抗，室溫孵育l小時(shí)。(8)用PBS洗滌3次，每次15min。(9)加入二抗，室溫避光放置1小時(shí)。(10)PBS洗滌3次，每次15min，輕輕搖動(dòng)，棄掉洗滌液。(11)盡快用FluoviewFV1000激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，以488nm激發(fā)光檢測FITC標(biāo)記的綠色熒光，以555nm激發(fā)光檢測cy3標(biāo)記的紅色熒光，以360nm激發(fā)光檢測Heochest33342標(biāo)記的藍(lán)色熒光，同一指標(biāo)采用一致的成像系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置。(12)每視野隨機(jī)選擇5個(gè)細(xì)胞測定熒光表達(dá)強(qiáng)度，計(jì)算其均值。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，用PBS代替第一抗體來排除非特異性的二抗結(jié)合。4.—般形態(tài)觀察分別接種角朊細(xì)胞8天及成纖維細(xì)胞5天的膜經(jīng)4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，透明，浸臘，包埋，切片，脫臘，然后HE染色，最后樹脂封片。光鏡下觀察，攝片。5.掃描電鏡觀察分別接種角朊細(xì)胞8d及成纖維細(xì)胞5天的膜經(jīng)4X戊二醛前固定，再用1%鋨酸后固定，系列乙醇脫水，臨界點(diǎn)干燥，噴金。掃描電鏡觀察，攝片。6.成纖維細(xì)胞分泌膠原功能的測定按羥脯氨酸測試盒說明測定培養(yǎng)上清中羥脯氨酸含量，培養(yǎng)液中膠原含量=羥脯氨酸含量/13.4%，培養(yǎng)皿中成纖維細(xì)胞分泌的膠原量=培養(yǎng)6天的成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)液中膠原含量_未作細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液中膠原含量，膜上成纖維細(xì)胞分泌的膠原量=膜上接種6天成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)液中膠原含量_孵育6天的不含成纖維細(xì)胞的膜培養(yǎng)液中膠原含7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果71.膠原-殼聚糖膜的形貌特征經(jīng)實(shí)驗(yàn)方法制備的膠原_殼聚糖膜是呈白色、半透明狀，具有一定彈性的組織，并有一定的抗拉力，適于手術(shù)操作。見圖l。2.膠原_殼聚糖膜上鼓膜上皮層角朊細(xì)胞培養(yǎng)及生物學(xué)特性的觀察DAPI標(biāo)記的傳代鼓膜上皮層角朊細(xì)胞接種于膜表面，在接種后48小時(shí)，大部分細(xì)胞貼壁(圖2);4天后細(xì)胞數(shù)量開始增多，并有集落形成(圖3);培養(yǎng)到第IO天左右，細(xì)胞接近鋪滿培養(yǎng)皿的底部，呈現(xiàn)典型的鋪路石狀形態(tài)(圖4)。角蛋白是上皮細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，免疫熒光方法鑒定角朊細(xì)胞，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)，接種于膠原-殼聚糖膜上的鼓膜上皮層角朊細(xì)胞均表達(dá)標(biāo)志蛋白，綠色熒光為陽性表達(dá)，藍(lán)色熒光為核復(fù)染(Ho33342)(圖5)。證明膠原-殼聚糖膜對(duì)鼓膜角朊細(xì)胞的生物學(xué)特性均影響且無其它細(xì)胞污染。3.膠原-殼聚糖膜上鼓膜纖維層成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及生物學(xué)特性的觀察DAPI標(biāo)記的傳代鼓膜纖維層成纖維細(xì)胞，接種3h，即可見細(xì)胞貼壁，逐漸伸展延長，形成2個(gè)以上的胞質(zhì)突起，呈梭形或星狀(圖11)，48h貼壁細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞變長(圖12)，6天左右細(xì)胞形態(tài)為長梭形，細(xì)胞集落彼此融合接近長滿單層，且細(xì)胞逐漸呈極性分布(圖13)。細(xì)胞膜波形蛋白(Vim)是成纖維細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，免疫熒光方法鑒定成纖維細(xì)胞，Vim陽性表達(dá)呈紅色熒光，定位于細(xì)胞漿，接種于膠原_殼聚糖膜上的成纖維細(xì)胞均表達(dá)標(biāo)志蛋白Vim，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)(圖14)。4.膠原-殼聚糖膜上接種細(xì)胞的增殖能力的鑒定增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)。分別為培養(yǎng)皿中及膠原-殼聚糖膜上的鼓膜上皮角朊細(xì)胞或成纖維細(xì)胞進(jìn)行PCNA免疫熒光染色，觀察它們的細(xì)胞增殖能力，PCNA表達(dá)為綠色熒光，定位于細(xì)胞核。并利用軟件分別測定細(xì)胞表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)膠原-殼聚糖膜上與培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)比較，PCNA的表達(dá)無顯著性差異。見圖6-9，圖15-18，表1、2。表1培養(yǎng)皿組及膜上角朊細(xì)胞PCNA熒光強(qiáng)度的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2培養(yǎng)皿組及膜上成纖維細(xì)胞PCNA熒光強(qiáng)度的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>5.膠原_殼聚糖膜接種鼓膜細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察(1)分別將接種鼓膜上皮層角朊細(xì)胞8天和接種鼓膜纖維層成纖維細(xì)胞5天的膜進(jìn)行石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察見細(xì)胞分布生長于膜表面，接觸細(xì)胞的膜表層結(jié)構(gòu)相對(duì)致密，400倍光鏡下鮮見網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而深層的膜結(jié)構(gòu)具有不規(guī)則的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑大小基本在50250iim之間(圖10、圖19)。(2)將接種鼓膜纖維層成纖維細(xì)胞4d的膜進(jìn)行掃描電鏡觀察，可見成纖維細(xì)胞呈多突起的長梭形，均緊緊貼附于膜的表面生長，膜呈立體三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)孔大小不一，表面孔徑大小基本在O.520iim之間。圖20。6.膠原-殼聚糖膜上成纖維細(xì)胞分泌功能的檢測以相同密度1.OX105/ml接種傳3代的成纖維細(xì)胞，分別接種于24孔培養(yǎng)板底壁及膠原_殼聚糖膜上，每組5個(gè)樣本，每樣本接種0.2ml，于第6天獲取培養(yǎng)液上清，通過羥脯氨酸測定法檢測其膠原分泌量，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組間無顯著性差異(P>0.05)，見表3。表3培養(yǎng)板組及膜組成纖維細(xì)胞膠原分泌的比較(單位Pg/ygprot)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>討論膠原蛋白廣布于人體各組織中，系各組織中的重要成分并構(gòu)成組織細(xì)胞外基質(zhì)ECM，其性質(zhì)是一種天然的組織支架材料。它的生物學(xué)性質(zhì)與功能主要表現(xiàn)在(l)低抗原性，與其它具有免疫原性的蛋白質(zhì)相比，膠原蛋白的免疫原性非常低。(2)可生物降解性(易被人體吸收)，可生物降解性是膠原蛋白能作器官移植材料被利用的基礎(chǔ)。(3)生物相溶性，即膠原蛋白與宿主細(xì)胞及組織之間良好的相互作用。(4)成纖維性能，天然的纖維在組織中以特定的順序組織起來。例如鼓膜中的纖維就以環(huán)狀和放射狀排列，有利于提供合適的強(qiáng)度及彈性。(5)力學(xué)性能，天然膠原緊密的螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)高強(qiáng)度的力學(xué)性能起重要作用，在生物體中，膠原是為結(jié)締組織提供強(qiáng)度的主要蛋白組分，因而可在廣范圍內(nèi)滿足肌體對(duì)機(jī)械強(qiáng)度的要求。實(shí)際應(yīng)用中，常常通過一定方法提高膠原的拉伸強(qiáng)度及抗降解能力，降低膨脹率，改善膠原的力學(xué)性能與抗水性。如將膠原與其它物理、化學(xué)性質(zhì)不同的合成或天然高分子共混，組成一種多相固體材料，在性能上膠原與其它高分子取長補(bǔ)短，互相補(bǔ)充，既可改善膠原材料的性能，又可制備出單一膠原材料所不具有的優(yōu)良特性的新材料。殼聚糖是天然生物多糖甲殼質(zhì)的脫乙酰基產(chǎn)物，來源廣泛，具有無毒性、生物相容性好，可控的降解性，和無免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，而且具有廣譜的抑制細(xì)菌、真菌生長作用，收縮變形幅度顯著低于膠原凝膠。殼聚糖成膜后擁有良好的透光率和力學(xué)強(qiáng)度，但單獨(dú)作為生物支架由于表面電荷作用，不利于細(xì)胞生長和增殖。膠原和殼聚糖互補(bǔ)制成膜后可以提高生物學(xué)性能成為較理想的生物材料，改良了殼聚糖的吸附力，利于細(xì)胞的黏附生長、遷移和增殖。此外，殼聚糖分子鏈剛性較好，膠原填入網(wǎng)孔可提高力學(xué)性能。殼聚糖本身降解緩慢且能抑制多種蛋白酶活性，如可直接同膠原酶結(jié)合，延緩了膠原酶對(duì)膠原蛋白的降解?！N生物材料在用于臨床前，必須經(jīng)過一系列的生物學(xué)性能測試，用細(xì)胞培養(yǎng)法評(píng)價(jià)生物材料的組織相容性已是公認(rèn)的方法之一，其特點(diǎn)是操作簡單、重復(fù)性好、費(fèi)用較為低廉，在一定程度上可以替代動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。因此，細(xì)胞培養(yǎng)法廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)不同的生物材料的安全性能。本實(shí)驗(yàn)分別將傳代的鼓膜上皮角朊細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在膠原-殼聚糖膜上接種培養(yǎng)，觀察到細(xì)胞保持正常的生長形態(tài)，分別進(jìn)行keratin、vimentin免疫熒光染色，結(jié)果表明細(xì)胞的生物學(xué)特性亦未受到影響。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用，它與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，其量的變化與DNA合成一致，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)。分別在培養(yǎng)皿及膜上接種的上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞PCNA熒光免疫染色的平均熒光強(qiáng)度無顯著性差異(P>0.05)，說明在膜上生長的鼓膜細(xì)胞同樣具有良好的細(xì)胞增殖能力。另外在培養(yǎng)皿上接種6天的成纖維細(xì)胞膠原分泌量為11.26±0.68，膜上接種6天的成纖維細(xì)胞膠原分泌量為12.02±0.8，無顯著性差異(p>0.05)，這表明成纖維細(xì)胞的膠原分泌功能未受影響。以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)了本專利中采用熱干法制備的具有三維多孔結(jié)構(gòu)的膠原-殼聚糖膜適合鼓膜上皮角朊細(xì)胞和成纖維細(xì)胞生長、增殖，且能保持成纖維細(xì)胞良好的膠原分泌功能。權(quán)利要求一種烘干法制備膜性混合物，其含有膠原和殼聚糖。2.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中的膠原為I型膠原。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的混合物，其中I型膠原占混合物重量的90%。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的混合物，其中75-95%脫乙酰的殼聚糖占混合物重量的10%。5.根據(jù)權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)的混合物在制備用于組織工程鼓膜構(gòu)建的用途。6.—種用于替代鼓膜移植物的膜性基質(zhì)材料，其含有膠原和殼聚糖。7.根據(jù)權(quán)利要求5的膜性基質(zhì)(細(xì)胞支架)，其中I型膠原占支架重量的90%。8.根據(jù)權(quán)利要求7的膜性基質(zhì)(細(xì)胞支架)，其中75-95%脫乙酰的殼聚糖與膠原的重量比為1:9。全文摘要本發(fā)明公開了一種由膠原和殼聚糖混合后烘干制備而成的膜性基質(zhì)(細(xì)胞支架)，制備過程簡便，其中膠原成分為鼠尾提取的I型膠原，占混合物重量的90％，殼聚糖成分為75-95％脫乙酰的殼聚糖，占混合物重量的10％。本發(fā)明利用這種復(fù)合膜作為組織工程化鼓膜構(gòu)建的細(xì)胞支架，發(fā)現(xiàn)其適合鼓膜上皮角朊細(xì)胞和成纖維細(xì)胞生長、增殖，且能夠保持成纖維細(xì)胞良好的膠原分泌功能。本發(fā)明為進(jìn)一步構(gòu)建組織工程鼓膜奠定了基礎(chǔ)。文檔編號(hào)A61L27/20GK101721741SQ20081016662公開日2010年6月9日申請(qǐng)日期2008年10月14日優(yōu)先權(quán)日2008年10月14日發(fā)明者孫建軍,湯勇申請(qǐng)人:孫建軍;湯勇