專利名稱：一種治療雄激素源性禿發(fā)藥物的制備方法及其在臨床中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物的制備方法，特別是涉及一種治療雄激素源性禿發(fā) 藥物的制備方法及其在臨床中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雄激素源性禿發(fā)是中老年女性臨床常見的一種疾病，目前還沒有一種有 效治療方法。由于生活節(jié)奏的加快，雄激素源性禿發(fā)還有進(jìn)一步升高的趨勢(shì)。
一般認(rèn)為，人毛乳頭細(xì)胞(dermal papilla cells, DPC)在毛囊的發(fā)育及周期性 生長(zhǎng)調(diào)控中起重要作用。要闡明人毛乳頭細(xì)胞對(duì)調(diào)節(jié)毛囊生長(zhǎng)和發(fā)育的機(jī)制， 必須從人毛乳頭細(xì)胞自身分泌的生物活性成份著手，這也是今后毛囊研究的 重要內(nèi)容之一。本發(fā)明在建立人毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)模型基礎(chǔ)上，應(yīng)用l、 2 代人毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)上清制成條件培養(yǎng)基，觀察其對(duì)不同傳代的人毛乳頭 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液(dermal papilla cell conditional medium DPCCM)能將非凝集生長(zhǎng)的人毛乳頭細(xì)胞有效誘導(dǎo)為凝 集性生長(zhǎng)狀態(tài)，并促進(jìn)細(xì)胞增殖。為進(jìn)一步分析人毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)活性蛋白 的體內(nèi)生物學(xué)活性，本發(fā)明將人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液制成凍干粉，初步應(yīng) 用于雄激素源性禿發(fā)患者，發(fā)現(xiàn)其有改善雄激素源性禿發(fā)的治療效果。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述，本發(fā)明的目的在于提供一種治療雄激素源性禿發(fā)藥物的制備 方法。
本發(fā)明的另一目的在于雄激素源性禿發(fā)藥物在臨床中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)
一種用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的1、 2代人毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)上清液在制備治療
雄激素源性禿發(fā)藥物，其特征在于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基按15ml人AB型血清與85ml 低糖DMEM培養(yǎng)基，0.24gH印es， 0.2g碳酸氫鈉，0. 03g L-谷氨酰胺的配比 構(gòu)成。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和產(chǎn)生的有益效果是
3人毛乳頭細(xì)胞為分泌性細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時(shí)可分泌許多蛋白質(zhì)，這些蛋 白質(zhì)可促進(jìn)毛囊的生長(zhǎng)和發(fā)育，在體外實(shí)驗(yàn)我們已證明其有確切的生物學(xué)活 性，但其應(yīng)用于臨床治療雄激素源性禿發(fā)還未見報(bào)道，我們?cè)谠械呐囵B(yǎng)人
毛乳頭細(xì)胞的基礎(chǔ)上，改進(jìn)其培養(yǎng)基，用人AB型血清替代小牛血清，成功 地培養(yǎng)出人毛乳頭細(xì)胞，我們收集培養(yǎng)過1、2代人毛乳頭細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 用于臨床治療雄激素源性禿發(fā)，觀察其治療效果，發(fā)現(xiàn)有確切的治療作用， 取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
應(yīng)用本發(fā)明制備的藥物在治療雄激素源性禿發(fā)中有明顯的療效，本藥物 所用細(xì)胞和培養(yǎng)血清均對(duì)人體均無抗原性，用于人體無任何過敏反應(yīng)，本發(fā) 明用含人AB型血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞，較以前用小牛血清培養(yǎng) 人毛乳頭細(xì)胞在技術(shù)上取得了突破，為本藥物應(yīng)用于臨床奠定了基礎(chǔ)，這也 是本發(fā)明關(guān)鍵技術(shù)的核心所在。此外，本發(fā)明所用藥物為皮下注射，其有效 藥物利用度大大提高，其制備工藝十分考究，實(shí)用性強(qiáng)，能為廣大患者服務(wù)。


圖1為本發(fā)明對(duì)雄激素源性禿發(fā)治療前示意圖 圖2為本發(fā)明對(duì)雄激素源性禿發(fā)治療后示意圖
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明藥物的制備方法及其臨床應(yīng)用是通過以下步驟來實(shí)現(xiàn)的
(1) .試劑和材料
低糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司。H印es:購(gòu)自Boehringer Mannheim 公司。健康人AB型血清第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院輸血科提供。
(2) .藥物制備的方法 2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備 2丄1人AB型血清的制備
a) 采集健康獻(xiàn)血員(經(jīng)查排除mV、 HBV、 HCV、梅毒螺旋體感染)全 血200ml入無抗凝劑的血袋；
b) 將全血血袋37"C水箱中放置1小時(shí)；
c) 2000rpm離心30分鐘；
d) 用血清分離器分離人AB型血清，所分離的人AB型血清可放入-2(TC;
e) 將人AB型血清袋從-2(TC冷凍箱中取出，放入4。C冷藏箱中12小時(shí)；f) 將人AB型血清室溫放置2小時(shí)；
g) 將人AB型血清在37C水箱中放置1小時(shí)；
h) 將人AB型血清在56'C水箱中放置1小時(shí)去除補(bǔ)體，其上下溫差應(yīng)小
于0.5。C;
i) 在超凈臺(tái)上用2%碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空干；
j)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中； k)用吸管分裝為15ml/瓶，-20°(:凍存?zhèn)溆谩?上述人AB型血清制備的步驟也可為
a) 采集健康獻(xiàn)血員全血200ml入無抗凝劑的血袋；
b) 將全血血袋37'C水箱中放置1小時(shí)；
c) 2000rpm離心30分鐘；
d) 用血清分離器分離人AB型血清，所分離的AB型血清可放入-2(TC冷 凍箱備用；
e) 將人AB型血清袋從-20'C冷凍箱中取出，放入4'C冷藏箱中12小時(shí)；
f) 將人AB型血清室溫放置2小時(shí)；
g) 將人AB型血清在37'C水箱中放置1小時(shí)；
h) 將人AB型血清在56T:水箱中放置1小時(shí)去除補(bǔ)體，其上下溫差應(yīng)小 于0.5 °C;
i) 在超凈臺(tái)上用2%碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空干；
j)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中； k)用吸管分裝為15ml/瓶，-20^凍存?zhèn)溆谩?2丄2基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備將15ml人AB型血清與85ml低糖DMEM培養(yǎng) 基，0.24gH印es， 0.2g碳酸氫鈉，0. 03g L-谷氨酰胺混勻后，用0.22微米孔 徑的微孔濾膜過濾除菌，直接使用或-2(TC凍存?zhèn)溆谩?2.2人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液的收集
(1) 取意外死亡的正常健康青年(經(jīng)査排除fflV、 HBV、 HCV、梅毒螺 旋體感染)枕后一手掌大小頭皮，用二步酶法分離人毛乳頭細(xì)胞(參見鐘白 玉，楊希川，楊衛(wèi)兵，等。二步酶消化法分離人頭皮毛乳頭細(xì)胞[J]。中華皮 膚科雜志，2003; 36 (7): 406。)；
(2) 培養(yǎng)時(shí)在50ml培養(yǎng)瓶中加入5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，100ml培養(yǎng)瓶中加入 7ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，3天換一次基礎(chǔ)培養(yǎng)基；
(3) 開啟超凈臺(tái)并用紫外線消毒30分鐘，操作時(shí)著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75%酒精消毒雙手后在超凈臺(tái)上將1、 2代毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清 從培養(yǎng)瓶中無菌倒入50ml無菌離心管中，用旋絲口蓋蓋上離心管并擰緊，在 IK16型離心機(jī)(美國(guó)SIGMA公司)中3000rpm離心10分鐘；
(4)在超凈臺(tái)上打開離心管，用無菌吸管吸出離心管中的上清(小心不能 攪起底部的沉淀)，移入無菌玻璃容器中，加無菌橡皮塞后，作好標(biāo)記，-20 。C凍存?zhèn)溆谩?br> 2.3人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液凍干粉的制備
(1) 凍干室紫外線消毒4小時(shí)；
(2) 操作時(shí)著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75%酒精消毒雙手后在超 凈臺(tái)上用無菌吸管將人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液分為3ml/凍干瓶，蓋上瓶塞且 留出凍干孔；
(3) 將凍干瓶放入凍干機(jī)中；
(4) 凍干過程
I-40 。C4小時(shí)
II-20 。C3小時(shí)(開始抽真空至結(jié)束)
III腸5。C10小時(shí)
IV5。C4小時(shí)
V15。C3小時(shí)
VI25 。C5小時(shí)
(5) 在真空環(huán)境下，真空封包凍干瓶；
(6) 打開凍干機(jī)凍干室門，取出凍干瓶，加瓶蓋并加壓封包瓶塞；
(7) 貼上標(biāo)簽，注明標(biāo)識(shí)和日期，4'C保存?zhèn)溆谩?治療雄激素源性禿發(fā)藥物的理化特性為
顏色白色； 形態(tài)粉末狀； pH值7.35;
溶解度每瓶用3ml生理鹽水在3秒鐘內(nèi)可完全溶解，溶解后液體為橙 紅色。
使用前依照上述藥物制備的方法進(jìn)行藥物的配制每瓶?jī)龈煞塾?ml生 理鹽水溶解(恢復(fù)凍干前原始濃度)。 '(3)、藥物的生物安全性實(shí)施例
3.1小鼠急性毒性試驗(yàn)我們選用7 9周齡、體重為18 22g的昆明 種小鼠。按預(yù)試驗(yàn)公比0.8設(shè)立50.0ml/kg、 40.0ml/kg、 32.0ml/kg、 25.6ml/kg、 20.5ml/kg等5個(gè)劑量組，每組10只小鼠，雌雄各半。單次腹腔注射，藥后 立即觀察、記錄動(dòng)物的中毒反應(yīng)、死亡情況及時(shí)間，連續(xù)觀察14天。
3.2家兔熱原試驗(yàn)選3只體重為1.8 2.4 kg的日本大耳白家兔。按 10ml/kg耳靜脈注射給藥。測(cè)量家兔肛門體溫，深度為6厘米，以后每隔1 小時(shí)測(cè)量體溫l次，共3次。
3.3細(xì)菌培養(yǎng)隨機(jī)抽取5支凍干瓶，無菌生理鹽水溶解，4道劃線法 接種于普通血平板上，培養(yǎng)48小時(shí)后觀察結(jié)果。
3.4真菌培養(yǎng)隨機(jī)抽取5支凍干瓶，無菌生理鹽水溶解，接種于沙堡 氏培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10日后觀察結(jié)果。
3.5結(jié)果小鼠急性毒性試驗(yàn)顯示在腹腔注射不同劑量人毛乳頭細(xì)胞條 件培養(yǎng)液樣品溶液后，各組動(dòng)物未發(fā)現(xiàn)明顯的中毒癥狀，在整個(gè)試驗(yàn)期限內(nèi) 無動(dòng)物死亡或其它異常征象。家兔熱原試驗(yàn)顯示在耳靜脈注射人毛乳頭細(xì)胞 條件培養(yǎng)液樣品溶液后，各動(dòng)物的體溫變化均符合熱原試驗(yàn)的要求。細(xì)菌和 真菌培養(yǎng)均未見細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)。 (4)、藥物的臨床應(yīng)用
(l)治療雄激素源性禿發(fā)藥物的理化特性為
顏色白色； 形態(tài)粉末狀； pH值7.35;
使用前依照上述藥物制備的方法進(jìn)行藥物的配制每瓶?jī)龈煞塾?ml生 理鹽水溶解(恢復(fù)凍干前原始濃度)。藥物溶解度每瓶用3ml生理鹽水在3
秒鐘內(nèi)可完全溶解，溶解后液體為橙紅色。
(2)治療方案選擇50例年齡在40 68歲的雄激素源性禿發(fā)患者為試驗(yàn) 對(duì)象，常規(guī)消毒患部皮膚后皮下多點(diǎn)注射，每周1次，每個(gè)患部(直徑小于 5厘米)每次最多3ml，共4次，治療完成后觀察6個(gè)月。
人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液在通過生物安全鑒定后，在患者知情同意的情 況下應(yīng)用于患部。50例人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液治療的雄激素源性禿發(fā)患者 中，除6例無效外其余均有一定療效。
權(quán)利要求
1、一種用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的1、2代人毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)上清液在制備治療雄激素源性禿發(fā)藥物，其特征在于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基按15ml人AB型血清與85ml低糖DMEM培養(yǎng)基，0.24gHepes，0.2g碳酸氫鈉，0.03g L-谷氨酰胺的配比構(gòu)成。
2、 由權(quán)利要求1所述培養(yǎng)上清液制備的凍干粉在制備治療雄激素源 性禿發(fā)藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療雄激素源性禿發(fā)藥物的制備方法及其在臨床中的應(yīng)用。藥物的前體為含15％人AB型血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，該基礎(chǔ)培養(yǎng)基按15ml人AB型血清、85ml低糖DMEM培養(yǎng)基、0.24gHepes、0.2g碳酸氫鈉、0.03gL-谷氨酰胺配比構(gòu)成。用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)1、2代人毛乳頭細(xì)胞，收集1、2代人毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清為人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液，將所收集的人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液制備成凍干粉。本發(fā)明所制備的藥物在治療雄激素源性禿發(fā)中有明顯的療效，本藥物所用細(xì)胞和培養(yǎng)血清對(duì)人體均無抗原性，用于人體無任何過敏反應(yīng)。本發(fā)明所用藥物為皮下注射，其有效藥物利用度得到大大提高。
文檔編號(hào)A61K35/36GK101537018SQ200810017818
公開日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2008年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月21日
發(fā)明者葉慶佾, 洋 羅, 飛 郝 申請(qǐng)人:洋 羅