專利名稱：一種透明質(zhì)酸修飾的新型三元結(jié)構(gòu)非病毒基因傳輸系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)基因治療領(lǐng)域，涉及基因傳輸系統(tǒng)，具體來說涉及一種三元結(jié)構(gòu)的 非病毒基因傳輸系統(tǒng)、制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組計(jì)劃對(duì)人類基因測(cè)序的順利完成，目前己經(jīng)能夠確定許多的先天性或者 后天性疾病的致病基因，這為人類能夠預(yù)防、治療甚至是徹底治愈這些疾病帶來了希望。比 如某些遺傳性疾病的致病基因在發(fā)生畸變后，在個(gè)體自身無法正常修復(fù)的情況下，最佳的辦 法就是將外源性的修復(fù)基因或者治療基因?qū)胫敛∽兗?xì)胞，通過與宿主細(xì)胞核中的染色體DNA
進(jìn)行整合，穩(wěn)定長(zhǎng)效的表達(dá)出相應(yīng)的功能蛋白，最終治療或者治愈各種疾病。基因治療包括 三個(gè)方面的內(nèi)容，即治療基因、基因傳輸載體和標(biāo)靶細(xì)胞，而其中的基因傳輸載體又是基因 治療中最關(guān)鍵的部分。根據(jù)來源的不同，常見的基因傳輸載體可分為病毒和非病毒載體兩大 類。盡管病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，是體內(nèi)基因治療的主要工具，但病毒載體制備工藝復(fù)雜，基 因的有效荷載率低，以及一系列的潛在安全性問題(比如機(jī)體產(chǎn)生免疫原性反應(yīng)等等)，使得 病毒載體的發(fā)展受到限制。而非病毒載體作為新一代的基因傳輸系統(tǒng)，最近10年發(fā)展的很快， 甚至被稱為"人工病毒"。它易于制備和修飾，目的基因荷載量大，免疫原性反應(yīng)也更低。
非病毒載體分為陽離子脂質(zhì)載體和陽離子聚合物載體兩大類。作為第一代的陽離子脂質(zhì) 載體系統(tǒng)，由于它在內(nèi)含體逃逸以及進(jìn)入細(xì)胞核等關(guān)鍵步驟的效果不理想，人們開發(fā)了第二 代的非病毒載體系統(tǒng)——陽離子聚合物(polycation)載體。自從上世紀(jì)90年代報(bào)道聚合物 作為基因載體以來，聚賴氨酸(PLL)，聚乙烯亞胺(PEI)和殼聚糖(Chitosan)等已陸續(xù)成 為多聚物基因載體研究的熱門研究領(lǐng)域。陽離子聚合物不含有陽離子脂質(zhì)體的長(zhǎng)脂肪烷鏈， 它有一些特殊的性質(zhì)，在PEI, PLL等聚合物的骨架單體中含有可質(zhì)子化的氮原子，荷有大 量的正電荷，有很強(qiáng)的濃縮DNA能力和細(xì)胞黏附能力，同時(shí)能保護(hù)DNA不被血液調(diào)理素等成 分降解。陽離子聚合物與DNA所形成的polycation/DNA 二元結(jié)構(gòu)復(fù)合物被攝取進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi) 含體后，內(nèi)含體不斷酸化(pH值約為4.5 5.0)，陽離子聚合物中多數(shù)的氨基團(tuán)可被質(zhì)子化(比 如25KDa的PEI表觀pKa值為8.5)，使得陽離子聚合物在內(nèi)含體中有較大的質(zhì)子緩沖能力， 能發(fā)揮"質(zhì)子海綿"作用，最終成功從內(nèi)含體中逃逸，并能促進(jìn)DNA進(jìn)入細(xì)胞核，為提高治療 基因的轉(zhuǎn)染效率提供了前提保障。但是陽離子聚合物與DNA所形成的二元復(fù)合物往往帶有過剩的正電荷，與細(xì)胞表面的 粘附?jīng)]有特異性，而且大量的正電荷也可能給細(xì)胞帶來急性以及延遲的毒副作用。為了解決 陽離子聚合物等非病毒基因傳輸系統(tǒng)的靶向性以及安全性問題，研究人員進(jìn)行了大量的研究。 譬如在陽離子聚合物上連有針對(duì)特定細(xì)胞耙向配體(比如葉酸，轉(zhuǎn)鐵蛋白，半乳糖等等)，提 高polycation/DNA復(fù)合物的靶向攝取能力，或者對(duì)陽離子聚合物用一些親水性物質(zhì)進(jìn)行修飾 (比如PEG)，降低陽離子聚合物外周的正電荷分布，提高復(fù)合物的血槳穩(wěn)定性和降低細(xì)胞毒 性等等。
但是非常遺憾，尚沒有一種非病毒基因傳輸系統(tǒng)同時(shí)兼有靶向性和親水性，且細(xì)胞毒性 較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種同時(shí)具有靶向性和親水 性而且細(xì)胞毒性低的非病毒基因傳輸系統(tǒng)。同時(shí)，本發(fā)明還提供該非病毒基因傳輸系統(tǒng)的制 備方法和應(yīng)用。
我們發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性物質(zhì)透明質(zhì)酸(HyaluronicAcid ， HA)是以葡糖醛酸-N-乙酰氨基葡糖為 雙糖單位組成的直鏈高分子多糖，平均分子量為105 10703 ，廣泛存在于機(jī)體的多種組織。 HA分子中的每一雙糖單位均含有一個(gè)羧基，在生理?xiàng)l件下均可解離成負(fù)離子并可與金屬離 子成鹽(比如說透明質(zhì)酸鈉)，具有水溶性。根據(jù)HA分子量以及濃度的不同，HA分子在生 理?xiàng)l件下的水溶液中形成一定的線團(tuán)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可以附著在細(xì)胞等物體的周圍。而且許多細(xì) 胞表面(比如上皮細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，單核吞噬細(xì)胞等)存在有HA的特異性受體(比如CD44 和RHAMM)，且在肺癌等多種腫瘤細(xì)胞的表面HA的特異性受體CD44也過量表達(dá)，HA可 通過與細(xì)胞表面的HA受體發(fā)生特異性結(jié)合，介導(dǎo)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的移動(dòng)以及吞 飲過程。由于HA具有良好的生物相容性，并同時(shí)具備親水性和一定的靶向性，利用其對(duì)陽 離子聚合物與質(zhì)粒DNA所形成的二元復(fù)合物進(jìn)行適當(dāng)?shù)奈锢硇揎棧梢酝瑫r(shí)解決減少細(xì)胞 毒性和提高靶向性等關(guān)鍵難題。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案
一種非病毒基因傳輸系統(tǒng)，該系統(tǒng)由透明質(zhì)酸(HA)、陽離子聚合物(polycation)和質(zhì) 粒DNA組成，其中含有可質(zhì)子化的氨基單元的陽離子聚合物與含有的可電離的磷酸根離子 的DNA形成二元結(jié)構(gòu)復(fù)合物粒子，然后用含有可以電離的羧基的透明質(zhì)酸進(jìn)行物理修飾形成三元結(jié)構(gòu)復(fù)合物，三者之間通過靜電作用結(jié)合。
所述的透明質(zhì)酸分子量為5~3000KDa，優(yōu)選范圍為10~1500 KDa。
所述的質(zhì)粒DNA是各種含報(bào)告基因、抗癌基因或細(xì)胞因子基因的能在真核細(xì)胞中重組 表達(dá)的質(zhì)粒DNA。
所述陽離子聚合物為含有可質(zhì)子化的氨基的聚合物，選自聚乙烯亞胺、殼聚糖或聚賴氨 酸，聚乙烯亞胺的分子量為1.8-100 KDa(優(yōu)選范圍為1.8-25 KDa)，殼聚糖的分子量為5-200 KDa (優(yōu)選范圍為10~100 KDa)，聚賴氨酸的分子量為1~200 KDa (優(yōu)選范圍為2~100 KDa)。
本發(fā)明的非病毒基因傳輸系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟將透明質(zhì)酸、陽離子聚合物
和質(zhì)粒DNA分別用適當(dāng)溶媒溶解，配制成所需濃度的溶液，陽離子聚合物與質(zhì)粒DNA的按 合適的比例混勻，陽離子聚合物和DNA通過靜電作用力自組裝形成二元結(jié)構(gòu)復(fù)合物溶液， 然后按照合適的比例加入透明質(zhì)酸溶液，混勻后即得三元結(jié)構(gòu)的微^t。
所適當(dāng)溶媒選自磷酸鹽緩沖溶液、氯化鈉溶液、葡萄糖溶液或HBS緩沖液，溶媒pH 值5.0-9.0;透明質(zhì)酸、陽離子聚合物和質(zhì)粒DNA的濃度為0.1 10 mg/ml;陽離子聚合物與 DNA的N/P比例(陽離子聚合物中氮原子與DNA中磷酸根的摩爾比例)為0.01-100;透明 質(zhì)酸與陽離子聚合物的重量比(w/w)為0.05-50;陽離子聚合物與質(zhì)粒DNA室溫下混勻后 靜置15 60min，后與透明質(zhì)酸溶液混勻后靜置15~60min。所得微粒粒徑在2微米以下。
其中優(yōu)選的陽離子聚合物與DNA的N/P為1~50，透明質(zhì)酸與陽離子聚合物的重量比 (w/w)為1~20。
本發(fā)明提供的非病毒基因傳輸系統(tǒng)可以用在轉(zhuǎn)染包括人體以及動(dòng)物來源的內(nèi)皮細(xì)胞、上 皮細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明提供的非病毒基因傳輸系統(tǒng)用于制備基因治療藥物。
本發(fā)明提供的非病毒基因傳輸系統(tǒng)的給藥方法，可采用口服、注射或者粘膜途徑給藥， 進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。
本發(fā)明通過透射電鏡(TEM)以及動(dòng)態(tài)光散射(DLS)表征載體與DNA復(fù)合物的形態(tài) 及粒子表面特征，考察其是否能滿足被細(xì)胞內(nèi)吞的要求。具體步驟見實(shí)施例4和5。
本發(fā)明通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該新型的基因傳輸系統(tǒng)對(duì)質(zhì)粒DNA的荷載及包裹效果， 并通過DNA酶解實(shí)驗(yàn)考察該基因傳輸系統(tǒng)對(duì)抗核酸酶降解的能力，進(jìn)而進(jìn)一步驗(yàn)證復(fù)合物 在轉(zhuǎn)染條件下的穩(wěn)定性。具體實(shí)驗(yàn)步驟見實(shí)施例6和7。
本發(fā)明用體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證該新型三元結(jié)構(gòu)非病毒基因傳輸系統(tǒng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染性能。 通過與未加修飾的PE]/DNA 二元復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行對(duì)比，說明該新型基因傳輸系統(tǒng)的靶向性和提高基因轉(zhuǎn)染效率的有效性。具體步驟見實(shí)施例8。
本發(fā)明測(cè)試了載體的細(xì)胞毒性。聚乙烯亞胺細(xì)胞毒性較高，為考察該新型三元結(jié)構(gòu)的非 病毒基因傳輸載體的細(xì)胞毒性，采用MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)試。具體步驟見實(shí)施例9。
本發(fā)明還將該新型三元結(jié)構(gòu)非病毒基因傳輸載體用于動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)，結(jié)果表明該載 體能有效地將目的基因遞送至靶細(xì)胞并能表達(dá)出相應(yīng)的蛋白，發(fā)揮基因治療的作用。具體歩 驟參見實(shí)施例10和11。
木發(fā)明的有益效果包括-
(1) 本發(fā)明的非病毒基因傳輸系統(tǒng)同時(shí)具有靶向性和親水性，細(xì)胞毒性低，大大提高基 因傳輸系統(tǒng)的安全性；
(2) 本發(fā)明提供的非病毒基因傳輸系統(tǒng)能將外源性的治療基因更加有效地導(dǎo)入高表達(dá)有 HA受體的腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織(比如說肺癌和肝癌)，能夠抑制惡性腫瘤的生長(zhǎng)，使得該 新型基因傳輸系統(tǒng)更加具有腫瘤靶向性和腫瘤治療的有效性；
(3) 本發(fā)明提供的聚合物具有廣泛的基因適應(yīng)性，有效荷載的外源DNA大小范圍可以 從幾十bp到幾千kb，克服了病毒載體荷載外源基因量較小的缺點(diǎn)，可用于制備多基因的聯(lián) 合轉(zhuǎn)移以治療腫瘤等疾病的新型基因傳輸載體，同時(shí)也可作為平臺(tái)技術(shù)用于制備治療其他疾 病的基因傳輸系統(tǒng)。
(4) 本發(fā)明提供的非病毒基因傳輸系統(tǒng)制備工藝簡(jiǎn)便可行，無需特殊的儀器設(shè)備，可直 接用于細(xì)胞和動(dòng)物試驗(yàn)。
說明書附圖


圖1是新型的三元結(jié)構(gòu)非病毒基因傳輸系統(tǒng)——HA/polycation/DNA制備后，用TEM觀 測(cè)，所得復(fù)合物的物理形態(tài)和粒子大小。
其屮，A為三元結(jié)構(gòu)復(fù)合物，HA/PEI/DNA=30:3:1
B為二元結(jié)構(gòu)復(fù)合物，PE1/DNA=3:1
圖2是新型的三元結(jié)構(gòu)非病毒基因傳輸系統(tǒng)——HA/polycation/DNA制備后，用DLS測(cè) 定，所得復(fù)合物的粒徑大小。
其中，A為三元結(jié)構(gòu)復(fù)合物，HA/PEI/DNA=30:3:1B為二元結(jié)構(gòu)復(fù)合物，PEI/DNA=3:1
圖3是新型的三元結(jié)構(gòu)非病毒基因傳輸系統(tǒng)——HA/polycation/DNA制備后，凝膠電泳阻 滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖中的點(diǎn)樣順序?yàn)?右起)
HA/PEI/DNA=5:0.5:1， HA/PE1/DNA= 10:1.0:1, HA/PEI/DNA=15:1.5:1,
HA/PEI/DNA=20:2.0:1, HA/PEI/DNA=25:2.5:1， HA/PEI/DNA=30:3.0:1，
HA/PEI/DNA=40:4.0:1, DNA
圖4是HA/polycation/DNA新型的三元結(jié)構(gòu)非病毒基因傳輸系統(tǒng)轉(zhuǎn)染H鄰G2細(xì)胞后熒光 顯微鏡視圖。
其中，A為三元復(fù)合物組，HA/PEI/DNA= 120:12:1; B為陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000組； C為裸DNA組;
D為二元復(fù)合物組，PEI/DNA=12:1。 圖5是MTT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖表，包括PEITHA組和PEI組。
具體實(shí)施例
以下內(nèi)容將結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)充分說明的是，應(yīng)充分說明的是，這 些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。例如本發(fā)明所描述的陽離子聚合物 除聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和殼聚糖外，還應(yīng)包括其他的具有類似性質(zhì)的陽離子聚合物，比如 聚酰胺-胺型分枝狀聚合物(PAMAM)和聚精胺酸等，所述陽離子聚合物的分子量也不應(yīng)局 限于所采用的分T量范圍。作為物理修飾物的透明質(zhì)酸，其分子量范圍也不局限于實(shí)施例中 釆用的范圍，應(yīng)具備更廣闊的選擇尺度，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明 的適用范圍。
實(shí)例1: HA/PE1/DNA三元結(jié)構(gòu)基因傳輸系統(tǒng)的制備
將聚乙烯亞胺，pIRES2-EGFP質(zhì)粒和透明質(zhì)酸用PBS緩沖液配成濃度分別為0.1mg/ml， O.lmg/ml和2mg/ml的溶液。將聚乙烯亞胺溶液與pIRES2-EGFP-p53質(zhì)粒溶液按合適的比例 渦旋混勻10s后，制得PEI/DNA 二元復(fù)合物溶液，室溫放置30min后按合適的比例將透明質(zhì) 酸溶液加入至PEI/DNA二元復(fù)合物溶液中，渦旋10s后，即可得三元復(fù)合物溶液。實(shí)例2: HA/Chitosan/DNA三元結(jié)構(gòu)基因傳輸系統(tǒng)的制備
將殼聚糖適量用PBS溶解，pH值調(diào)至5.0，濃度為O.lmg/ml。將pIRES2-EGFP質(zhì)粒和 透明質(zhì)酸用PBS緩沖液配成濃度分別為O.lmg/ml和2mg/ml的溶液。將殼聚糖溶液與 pIRES2-EGFP質(zhì)粒溶液按合適的比例渦旋混勻10s后，制得Chitosan/DNA 二元復(fù)合物溶液， 室溫放置30min后按合適的比例將透明質(zhì)酸溶液加入至Chitosan/DNA 二元復(fù)合物溶液中，渦 旋10s后，即可得三元復(fù)合物溶液。
實(shí)例3: HA/PLL/DNA三元結(jié)構(gòu)基因傳輸系統(tǒng)的制備
將聚賴氨酸，pIRES2-EGFP質(zhì)粒和透明質(zhì)酸用PBS緩沖液配成濃度分別為0.1mg/ml， O.lmg/ml和2mg/ml的溶液。將聚乙烯亞胺溶液與pEGFP-Cl質(zhì)粒溶液按合適的比例渦旋混 勻10s后，制得PLL/DNA 二元復(fù)合物溶液，室溫放置30min后按合適的比例將透明質(zhì)酸溶 液加入至PEI/DNA二元復(fù)合物溶液中，渦旋10s后，即可得三兀復(fù)合物溶液。
實(shí)施例4: HA/PEI/DNA三元結(jié)構(gòu)基因傳輸系統(tǒng)透射電鏡(TEM)觀察
HA/PEI/DNA三元結(jié)構(gòu)復(fù)合物的大小和形態(tài)可通過負(fù)染透射電鏡檢測(cè)。按 HA/PEI/DNA=50:5:1以及PEI/DNA=5:1的比例分別制備三元和二元結(jié)構(gòu)復(fù)合物，渦旋混合后 室溫靜置30min后，取少量樣品輕輕地滴在專用銅網(wǎng)上。lmin后，將銅網(wǎng)放在醋酸雙氧鈾溶 液(1%, w/w)上染色20s。過量的溶液用吸水紙小心吸除。樣本在JEM-2100透射電子顯微 鏡下觀測(cè)，加速電壓100千伏。三元結(jié)構(gòu)復(fù)合物在電鏡下呈類圓形顆粒狀，稍不規(guī)則，大小 200-250nm左右， 一元結(jié)構(gòu)復(fù)合物呈現(xiàn)類圓形，粒徑在100-150nm左右。表明HA/PE]/DNA 三元結(jié)構(gòu)復(fù)合物的粒徑相比二元復(fù)合物粒子大小要偏大些。(參見圖1)
實(shí)例5: HA/PEI/DNA三元結(jié)構(gòu)基因傳輸系統(tǒng)粒徑測(cè)定和zeta電位測(cè)定
將實(shí)例1中的制備方法，按HA/PE1/DNA-30:3:1以及PEI/DNA=3:1的比例分別制備三元 和二元結(jié)構(gòu)復(fù)合物，室溫靜置20min后，取100u 1復(fù)合物溶液用三次過濾的PBS溶液稀釋到 1000ul，用粒徑和電位測(cè)定儀(Marvern， Nano ZS90)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明三元復(fù)合物的水 合粒徑在400nm左右，二元結(jié)構(gòu)復(fù)合物的水合粒徑在220nm左右(參見圖2)， zeta電位為-17mv 左右。
實(shí)例6: HA/PEI/DNA三元結(jié)構(gòu)基因傳輸系統(tǒng)電泳阻滯試驗(yàn)
按實(shí)例1中HA/PEI/DNA三元結(jié)構(gòu)基因傳輸系統(tǒng)的制備方法，取PEI/DNA的N/P=0，0.5， 1.0， 1.5， 2.0， 2.5, 3.0， 4.0，應(yīng)用PBS (pH=7.4)作為溶媒，分別配制二元復(fù)合物的溶液，室溫下放置20min。在制各二元復(fù)合物的基礎(chǔ)上，按照HA與PEI的質(zhì)量比為10:1加入2mg/ml 的HA溶液(PBS)，使得溶液的總體積為即可制備得到三元結(jié)構(gòu)的復(fù)合物。分別取15pl 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA阻滯情況。電泳條件:0.7%瓊脂糖(含GoldViewer ), 0.5xTBE 緩沖液，電壓90V，電泳時(shí)間90min。結(jié)果表明當(dāng)三元復(fù)合物N/P達(dá)到3時(shí)可將質(zhì)粒DNA完 全阻滯在加樣孔中。(參見圖3)
實(shí)例7: HA/PE1/DNA三元結(jié)構(gòu)基因傳輸系統(tǒng)DNase酶解試驗(yàn)
制備不同N/P/HA比例的PEI/DNA/HA的復(fù)合物，然后在反應(yīng)緩沖液(pH 7.4, 50 mM Tris - HCl， 10 mM NaCl, 10 mM CaCl2， 6 mM MgCl2)中加入1 unit/ u g of DNase I， 37 °C下孵 育lh。孵育后，每個(gè)樣品中加入10iiL的EDTA(0.1M)，溶液同時(shí)在80°C卜加熱lOmin， 將DNase I滅活。最后加入30uL的肝素(10mg/ml)，渦旋15min將DNA從三元復(fù)合物 中競(jìng)爭(zhēng)解聚出來，隨后進(jìn)行電泳阻滯實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明當(dāng)N/P/HA比例在3:1:30時(shí)，三元復(fù)合 物便能保護(hù)DNA不被DNase降解。
實(shí)例8: HA/PE]/DNA三元結(jié)構(gòu)基因傳輸系統(tǒng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)
人肝癌細(xì)胞HepG2以適宜濃度接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10呢胎牛血清、100U/ml的青霉 素、100U/ml的鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37。C恒溫、5%C02及飽和濕度的培養(yǎng)箱屮培 養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)。每2 3天傳代一次，傳代時(shí)用0.02% EDTA消化2 3min，棄去消化 液，加入新培養(yǎng)液吹打均勻，按所需細(xì)胞量移入新培養(yǎng)瓶中，添加完全培養(yǎng)液至適量。
轉(zhuǎn)染前一天，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種于24孔板，使得次日細(xì)胞融合率達(dá) 80%-90%。轉(zhuǎn)染前4h，將細(xì)胞用無血清無雙抗的培養(yǎng)基孵育。將配置好的轉(zhuǎn)染試劑均勻加入 各孔中，于37。C、 5免C02條件下培養(yǎng)4-6h，后更換有血清無雙抗的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h 或48h，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光檢測(cè)，觀察GFP的表達(dá)情況，結(jié)果表明HA/PEI/DNA三元結(jié)構(gòu)基因 傳輸系統(tǒng)組的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果與陽性對(duì)照組(Lipofectamhie2000)相當(dāng)，且明顯高于PEI/DNA 二元結(jié)構(gòu)復(fù)合物組。(參見圖4)
實(shí)例9: HA/PEI/DNA三元結(jié)構(gòu)基因傳輸系統(tǒng)細(xì)胞毒性試驗(yàn)
將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞用0.02%EDTA消化，制成細(xì)胞懸液，分別以1 X 105/ml 細(xì)胞濃度加入96孔酶標(biāo)板內(nèi)，每孔100^1，設(shè)五復(fù)孔，置37°C 5% C02孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h左右， 再分別加入終濃度為l、 5、 10、 20、 40、 80和160|ig/ml的PEI或PEI/HA100n]/孔，分別孵 育24h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液20|^1，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去全部上清，加入DMSO 100)ll /孔，微型振蕩器上振動(dòng)5分鐘，使結(jié)晶完全溶解，于酶聯(lián)儀570nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(A)，A值越高活細(xì)胞數(shù)也越多。根據(jù)A計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的活力抑制率。結(jié)果表明PEI/HA組的細(xì) 胞抑制率要明顯低于PEI組，表明加入HA修飾后降低了基因傳輸系統(tǒng)的細(xì)胞毒型。(參見圖 5)
油制重《n加藥組細(xì)胞平均吸光值、x麗 抑制率%= (1—對(duì)照組細(xì)胞平均吸光值)X100%
實(shí)例10: HA/PEI/DNA三元結(jié)構(gòu)基因傳輸系統(tǒng)荷瘤小鼠注射給藥轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)
將Hela細(xì)胞株接種于5周齡BALB/C裸鼠腹側(cè)皮下，待瘤直徑長(zhǎng)至0.3-0.5 cm后，將荷 瘤裸鼠隨機(jī)分組，每組5只，分別為NS (生理鹽水)組、質(zhì)粒pIRES2-EGFP-p53組、PEI/ pIRES2-EGFP-p53組、HA7PET/ pIRES2-EGFP-p53組。瘤體注射相當(dāng)5pgDNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染復(fù) 合物lOO^il, HA/PEI/DNA =120:12:1。第二天重復(fù)注射一次。注射后7天，處死裸鼠，取皮 下腫瘤，用PBS緩沖液(pH7.0)漂洗2次，加入新鮮配制的固定液(2%多聚甲醛0.25%戊 二醛PBS溶液)4(TC固定15 min， PBS漂洗15minx3次。用OCT包埋液包埋腫瘤組織，放 在冷凍切片機(jī)內(nèi)冷凍。切片冷凍后，將切片固定在載玻片上，風(fēng)干。用4%甲醛中作用10min， 使切片固定在載玻片上。在漂洗后將載玻片于反應(yīng)緩沖液中37'C染色4-24h。鏡下觀察結(jié)果， 發(fā)現(xiàn)pIRES2-EGFP-p53組瘤體組織EGFP有效表達(dá)，且明顯高于其他對(duì)照組。
將HepG2細(xì)胞株接種于裸鼠皮下，建立腫瘤模型，瘤塊長(zhǎng)至直徑約0.4cm時(shí)，小鼠尾靜 脈內(nèi)注射攜帶pIRES2-EGFP-p53質(zhì)粒的PE1/DNA/HA新型三元結(jié)構(gòu)復(fù)合物進(jìn)行基因治療，給 藥量為5ug每周二次共兩周，同時(shí)觀察腫瘤形態(tài)變化。與NS (生理鹽水)組、質(zhì)粒 pIRES2-EGFP-p53組、PEI/ pIRES2-EGFP-p53組比較，HA/PEI/ pIRES2-EGFP-p53組腫瘤牛 長(zhǎng)明顯受抑，接種后四周，與NS組比較，HA/PEI/pIRES2-EGFP-p53組腫瘤抑制率達(dá)46%。
實(shí)施例11: HA/PEI/DNA三元結(jié)構(gòu)基因傳輸系統(tǒng)荷瘤小鼠肺部粘膜給藥轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)
用雄性無胸腺裸鼠構(gòu)建LM-6骨肉瘤細(xì)胞模型，將SAOS-LM6人源骨肉瘤細(xì)胞株靜脈注 射后6周肺轉(zhuǎn)移，8周后可見肺部明顯腫瘤形貌。將荷瘤鼠隨機(jī)分組，每組5只，分別為NS (生理鹽水)組、質(zhì)粒pIRES2-EGFP-p53組、PE1/ pIRES2-EGFP-p53組、HA/PEI/ pIRES2-EGFP-p53組。將藥液氣霧給藥至肺部粘膜，給藥量為2mg質(zhì)^/10ml氣霧溶液， HA/PEI/DNA=120:12:1。初次給藥后第三天再次給藥， 一周兩次共6周，然后處死裸鼠，分 離肺部腫瘤并稱重。用PBS緩沖液(pH7.0)漂洗后用OCT包埋液包埋腫瘤組織，放在冷凍 切片機(jī)內(nèi)冷凍。切片冷凍后，用4%甲醛固化，將載玻片在PBS漂洗2次。將載玻片于37'C 染色12h。用PBS漂洗載玻片3次。顯微鏡下觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)pIRES2-EGFP-p53組的瘤體組織重量減輕，肺部腫瘤的病灶數(shù)也明顯低于其他對(duì)照組，腫瘤抑制率約為40%，說明 HA/PEI/DNA新型三元結(jié)構(gòu)基因傳輸系統(tǒng)能有效抑制肺部腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
權(quán)利要求
1、一種非病毒基因傳輸系統(tǒng)，其特征在于該系統(tǒng)由透明質(zhì)酸、陽離子聚合物和質(zhì)粒DNA組成，含有可質(zhì)子化的氨基單元的陽離子聚合物與含有的可電離的磷酸根離子的DNA形成二元結(jié)構(gòu)粒子，之后與含有可以電離的羧基的透明質(zhì)酸形成三元結(jié)構(gòu)復(fù)合物，三者通過靜電作用結(jié)合。
2、 按權(quán)利1要求所述的非病毒基因傳輸系統(tǒng)，其特征在于，所述的透明質(zhì)酸分子量為 5~3000KDa。
3、 按權(quán)利要求1所述的非病毒基因傳輸系統(tǒng)，其特征在于，所述的質(zhì)粒DNA是各種含報(bào)告 基因、抗癌基因或細(xì)胞因子基因的能在真核細(xì)胞屮重組表達(dá)的質(zhì)粒DNA。
4、 按權(quán)利要求1所述的非病毒基因傳輸系統(tǒng)，其特征在于，陽離子聚合物選自聚乙烯亞胺、 殼聚糖或聚賴氨酸，聚乙烯亞胺的分子量為1.8~100KDa，殼聚糖的分子量為5~200KDa，聚 賴氨酸的分子量為l~200KDa。
5、 按權(quán)利要求l所述的非病毒基因傳輸系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟將透明質(zhì)酸、陽離 子聚合物和質(zhì)粒DNA分別用適當(dāng)溶媒溶解，配制成所需濃度的溶液，陽離子聚合物與質(zhì)粒 DNA的按合適的比例混勻，陽離子聚合物和DNA通過靜電作用力自組裝形成二元結(jié)構(gòu)復(fù)合 物溶液，然后按照合適的比例加入透明質(zhì)酸溶液，混勻后即得三元結(jié)構(gòu)的微粒。
6、 按權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述適當(dāng)溶媒選自磷酸鹽緩沖溶液、氯化鈉 溶液、葡萄糖溶液或HBS緩沖液，溶媒pH值5.0-9.0;透明質(zhì)酸、陽離子聚合物和質(zhì)粒DNA 的濃度為0.1-10 mg/ral;陽離子聚合物與DNA的N/P比例為0.01~100，透明質(zhì)酸與陽離子 聚合物的重量比(w/w)為0.05~50;陽離子聚合物與質(zhì)粒DNA室溫下混勻后靜置15 60min， 后與透明質(zhì)酸溶液混勻后靜置15 60min。
7、 按權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，陽離子聚合物與DNA的N/P比例優(yōu)選為 1~50，透明質(zhì)酸與陽離子聚合物的重量比(w/w)優(yōu)選為1~20。
8、 按權(quán)利要求l所述的非病毒基因傳輸系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染包括人體以及動(dòng)物來源的內(nèi)皮細(xì)胞、上皮 細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞中的用途。
9、 按權(quán)利要求1所述的非病毒基因傳輸系統(tǒng)在制備基因治療藥物中的應(yīng)用。
10、 按權(quán)利要求1所述的非病毒基因傳輸系統(tǒng)的給藥方法，可采用口服、注射或者粘膜途徑 給藥，進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)基因治療領(lǐng)域，涉及一種由透明質(zhì)酸修飾的三元結(jié)構(gòu)非病毒基因傳輸系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用；本發(fā)明采用生物相容性能優(yōu)良的透明質(zhì)酸作為修飾物，增加非病毒基因傳輸系統(tǒng)的水溶性和降低細(xì)胞毒性，同時(shí)能依靠腫瘤細(xì)胞表面的透明質(zhì)酸特異性受體介導(dǎo)外源性的治療基因更加有效地進(jìn)入腫瘤組織，能夠抑制惡性腫瘤生長(zhǎng)，使得該新型基因傳輸系統(tǒng)更加具有腫瘤靶向性和腫瘤治療的有效性；本發(fā)明提供的透明質(zhì)酸修飾的新型三元結(jié)構(gòu)非病毒基因傳輸系統(tǒng)的制備工藝簡(jiǎn)便可行，無需特殊的儀器設(shè)備，能直接用于細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，是一種可用于制備多基因的聯(lián)合轉(zhuǎn)移以治療腫瘤等疾病的新型基因傳輸載體。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101417134SQ20081002475
公開日2009年4月29日 申請(qǐng)日期2008年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月13日
發(fā)明者韻 盧, 周建平, 靜 姚, 偉 王, 星 王, 穎 范 申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)