專利名稱：：一種產(chǎn)揮發(fā)油的滇重樓內(nèi)生畢赤酵母及其抗菌活性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種具抗菌活性內(nèi)生真菌的應(yīng)用，特別是涉及一種其代謝產(chǎn)物為揮發(fā)油的微生物一滇重樓內(nèi)生畢赤酵母。技術(shù)背景植物內(nèi)生真菌(plantendophyticfungi)是指那些在其生活史中的某一階段或全部階段生活在健康植物組織或器官內(nèi)部，宿主植物不表現(xiàn)外在病害癥狀的真菌。植物內(nèi)生真菌是一種新的微生物資源，能產(chǎn)生多種結(jié)構(gòu)類型的代謝產(chǎn)物，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗蟲、調(diào)節(jié)植物生長等多種生物活性。由于植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、功能獨特的代謝產(chǎn)物而成為新化合物、新藥物的潛在資源，它們在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、工業(yè)、食品等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。近年來發(fā)現(xiàn)一些植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生易揮發(fā)的成分(volatilecomponents),這些易揮發(fā)成分具有抗菌和殺蟲活性，能作為熏蒸劑應(yīng)用于倉儲和果蔬種植園的病蟲害防治。滇重樓(Pan'spo/yp/^〃avar.y"""a"e"w'sHand.-Mazz.)在分類上屬于單子葉綱(Monocotyledoneae)百合目(Liliales)延齡草科(Trilliaceae)重樓屬，是我國特有的一種珍稀藥用植物，又叫七葉一枝花、獨角蓮，主要分布在云南、四川、貴州等省區(qū)，是著名的"云南白藥"、"宮血寧"、"季勝德蛇藥片"、"熱毒清"等中成藥的主要原料。滇重樓是一種多年生草本植物，其根狀莖多年生長在地下，對土傳病原菌具有強的抵抗能力，這很可能與其共生的內(nèi)生真菌有關(guān)，這些內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)來協(xié)助滇重樓抵抗病原物的侵襲，促進其健康生長。目前尚未見從滇重樓內(nèi)生真菌中提取揮發(fā)性成分的報道。本發(fā)明著重于內(nèi)生真菌揮發(fā)油的提取、化學(xué)組成分析和抗菌活性的研究，為探討內(nèi)生真菌的生理生態(tài)功能(如提高宿主的抗病性等)和新型殺菌劑的開發(fā)提供依據(jù)。本發(fā)明的目的是提供一種經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)能產(chǎn)生揮發(fā)油的微生物，即滇重樓內(nèi)生畢赤酵母。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種畢赤酵母(尸/cWasp.),菌株代號為Ppf9,現(xiàn)保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2008年4月29日，登記入冊編號為2475。本發(fā)明涉及畢赤酵母的分離和分類鑒定、揮發(fā)油的制備方法和組成分析，以及揮發(fā)油對病原真菌和細菌的抑制活性，提供如下的技術(shù)方法。1、內(nèi)生畢赤酵母Ppf9的分離采集新鮮的滇重樓根狀莖，采用內(nèi)生真菌的分離和純化技術(shù)，獲得一株內(nèi)生真菌，編號為Ppf9。2、內(nèi)生畢赤酵母Ppf9的形態(tài)特征(l)無性世代內(nèi)生真菌Ppf9菌株在PDA培養(yǎng)基上25。C培養(yǎng)，菌落致密，不規(guī)則突起，生長緩慢，背部有鈹折，單細胞，有假菌絲，細胞卵圓形，橢圓形，無色，大小2.2nm4.8nmx2nm4.4nm。內(nèi)生真菌Ppf9的形態(tài)特征(見圖l、圖2和圖3)符合畢赤酵母屬(P/c/n'a)真菌的形態(tài)特征。(2)有性世代未發(fā)現(xiàn)。3、內(nèi)生畢赤酵母Ppf9的分子生物學(xué)特征運用PCR技術(shù)，擴增采用ITS通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。將Ppf9菌株的ITS序列提交到GenBank核酸序列庫中注冊獲得序列號(accessionnumber)EF495244。同時將Ppf9菌株的ITS序列與GenBank中其他真菌的ITS序列進行比對，找出相似性最高，親緣關(guān)系最近的真菌，Pp菌株的ITS序列與季氏畢赤氏酵母(Wc/n'agM!7/!'OTwo"必)DQ663478的ITS序列相似度為99%，聚在一個分支上的可信度為100%。其同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹圖見圖4。4、內(nèi)生畢赤酵母Ppf9的發(fā)酵培養(yǎng)特征培養(yǎng)基液體馬鈴薯-葡萄糖(PD)培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度25±1°C。是否光照否。培養(yǎng)時間7天。搖床轉(zhuǎn)速150ipm。培養(yǎng)特征培養(yǎng)第3天，菌液無色，菌體聚集成球狀；培養(yǎng)第5天，菌液略帶橙紅色；培養(yǎng)第7天，菌液為深紅色，菌絲成小球狀。5、內(nèi)生畢赤酵母Ppf9揮發(fā)油的制備采用水蒸餾法制備內(nèi)生畢赤酵母揮發(fā)油，得率為0.17%(g/g鮮重)6、內(nèi)生畢赤酵母Ppf9揮發(fā)油的化學(xué)組成分析采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用的方法，從內(nèi)生畢赤酵母Ppf9揮發(fā)油中一共鑒定出27個化合物(表1),占總含量的98.219%,其中含量較高的化學(xué)成分分別為1，1,3a,7-Tetramethyl-la，2，3,3a,4,5,6，7b-octahydro-li/-cyclopropa[a]naphthalene(25.896%)、棕櫚酸(Palmiticacid,15.514%)、l-Methyl-2，4-di(prop"l-en-2-yl)-l-vinylcyclohexane(7,914%)、(￡)-十八碳-9-烯酸((￡)-Octadec-9-enoicacid,7.277%)、(9E,12E)陽十八碳-9，12-二烯酸已酯((9E,12E)-Ethyloctadeca-9，12-dienoate,5.199%)、3,6a,10-Trimethyl-ZJASAGa^S-octahydro-4，10a-methano-10a//-l-benzoxocin(4.813)、l-乙烯基己醇(l-Vinylhexanol，4.212。/。)、(-)-藍桉醇((-)-Globul01，3.440。/。)、CE)-十八碳-9-烯酸乙酯((jE)"Ethyloctadec-9-enoate，3.032%)。7、內(nèi)生畢赤酵母Ppf9揮發(fā)油的對細菌生長的抑制作用采用多孔板-MTT顯色法，測定內(nèi)生畢赤酵母Ppf9揮發(fā)油對四種革蘭氏陰性細菌(大腸桿菌、根癌土壤桿菌、番茄細菌斑點病菌、黃瓜角斑病菌)和兩種革蘭氏陽性細菌(枯草芽孢桿菌、溶血葡萄球菌)的抑制活性。Ppf9揮發(fā)油對大腸桿菌、根癌土壤桿菌、番茄細菌斑點病菌、黃瓜角斑病菌、枯草芽孢桿菌、溶血葡萄球菌的最低抑制濃度(MIC)分別為0.60mg/mL、1.00mg/mL、0.40mg/mL、0.80mg/mL、1.00mg/mL禾U1.50mg/mL,而陽性對照硫酸鏈霉素對大腸桿菌、根癌土壤桿菌、番茄細菌斑點病菌、黃瓜角斑病菌、枯草芽孢桿菌、溶血葡萄球菌的最低抑制濃度(MIC)分別為0.080mg/mL、0.060mg/mL、0.040mg/mL、0,060mg/mL、0.10mg/mL禾B0.125mg/mL。8、內(nèi)生畢赤酵母Ppf9揮發(fā)油對稻瘟菌孢子萌發(fā)的抑制作用內(nèi)生畢赤酵母Ppf9揮發(fā)油對稻瘟菌孢子萌發(fā)的半抑制濃度(ICw)為1.558mg/mL，陽性對照多菌靈對對稻瘟菌孢子萌發(fā)的半抑制濃度(IC化)為0.00211mg/mL。圖l:內(nèi)生真菌PpS菌落正面。圖2:內(nèi)生真菌Ppf9菌落背面。圖3:內(nèi)生真菌Ppf9的細胞形態(tài)。圖4:內(nèi)生真菌Ppf9同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹圖。圖5:內(nèi)生真菌Ppf9揮發(fā)油的氣相色譜圖。圖6:正垸烴C8Q。的氣相色譜圖。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明首次明確了具有廣譜抗菌活性的內(nèi)生畢赤酵母Ppf9菌株的微生物學(xué)分類地位，同時發(fā)現(xiàn)該菌揮發(fā)油對大腸桿菌、根癌土壤桿菌、番茄細菌斑點病菌、黃瓜角斑病菌、枯草芽孢桿菌和溶血葡萄球菌的生長具有明顯的抑制作用，對稻瘟菌孢子萌發(fā)具有明顯的抑制作用。本發(fā)明的目的是利用植物內(nèi)生真菌資源，以求獲得天然抗菌活性成分，為真菌源農(nóng)藥的研究與開發(fā)，為探討內(nèi)生真菌的生理生態(tài)功能提供依據(jù)。為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合本發(fā)明的實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。具體實施方式實施例l:內(nèi)生真菌Ppl9的分離采集新鮮的滇重樓根狀莖，表面先用70%乙醇處理30s，然后用0.2%氯化汞處理20min以進行徹底的表面滅菌，無菌條件下去除表皮，將根狀莖分成約0.5cmx0.5cmx0.5cm大小的塊段，擺放在PDA培養(yǎng)基上，每皿1塊，在25。C，光照條件下培養(yǎng)至第720天，從每個菌落的邊緣挑取一小段菌絲接種到PDA培養(yǎng)基上進行純化，連續(xù)純化45次，至菌落形態(tài)一致。將純化后的菌株在PDA斜面上保存，其中一株內(nèi)生真菌的編號為Ppf9。實施例2:內(nèi)生真菌Ppf9菌株的形態(tài)特征觀察內(nèi)生真菌Ppf9菌株在PDA培養(yǎng)基上25。C培養(yǎng)，菌落致密，不規(guī)則突起，生長緩慢，背部有皺折，單細胞，有假菌絲，細胞卵圓形，橢圓形，無色，大小2.2nm4.8nmx2nm4.4nm。內(nèi)生真菌Ppf9的形態(tài)特征見圖1圖3。在培養(yǎng)條件下，未發(fā)現(xiàn)Ppf9的有性世代。實施例3:內(nèi)生真菌Ppf9菌株ITS序列分析與分子鑒定首先將在平板上活化的Pp菌株的菌絲轉(zhuǎn)移到PDA液體培養(yǎng)基中，懸浮培養(yǎng)5天后獲得新鮮的菌絲，采用常規(guī)的分子生物學(xué)方法提取基因組DNA。運用PCR技術(shù)，DNA擴增采用ITS通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')禾卩ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。DNA測序所用的引物分別為ITS1和ITS4，釆用ABIPRISM3730測序儀，分別進行正向(5'~>3')和反向(3'—5')雙向測序。反向序列經(jīng)DNAMAN軟件反向互補后與正向序列拼接形成5'—3'完整序列。把所得的ITSrDNA序列提交至!jGenBank數(shù)據(jù)庫(NationalCenterforBiotechnologyInformationWebsite,http:〃www.ncbi,nlm.nih.gov)，獲得序列號(accessionnumber)EF495244。利用Blast工具進行序列比對，找出與該序列相似度最高的菌的序列信息。Ppf9菌株的ITS序列與季氏畢赤氏酵母(WcWag"朋emtoncW)DQ663478的ITS序列相似度為99%，其同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹圖見圖4。根據(jù)Blast比對結(jié)果，從中抽取與所分離的內(nèi)生真菌Ppf9菌株序列相似性高的菌株的序列，采用ClustalX1.8軟件進行序列對準，再用MEGA軟件計算遺傳距離，然后利用距離依靠法中的鄰位相連法(Neighbor-joining,NJ)構(gòu)建進化樹，計算Bootstrap值來評價系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性。Ppf9同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹圖見圖4，Ppf9菌株與季氏畢赤氏酵母CP/c/w'agw7&rao"必)聚在一個分支上的可信度為100°/o。實施例4:內(nèi)生真菌Ppf9菌株的發(fā)酵工藝本發(fā)明采用的是搖床發(fā)酵，500mL體積的三角瓶中盛馬鈴薯-葡萄糖(PD)培養(yǎng)基200mL,將預(yù)先培養(yǎng)好的Ppf9菌絲接種到已滅菌的培養(yǎng)基中，在25。C、150rpm下暗培養(yǎng)7天，得總發(fā)酵液10L，采用高速離心(離心力為8000g，離心時間10min)的方法將菌絲和菌液分開，得菌絲體150.0g，于-20。C保存?zhèn)溆?。實施例S:內(nèi)生真菌Ppf9揮發(fā)油的制備內(nèi)生真菌Ppf9揮發(fā)油采用水蒸餾法制備。按實施例2中的發(fā)酵工藝獲得新鮮菌絲體150.0g,進行水蒸餾，溫度為100。C，連續(xù)蒸餾4h后收集揮發(fā)油，于4。C避光保存。在油水混合的流出液(5.0mL)中加入一定量的氯化鈉(NaCl)(10.0mg)，用乙醚進行萃取(重復(fù)3次，每次10mL)，然后用無水硫酸鈉(3.0g)干燥后濃縮萃取液(讓乙醚自然揮發(fā))，將獲得的純揮發(fā)油于4。C密封避光保存。計算得油率(g/g鮮重)咽餘、純化揮發(fā)油的質(zhì)量(g)1An得油率(％)=新難雖的質(zhì)量(g)Xl00實施例6:內(nèi)生真菌Ppf9揮發(fā)油的化學(xué)組成分析GC條件色譜柱為安捷倫公司(Agilent)HP-5石英毛細管柱[30mx0.25mmx0.25pm(5%苯基)-甲基聚硅氧烷]。進樣口溫度250。C,傳輸線溫度240。C。程序升溫如下起始柱溫50。C,停留1.50mim以10。C/min升至180。C，停留2min;然后以6。C/min升至280。C,停留10min。載氣為高純氦(99.999。/o);柱流量1mL/min。用實施例3所述的方法制備內(nèi)生真菌Ppf9揮發(fā)油，揮發(fā)油進樣量每次為1.0(分流比1:20)。內(nèi)生真菌Ppf9揮發(fā)油的氣相色譜圖見圖5。GC-MS分析采用Agilent68卯GC-5973MSD氣質(zhì)聯(lián)用儀完成。GC條件如上所述。MS條件如下.離子源溫度280°C;電離方式EI，電離能量70eV;質(zhì)量掃描范圍m/z:50500。保留系數(shù)(Retentionindices,RI)的測定系列正垸烴C8-C40(Sigma)用氯仿稀釋50倍，然后與上述GC條件一樣進樣分離，記錄C8C4o各正烷烴保留時間。用線性升溫公式計算各成分的RI值RI=100"+100(lgG-lg/)/(lgr+1-lgf)，其中G、/和/+/分別為被分析的組分和碳原子數(shù)處于11和11+1之間的正垸烴(/</,</+1)的流出峰保留時間(min)。正烷烴C廣C4o的氣相色譜圖見圖6。數(shù)據(jù)庫的檢索各組分峰相對含量(Relativeamounts,RA)的確定采用峰面積歸一化法。各組分峰用NISTLibrae(2002版)質(zhì)譜庫進行檢索，同時與相關(guān)文獻RI值進行比較，最后以質(zhì)譜匹配度和RI值匹配度最高的化學(xué)結(jié)構(gòu)為最佳鑒定結(jié)果；無RI值匹配性的以質(zhì)譜匹配度最高的化學(xué)結(jié)構(gòu)為鑒定結(jié)果。GC-MS分析結(jié)果見表l。從內(nèi)生真菌Ppf9揮發(fā)油中一共鑒定出了27個化合物，占總含量的98.219%，其中含量較高的化學(xué)成分分別為，,3a,7-Tetramethyl-1a，2,3,3aA5,6,7b-octahydro-1H陽cycopropa[a〗naphthaene(25.896%)、棕櫚酸(Palmiticacid，15.514%)、l-Methyl-2,4-di(prop-l-en-2-yl)-l-vinylcyclohexane(7.914%)、(E)-十八碳-9-烯酸((E)-Octadec-9-enoicacid，7.277%)、(9E,12E)-十八碳-9，12-二烯酸已酯((9E，12E>Ethyloctadeca-9，12-dienoate,5.199%)、3，6a,10-Trimethyl-2,3,4,5,6，6a,7,8-octahydro-4,10a-methano-10aH-1-benzoxocin(4.813)、1-乙烯基己醇(l-Vinylhexanol，4.212%)、(-)-藍桉醇((-)-Globulol，3.440%)、(E>十八碳-9-烯酸乙酯((E)-Ethyoctadec-9-enoate,3.032%)。表l內(nèi)生真菌Ppf9揮發(fā)油的化學(xué)成分GC-MS分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>151，4，9,9-Tetmmethyl-l,2,3,4，5，6，7，8-octahydro-4，7-methanoazulene16(-)-Globulol〗7p-Guaiene18a-Hexadecene193-(2-isopropyl-5-methylphenyl)-2-Methylpropanoicacid203，6a,0-Trimethy-2，3，4，5,methano-10aff-1-benzoxocin21Palmiticacid22(9S，闊-Methyjoctadeca-9，12-dienoate23的隱Methyloctadec-9-enote24(￡>Octadec-9-enoicacid25(犯，12，thyloctadeca-9，12-dienoate26(￡)-EthyIoctadec-9-enoate27DocosaneC15H24(204)C15H260(222)C15H24(204)(224)C14H20O2(220)C15H24O(220)C16H32。2(256)C19H34O2(294)C19H3602(296)C18H34O2(282)(308)C20H38O2(310)(310)14.26715362.]97■(CH2)r2、<CH2),■WV、CHJ(OH賄15.135讓3.44015.92316571.86016.22016762.03817.0021725U8017.67117664.81321.351198315.514i23.18021012.289人23.27721080.90524.05421567.27724.27521705.19924.34521753.03224.762199.340實施例7:內(nèi)生真菌Ppff揮發(fā)油的抗細菌活性(1)活性測定的細菌菌株枯草芽孢桿菌(5ad//tATCC11562)(革蘭氏陽性)；溶血葡萄球菌(&ap/y/ococc^Aaewoiy"cusATCC29970)(革蘭氏陽性)；黃瓜角斑病菌(尸seMCcwo"as/ac/zow""sATCC11921)(革蘭氏陰性)；根癌土壤桿菌G4gro&acfm'鵬f柳e/ade"sATCC11158)(革蘭氏陰性)；大腸桿菌(&c/zen'cWaco//ATCC25922)(革蘭氏陰性)；番茄細菌斑點病菌(XaWtowo"asv"icatoriaATCC11633)(革蘭氏陰性)。(2)培養(yǎng)基采用LB瓊脂培養(yǎng)基(酵母浸膏5g/L,蛋白胨10g/L,氯化鈉5g/L，瓊脂20g/L,pH7.0)和LB液體培養(yǎng)基(酵母浸膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，pH7.0)。(3)內(nèi)生真菌Ppf9揮發(fā)油溶液的配制稱取Ppf9揮發(fā)油40.0mg到Eppendorf管中，加入0.3mL的丙酮(100%),再加入0.7mL無菌水，振蕩溶解，得到40.0mg/mL的Ppf9揮發(fā)油母液。然后將揮發(fā)油母液配制成系列濃度為20.00mg/mL、17.50mg/mL、15.00mg/mL、12.50mg/mL、10.00mg/mL、8.00mg/mL、6.00mg/mL、4.00mg/mL、2.00mg/mL、1.00mg/mL、0.50mg/mL、0.25mg/mL,溶劑為30%丙酮的溶液。陽性對照選用硫酸鏈霉素(Amresco)，稱取硫酸鏈霉素4.0mg到Eppendorf管中，向其中加入1.0mL無菌水，振蕩溶解，得到4.0mg/mL的硫酸鏈霉素母液。然后將硫酸鏈霉素母液配制成系列濃度為2.0mg/mL、1.50mg/mL、1.25mg/mL、1.00mg/mL、0.80mg/mL、0.60mg/mL、0.40mg/mL、0.20mg/mL、0.10mg/mL、0.050mg/mL、0.010mg/mL的溶液。(4)抗菌活性測定抗細菌活性測定采用多孔板-MTT顯色法測定其最低抑制濃度(Minimalinhibitoryconcentration,MIC),結(jié)果見表2。具體操作步驟如下在潔凈無菌的96孔培養(yǎng)板中加入濃度為106cfu/mL的供試菌液90^,不同濃度梯度的揮發(fā)油lOuL,這樣得到Ppf9揮發(fā)油的檢測終濃度為2.0mg/mL、1.75mg/mL、1.50mg/mL、1.25mg/mL、1.00mg/mL、0.80mg/mL、0.60mg/mL、0.4mg/mL、0.20mg/mL、0.10mg/mL、0.05mg/mL、mg/mL0.025mg/mL,溶劑終濃度為3.0%丙酮的溶液。而陽性對照硫酸鏈霉素的檢測終濃度為0.20、0.15mg/mL、0.125mg/mL、0.10mg/mL、0.080mg/mL、0.060mg/mL、0.040mg/mL、0.020mg/mL、0.010mg/mL、0.0050mg/mL、0.0010mg/mL。同時設(shè)空白對照和溶劑對照(3.0%丙酮)，每個處理3個重復(fù)。將96孔板于37。C下培養(yǎng)24h后每孔中加入MTT(0.5mg/mL)溶液10^L，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加入10。/。DMSO100[iL終止反應(yīng)，振蕩30min，以助其溶解。肉眼即可觀察判斷Ppf9揮發(fā)油的MIC值。為了進一步驗證MIC值，從多孔板每個孔中吸取IOnL培養(yǎng)液涂布到LB平板上，在37。C下培養(yǎng)24h后觀察統(tǒng)計平板菌落數(shù)即可。表2內(nèi)生真菌Ppf9揮發(fā)油的抗細菌活性_<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例8:內(nèi)生真菌Ppf9菌株揮發(fā)油的對稻瘟菌孢子萌發(fā)的抑制作用(1)培養(yǎng)基采用燕麥西紅柿培養(yǎng)基(Oat-tomatoagarmedium,OTA)。配制1L的燕麥西紅柿培養(yǎng)基的步驟為將完全成熟的西紅柿切碎，用榨汁機榨汁，汁液用四層紗布過濾，取已過濾的汁液150mL待用。同時，稱取燕麥片30g，加入lOOOmL去離子水，煮沸30min，注意邊煮邊攪拌。煮好的燕麥片用兩層紗布過濾。收集濾液，然后往濾液中加入已準備好的番茄汁150mL和20g瓊脂，加熱融化，趁熱用紗布過濾，然后加去離子水定容至1000mL。分裝后121。C濕熱滅菌20min。該培養(yǎng)基用于稻瘟菌的培養(yǎng)。(2)供試的植物病原真菌稻瘟菌(Magna/w/Zzeo/yzae).(3)稻瘟菌活化培養(yǎng)用滅菌的接種針從保存菌種的試管中挑取少量菌絲，接種到燕麥番茄汁培養(yǎng)基平板上，用封口膜封好，25。C下培養(yǎng)。(4)稻瘟菌繼代培養(yǎng)倒燕麥番茄汁培養(yǎng)基平板，每皿倒約40mL。用移液槍在稻瘟菌菌落中央滴加無菌水1mL,然后用滅菌后的接種針輕輕擦洗菌落表面，注意用力要輕，以免擦破培養(yǎng)基表面。待無菌水變渾濁后，再用移液槍吸取100滴加到倒好的燕麥番茄汁培養(yǎng)基平板表面，然后用玻璃涂棒將其涂散均勻。待培養(yǎng)基表面干燥后，蓋好倒置25。C下培養(yǎng)。(5)機械刺激誘導(dǎo)產(chǎn)孢接種活化的稻瘟菌室溫下培養(yǎng)48h后，在其表面滴加無菌水約3niL,然后用滅菌后的棉簽輕輕擦洗菌絲，將菌絲機械擦斷，連續(xù)擦洗兩次，待灰色菌落變?yōu)楹谏蠹纯桑瑢⒈砻娴乃沟?，然后倒扣于滅菌后的吸水紙上，晾干水分，用三層滅菌后的紗布將皿口封住，置于干燥有光的條件下培養(yǎng)48h即可得到稻瘟菌孢子。(6)配制Ppff揮發(fā)油溶液:稱取Ppf9揮發(fā)油20.0mg到Eppendorf管中，加入0.3mL的丙酮(IOO%)，再加入0.7mL無菌水，振蕩溶解，得到20.0mg/mL的Pp揮發(fā)油母液。然后將Ppf9揮發(fā)油母液配制成系列濃度為4.0mg/mL、3.5mg/mL、3.0mg/mL、2.5mg/mL、2.0mg/mL、1.5mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL，稀釋用的溶劑為30%丙酮溶液。陽性對照采用多菌靈(Aldrich),稱取多菌靈1.0mg到Eppendorf管中，向其中加入30%的丙酮溶液1.0mL,振蕩溶解，得到1.0mg/mL的多菌靈母液。然后將多菌靈母液配制成系列濃度為0.03mg/mL、0.02mg/mL、0.016mg/mL、0.010mg/mL、0.004mg/mL、0.002mg/mL、0.001mg/mL,溶劑為30%丙酮溶液。(7)配制孢子懸浮液在機械誘導(dǎo)產(chǎn)孢好的平板上滴加無菌水3.0mL,然后用無菌棉簽輕輕擦洗菌落表面，洗下孢子，將孢子洗液裝到l.OmL的離心管中，離心3次(離心力8000g,每次離心10min)。然后配制孢子懸液，利用血球記數(shù)板測定孢子濃度，將孢子濃度配制為2xl(^個/mL。(8)進行活性測定準備潔凈培養(yǎng)皿，然后在每個培養(yǎng)皿中放上四層吸水紙，進行滅菌。滅菌后，往每皿中加無菌水5.0mL，在吸水紙上平行放置兩根無菌牙簽。另準備好凹玻片，用75%的乙醇浸泡24h，然后晾干。在每個凹洞上滴加25pL配制好的稻瘟菌孢子懸浮液(2xl06個/mL)和25系列濃度梯度的Ppf9揮發(fā)油溶液(滴加前應(yīng)在振蕩器上充分震蕩，以保證孢子懸浮液和藥劑溶液充分混勻)，這樣得到Ppf9揮發(fā)油的檢測終濃度為2.0mg/mL、1.75mg/mL、1.5mg/mL、1.25mg/mL、1.0mg/mL、0.75mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.10mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL、0.0125mg/mL。而陽性對照的檢測終濃度為0.015mg/mL、0.01mg/mL、0.008mg/mL、0.005mg/mL、0.002mg/mL、0.001mg/mL、0.0005mg/tnL。同時設(shè)空白對照和溶劑對照(15%丙酮)，每個處理3個重復(fù)。然后將凹玻片放在培養(yǎng)皿中的牙簽上，室溫下培養(yǎng)7h后進行觀察。(9)觀察記錄實驗結(jié)果和孢子萌發(fā)率的計算在顯微鏡10x10(目鏡x物鏡)倍下觀測每一凹玻片上的孢子萌發(fā)情況，選擇3個不同的視野，每個視野中IOO個以上孢子，共數(shù)300個孢子，用計數(shù)器記下萌發(fā)的孢子數(shù)，將3個重復(fù)合到一塊計算孢子萌發(fā)率(％)。溶劑對照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率孢子萌發(fā)抑制率(％)=_xi00溶劑對照萌發(fā)率(10)數(shù)據(jù)處理和半抑制濃度的計算試驗結(jié)果采用MicrosoftExcel軟件進行數(shù)據(jù)整理，在分析中，供試樣品濃度取對數(shù)(;O,抑制率換算成生物統(tǒng)計幾率值("，求得毒力回歸方程(r=aX+b)，從而可以求得半抑制濃度(IC5。)。實驗設(shè)空白對照和溶劑對照(15%丙酮)，每個處理兩個重復(fù)。Ppf9揮發(fā)油對稻瘟菌孢子萌發(fā)的線性回歸方程y=1.82624.6482(相關(guān)系數(shù)及=0.9735);1C50=1.558mg/mL。陽性對照多菌靈對稻瘟菌孢子萌發(fā)的線性回歸方程F=1.61139.3123(相關(guān)系數(shù)及-0.9813);IC50=0.00211mg/mL。權(quán)利要求1.一株產(chǎn)揮發(fā)油的滇重樓內(nèi)生真菌，其特征是命名為畢赤酵母(Pichiasp.)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊編號為CGMCCNo.2475。2、一種按權(quán)利要求1所述的內(nèi)生真菌的分離方法，通過嚴格的表面消毒，從植物內(nèi)部分離出來的，并通過形態(tài)和分子鑒定，將ITSrDNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得序列號EF495244。3、一種從權(quán)利要求l所述的內(nèi)生真菌中獲得的揮發(fā)油，該揮發(fā)油具有抗菌活性。4、一種制備權(quán)利要求3中的內(nèi)生真菌揮發(fā)油的方法將新鮮菌絲放入水蒸餾裝置中，進行水蒸餾，收集揮發(fā)油。在油水混合的流出液中加入一定量的氯化鈉，用乙醚進行萃取，然后用無水硫酸鈉干燥后濃縮萃取液，獲得揮發(fā)油。5、權(quán)利要求3中的揮發(fā)油用于制備抗細菌的藥物，所屬的細菌包括枯草芽孢桿菌、溶血葡萄球菌、黃瓜角斑病菌、根癌土壤桿菌、大腸桿菌和番茄細菌斑點病菌。6、權(quán)利要求3中的揮發(fā)油用于制備抗真菌的藥物，所屬的真菌包括稻瘟病菌。全文摘要本發(fā)明涉及一種產(chǎn)揮發(fā)油的滇重樓內(nèi)生畢赤酵母。本發(fā)明所述的內(nèi)生真菌Ppf9是從滇重樓中采用內(nèi)生真菌分離技術(shù)分離獲得的，經(jīng)微生物分類鑒定為畢赤酵母(Pichiasp.)，該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊編號為CGMCCNo.2475。本發(fā)明首次從滇重樓中分離出產(chǎn)揮發(fā)油的內(nèi)生畢赤酵母，并明確了揮發(fā)油的化學(xué)組成和抗菌活性。目的是利用植物內(nèi)生真菌資源，獲得天然活性成分。文檔編號A61P31/00GK101270340SQ200810112068公開日2008年9月24日申請日期2008年5月21日優(yōu)先權(quán)日2008年5月21日發(fā)明者劉西莉,周立剛,王明安,蔡曉月,趙江林,高希武,黃永富申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)