專利名稱：：用于誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生的氧化氮供體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：的方法和化合物。更明確的講，本發(fā)明涉及促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)發(fā)生和可塑性的方法和組合物。
背景技術(shù)：
：如果大腦部分梗塞就會(huì)發(fā)生中風(fēng)，就會(huì)由于腦部供血中斷而造成腦組織壞死。伴隨急性中風(fēng)的腦血栓可造成突然和劇烈的神經(jīng)損傷。在美國的成年人中，中風(fēng)是第三大死因，也是致殘的重要因素。藥理學(xué)上的各種干涉試圖使那些有可能存活下去的受中風(fēng)影響的大腦區(qū)域血流量達(dá)到最大，但是臨床效果讓人很事困惑。正如Harrison的PrinciplesofInternalMedicine(9thED.，1980，p.1926)中所講的，盡管實(shí)驗(yàn)證明...(腦血管擴(kuò)張)增加了腦部血液流量，正如氧化氮方法檢測(cè)的結(jié)果，它們還沒有證明這在對(duì)瞬時(shí)局部缺血攻擊、血栓形成或慢性中風(fēng)階段的人類中風(fēng)的仔細(xì)研究是有幫助的。給藥煙酸、煙酸千唑啉、乙醇、罌粟堿和吸入5%二氧化碳是對(duì)的...與應(yīng)用這些方法相反的建議就是血管擴(kuò)張藥物是有害的，而不是有益的，因?yàn)樗麄兘档土讼到y(tǒng)血壓，從而降低了與碩腔相吻合的血流，或者通過擴(kuò)張大腦正常區(qū)域的血管來從梗阻處銀取血流。因此，開發(fā)一種化合物和方法，通過產(chǎn)生神經(jīng)發(fā)生來緩解中風(fēng)的影響是有用的。
發(fā)明內(nèi)容按照本發(fā)明，它提供了一種方法，可通過對(duì)需要促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的患者給藥以治療劑量的氧化氮供體來促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。在沒有受到損傷的大腦中也可促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。并且提供了一種化合物，它含有足以促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的有效劑量的氧化氮供體來誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生。也提供了一種促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的氧化氮化合物。此外，本發(fā)明也提供了一種方法，它通過對(duì)需要增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的位點(diǎn)給藥以有效劑量的氧化氮供體化合物就可增強(qiáng)此處神經(jīng)細(xì)胞的產(chǎn)生。本發(fā)明提供了一種方法，它通過對(duì)患者給藥以有效劑量的氧化氮供體化合物來增強(qiáng)神經(jīng)功能和認(rèn)知功能。結(jié)合其中的圖表，只要通過參考下面的發(fā)明詳述你就可更好的理解本發(fā)明，你也就很容易的意識(shí)到本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)。圖l是一張照片，它展示了所選區(qū)域的BrdU-陽性細(xì)胞核；圖2A和2B是兩個(gè)圖表，它們顯示了在subventricular區(qū)(SVZ)的BrdU-陽性細(xì)月包數(shù)量；圖3顯示了在鋸齒狀腦回中的BrdU-陽性細(xì)胞數(shù)量；圖4A和4B是兩個(gè)圖表，它顯示在鋸齒狀腦回中BrdU細(xì)胞的分布百分比；圖5是一張照片，它展示了免疫反應(yīng)性細(xì)胞相對(duì)于粒細(xì)胞層中的粒細(xì)胞的大??；圖6A和6B顯示了SVZ中的BrdU-陽性細(xì)胞數(shù)量；圖7A和7B顯示了嗅覺球(0B)中的BrdU-陽性細(xì)胞數(shù)量；圖8A和8B顯示了鋸齒狀腦回中的BrdU-陽性細(xì)胞數(shù)量；圖9顯示了損害體積研究；圖10顯示了時(shí)間相對(duì)于粘連性去除檢測(cè)的結(jié)果-MCAo變化；圖ll顯示了Rotarod檢測(cè)的結(jié)果；圖12顯示了NSS檢測(cè)的結(jié)果；圖13顯示了重量百分比；圖14顯示了Rotarod檢測(cè)的結(jié)果；圖15顯示了Rotarod檢測(cè)的進(jìn)一步結(jié)果；圖16顯示了footfault檢測(cè)的結(jié)果；以及圖17顯示了進(jìn)一步的粘連性去除檢測(cè)的結(jié)果。發(fā)明詳述一般的講，本發(fā)明提供了促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的方法和化合物。更明確的講，本發(fā)明提供了可促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的方法和化合物，它是通過利用有效劑量的可促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的氧化氮供體來促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的。多種部位可需要神經(jīng)發(fā)生，這包括但不局限于大腦、CNS、耳或其中含有損傷的神經(jīng)細(xì)胞的部位。'氧化氮供體，是指一類化合物，它能提供氧化氮或促進(jìn)氧化氮濃度的增加..有多類化合物可提供氧化氮。這些化合物包括DETAN0N0ate(DETAN0N0，.N0N0ate或1-取代diazen-1-ium-1,2-diolate是含有[N(NO)NO]-功能基團(tuán)的化合物；DEA/NO;SPER/NO;DETA/NO;OXI/NO;SULF/NO;PAPA/NO;MAHMA/NO以及DPTA/NO);PAPANONOate,SNAP(S-亞硝基-N-乙酰青霉胺)，硝普鈉，硝化甘油鈉。這些化合物可促進(jìn)氧化氮的提高，例如磷酸二酯酶抑制劑和L-精氨酸.此處所用的'促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生'是指促進(jìn)或增強(qiáng)神經(jīng)增長(zhǎng).它可包括但不局限于，新神經(jīng)細(xì)胞的增長(zhǎng)或增強(qiáng)已存在的神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)，以及實(shí)質(zhì)細(xì)胞和可促進(jìn)組織可塑'逸的細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。神經(jīng)發(fā)生也包括，但并不局限于，軸突和樹突延伸和突觸發(fā)生.此處所用的'增強(qiáng)，指在特定條件下，按照要求對(duì)生長(zhǎng)進(jìn)行增強(qiáng)和抑制。因此，如果需要額外的神經(jīng)元生長(zhǎng)，添加氧化氮供體就能提高這種生長(zhǎng)。氧化氮供體，或氧化氮源，通過增強(qiáng)受體活化和促進(jìn)細(xì)胞形態(tài)改變和細(xì)胞增殖使腦組織準(zhǔn)備來補(bǔ)償由于損傷、神經(jīng)變性或老化引起的損傷.此處所用的'神經(jīng)，和'認(rèn)知'功能指大腦中的神經(jīng)生長(zhǎng)增強(qiáng)了患者思考、官能或其他的能力，接受氧化氮治療的正常人增強(qiáng)了腦細(xì)胞的產(chǎn)生，加快了認(rèn)知、記憶和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的功能。此外，當(dāng)進(jìn)行氧化氮治療之后，遭受神經(jīng)疾病或損傷的患者可提高認(rèn)知、記憶和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞的功能。本發(fā)明的目的就是通過誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生和細(xì)胞變化來促進(jìn)功能的提高，從而促進(jìn)在局部缺血性腦損傷或其他神經(jīng)損傷治療中取得改良性的成果。在患有中風(fēng)、CNS損傷和神經(jīng)變性疾病之后，患者會(huì)遭受神經(jīng)和功能性缺陷。這些發(fā)現(xiàn)提供了一種方法來增強(qiáng)大腦在CNS損傷或惡化之后的補(bǔ)償機(jī)制。在患者遭受中風(fēng)、損傷、老化和退化疾病之后，通過對(duì)氧化氮給藥來誘導(dǎo)神經(jīng)元和細(xì)胞的變化就可促進(jìn)患者的功能性改進(jìn)這種方法也有益于遭受其他神經(jīng)疾病，例如，但又不局限于ALS、MS和Huntingtons的患者，在遭受CNS損傷之后，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間對(duì)氧化氮給藥可促進(jìn)大腦的神經(jīng)發(fā)生，并且能加快神經(jīng)發(fā)生。這種效果的主要機(jī)制是NO活化了谷氨酸受體。這些谷氨酸受體促進(jìn)了長(zhǎng)期增強(qiáng)作用，并且隨后誘導(dǎo)了神經(jīng)元的再生.在最初的實(shí)驗(yàn)中，選用一種長(zhǎng)半衰期(約為50小時(shí))并可產(chǎn)生NO的化合物——DETA/NO來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在從中風(fēng)起始計(jì)245小時(shí)時(shí)和24小時(shí)以外時(shí)對(duì)這種4匕合物給藥，檢測(cè)新神經(jīng)元增加的數(shù)百。本文包括的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明一種設(shè)計(jì)來誘導(dǎo)NO產(chǎn)生的藥理學(xué)介入能促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。選用兩種化合物，DETAN0N0ate和SNAP,這兩種化合物成功的誘導(dǎo)了中風(fēng)后的神經(jīng)發(fā)生和提高了功能性結(jié)果(functionaloutcome),選用的這些化合物可能跨過了血腦屏障。在神經(jīng)科學(xué)研究中，神經(jīng)發(fā)生是主要的最后目標(biāo)。發(fā)明一種方法來促進(jìn)神經(jīng)元的產(chǎn)生將會(huì)為治療多種神經(jīng)疾病、CNS損傷和神經(jīng)變性提供機(jī)會(huì).也可能在非損傷大腦中增強(qiáng)神經(jīng)元的產(chǎn)生，從而可提高其功能.能促進(jìn)神經(jīng)元產(chǎn)生的一族藥物的市場(chǎng)是巨大的.氧化氮供體，其中DETAN0N0時(shí)一個(gè)例子，可促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生.提高神經(jīng)發(fā)生可轉(zhuǎn)化為一種方法，它可隨著年齡增長(zhǎng)和在損傷與疾病后提高、改進(jìn)神經(jīng)、行為和認(rèn)知功能。上迷討論為使用氧化氮來促迎神經(jīng)發(fā)生提供了一個(gè)事實(shí)基礎(chǔ)。應(yīng)用的方法和這些方法在本發(fā)明中的應(yīng)用可通過隨后的這些非限制性示例和圖表來展示。方法分子生物學(xué)中的一般方法本領(lǐng)域中熟知的和沒有特別描述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)一般是按照ColdSpringHarborLaboratorypress,NevYork(1989)出版的、Sambrook等編寫的MolecularCloning:ALaboratoryManual和JohnffileyandSons，Baltimore，Maryland(1989)出版的、Ausubel等編著的CurrentProtocolsinMolecularBiology,以及Perbal編箸的、JohnWiley$Sons，NevYork(1988)出版的APracticalGuidetoMolecularCloning,以及Watson等編著的、ScientificAmericanBooks,NeirYork出版的RecombinantDNA，以及Biiren等編著、ColdSpringHarborLaboratorypress,NewYork(1998)出版的GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries,Vols.1-4中的技術(shù)，并且美國專利4，666,828、4,683,202、4,801，531、5,192,659和5,272，057中提出的方法也在此處一并應(yīng)用作為參考。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)—般時(shí)按照AcademicPress,SanDiego,CA(1990)出版的PCRprotocols:AGuidetoMethodsandApplications中的方法進(jìn)行的.將原位(in-cell)PCR和流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)合來檢測(cè)含有特定DNA和mRNA序列的細(xì)胞(Testonietal，1996,Blood87:3822).免疫學(xué)中的一般方法本領(lǐng)域中熟知的和沒有特別描述的標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)方法一般是參考Appleton&Lange,Norwalk，CT(1994)出版的、Stites等編著的basicandClinicalImmunology(8thEdition)和W.H,FreemanandCo,,Newyourk(1980)出版的、Mishell和Shiigi(eds)編著的SelectedMethodsinCellularImmunology,治療劑的傳送本發(fā)明中的化合物的給藥和劑量確定是按照良好的醫(yī)學(xué)實(shí)踐進(jìn)行的，要考慮到醫(yī)生已知的個(gè)體患者的醫(yī)療條件、給藥位點(diǎn)和方法、給藥的時(shí)間安排、患者年齡、性別、體重以及其他的因素.在此處來講，藥理學(xué)上的有效劑量是通過這些本領(lǐng)域中熟知的考慮事項(xiàng)來確定的.這個(gè)劑量必須能夠取得有效成果.它包括但并不局限于增加的存活率或更快的恢復(fù)、或增加或減少一些癥狀或由本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員精選出來作為適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)的其他的指標(biāo).在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明中的化合物可以多種方式給藥.應(yīng)該指出的是他們可以化合物或藥物上可接受的鹽的形式給藥，也可單獨(dú)給藥或作為活性組分與藥物上可接受的載體、溶劑、助劑和媒介物結(jié)合給藥。這些化合物可通過口、皮下或包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉、腹膜內(nèi)和鼻內(nèi)在內(nèi)的腸胃外注射，以及鞘內(nèi)注射和輸注技術(shù)來給藥.將化合物植入的給藥方式也是有效的。接受治療的患者是溫血?jiǎng)游铮⑶姨貏e是哺乳動(dòng)物，包括人.藥物上接受的載體、溶劑、助劑和媒介物以及植入栽體一般指惰性的、無毒的固態(tài)或液態(tài)填充物、溶劑或不與本發(fā)明中的活性成分反應(yīng)的膠嚢包被物質(zhì).必須指出的是對(duì)人進(jìn)行的治療時(shí)間要比對(duì)鼠或此處示例中的其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的治療時(shí)間要長(zhǎng)，這些治療時(shí)間是與患病時(shí)間和藥效成比例的。這些藥劑可以是長(zhǎng)時(shí)間的單獨(dú)給藥或重復(fù)給藥，但優(yōu)逸的是單獨(dú)給藥這些藥劑可以是長(zhǎng)時(shí)間的單獨(dú)給藥或重復(fù)給藥.治療時(shí)間是與患病時(shí)間和藥效以及接受治療的患者的種類相適合的.當(dāng)對(duì)本發(fā)明中的化合物進(jìn)行腸胃外給藥時(shí)，一般是將這些化合物制備為單位劑量的可注射形式(溶^0懸浮液，乳狀液).適于注射的藥物制劑包括無菌水溶液或懸浮泉以及可重構(gòu)于無菌可注射溶液或懸浮液中的無菌粉.載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包括如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙烯乙二醇、液態(tài)丙烯乙二醇等等)、它們的運(yùn)當(dāng)混合物以及植物油。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性是可以維持的，例如，可通過應(yīng)用糖衣如卵磷脂、通過在懸浮液中維持所要求的顆粒大小以及通過使用變性劑，非水媒介物，如棉籽油、芝麻油、大豆油、玉米油、向曰葵油或花生油以及醋如異丙基豆蔻酸酯也可用做復(fù)合組合物的溶劑體系。此外，也可添加多種可增強(qiáng)組合物的穩(wěn)定性、無菌狀態(tài)以及等張性的添加劑，包括抗菌防腐劑、抗氧化劑、螯合劑以及緩沖液，通過添加多種抗真菌和抗細(xì)菌藥物，如對(duì)羥基笨甲酸酯類、酚、山梨酸等可保證預(yù)防徵生物的作用。在很多情況下最好是包括等張因子，如糖、氯化鈉等。對(duì)可注射藥物形式的延長(zhǎng)吸收可通過應(yīng)用延緩吸收的藥物如單硬脂酸鋁和凝膠來實(shí)現(xiàn)。然而，按照本發(fā)明，應(yīng)用的所有稀釋劑或添加劑都要與這些化合物相協(xié)調(diào)。將本發(fā)明示例中使用的化合物連同其他需要的多種成分溶解到所要求量的溶劑中，就可制備無菌注射溶液.本發(fā)明中的藥劑可以含有多種載體，如多種媒介物、助劑、添加劑以及稀釋劑的注射制劑形式對(duì)患者給藥；或者本發(fā)明中的化合物可以緩釋皮下植入物或耙定傳送體系，如單克隆抗體、載體傳送、離子電滲析、聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和徵球體等形式進(jìn)行腸胃外給藥。本發(fā)明中有效的傳送體系示例包括5,225,182;5,169,383;5,167,616;4，959，217;4，925，678;4,487，603;4，486，194;4，447，233;4,447,224;4,439,196;以及4，475,196.許多其他的植入物、傳送體系和組件對(duì)于本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員來講是熟知的。本發(fā)明中的化合物藥劑可以口服形式對(duì)患者給藥.傳統(tǒng)的給藥方法入對(duì)這些化合物以片劑、懸浮波、溶液、乳劑、膠嚢、粉劑、糖漿等都是適用的.優(yōu)選的是那些已知可經(jīng)口或皮下傳送藥物并且能保留藥物的生物活性的技術(shù).在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中的藥物最初是通過皮下注射給藥使血液水平達(dá)到一個(gè)合適的水平.然后再通過口S^藥劑的形式來維持患者體內(nèi)的水平，其他依賴患者身體情況的給藥形式以及上面提到的給藥形式都可使用.給藥量因接受治療的患者不同而不同，大約為100ng/kg體重/天一100mg/kg體重/天，優(yōu)選的使10mg/kg體重/天一10mg/kg體重/天。示例示例1發(fā)明了一種藥物學(xué)方法來促進(jìn)大腦的神經(jīng)發(fā)生.通過在雄性Wistar鼠的右MCA的起端放入動(dòng)脈內(nèi)凝塊使得大鼠患中腦動(dòng)脈(MCA)梗塞.在誘導(dǎo)中風(fēng)之后的第24和48小葉對(duì)動(dòng)物給藥(iv/ip)以氧化氮供體化合物(DETANONO)(組1)，或者在24小時(shí)之后每天注射(ip)NO供體化合物(組2)。BrdU是一種胸普類似物，它可檢測(cè)新細(xì)胞的形成，從局部缺血后開始每天注射(ip)BrdU,并持續(xù)14天。通過特異細(xì)胞的免疫活性標(biāo)記來確定細(xì)胞類型.因此，可通過表達(dá)NeuN和MAP2來檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞，通過GFAP來檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞.在大腦特定區(qū)域、subventricularzone和鋸齒狀腦回檢測(cè)神經(jīng)發(fā)生.結(jié)果數(shù)據(jù)表明，相對(duì)于沒有進(jìn)行治療的組，接受DETANONO治療的大鼠中可觀察到BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量的顯著增加.對(duì)于組2來講，結(jié)果如下subventricularzone:2748±326/1653±91.4,鋸齒狀腦回粒狀細(xì)胞層，135±18.9/37.3±3.6;53.7±6.3/34.9±2.8,解門，43.8±10.2/10.1±2.4,對(duì)組1來講，分別在接受治療的鼠的粒狀細(xì)胞層和未接受治療的鼠的粒狀細(xì)胞層中檢測(cè)到89.5±12/37.3±3.6的BrdU細(xì)胞數(shù)量顯著增加。在鋸齒狀腦回中絕大多數(shù)新形成的細(xì)胞(>90%)是神經(jīng)細(xì)胞。在大腦的其他區(qū)域，新形成的細(xì)胞具有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞表型.對(duì)非局部缺血大腦的DETANONO治療對(duì)沒有接受任何外科手術(shù)的大鼠進(jìn)行DETANONO治療。藥物是以單劑量(iv0.12mg)給藥的。在開始治療后持續(xù)14天每天注射BrdlL—組大鼠(組3)在BrdU注射的最后一天處理.另一組(組4)在最后的BrdU注射后4星期處理。按照與接受DETANONO治療的鼠(組5)的方法對(duì)不進(jìn)行DETANANO給藥的動(dòng)物進(jìn)行BrdU注射.組3/組5的結(jié)果如下在subventricularzone結(jié)果分別是2952±102.6/1432±104.6和2725.3±115.5/1655.2土102.9;在鋸齒狀腦回(粒狀細(xì)胞層)是73.7±6.11/39.9±7.26.在纟且4/纟且5中，在subventricularzone結(jié)果分另'J是456-5±42.3/214.6±67.9和518.4±67.2/233.1±49.2;在鋸齒狀腦回(解門)是7.71±89/3.23±1.22。相對(duì)于沒有接受處理的組，接受DETAN0N0治療的大鼠在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)都表現(xiàn)出新形成細(xì)胞的顯著增加。新形成細(xì)胞在subventricularzone和海馬狀突起有明顯增加.用神經(jīng)標(biāo)記物NeuN和MAP2以及星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP對(duì)BrdU活性細(xì)胞進(jìn)行雙重標(biāo)記。新形成的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞蛋白.圖1表明遭受中風(fēng)并且接受DETAN0N0治療的鼠中，在海馬狀突起通過BrdU和神經(jīng)標(biāo)記物NeuN和MAP2、BrdU和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物以及GFAP進(jìn)行雙重標(biāo)記免疫組織化學(xué)。細(xì)胞對(duì)這些標(biāo)記都表現(xiàn)了免疫組織活性，這表明新形成細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞元(neuronalcell)和星形膠質(zhì)細(xì)胞表型。估計(jì)在海馬狀突起中新形成的細(xì)胞大于90X是神經(jīng)細(xì)胞表型.這些數(shù)據(jù)表明對(duì)NO供體給藥促進(jìn)了局部缺血大腦的神經(jīng)發(fā)生。這種方法適用于多種形式的CNS病理和損傷。此外，NO液促進(jìn)了正常成人大腦中的神經(jīng)發(fā)生。本發(fā)明的目的是通過誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生來促進(jìn)在對(duì)大腦局部缺血損傷或其他神經(jīng)損傷進(jìn)行的治療方面取得改進(jìn)性成果。在患有中風(fēng)、CNS損傷和神經(jīng)變性疾病之后，患者會(huì)遭受神經(jīng)和功能缺陷.這些發(fā)現(xiàn)提供了一種方法來增強(qiáng)大腦補(bǔ)償性機(jī)制以提高遭受CNS損傷和神經(jīng)變性后的大腦功能。神經(jīng)元誘導(dǎo)將促進(jìn)中風(fēng)后官能提高。在遭受CNS損傷之后，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間對(duì)氧化氮給藥可促進(jìn)大腦的神經(jīng)發(fā)生，并且能加快神經(jīng)發(fā)生。這種效果的主要機(jī)制是N0活化了谷氨酸受體。這些谷氨酸受體促進(jìn)了長(zhǎng)期增強(qiáng)作用，并且隨后誘導(dǎo)了神經(jīng)元的再生。在最初的實(shí)驗(yàn)中，選用一種長(zhǎng)半衰期(約為50小時(shí))并可產(chǎn)生N0的化合物---DETA/N0來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在從中風(fēng)起始計(jì)24小時(shí)時(shí)和24小時(shí)以上時(shí)對(duì)這種化合物給藥，檢測(cè)新神經(jīng)元增加的數(shù)目。本文包括的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明一種設(shè)計(jì)來誘導(dǎo)N0產(chǎn)生的藥理學(xué)介入能促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。選用兩種化合物，DETAN0N0ate和SNAP,這兩種化合物成功的誘導(dǎo)了中風(fēng)后的神經(jīng)發(fā)生和提高了功能性成果。選用的這些化合物可能跨過了血腦屏障。在神經(jīng)科學(xué)研究中，神經(jīng)發(fā)生時(shí)主要的最后目標(biāo)。發(fā)明一種方法來促進(jìn)神經(jīng)元的產(chǎn)生將會(huì)對(duì)治療多種神經(jīng)疾病、CNS損傷和神經(jīng)變性提供機(jī)會(huì).也可能在非損傷大腦中增強(qiáng)神經(jīng)元的產(chǎn)生，從而可提高其功能.能促進(jìn)神經(jīng)元產(chǎn)生的一族藥物的市場(chǎng)時(shí)巨大的。氧化氮供體，其中DETAN0N0時(shí)一個(gè)例子，可促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。提高的神經(jīng)發(fā)生可轉(zhuǎn)化為一種方法，它可隨著年齡增長(zhǎng)和在損傷與疾病后提高、改進(jìn)神經(jīng)、行為和i人知功能.在此之前沒有NO供體或藥物，尤其是中風(fēng)后可誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生的藥物的專利申請(qǐng).在成年嚙齒類動(dòng)物的整個(gè)生命過程中，在其大腦的subventricularzone(SVZ)和海馬狀突起的鋸齒狀腦回能夠產(chǎn)生神經(jīng)祖細(xì)胞。然而，祖細(xì)胞增殖和分化的信號(hào)還不為所知，氧化氮(N0)是生物體系中的一種化學(xué)信使，可作為大腦中的一幹神經(jīng)遞質(zhì).在本發(fā)明的研究中，探討了N0對(duì)成年鼠SVZ和鋸齒狀腦回的神經(jīng)粗細(xì)胞增殖的影響.進(jìn)行了兩個(gè)實(shí)驗(yàn).在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)了N0對(duì)非局部缺血成年鼠的SVZ和鋸齒狀腦回的神經(jīng)祖紐胞增殖的影響，在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)了NO對(duì)局部缺血成年鼠的SVZ和鋸齒狀腦回的神經(jīng)祖細(xì)胞增殖的影響。本發(fā)明中選用的是體重為300-350克的成年Wistar鼠(CharlesriverBreedingCompany,Wilmington,MA).從ALEXISBiochemicalCorporation購買了生理狀態(tài)的、半衰期為20小時(shí)的NO供體一DETANOPNOate.從Sigmachemical購買了作為有絲分裂標(biāo)記的胸苷類似物一溴尿普(BrdU).從BoehringerMannheim購買了抗BrdU的鼠單克隆抗體。將體重為300-350克的雄性Wistar(n=28)鼠通過面罩用氟烷(在70%N20和30%02混合物中的濃度為1-3.5%)進(jìn)行麻痹.在整個(gè)外科手術(shù)過程中，通過反饋調(diào)節(jié)水加熱系統(tǒng)將鼠直腸溫度控制在37±1TC.在右股動(dòng)脈和靜脈中插入PE-50導(dǎo)管來分別進(jìn)行血壓持續(xù)監(jiān)測(cè)和測(cè)量血波中的氣體(pH、p02、pC02),以及給藥.DETAN0N0ate是通過靜脈或腹膜注射的方式對(duì)鼠給藥的.DETAN0N0治療將鼠隨機(jī)分為4組.在組1(單Rx)中，每15分鐘就皮下注射一個(gè)DETAN0N0大丸劑(每個(gè)0.lmg/kg),共注射4次(總共0.4mg/kg).在組2(2Rx)中，每15分鐘就皮下注射一個(gè)DETAN0N0大丸劑(每個(gè)0.lmg/kg),共注射4次(總共0.4mg/kg),并且在24小時(shí)之后重復(fù)進(jìn)行第二次治療。在紐3(7Rx)中，在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)曰，每15分鐘就對(duì)鼠皮下注射一個(gè)DETANONO大丸劑(每個(gè)0.lmg/kg)，共注射4次(總共0.4mg/kg),以后每天腹膜注射一個(gè)DETANONO大丸劑(每個(gè)0.4fflg/kg),連續(xù)注射6天。在組4(對(duì)照)中，僅僅對(duì)鼠注射鹽水(單劑量)。在進(jìn)行DETANONO治療的第一天，對(duì)鼠進(jìn)行腹膜注射BrdU(50mg/kg),每天注射，連續(xù)14天.為了確定SVZ和鋸齒狀腦回中的細(xì)胞分化和增殖是否受到了NO的影響，在笫一劑DETANONO治療后分別在第14天(n-3-5/組)和第42天(11=3-5/組)將鼠殺死.將鼠利用含在pH7.4的100毫升磷酸緩沖液中的4%多聚甲醛進(jìn)行經(jīng)心灌注.將腦取出并固定在4%甲醛中。對(duì)于BrdU免疫染色來講，首先通過將腦切片(6uin)在65C、50%甲酰胺2XSSC中培育2小時(shí)進(jìn)ff變性，然后在37C的2NHC1中培育30分鐘.然后用Tris緩沖液沖洗腦切片，并且用1%11202處理來阻斷內(nèi)源過氧化物酶.腦切片在室溫與抗BrdU(1:100)的第一種抗體培育1小時(shí)，然后與生物素化的第二種抗體(1:200，vector,burlingame，CA)共培育1小時(shí)，利用3'3'-4基聯(lián)苯胺-四氫氯化物(DAB,Sigma)。在40X顯徵鏡(01ympusBX40)下通過MCID計(jì)算機(jī)成像分析系統(tǒng)(ImagingResearch,St.Catharines,Canada)將BrdU免疫染色切片進(jìn)行數(shù)字化顯示。在計(jì)算機(jī)監(jiān)視器上進(jìn)行BrdU核技術(shù)以提高可見性，并且使用單焦平面奉避免重復(fù)計(jì)數(shù).對(duì)結(jié)構(gòu)的取樣是通過選擇每個(gè)切片(RMS和OB)上預(yù)先確定的區(qū)域或通過分析每個(gè)切片(鋸齒狀腦回和SVZ)的整個(gè)結(jié)構(gòu)來確定的。選取每只鼠在AP+10.6咖處的驕胝體膝和AP+8.74mm處的前聯(lián)合交叉點(diǎn)之間總共7個(gè)切片的每個(gè)第40冠狀部分(PaxinosandWaston，1986).對(duì)在側(cè)心室壁上的BrdU免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞核進(jìn)行計(jì)數(shù).在這些區(qū)域的所有BrdU免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞核都以BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)/咖2表示。將這七個(gè)切片的密度進(jìn)行平均以獲得每只鼠的平均密度.選取每只鼠在OB前沿皮層前后向上的連續(xù)總共6個(gè)切片的每個(gè)第20部分。如圖1中所描述的，在每個(gè)部分上，對(duì)RMS中的兩個(gè)預(yù)先確定區(qū)域(100x100um)和0B的粒狀細(xì)胞層(GCL)中的四個(gè)區(qū)域進(jìn)行了分析。在這些選定區(qū)域中，所有BrdU性細(xì)胞核都以BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)/咖2表示將這6個(gè)切片的密度進(jìn)行平均以獲得每只鼠的平均密度，選取每只鼠在AP+5.86mm和AP+2.96mm間，包括解門、亞粒狀區(qū)(SGZ)和內(nèi)部第一、笫二、第三束i狀細(xì)胞層(GCL)在內(nèi)總共8個(gè)切片的每個(gè)第50冠狀切片。SGZ是GCL和解門交界處的一個(gè)有兩個(gè)細(xì)胞厚的帶，它一直是與GCL結(jié)合進(jìn)行計(jì)數(shù)的.在這些選定區(qū)域中，所有BrdU陽性細(xì)胞核都以BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)/mn^表示.將這8個(gè)部分的密度進(jìn)行平均以獲得每只鼠的平均密度.結(jié)果相對(duì)于接受鹽水治療的鼠，在進(jìn)行治療后的第14天和第42天，接受DETANONO治療的鼠的SVZ中的BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)(圖2a).相對(duì)于在治療后14天給藥1和2劑DETANONO的鼠，給藥7劑DETANONO的鼠顯示了更高數(shù)量的免疫反應(yīng)細(xì)胞.在給藥1劑和7劑DETANONO鼠之間檢測(cè)到BrdU細(xì)胞數(shù)量有顯著的差異(圖2b),這表明BrdU細(xì)胞數(shù)量的增加是以劑量依賴形式進(jìn)行的.雖然相對(duì)于在處理后笫14天給藥的鼠相比，BrdU細(xì)胞數(shù)量下降了，但是相對(duì)于對(duì)照的鹽水組鼠BrdU細(xì)胞數(shù)量還是顯著增加了(圖2a)在處理后第42天和第14天進(jìn)行DETANONO治療的鼠的RMS中，BrdU細(xì)胞數(shù)量沒有顯著增加(表1)然而，相對(duì)于對(duì)照組，在接受單劑DETANONO治療后第42天的OB中，以及在接受2劑和7劑DETANONO治療后第42天的OB中檢測(cè)到BrdU細(xì)胞數(shù)量顯著增加(表1),這表明SVZ祖細(xì)胞的遷移增加.在處理后第14天和笫42天，單劑量的DETANONO治療沒有顯箸增加鋸齒狀腦回中的BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量(圖3)。相反，相對(duì)于對(duì)照組，在處理后第14天和第42天，接受2劑量和7劑量DETANONO治療的鼠鋸齒狀腦回中的BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖3)。相對(duì)于對(duì)照組，在處理后第42天和第14天，鋸齒狀腦回中的BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞分配百分比表明DETANONO治療顯著降低了BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞在亞粒狀區(qū)域的百分比，但顯著增加了在粒狀細(xì)胞層的BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞百分比(圖4a和4b)，這暗示了NO促進(jìn)了BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞的遷移。在粒狀細(xì)胞層中的BrdU克疫反應(yīng)細(xì)胞是卵圓形的和圓形的，大小與粒狀細(xì)胞的細(xì)胞核相同或比其小。數(shù)據(jù)表明，對(duì)成年鼠進(jìn)行DETANONO治療不僅增加了SVZ和鋸齒狀腦回祖細(xì)胞的增殖，而且延長(zhǎng)了增殖的祖細(xì)胞的存活.在鋸齒狀腦回中的一些BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞具有粗狀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。因此，數(shù)椐表明NO增強(qiáng)了成年鼠大腦的神經(jīng)發(fā)生。基于以上數(shù)據(jù)，進(jìn)行了第二個(gè)實(shí)驗(yàn)來探討NO對(duì)focalemboliccerebralischemicbrain的影響。除下列搡作外，其他所有操作與第一個(gè)實(shí)驗(yàn)相同.體重為300-350克的雄性Winstar鼠(n=30)都遭受中腦動(dòng)脈(MCA)栓塞.通過在MCA起端處放置栓塞物使MCA栓塞。簡(jiǎn)單的講，就是利用15咖長(zhǎng)、已經(jīng)修飾過的PE-50導(dǎo)管在MCA起端放置一個(gè)完整且富舍血纖維蛋白、形成時(shí)間為24小時(shí)的同源血塊(約lul)。實(shí)驗(yàn)分為四組.組I(對(duì)照組)中的鼠接受MCA血栓處理，并且在局部缺血后的第24小時(shí)接受連續(xù)4次皮下注射鹽水大丸藥(每次0.52ml,每隔15分鐘一次)。組II(DETN0/N0預(yù)處理)中的鼠在栓塞前24小時(shí)接受連續(xù)4次對(duì)DETANONO大丸劑的皮下給藥(每次0.lmg/kg,每隔15分鐘一次，總劑量0.4mg/kg)組III(DETANONO兩次組)中的鼠在拴塞后24小時(shí)和48小時(shí)接受連續(xù)四次DETANONO大丸劑皮下給藥(每次0.lmg/kg,每隔15分鐘一次，總劑量0.4fflg/kg).組IV(DETANONO七次組)中的鼠在栓塞后24小時(shí)接受連續(xù)4史對(duì)DETANONO大丸劑的皮下給藥(每次0.lmg/kg，每隔15分鐘一次，總劑量0.4mg/kg)。隨后，每天對(duì)鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射0.4mg/kgDETA/N0，持續(xù)6天.相對(duì)于非局部缺血鼠，在MCA栓塞后的第14天，栓塞性MCA栓塞造成同側(cè)SVZ和0B的Brdli免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(p<0.05)(表2),在MCA栓塞后第42天，BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量降低，這表明灶性大腦局部缺血誘導(dǎo)了同側(cè)SVZ的祖細(xì)胞增殖的暫時(shí)增加(表2).MCA栓塞沒有影響SVZ和0B對(duì)側(cè)祖細(xì)胞和鋸齒狀腦回兩側(cè)的祖細(xì)胞的增殖(表2)'相對(duì)于沒有處理的MCA栓塞組，在預(yù)處理組中，在進(jìn)行MCA栓塞后的第14天，在SVZ的對(duì)側(cè)和在第42天在SVZ的兩側(cè)面檢測(cè)到BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(p<0.05)(圖6A,6B).兩劑量組的鼠中，在進(jìn)行MCA栓塞后第14天，在SVZ的同側(cè)面和第42天在SVZ兩側(cè)面的BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量都有顯箸的增加(圖6A，6B).在MCA栓塞后的第14天和笫42天，進(jìn)行七次DETANONO注射組中的鼠的SVZ同側(cè)和對(duì)側(cè)面就表現(xiàn)BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的顯著增加(圖7A,7B).在MCA栓塞后的第14天和42天，進(jìn)行DETANONO處理的缺血大鼠的0B中，檢測(cè)到明顯增加的BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞(圖7A，7B).相對(duì)于MCA栓塞對(duì)照組，在迚行MCA栓塞之后的第14天和第42天，接受DETANONO處理的局部缺血鼠的鋸齒狀腦回中BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖8A，8B)。接受DETANONO處理的局部缺血鼠沒有表現(xiàn)出局部缺血損傷體積的顯著減小(圖9).這些數(shù)據(jù)說明檢塞性MCA檢塞本身增加了SVZ同側(cè)面祖細(xì)胞的增殖。許多在SVZ產(chǎn)生的細(xì)胞沿RMS遷移進(jìn)OB，它們?cè)谀抢锓只癁樯窠?jīng)元，因此，OB同側(cè)面BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量增加表明SVZ同側(cè)面祖細(xì)胞遷移的增加。這些數(shù)據(jù)也表明MCA栓塞后祖細(xì)胞增殖信號(hào)是短暫的和局部的.然而，但進(jìn)行MCA栓塞后對(duì)局部缺血鼠進(jìn)行DETANONO處理時(shí)的祖細(xì)胞增殖顯箸增加至少持續(xù)42天。祖細(xì)胞增殖的增加是由NO誘導(dǎo)的，因?yàn)锽rdU免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量增加不僅涉及到SVZ兩側(cè)面，而且涉及到鋸齒狀腦回的兩側(cè)面.然而，在接受DETANONO處理的非局部缺血鼠和接受處理的局部缺血鼠的BrdU細(xì)胞數(shù)量還是有區(qū)別的.在MCA栓塞后第14小時(shí)和42小時(shí)，接受DETANONO處理的非局部缺血鼠鋸齒狀腦回中的BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量要多于接受DETANONO處理的局部缺血鼠鋸齒狀腦回中的BrdU免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量，這表明NO可通過局部缺血來增強(qiáng)已產(chǎn)生的信號(hào)以增加祖細(xì)胞的增殖.因此，數(shù)據(jù)暗示病灶性大腦局部缺血產(chǎn)生了短暫的祖細(xì)胞增殖，并且NO增強(qiáng)了局部缺血大腦中祖細(xì)胞的增殖。示例2對(duì)正常和局部缺血鼠給藥以氧化氮供體(DETA/NO)促進(jìn)了非局部缺血大腦和局部缺血大腦中的神經(jīng)發(fā)生.此后，進(jìn)行了額外實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)DETA/NO誘導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)生促進(jìn)了中風(fēng)后的大腦功能性改進(jìn)這一假說；同時(shí)提供了數(shù)椐.在誘導(dǎo)中風(fēng)后第一天(組1)或笫7天(組2)對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠給藥DETA/NO(iv/ip),隨后是為時(shí)7天的每日給藥DETA/NO(ip).另一種NO供體化合物(SWAP)在i秀導(dǎo)中風(fēng)后的第一天和第二天對(duì)局部缺血鼠給藥(iv)(組3)。組1和組2中是選用的幼鼠(3月)。組3中是選用中等年齡的鼠(10-12個(gè)月)。從誘導(dǎo)中風(fēng)后的第一天到第42天，進(jìn)行了一系列神經(jīng)功能檢驗(yàn).這些檢驗(yàn)包括1)神經(jīng)嚴(yán)重性分?jǐn)?shù)(NSS)檢測(cè)運(yùn)動(dòng)功能、感覺功能和反射坊能，它類似于用來描述人的對(duì)側(cè)忽略實(shí)驗(yàn)。分?jǐn)?shù)越高，損傷越嚴(yán)重；2)Rotard檢驗(yàn)檢測(cè)前后肢運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)和平衡，給出的數(shù)據(jù)是以下限值的百分?jǐn)?shù)來表示的；3)footfault檢驗(yàn)檢測(cè)前后肢的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)作用。數(shù)值越高，損傷越嚴(yán)重；4)結(jié)合去除檢驗(yàn)檢測(cè)運(yùn)動(dòng)傳感器損傷.數(shù)據(jù)以時(shí)間(秒)來表示。時(shí)間越長(zhǎng)，損傷越嚴(yán)重；5)動(dòng)物體重。結(jié)果組l:相對(duì)于對(duì)照組鼠，在接受DETA/N0處理的鼠中檢測(cè)到運(yùn)動(dòng)和運(yùn)動(dòng)傳感功能(圖10為Rotard檢驗(yàn)，圖11為結(jié)合去除檢驗(yàn)，圖12為NSS檢驗(yàn))和實(shí)驗(yàn)鼠體重(圖13)的顯著提高。組2:相對(duì)于對(duì)照組鼠，在誘導(dǎo)中風(fēng)后第28和42天僅僅在Rotard檢驗(yàn)中檢測(cè)到神經(jīng)功能的顯著提高(圖14).組3:相對(duì)于對(duì)照組鼠，接受SNAP處理的實(shí)驗(yàn)鼠表現(xiàn)了在運(yùn)動(dòng)和運(yùn)動(dòng)傳感功能上的顯著提高(圖15為Rotard檢驗(yàn)，圖16為footfault檢驗(yàn)，圖17為結(jié)合去除檢驗(yàn)).結(jié)論這些數(shù)據(jù)表明1)對(duì)大腦局部缺血的鼠給藥DETAN0N0可提高神經(jīng)功能的恢復(fù)，并且甚至在中風(fēng)七天后也能取得這些提高；2)除給藥DETAN0N0外，對(duì)大腦局部缺血的鼠給藥SNAP也提高了神經(jīng)功能，這表明對(duì)NO供體化合物給藥可增強(qiáng)神經(jīng)功能的恢復(fù)；以及3)對(duì)中等年齡的鼠給藥SNAP有效的促進(jìn)了功能恢復(fù)，這是很重要的，并且是與臨床相關(guān)的，因?yàn)橹酗L(fēng)患者是中年或更老.結(jié)合上述的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)表明NO供體促進(jìn)了神經(jīng)發(fā)生，暗示NO供體化合物通過促進(jìn)局部缺血大腦中的神經(jīng)發(fā)生來增強(qiáng)中風(fēng)后的神經(jīng)功能恢復(fù).在本專利申請(qǐng)中，多種出版物，包括美國專利是按照作者和年代來參考引用的，而專利是按照申請(qǐng)?zhí)杹韰⒖家玫?。全文引用的文獻(xiàn)如下所列.因此，全文引用這些出版物和專利作為參考文獻(xiàn)以便更加全面的描述與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域的現(xiàn)狀。本發(fā)明是以例證性的方式來播述的，應(yīng)該明白，本專利中用到的術(shù)語在詞匯本身是說明本發(fā)明，而不是進(jìn)行限制本發(fā)明的。很顯然，本發(fā)明可能按照上逸學(xué)說進(jìn)行多種修飾和變動(dòng).因此，應(yīng)該理解為在本發(fā)明描述的范圍內(nèi)，而不是明確描述，本發(fā)明是可以實(shí)施的。表l.大腦中新產(chǎn)生的細(xì)胞的密度<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>新產(chǎn)生的細(xì)胞的密度是以BrdU陽性細(xì)胞平均如/mm2土SEM來表示的.它們的值與鹽水處理不同，*p<0.05,"p<0.01-表2.大腦中新產(chǎn)生細(xì)胞的密度<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>新產(chǎn)生的細(xì)胞的密度是以BrdU陽性細(xì)胞平均如/mn^士SEM來表示的.它們的值不同于非局部缺血組，-pO.05,"pO.01.參考文獻(xiàn)BurkeandOlson,"在酵母人工染色體載體上制備克隆庫，，inMethodsinEnzymology,Vol.194,"GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology".Eds.C.GuthrieandG.Fink,AcademicPress,inc.,Chap.17，pp.251-270(1991).Capecchi,"利用同源重組方法來修飾基因組，，science244:1288-1292(1989).Daviesetal.,酵母人工染色體中用于種間基因傳遞的耙定改造，NucleicAcidsResearch,Vol.20，No.11，pp.2693-2698(1992).Dicksonetal.，"通過可插入栽體進(jìn)行的高頻基因靶定"HumanMolecularGenetics,Vol,2,No-8，pp.1299-1302(1993).DuffandLincoln,"將病原t異基因插入攜帶有人APP基因的酵母人工染色體中并在ES細(xì)胞中表達(dá)，ResearchAdvancesinAlzheimer，sDiseaseandRelatedDisorders,1995.Huxleyetal.,"通過細(xì)胞融合技術(shù)將酵母染色體上的人HPRT基因轉(zhuǎn)移入鼠細(xì)胞中后的基因是有功能的基因，Genomics,9;742-750(1991).Jokobovitsetal.,"起源于人的酵母人工染色體的細(xì)菌系傳遞和表達(dá)，，，Nature，Vol.362,pp.255-261(1993).Lambetal.，"在轉(zhuǎn)基因鼠中引入和表達(dá)400kb前體淀粉體蛋白基因，，，NatureGenetics,Vol.5,pp.2-29(1983).PearsonandChoi.，"在轉(zhuǎn)基因鼠中表達(dá)取自酵母人工染色體的人b-淀粉體前體蛋白基因"，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993.90:10578-82Rothstein，"耙定、破壞、替代、等位基因拯救酵母中的整合DNA轉(zhuǎn)化，'inMethodologyinEnzymology，vol.194,"GuidetoYeastGeneticsand'MolecularBiology"-Eds.C.GuthrieandG.Fink,AcademicPress,inc.,Chap.17,pp.281-301(1991).Sched丄etal.，"在轉(zhuǎn)基因鼠中包含有酪氨酸酶基因的酵母人工染色體賦予了拷貝數(shù)量依賴型表達(dá)，，，Nature,Vol.362，卯.258-261(1993).Straussetal.，"鼠科動(dòng)物中酵母人工染色體的細(xì)菌系傳遞，(1)膠原質(zhì)位點(diǎn)"，Science,Vol.259，pp.1904-1907(1993).Gibola,E，Eglitis，MA,Kantoff，PW,anderson,WF:利用逆轉(zhuǎn)錄酶病毒來轉(zhuǎn)移和表達(dá)克隆的基因".Biotechniques4(6):504-512,1986.CreggJl，VedvickTS，RaschkeWC:在Pichiapastoris中表達(dá)外源基因的進(jìn)展，Bio/Technology11;905-910,1993.Culver,1998.用來修復(fù)人ADA基因突變的位點(diǎn)介導(dǎo)的重組.(Abstract)AntisenseDNA&RNAbasedtherapeutics,Febrary，1998，Coronado,CA.Hutsonetal,1991"單鏈Fv類似物和融合蛋白的蛋白質(zhì)工程"inMethodsinEnzymology(JJLangone，ed.;Academicpress,NewYork,NY)203:46-88.JohnsonandBird,1991"單克隆抗體單鏈fvb衍生物的構(gòu)建以及它們?cè)诖竽c桿菌中的表達(dá)，'inMethodsinEnzymology(JJLangone，ed.;Academicpress,NevYork，NY)203:88-89.MemaughandMernaugh,1995"嗟菌體展示的重組抗體概觀"inMolecularMethodsinplantPathology(RPSinghandUSSingh,eds.;CRCPressInc.,BocaRaton,FL)pp.359—365.2權(quán)利要求1.促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的方法，它包括對(duì)需要進(jìn)行神經(jīng)發(fā)生促進(jìn)的患者給藥治療劑量的氧化氮供體。2.促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的化合物，包括足以促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的有效劑量的氧化氮供體。3.包括包含在藥物上可接受的載體中的氧化氮供體的神經(jīng)發(fā)生促進(jìn)劑。4.權(quán)利要求3中的神經(jīng)發(fā)生促進(jìn)劑，其中該氧化氮供體增強(qiáng)了組織中的氧化氮。5.權(quán)利要求4中的神經(jīng)發(fā)生促進(jìn)劑，其中該氧化氮供體是選自基本上由磷酸二酯酶和L-精氨酸組成的組。6.增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的方法，它是通過對(duì)需要這種增強(qiáng)作用的位點(diǎn)給藥以有效劑量的氧化氮供體。7.提高神經(jīng)功能的方法，它是通過對(duì)患者給藥以有效劑量的氧化氮供體來實(shí)現(xiàn)的。8.提高認(rèn)知功能和神經(jīng)功能的方法，它是通過對(duì)患者給藥以有效劑量的氧化氮供體來實(shí)現(xiàn)的。全文摘要本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生的氧化氮供體。本發(fā)明提供了促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的方法，它可通過對(duì)需要促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的患者給藥以治療劑量的氧化氮供體來達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的目的。并且對(duì)于促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生來講，本發(fā)明也提供了一種化合物，它含有足以促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的劑量的氧化氮供體。也提供了可促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的氧化氮化合物。此外，本發(fā)明也提供了一種方法，它通過對(duì)需要進(jìn)行增強(qiáng)的位點(diǎn)給藥以有效劑量的氧化氮供體就可增強(qiáng)腦細(xì)胞的產(chǎn)生和加快細(xì)胞結(jié)構(gòu)和受體的改變。本發(fā)明還提供了一種方法，它可通過對(duì)患者給藥以有效劑量的氧化氮供體來提高患者的神經(jīng)功能和認(rèn)知功能。文檔編號(hào)A61K31/00GK101310772SQ20081009037公開日2008年11月26日申請(qǐng)日期2000年6月14日優(yōu)先權(quán)日1999年6月14日發(fā)明者M(jìn)·喬普,張瑞蘭申請(qǐng)人:亨利福特保健系統(tǒng)公司