專利名稱：一種基于樹(shù)形聚合物肝靶向抗癌納米前藥系統(tǒng)、制備及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于樹(shù)形聚合物肝靶向抗癌納米前藥系統(tǒng)，提供了該前藥系 統(tǒng)的制備方法及用途，屬生物醫(yī)藥技術(shù)和納米醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤是繼心血管疾病之后影響人類(lèi)健康乃至生命的最嚴(yán)重的疾病之一，患惡 性腫瘤的病人死亡率一直居高不下，尤其是肝癌。目前藥物療法是癌癥患者的主 要治療方法之一。通常情況下，化學(xué)藥物和放射藥物的選擇性不高,在治療中出現(xiàn) 明顯的毒副作用。臨床上所用的抗腫瘤藥物一般為小分子藥物,其特點(diǎn)是除了殺 死癌細(xì)胞外,對(duì)正常的細(xì)胞也有較大的毒副作用。此外小分子藥物還有代謝快、 半衰期短等缺點(diǎn)。為了提高肝癌治療效果，新的肝癌治療藥物的發(fā)現(xiàn)或現(xiàn)有肝癌 治療藥物療效，選擇性和生物利用度的提高成為改善肝癌臨床治療效果的關(guān)鍵。1906年Enrililich首次提出藥物選擇性地分布于病變部位以降低其對(duì)正常組 織的毒副作用，使病變組織的藥物濃度增大，從而提高藥物利用率這一靶向給藥 的概念。此后靶向藥物的載體材料一直吸引了醫(yī)藥工作者的興趣。其中納米粒子 以其特有的優(yōu)點(diǎn)是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外一個(gè)極為重要的研究熱點(diǎn)。特定設(shè)計(jì)的納米載體所具有的獨(dú)特理化性質(zhì)及生物學(xué)代謝行為幾乎可以滿足藥物載體所必須具備的各項(xiàng)功能。除了納米載體尺度比人體組織細(xì)胞還要小，具有異常的細(xì)胞通透性，一定粒徑的納米載體微粒具有能被組織或細(xì)胞選擇性代謝的特性之外，納米微粒的表面結(jié)構(gòu)也是影響納米微粒在血液中的穩(wěn)定性和體內(nèi)分布的重要因素，親水不帶電的表面結(jié)構(gòu)不會(huì)產(chǎn)生血紅蛋白的吸附，有利于延長(zhǎng)納米微粒在血液中的循環(huán)時(shí)間，并可避免納米微粒被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)非選擇性吞噬，從而可實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向的目的。藥物的靶向治療是增加藥物特異性、提高療效、減少對(duì)其他組織損傷的重要 措施。存在于哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞膜上的無(wú)唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein -receptor, ASGP -R)是一種肝結(jié)合蛋白(hepaticbindingprotein， HBP)，能專一性 識(shí)別分子末端帶有半乳糖殘基的糖蛋白并與之結(jié)合。半乳糖介導(dǎo)的專一性識(shí)別及 胞吞過(guò)程可以把配體上連接各種藥物、酶或基因定向作用于肝細(xì)胞，從而降低對(duì) 其它臟器的毒副作用。研究表明，半乳糖介導(dǎo)的肝靶向給藥系統(tǒng)是最具研究?jī)r(jià)值 和應(yīng)用前景的主動(dòng)肝靶向給藥系統(tǒng)之一。樹(shù)枝鏈大分子(Dendrimer)是近年來(lái)出現(xiàn)的一類(lèi)新型納米級(jí)的合成高分子,它 們?nèi)S高度枝化、精確的分子結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的單分散特性為這類(lèi)化合物帶來(lái)一系列 不同尋常的性質(zhì)和行為,如分子表面極高的官能團(tuán)密度,分子的球狀外形和分子內(nèi) 部的廣闊的空腔。樹(shù)枝鏈大分子特殊的結(jié)構(gòu)使其在作為藥物載體方面具有誘人的 應(yīng)用前景,它內(nèi)部的大量空腔可以用來(lái)包裹小分子藥物,并在一定條件下使它們得 到可控釋放。同時(shí),樹(shù)枝鏈大分子的高密度的末端官能團(tuán)能與小分子藥物反應(yīng),使 小分子藥物通過(guò)可以生物分解的化學(xué)鍵結(jié)合在大分子上，從而達(dá)到緩釋的效果。 另外,通過(guò)對(duì)樹(shù)枝鏈大分子進(jìn)行表面修飾,如引進(jìn)不同的陰離子、陽(yáng)離子、疏水基 團(tuán)或親水基團(tuán),可以改變和提高其生物相容性、生物利用度和靶向性。阿霉素是一種廣譜抗腫瘤藥，對(duì)機(jī)體可產(chǎn)生廣泛的生物化學(xué)效應(yīng)，具有強(qiáng)烈 的細(xì)胞毒性作用。其作用機(jī)理主要是嵌入DNA而抑制核酸的合成，抗瘤譜較廣， 對(duì)多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對(duì)各種生長(zhǎng)周期的腫瘤細(xì)胞都有殺 滅作用。研究表明，細(xì)胞質(zhì)和體液pH值為7.4，而內(nèi)涵體、溶酶體等細(xì)胞器的pH值顯 酸性(5.0<pH<6.5)。水溶性聚多胺(如聚酰胺-酰亞胺樹(shù)型聚合物(PAMAM)) 由于"質(zhì)子海綿效應(yīng)"能促使溶酶體膜破裂的特點(diǎn)(說(shuō)明聚多胺由于分子中含有 多級(jí)胺(如1級(jí)、2級(jí)、3級(jí)胺)，有"質(zhì)子海綿"的功能，當(dāng)其進(jìn)入溶酶體后在質(zhì)子 泵作用下吸收質(zhì)子(H+)的同時(shí)帶入反離子，使溶酶體中離子濃度加大，滲透壓 加大，水份進(jìn)入，從而使溶酶體膜破裂，使藥物逃逸溶酶體)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一類(lèi)對(duì)肝癌細(xì)胞具有靶向性的，只能在溶酶體酸性環(huán)境 中降解釋藥，并能幫助藥物克服溶酶體膜屏障而進(jìn)入藥物發(fā)生作用的場(chǎng)所(細(xì)胞核)的新一代智能納米聚合物藥物載體系統(tǒng)。本發(fā)明的又一目的在于提供一種對(duì)肝癌細(xì)胞具有靶向性的新一代智能納米 聚合物藥物載體系統(tǒng)的制備方法和用途。本發(fā)明提供的基于樹(shù)形聚合物肝靶向抗癌納米前藥系統(tǒng)由三個(gè)功能部分組 成(l)遠(yuǎn)端連肝癌細(xì)胞導(dǎo)向半乳糖基的聚乙二醇親水鏈段為納米粒的殼層；(2) 化療藥物(如阿霉素)共價(jià)連接在促使溶酶體膜破裂的水溶性樹(shù)枝鏈聚合物鏈段 上組成疏水部分作為納米顆粒的核層；(3)化療藥物與載體間的溶酶體可降解(酸 可降解)的連接鍵。通式為T(mén)-PEG—PAMAM—(DOX)n其中T為D-半乳糖，乳糖或肝癌靶向肽；'PEG為分子量為1000 ~ 10000Da 的聚乙二醇；PAMAM為樹(shù)狀支化系列代數(shù)聚合物；DOX為阿霉素；n為2的整 數(shù)次方(n為2~64);顆粒粒徑為40 150nm。4用結(jié)構(gòu)式可以表示如下CH2CH2COH,ox ZcH2CH2COH,oxh oh hho, oh。h J c_0oho h ohCH2CH20CH2CH2CONHCH2CH2N,CH2CH2COH,ox-CH2CH2'Nn CH2CH2CONHCH2CH2N、CH2CH2CONHCH2CH2N;CH2CH2COH,(w\ 、CH2CH2COH,ox ^^V^]^^軍CH2CH2CONHCH2CH2N、1HO\CH2CH2COH,ox、--〉oh CH2CH2CH2OHNN=^pHdox+《OH 、H \本發(fā)明提供的基于樹(shù)形聚合物肝靶向抗癌納米前藥系統(tǒng)的制備方法，步驟如下第一步聚乙二醇(PEG)鏈一端連接半乳糖(Gal)靶向基團(tuán)，另一端發(fā)散法， 反復(fù)和丙烯酸甲酯(MA)邁克爾加成，再和乙二胺(EDA)胺解，得到半數(shù)代 端基為甲酯基的樹(shù)形聚合物(T-PEG-PAMAM)。對(duì)于以上反應(yīng)有兩種途徑A:以一端氨基、 一端羥基的單取代聚乙二醇胺(HO-PEG-NH2)為核，端 氨基發(fā)散法反復(fù)和MA邁克爾加成，再和EDA胺解，得到半數(shù)代端基為甲酯基 的樹(shù)形聚合物(HO-PEG-PAMAM)。另一端羥基縮合接上T靶向基團(tuán) (T-PEG陽(yáng)PAMAM);B: PEG兩端羥基，經(jīng)SOCl2氯代，NaN3疊氮化，三苯基磷氫化還原為兩端 氨基的聚乙二醇二胺(NH2-PEG-NH2)，再用Boc酸酐單保護(hù)氨基，通過(guò)硅膠柱層 析色譜分離純化得到單Boc酸酐保護(hù)聚乙二醇胺(并將未反應(yīng)的聚乙二醇二胺回 收再利用)，然后以一端未保護(hù)氨基和縮合連接上T靶向基團(tuán)。用三氟乙酸(TFA) 脫Boc保護(hù)，得到含靶向基團(tuán)T的T-PEG-NH2,再以這個(gè)端氨基為核發(fā)散法，反 復(fù)和丙烯酸甲酯(MA)邁克爾加成，再和乙二胺(EDA)胺解，得到半數(shù)代端 基為甲酯基的樹(shù)形聚合物(T-PEG-PAMAM)。'其中從聚乙二醇到合成該體系另一主體聚乙二醇二胺的合成路線如下PEG S0Cl2 Pyridine， C卜PEG.CI sodium azide， N3-PEG_N3^^Boc anhydrideH2N-PEG-NH2-^- Boc-NH-PEG-NH2triethylamine第二步將第一步得到的端基為大量甲酯基樹(shù)形聚合物和水合肼肼解反應(yīng)，得到大量的酰肼基團(tuán)，再和阿霉素(dox)反應(yīng)，葡聚糖G-50凝膠色譜純化得到5目標(biāo)產(chǎn)物T-PEG—PAMAM—(DOX)n 。本發(fā)明提供的基于樹(shù)形聚合物肝靶向抗癌納米前藥系統(tǒng)的制備方法可表示 如下HO-CH9CCH2CH2NH2 H2C=CHCOOCH3> H2N NH2 >CH3OHCH,OHCH2CH2CONHCH2CH2N'1CH2CH2CONHCH2CH2N^CH2CH2CONHCH2CH2N、HO-.CH2CH20■ch2ch2—nCH2CH2CONHCH2CH2N、、ch2CH2CONHCH2CH2NCH2CH2CONHCH2CH2N PEG-N-Dendrimer(G2.5),CH2CH2COOCH3CH2CH2COOCH3 ,CH2CH2COOCH3CH2CH2COOCH3 CH2CH2COOCH3、CH2CH2COOCH3 ,CH2CH2COOCH3CH2CH2COOCH3H H H OHHCOOHSuOH,DCCfc PEG-N-Dendrimer(G2s)CH2CH2CONHCH2CH2N',CH2CH2COOCH3CH2CH2CONHCH2CH2NzCH2CH2CONHCH2CH2M\CH2CH2COOCH3.CH2CH2COOCH3GalCOO--CH2CH20 -CH2CH2_N,CH2CH2CONHCH2CH2N、、ch2CH2CONHCH2CH2NGal-PEG-G2.5CH2CH2CONHCH2CH2N\CH2CH2COOCH3 CH2CH2COOCH3■CH2CH2COOCH3 CH2CH2COOCH3■CH2CH2COOCH3Gal-PEG-G2.5.H2N=NH2-H20， C恥H 'GalCOO'CH2CH20'CH2CH2COHNNH2 /'CH2CH2CONHCH2CH2NT' y ,CH2CH2COHNNH2,CH2CH2CONHCH2CH2N〈CH2CH2C圃CH2CH2N、CH2CH2COHNNH2CH2CH2'NCH2CH2CONHCH2CH2N、、CH2ch2conhch2ch2n-CH2CH2COHNNH2、CH2CH2COHNNH2 iDH2CH2CONHCH2CH2N、、、CH2CH2COHNNH2bH2CH2COHNNH2Doxombicin(Dox)> CH2CH2COHNNDoxZcH2CH2COHNNDox CH2CH2CONHCH2CH2N ' zCH2CH2COHNNDoxzCHzCHsCONHCHaCH^'CHsCHsCONHCHsCHzNNcKCHsCOHNNDox■CH2CH2-N11 CH2CH2CONHCH2CH2N\、CH2CH2CONHCH2CH2N-CH2CH2COHNNDOX\ 、CH2CH2COHNNDox ^"~可酸降解CH2CH2CONHCH2CH2N、\CH2CH2COHNND。x、HU〉CH2CH2CH20HNN=^=^ph、—，、0，H2 ,、 C^OHGalCOOCH2CH20該智能納米藥物載體的顯著效果在于其一，聚乙二醇為聚合物納米顆粒的 殼層，保證了納米微粒在血液中能夠長(zhǎng)效循環(huán)；其二，聚乙二醇遠(yuǎn)端的肝癌細(xì)胞 耙向半乳糖基，一方面可通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)聚合物納米顆 粒的吞噬作用，另一方面可將治療藥物選擇性地運(yùn)送到肝腫瘤部位，定向殺傷肝 腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝部腫瘤細(xì)胞水平的主動(dòng)耙向；其三，通過(guò)改變聚乙二醇的分 子量，以及樹(shù)形聚合物的代數(shù)來(lái)控制載藥量，和該大分子納米前藥的粒徑大小來(lái) 達(dá)到被動(dòng)耙向目的；其四，納米顆粒通過(guò)細(xì)胞吞噬作用克服細(xì)胞膜屏障后，首先 進(jìn)入內(nèi)涵體、溶酶體等細(xì)胞器，由于內(nèi)涵體、溶酶體等細(xì)胞器的pH值顯酸性(5.0 <pH<6.5)，治療藥物與載體間的連接鍵發(fā)生酸催化降解，釋放出治療藥物和促 使溶酶體膜破裂的樹(shù)枝鏈聚合物鏈段，隨著溶酶體膜的破裂，化療藥物阿霉素逃 逸溶酶體，進(jìn)入發(fā)揮治療作用的場(chǎng)所——細(xì)胞核，從而能最大限度地降低阿霉素 等細(xì)胞毒類(lèi)藥物治療肝癌的毒副作用，提高現(xiàn)有肝癌治療藥物的臨床療效和生物 利用度，可望克服目前肝癌臨床治療效果不理想的瓶頸，具有巨大應(yīng)用前景。


圖l、 PAMAM半數(shù)代甲酯基和整數(shù)代伯胺基間隔變化紅外譜圖，端胺基、甲酯 基呈周期性變化。圖2、 Gal-PEG-PAMAM紅外譜圖，對(duì)比HO-PEG-PAMAM可以看到半乳糖基使 得羥基峰所占比例增大很多。圖3、 Gal-PEG-PAMAM半代端甲酯基氨解后核磁譜圖。 圖4、 Gal-PEG-PAMAM-dox紅外表征。 圖5、 Gal-PEG-PAMAM-dox核磁表征。圖6、 Gal-PEG-PAMAM-dox紫外表征，和dox對(duì)比可以看出在低波長(zhǎng)處，阿霉 素的吸收峰被PEG的吸收峰掩蓋。圖7、該聚合物前藥在稀溶液中的動(dòng)態(tài)光散射表征，包括粒徑和Zeta電位的表征，可以看出單分散性很好。圖8C1-PEG-C1紅外表征。圖9 N3-PEG-N3紅外表征。圖10H2N-PEG-NH2紅外表征。圖11 Boc-N-PEG-NH2紅外表征。圖12.智能納米聚合物藥物載體系統(tǒng)示意圖具體實(shí)施方式
下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于此。 其中HO-PEG-NH2購(gòu)于美國(guó)Laysan公司，PEG、 TFA購(gòu)于國(guó)藥試劑公司， Boc酸酐購(gòu)于上海吉爾生化有限公司，半乳糖酸購(gòu)于aldrich公司，NaN3、三苯 基磷購(gòu)于阿法埃莎公司，葡聚糖凝膠G-50購(gòu)于上海摩速科學(xué)器材有限公司，水 為三次蒸餾水，其余試劑為市售AR試劑。用BRUKER AVANCE 500核磁共振儀(NMR)對(duì)Gal-PEG-PAMAM-dox的結(jié) 構(gòu)進(jìn)行了表征。用亞研電子有限公司的紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)UV1900PC對(duì) Gal-PEG-PAMAM-dox進(jìn)行了表征。用英國(guó)MARLVEN公司Zetasizer3000HS型 激光粒度散射儀，對(duì)本發(fā)明基于樹(shù)形聚合物的大分子靶向抗癌納米前藥的粒徑及 粒徑分布進(jìn)行表征，測(cè)試時(shí)的溫度為25°C，入射激光的波長(zhǎng)為633nm，其偏振 方向與散射檢測(cè)光平面垂直。實(shí)施例l:1. HO-PEG-PAMAM的合成將0.1732g(0.0507mmol)分子量為3400的單取代聚乙二醇胺(HO-PEG-NH2) 溶于無(wú)水甲醇中，加入0.913ml (lO.lmmol)丙烯酸甲酯(MA)， 25'C避光反應(yīng) 72小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)絕大部分溶劑，后溶于少量甲醇中，在大量無(wú)水乙醚中重沉淀，離心分離沉淀并真空干燥得到半數(shù)代0.5代(00.5);再Ga5溶于無(wú)水甲醇中，加入1.352ml (20.2mmo1)乙二胺(EDA) ,25。C反應(yīng)72小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)絕大部 分溶劑，后溶于少量甲醇中，在大量無(wú)水乙醚中重沉淀，離心分離沉淀并真空干 燥得到1.0代(Glo);再將Glo溶于無(wú)水甲醇中，加入3.651ml (40.4mmo1) MA,25'C避光反應(yīng)96小時(shí)，后處理純化如同Go.5，得到1.5代(Gl5);再將Gls溶于 無(wú)水甲醇中，加入2.705ml (40.4mmo1)乙二胺(EDA) ,25。C反應(yīng)96小時(shí)，后 處理純化如同G10，得到2.0代(G2.o);再將G2.o溶于無(wú)水甲醇中，加入7.301 ml (80.8mmol)MA, 25。C避光反應(yīng)120小時(shí)，后處理純化如同GQ.5，得到2.5代(。2.5) HO-PEG-PAMAM。2. Gal- PEG-PAMAM的合成取0.0145g (0.0404mmo1)半乳糖酸溶于無(wú)水DMF中，氮?dú)獗Ｗo(hù)冰鹽浴冷卻 至-15。C -20。C，加入0.0125g (0.0606mmo1) N,N，-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC), 于-15。C攪拌反應(yīng)20min后，升至-5'C反應(yīng)15min,然后加入0.0047g(0.0404mmo1) N-羥基琥珀酰亞胺，于-5'C攪拌反應(yīng)lh，在室溫下攪拌反應(yīng)lh，再加入HO-PEG -PAMAM 0.1928g (0.0404mmo1)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h，將溶劑DMF旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除 去，再加入水溶解，過(guò)濾去不溶物，將濾液用截留分子量為1000的透析72h后 冷凍干燥。蒽酮比色法鑒定半乳糖基團(tuán)被連接上，紅外譜圖中羥基峰加強(qiáng)(與其 他官能團(tuán)特征峰面積比例)3. Gal- PEG-PAMAM-dox的合成取0.0442g(0.0087mmol)的Gal- PEG-PAMAM溶于無(wú)水甲醇，加入0.3353mL (6.921 mmol)的水合肼，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)72h。然后將溶劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 除去，殘留物再用無(wú)水甲醇溶解，在無(wú)水乙醚中重沉淀，沉淀物真空干燥后溶于 無(wú)水甲醇中，加入0.0481g (0.0831mmo1)的阿霉素(dox)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫避 光攪拌反應(yīng)168h，再將溶劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去，溶于水中用葡聚糖凝膠G-50分離產(chǎn) 物得到Gal- PEG-PAMAM-dox。用紅外核磁紫外進(jìn)行了對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了表征和紫外 可見(jiàn)分光光度計(jì)表征。并通過(guò)測(cè)一組不同濃度的阿霉素在波長(zhǎng)495nm處阿霉素 特征吸峰的吸光度值作標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)定量測(cè)得大分子量前藥Gal-PEG-PAMAM-dox的阿霉素含量8.25% (線性相關(guān)系數(shù)為0.998633)。用動(dòng)態(tài)光 散射測(cè)的Gal- PEG-PAMAM-dox的粒徑和Zeta電位。實(shí)施例2: NH2-PEG-NH2的合成PEG—C1-PEG國(guó)C1取PEG-IOOO (10.3g, 10.3mmol)溶于甲苯(250mL)，油水分離器共沸除水。 加入新鮮蒸餾的吡啶(0.83mL, 10.3mmol)和二氯亞砜(7.3mL, 103mmol) ，75°C 回流12h,冷卻至室溫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除絕大部分溶劑，再溶于二氯甲烷,用無(wú)水碳酸 鉀干燥處理12h，過(guò)濾，將濾液再用中性三氧化二鋁(20g， 12(TC活化2h)吸附 處理，過(guò)濾，將濾液濃縮后用乙醚沉淀，并用二氯甲烷溶解，乙醚重沉淀一次， 離心，真空干燥。C1-PEG-C1—N3-PEG-N3取Cl-PEG-Cl(7g, 6.8mmo1)溶于DMF ( 20mL )， 加入疊氮化鈉9(7.7g,118mmo1) ,70'C回流攪拌24h。反應(yīng)液冷卻至室溫后過(guò)濾，旋蒸除絕大部 分DMF,再溶于二氯甲垸，過(guò)濾，濃縮濾液后，用乙醚沉淀，真空干燥。 N3-PEG-N3—H2N-PEG-NH2取N3-PEG-N3 (2.5g, 2.4纖o1)溶于THF (20mL)，加入三苯基磷(l,9g, 7.1mmol)，加入三重蒸餾水(127.5 uL,7.1mmo1)。 50。C氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流36h,旋蒸 除大部分有機(jī)溶劑，溶解三重蒸餾水中，4'C靜置12h,過(guò)濾，濾液濃縮后，冷凍 干燥。H2N-PEG-NH2—Boc-N-PEG-NH2取H2N-PEG-NH2(2.1g, 2.1mmol)溶于20mL 二氯甲烷。再取Boc酸酐(48L2 u L， 2.1mmoD ，溶于20mL 二氯甲烷，然后6h內(nèi)緩慢滴加入上述H2N-PEG-NH2 溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢?2h,濃縮后乙醚中沉淀，離心，真空干燥，200-400 目硅膠柱層析分離產(chǎn)物，洗脫液為氯仿/二氯甲烷。實(shí)施例3: T-PEG-NH2中T靶向基團(tuán)為半乳糖基的半乳糖基聚乙二醇胺 Gal-PEG-NH2的合成1.單Boc保護(hù)聚乙二醇二胺(Boc-PEG-NH2)的合成取2.0922g (2.0922mmol) NH2-PEG-NH2溶于50mL 012<:12，再將0.4812mL (2.0922mmol) 二碳酸二叔丁酯(Boc酸酐)禾B 0.6956 mL (4.8121mL)三乙胺 (Et3N)溶于50 mL CH2C12在30。C氮?dú)獗Ｗo(hù)下滴加入上述NH2-PEG-NH2溶液， 反應(yīng)48h后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去絕大部分溶劑，再溶于少量CH2Cl2并在乙醚中重沉淀， 離心后將固體真空干燥，然后通過(guò)硅膠柱層析色譜分離提純，淋洗劑為 CHCl3/CH30H,比例為16/1。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去絕大部分溶劑后真空干燥產(chǎn)物。 2半乳糖基聚乙二醇胺(Gal-PEG-NH2)的合成取0.1778g (0.4%6mmol)半乳糖酸溶于無(wú)水DMF中，氮?dú)獗Ｗo(hù)冰鹽浴冷卻 至-15。C -20。C，加入0.1024g (0.4966mmol) N,N，-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC), 于-15。C攪拌反應(yīng)20min后，升至O'C反應(yīng)15min,然后加入0.0572g(0.4966mmo1) N-羥基琥珀酰亞胺，于(TC攪拌反應(yīng)lh，在室溫下攪拌反應(yīng)12h,再加入Boc-PEG-NH2 0.4966g (0.4573mmol)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h，將溶劑DMF旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去， 再加入水溶解，過(guò)濾去不溶物，將濾液濃縮后用截留分子量為1000的透析72h 后冷凍干燥。實(shí)施例4:同實(shí)施例1的試驗(yàn)方法，固定PEG的分子量為3400，改變PAMAM的代數(shù)， 分別合成0.5代、1.5代、2.5代、3.5代、4.5、 5.5代，實(shí)測(cè)載藥量隨代數(shù)的增加 而增加，而粒徑也隨之增加，發(fā)現(xiàn)釆用2.5代的PAMAM制得的肝耙向抗癌納米 前藥系統(tǒng)粒徑合適，粒徑分布均勻，適合作為肝靶向載藥系統(tǒng)。并可以預(yù)見(jiàn)根據(jù) 生物醫(yī)學(xué)需要改變納米大分子前藥的性質(zhì)。10實(shí)施例5:同實(shí)例1的試驗(yàn)方法，固定PAMAM的代數(shù)為2.5代，改變PEG的分子量， 分別釆用分子量為1000、 2000、 3400、 5000、 10000合成該樹(shù)形聚合物前藥，發(fā) 現(xiàn)該納米大分子前藥粒徑變化明顯，隨分子量的增加而增加，發(fā)現(xiàn)采用分子量為 3400的PEG制得的肝靶向抗癌納米前藥系統(tǒng)粒徑合適，粒徑分布均勻，適合作 為肝靶向載藥系統(tǒng)。并可以預(yù)見(jiàn)根據(jù)生物醫(yī)學(xué)需要改變納米大分子前藥的性質(zhì)。在上述實(shí)施例中，制得了粒徑為40 150nm，的基于樹(shù)形聚合物肝耙向抗癌 納米前藥系統(tǒng)。上述實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明但并不局限于此，應(yīng)該理解在不脫 離本發(fā)明的精神范圍內(nèi)還可有多種變通或替換方案。
權(quán)利要求
1.一種基于樹(shù)形聚合物肝靶向抗癌納米前藥系統(tǒng)，其特征在于結(jié)構(gòu)通式為 T-PEG-PAMAM-(DOX)n其中T為D-半乳糖，乳糖或肝癌靶向肽；PEG為分子量為1000～10000Da的聚乙二醇；PAMAM為樹(shù)狀支化系列代數(shù)聚合物；DOX為阿霉素；n為2的整數(shù)次方(n為2～64)；顆粒粒徑為40～150nm。
2. 如權(quán)利要求1所述的基于樹(shù)形聚合物肝靶向抗癌納米前藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于步驟如下第一步以單取代聚乙二醇胺(HO-PEG-NH2)為核，氨基端用發(fā)散法反復(fù)和 丙烯酸甲酯(MA)邁克爾加成，再和乙二胺(EDA)胺解，得到半數(shù)代端基為甲 酯基的樹(shù)形聚合物(HO-PEG-PAMAM);羥基端和T縮合接上Gal靶向基團(tuán)，得 T-PEG-PAMAM;第二步將第一步得到的Gal-PEG-PAMAM和水合肼肼解反應(yīng)，得到大量的酰 肼基團(tuán)，再和阿霉素(dox)反應(yīng)，純化得T-PEG_PAMAM_(DOX)n。
3. 如權(quán)利要求2所述的基于樹(shù)形聚合物肝靶向抗癌納米前藥系統(tǒng)的制備方法， 其特征在于第一步T-PEG-PAMAM的制備途徑為PEG兩端羥基，經(jīng)SOCl2氯代， NaN3疊氮化，三苯基磷氫化還原為兩端氨基的聚乙二醇二胺(NH2-PEG-NH2),再用 Boc酸酐單保護(hù)氨基，純化得到單Boc酸酐保護(hù)聚乙二醇胺，然后以一端未保護(hù)氨 基和T縮合連接上T靶向基團(tuán)；用三氟乙酸(TFA)脫Boc保護(hù)，再以這個(gè)端氨基 為核發(fā)散法，反復(fù)和丙烯酸甲酯(MA)邁克爾加成，再和乙二胺(EDA)胺解， 得T-PEG-PAMAM 。
4. 如權(quán)利要求2或者3中所述的基于樹(shù)形聚合物肝靶向抗癌納米前藥系統(tǒng)的制 備方法，其特征在于T為D-半乳糖，乳糖或肝癌靶向肽。
5. —種基于樹(shù)形聚合物靶向抗癌納米前藥系統(tǒng)在制備治療抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
6. —種基于樹(shù)形聚合物肝靶向抗癌納米前藥系統(tǒng)在制備治療抗肝腫瘤藥物中 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于樹(shù)形聚合物肝靶向抗癌納米前藥系統(tǒng)，提供了制備該前藥系統(tǒng)方法及其用途，屬生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，也屬于納米醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明是以遠(yuǎn)端帶肝靶向基團(tuán)(T)的聚乙二醇修飾PAMAM樹(shù)狀聚合物為載體(T-PEG-PAMAM)，以阿霉素(DOX)作為治療藥物，載體與阿霉素之間通過(guò)溶酶體可降解的共價(jià)鍵連接而得前藥(T-PEG-PAMAM-DOX)。本發(fā)明還提供了一種基于樹(shù)形聚合物肝靶向抗癌納米前藥系統(tǒng)在制備治療實(shí)體腫瘤藥物中的應(yīng)用。該發(fā)明在血液中能夠長(zhǎng)效循環(huán)，并能增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)聚合物納米膠束的吞噬作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝部腫瘤組織的主動(dòng)與被動(dòng)靶向，提高了現(xiàn)有肝癌治療藥物的臨床療效和生物利用度，降低毒副作用。
文檔編號(hào)A61K31/704GK101259284SQ20081003604
公開(kāi)日2008年9月10日 申請(qǐng)日期2008年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月15日
發(fā)明者余家會(huì), 劉順英, 羅淑芳, 峰 高, 進(jìn) 黃 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)