專利名稱：：心臟保護化合物的制作方法心臟保護化合物本發(fā)明涉及肽和基于肽的化合物，其用作為組織保護化合物，例如心臟保護化合物。曱硫氨酸-腦啡肽和亮氨酸-腦啡肽是五肽，分別具有結(jié)構(gòu)Tyr-Gly-Gly誦Phe國Met和Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu(HughesJ,SmithTW,KosterlitzHW,FothergillLA,MorganBA,MorrisHR(1975)Nature,Lond.258,577-579)。許多對這些及其類似化合物已經(jīng)進(jìn)行的研究集中于止痛活性。相比之下，對于用腦啡肽類似物的細(xì)胞保護或的組織保護只有相對很少的研究。類似物[D-Ala2,MePhe4Met(0)5-醇]-腦啡肽已經(jīng)顯示出抗胃損害的保護作用(Ferri,S.,Speroni，E.，Candeletti,S.,Cavicchini，E,Romualdi,P.，Govoni,P-,&Marchini,M.(1988).Pha畫cology36,140-144;Ferri，S.,Arrigo-Reina,R.,Candeletti,S.,Costa，S.，Murari,G.,Speroni,E.,&Scoto，G(1983)，Pha誦colResCommun15,409-418)。Dalargin[D-Ala2,Leu5,Arg6]也已經(jīng)顯示出抗胃損害的保護作用(TimoshinSS，ShvetsSI，RadivozMI，AleksandrovichAG,Mel'nikEI,BiullEkspBiolMed.1991Aug;112(8):130-2)。-腦啡肽(DADLE)已經(jīng)顯示出在器官移植之前延長多-器官存活時間和組織保存方面是有效的(Chien,S.，Oeltgen,P.R.,Diana，J.N.,Shi,X.,Nilekani，S.P.,&Salley,R.(1991)JThoracCardiovascSurg102,224-234;Chien,S.,Oeltgen,P.R.，Diana,l.N.,&Salley,R.K.(1994)JThoracCardiovascSurg107，964-967;Oeltgen,P.R.,Horton,N.D.,Boiling,S.F.，&Su,T.P.(1996)AnnThomeSurg61，1488-1492)。已經(jīng)研究了S-阿片樣物質(zhì)(opioid)受體活化的作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)[D-Pen(2,5)]腦啡肽(DPDPE);5啡肽-D,—種新S(2)-阿片樣物質(zhì)促效劑預(yù)處理降低了梗塞尺寸，然而[D-Ala(2),D-Leu(5)]腦啡肽(DADLE)沒有效果(AmJPhysiolHeartCircPhysiol.2002Jun;282(6):H1953-60)。Takasaki等已經(jīng)證明了兩種天然腦啡肽產(chǎn)生了保護，然而，(3-內(nèi)啡肽沒有所述效果[TakasakiY.,WolffR.A.,ChienG.L.,VanWinkleD.M.,1999,Am.J.Physiol,277,H2442-50](在分離的兔肌細(xì)胞中的研究)。市場上有許多止痛藥，使得可以選擇適當(dāng)?shù)囊环N用于特定情況。對比之下，可論證地存在對于有效的組織保護化合物(如心臟保護化合物)的更大需求。例如，心肌梗塞的治療仍然是醫(yī)學(xué)重點。我們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了顯示出有用的組織保護作用的新化合物。從第一方面，本發(fā)明提供了包含四肽結(jié)構(gòu)A-B-C-D的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽。本文所指的四肽結(jié)構(gòu)A-B-C-D根據(jù)慣例從其N-末端到其C-末端進(jìn)行定義。該化合物的N-末端，其為氨基酸殘基A,可以是未4皮取代的，即可以是自由的NH2基團?；蛘咴揘H2基團的每個氬任選地可獨立地被C!-5烷基或C!-5?；〈?，其中Cw表示可以是直鏈的或支鏈的1-5個碳原子的碳鏈，例如曱基，乙基，正-丙基，異-丙基，正-丁基，異-丁基，叔-丁基，正-戊基及其異構(gòu)體。A是D或L-構(gòu)型芳族氨基酸殘基，優(yōu)選地為L-構(gòu)型。在本發(fā)明的一些方面，該部分的芳族環(huán)可包含一個或多個硝基。然而，所述硝基不是強制的并且在該位置沒有硝基時已經(jīng)獲得了有效的結(jié)果。A的一些適當(dāng)?shù)陌被岚═yr,Thyronine,Phe或Trp。在本發(fā)明的一些方面，芳族環(huán)包括羥基取代基，優(yōu)選地在p-位置。A優(yōu)選地是Tyr。B是D-或L-構(gòu)型二氨基酸殘基，其中側(cè)鏈氨基基團用d-5?；?，Cw烷基，-8'-(:1-5?；?8，^1_5烷基取代，其中B，是任選地可用一個或多個硝基取代的氨基酸殘基。然而，所述硝基不是強制的并且在該位置沒有硝基已經(jīng)獲得了有效的結(jié)果。相應(yīng)地，優(yōu)選地B，不用任何硝基取代。B優(yōu)選地為D-構(gòu)型。由于B是二氨基酸殘基，利用一種氨基酸基團形成與A部分的肽鍵并且另一氨基酸在側(cè)鏈上并且如本文所述衍生化。適當(dāng)?shù)亩被釟埢―ap,Dab，Orn,Lys,4,5-脫氫-賴氨酸或2,6-二氨基-4-己炔酸，優(yōu)選地Dab,Orn或Lys,更優(yōu)選地Orn。在本發(fā)明的其他方面，B可以是Lys。在本發(fā)明的其他方面，B可以是Dab。B的側(cè)鏈氨基基團用d.5?；鶊F或d-s烷基基團取代，產(chǎn)生在此5點上的酰胺連接或仲胺。這有利地影響了化合物的活性。用d.5酰基基團的取代是優(yōu)選的。據(jù)信這通過改變電荷和極性促進(jìn)了有效性。D-或L-構(gòu)型(優(yōu)選地L-構(gòu)型)氨基酸殘基B'可存在于B和C]-5?；鶊F或Cw烷基基團之間，在這種情況下，B的側(cè)鏈氨基基團與B，的羰基基團形成肽鍵，并且B，的氨基基團用C^烷基基團或(優(yōu)選地)d-5?；鶊F取代。優(yōu)選地d-5酰基基團是乙?；?yōu)選地B，，如果存在，為Gly,Ala,Pro,Leu,Asn或Met,更優(yōu)選地Gly或Asn。C是Gly,其中肽N-H任選地可(然而優(yōu)選地不)被改變?yōu)镹-甲基。換句話說，主鏈可被修飾使得Gly的氮原子可被曱基化。D是D-或L-Phe,優(yōu)選地L-Phe,其在芳族環(huán)上用至少一個硝基取代。這種硝基增強了化合物的活性。還可有多至四種在芳族環(huán)上的其他進(jìn)一步的取代，獨立地選自硝基，氟代，氯代，溴代，碘代，三氟曱基或氰基。然而僅一個硝基的取代是關(guān)鍵的。硝基取代優(yōu)選地在對位。肽N-H任選地可(但是優(yōu)選地不)被被改變?yōu)镹-甲基。換句話說，主鏈可被修飾使得Phe的氮原子可被曱基化。殘基D的C-末端可采取自由酸-COOH或替代地-CONH2，-CONHd-5烷基，-CONH-NH2，-CONH-NHCw烷基，COO-d.5烷基，或-CH20H的形式。在一些實施方式中，殘基D的C-末端不采取自由酸-COOH或-CH20H的形式，而是選自CONH2,-CONHd.5烷基，-CONH-NH2,-CONH-NHCw烷基，或COO-d.5烷基。優(yōu)選地它是-CONH2。與其他部分結(jié)合，這產(chǎn)生了具有在體外和體內(nèi)生物學(xué)測試中高活性的化合物。從進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的化合物，以及用作藥物的化合物。從進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了這些化合物用于制備用于組織保護治療或心臟保護治療的藥物的用途。本發(fā)明的化合物保護組織，例如經(jīng)歷缺血的心臟肌肉。我們還觀察到明顯的抗缺氧作用和顯著的止痛活性。這三種作用的組合在包括心臟學(xué)和加強監(jiān)護的幾種醫(yī)學(xué)領(lǐng)域是特別有利的。缺血綜合征和循環(huán)性缺氧(circulatoryhypoxia)的控制在幾種病癥中是重要的。因此，在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明的化合物另外地或可替代地用于抗缺氧和/或止痛治療中。在一些方面，本發(fā)明涉及肽和基于肽的化合物，其用作用于心肌缺血(例如缺血性胸痛和心肌梗塞)的抗缺血藥物或為了改善特定腦機能障礙，例如缺血性腦損害(中風(fēng)等)的效果的抗缺血藥物。我們的新化合物的抗缺氧特性提高了對依賴氧氣的病理狀態(tài)，例如肺，肝，眼的機能障礙，和分娩，中風(fēng)，流血和身體超負(fù)荷的病理學(xué)，的穩(wěn)定性。新物質(zhì)的止痛作用可用于緩解與例如心肌梗塞相關(guān)的疼痛。在一些方面，新化合物顯示出顯著有用的心臟保護，抗缺氧和止痛作用。顯著的止痛作用可用于緩解與心肌梗塞相關(guān)的疼痛。放到一起，組合的作用先前是未知的，但卻是高度理想的。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選地的化合物是Tyr-D-Orn(Ac)-Gly-Phe(p-N02)-NH2(1)N02根據(jù)本發(fā)明的四種化合物(在通式A-B-C-D中修飾位置B)Tyr-D-Lys(Ac)-Gly-Phe(p-N02)-NH2(2)Tyr-D-Orn(Ac-Asn)-Gly-Phe(p-N02)-NH2(3)Tyr-D-Dab(Ac)-Gly-Phe(p-N02)-NH2(4)Tyr-D-Orn(Ac-Gly)-Gly-Phe(p-N02)-NH2(5)曰疋:附圖簡述圖1.圖解了用于研究肽(l,2,3,4,5)在心肌梗塞大鼠模型中的效果的實驗方案。肽在閉塞(occlusion)之前5分鐘給藥。梗塞尺寸(infarctsize)在120分鐘再灌注期之后分析。圖2.當(dāng)在25分鐘閉塞和120分鐘再灌注期之前5分鐘向雄性Sprague-Dawley大鼠i.v.給藥時，肽(4)降低了梗塞尺寸(其表示為危險區(qū)域的百分比(IS/AAR))。圖3.當(dāng)在除去25分鐘左冠狀動脈閉塞之后立即i.v.給藥雄性Sprague-Dawley大鼠時，肽(4)與對照相比降低了梗塞尺寸(其表示為危險區(qū)域的百分比(IS/AAR))。圖4.腦啡肽類似物(1-5)在靜脈內(nèi)給藥小鼠中的止痛活性("熱板"法)。圖5.跳《夭潛伏期作用的效力(potencyoftheeffectofjumplatencytime),表示為在從"5分鐘"的點直到"90分鐘"的點的曲線之下的區(qū)域。圖6.在給藥肽(A)和嗎啡(B)之后15分鐘點的跳躍潛伏期的劑量-響應(yīng)圖表。實施例縮寫詞符號和縮寫詞是才艮據(jù)IUPAC-IUBJointCommissiononBiochemicalNomenclature(S/oc/zem.J.(1984),219，345-374)的建議。任選地所有活性的氨基酸具有L-構(gòu)型除非另外聲明。使用的縮寫詞DCC,二環(huán)己基碳二亞胺；DCU,二環(huán)己脲；DMF,二曱基甲酰胺；HOBt,l-羥基苯并三唑；OPcp,五氯代苯；OPfp,五氟代苯；p-N02,對-硝基；RP-HPLC,反相高效液相色鐠；DIEA，二異丙基乙胺；TFA,三氟乙酸；DCM,二氯曱烷；MeOH,曱醇；MeCN,乙腈；"BuOH正-丁醇，,'PrOH,異丙醇；NH4OBt,l-羥基苯并三唑銨鹽；DPPA,疊氮石舞酸二苯酯(diphenylphosphorylazide);i.cist,腦池內(nèi)；i.v.,請爭月7jc內(nèi)；i.p.,腹月莫內(nèi)；OR，阿片類物質(zhì)受體；GPI,豚鼠回腸；MVD,小鼠輸精管；Phe(/7-N02)，4-硝基-L-苯丙氨酸；Dab，a,"二氨基丁酸；Orn,鳥氨酸；Boc，叔-丁氧基-羰基；Z,千氧基羰基；MBHA樹脂，4-曱基二苯甲基胺樹脂；Ac,乙?；籄cOH,乙酸。化學(xué)8類似物(2，3,4,5)通過利用BOC/Bzl-化學(xué)禾:N,N':」異丙基碳二亞胺作為偶聯(lián)劑的固相方法合成。實驗方案實施例1腦啡肽類似物(l)的合成腦啡肽類似物(l)的合成利用活性酯和疊氮偶聯(lián)方法而進(jìn)行。所有氨基酸具有L-構(gòu)型，除了D-鳥氨酸。氨基酸衍生物獲自Reanal(匈牙利)。在40。C下在真空中進(jìn)行蒸發(fā)。利用數(shù)字熔點分析器"Fisher",型號355確定熔點(未校正的)。！H-NMR光譜在BrukerWM-360光語儀上進(jìn)行記錄。合成的化合物的純度使用SilufolUV254(捷克斯洛伐克)或獲自Merck(德國)的Silicagel60F254通過TLC在以下系統(tǒng)中進(jìn)行證實A,CHCl3-EtOH-AcOH(85:10:5);B,nBuOH-吡咬-AcOH誦H2O(15:10:3:6);C,nBuOH-AcOH-H20(4:l:l);D,CHCl3-MeOH-AcOH-H2O(30:20:4:6);E,(60:18:2:3)。在肽在密封的安瓿中水解(在110。C，24小時)之后在BiocalBC-200氨基酸分析器上進(jìn)行氨基酸分析。保護的肽在色譜柱"Merck";型號C(440-37)上純化。利用下列溶劑系統(tǒng)進(jìn)行評價CHCl3-EtOH-乙酸乙酯-AcOH-H20,185:5:8:2:0.25(chl);85:5:8:2:0.25(ch11)。用于分析目的的HPLC在Dupontmodel8800HPLC系統(tǒng)上利用填充了反相吸附劑SilasorbC18(Lachema)的柱(4.6x110mm)而進(jìn)行。旋光度用帶有10-cm水加套池(waterjacketedcell)的Perkin-Elmer141旋光儀在溶劑中和在下述濃度時進(jìn)行測定。紐-G(y-尸/z咖M^向?qū)?.2g(20mmol)的L-Phe(p-N02)溶解于20ml的INNaOH溶液中，添加1.68g的NaHC03,25mlDMF,和在攪拌下和冷卻到5。C時，加入溶解于10mlDMF中的8.47g(20mmol)的Boc-Gly-OPcp。在攪拌幾小時之后，當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時(色譜控制)，混合物用乙酸乙酯和水稀釋并且用5%KHS04溶液酸化到pH3。將乙酸乙酯層分離并另外用兩部分乙酸乙酯提9取水相。將三種有機相合并，用水，NaCl的飽和水溶液洗滌，并且最后在無水Na2S04上干燥。溶劑蒸發(fā)之后，利用添加少量的石油醚從乙酸乙酯中重結(jié)晶晶體沉淀。得到4.67g(63%)的二肽(6),熔點(m.p.)167-168。C,[a]D24+46.9。(cl，EtOH)，Rf0.79(A);0.77(B);0'83(E)。紐匿G-尸A咖M^-,("7」將1.52g(10mmol)的NH4OBt和2.06g(10mmol)的DCC添加到溶解于20ml的DMF的3.67g(10mmol)的化合物(6)中。反應(yīng)混合物留置過夜。DCU被過濾并且在蒸發(fā)溶劑之后將殘留物溶解于氯仿中。有機相用5%KHS04溶液、水、5。/。NaHC03溶液、水、NaCl飽和水溶液洗滌并且最后在無水Na2S〇4上干燥。蒸發(fā)溶劑后，使產(chǎn)物從具有少量的乙酸乙酯的純乙醇中結(jié)晶。得到2.72g(74%)的保護的二肽酰胺(7),熔點169-171。C,[a]D22-9.2。(cl，DMF),Rf0.84(A);0.88(B);0.66(E)。將2.66g(10mmol)的D-Orn(Z)溶于10ml的lNNaOH，添加0.84g的NaHC03,25ml的DMF,和在攪拌下和冷卻到-5。C時，加入溶解于15mlDMF的5.47g(10mmol)的Boc-Tyr(Boc)-OPfp。反應(yīng)進(jìn)行幾小時并且留置過夜。反應(yīng)結(jié)束之后，對材料進(jìn)行類似于化合物(6)的處理。除去溶劑并從二乙基醚和正-己烷中結(jié)晶產(chǎn)物。固體殘留物從相同的溶劑混合物中重結(jié)晶出并真空干燥。得到3.28g(52。/。)的保護的二肽(9),熔點112-114。C,[a]D22+4.2。(c0.5，EtOH),Rf0.66(A);0.52(A,"Merck");0.78(B"Merck")。將鈀黑添加到在10ml的MeOH、0.5ml的AcOH和5ml的H20中的2.1g(3.3mmol)的保護的二肽(9)中，并且進(jìn)行氫化幾小時。反應(yīng)結(jié)束之后(色譜控制)，催化劑被過濾并且濾液被蒸發(fā)。將殘留物溶解在具有少量的乙酸乙酯的醚中?；旌衔镬o置在水箱中直到所有產(chǎn)物結(jié)晶出。產(chǎn)物被過濾出，在過濾器上用冷醚洗滌，并真空干燥。得到1.54g(83%)的化合物(10),其具有Rf0.16(C"Merck，，)；0.66(B，，Merck");0.67(D)。將8.32g(15mmol)的二肽乙酸鹽(dipeptideacetate)(10)溶解在50ml的DMF中，一旦攪拌和冷卻時，加入在15mlDMF中的5.lml(30mmo1)10DIEA和溶解于5mlDMF中的2.7g(15mmol)的對-硝基苯基乙酸酯。攪拌反應(yīng)混合物2-3小時，并且當(dāng)反應(yīng)結(jié)束(色諳控制)時對其進(jìn)行類似于化合物(6)的操作。除去溶劑并將殘留物溶解于醚中并且用己烷再沉淀兩次。產(chǎn)物被過濾出并真空干燥。得到6.52g(81。/。)的保護的二肽(11),其具有Rf0.33(A"Merck，，)；0.55(E，，Merck，，)；熔點95。C,[a]D22-9.6。(c0.5,EtOH)。Soc-7)rfBoc;"YA^4c」-iD-(9m-G-尸/ze^-A^^-AW2(72」將4.75g(13mmol)的二肽(3)被溶解在30ml在DCM中的50%TFA中并且保持30分鐘。除去溶劑；殘留物用醚研磨，過濾，在濾器上用醚洗滌并且在氫氧化鉀上進(jìn)行真空干燥。得到4.Mg(92%)的二肽三氟乙酸鹽(8),其具有Rf0.37(D);0.17(E)。將1.14g(3mmol)的二肽酰胺三氟乙酸鹽(8),1.6g(3mmol)的保護的二肽(ll)溶解在60ml的DMF中，冷卻到-5。C,并且一旦攪拌并冷卻，添力口0.51ml(3mmol)的DIEA,并將溶解于5ml的DMF的0.75ml(3.6mmol)的DPPA緩慢地滴加到混合物中。反應(yīng)進(jìn)行幾小時并且留置過夜。反應(yīng)完成之后(色譜控制)，混合物用乙酸乙酯和水稀釋，冷卻到0°C并且用5。/oKHS04溶液酸化到pH3。乙酸乙酯層被分離出；另外用一部分乙酸乙酯萃取水相。合并有機相，用5%NaHC03溶液、水、5%KHS04、水、飽和NaCl水溶液洗滌，并且最后在無水Na2S04上進(jìn)行干燥。除去溶劑并且產(chǎn)物在硅膠柱(C)上純化(產(chǎn)物在chl系統(tǒng)中進(jìn)行裝載并且在chII系統(tǒng)中連續(xù)洗脫)。收集分別的級分，蒸發(fā)并真空干燥。得到0.73g(31%)的保護的四肽酰胺(12)。通過RP-HPLC純化分析樣品。熔點169-170°C,[a]D22-46.8。(c0.25,DMF),Rf0.51(E,"Merck");0.66(B"Merck")。7y匿fA^4c,-Z)-0"-G(y-尸/^-M^-麗2(7」將0.25g(31mmol)的四肽酰胺(12)溶解于10ml在DCM中的50%TFA中，并且繼續(xù)如同對化合物(8)地進(jìn)行操作。產(chǎn)物在SephadexG-10柱上純化。用0.02AcOH溶液進(jìn)行洗脫。冷凍干燥后得到0.18g(90%)四肽酰胺(l)。熔點130畫131。C,[a]D22+80。(c0.15,0.2N,AcOH),Rf0.52(D,"Merck");0.49(B"Merck");氨基酸分析Gly1.00;TyrO.86;Orn0.82;Phe(p-N02)0.91。分析性HPLC分析顯示k'=1.6的峰(柱ii4.6x110,SilasorbSPH,流動相:CH3CN和0.2M乙酸銨緩沖液(21:79),pH5,流速1.5ml/分鐘，X:220nm。實施例2,3,4,5腦啡肽類似物(2,3,4，5)的合成N-保護的氨基酸衍生物，載體和用于肽合成的試劑購自Sigma,FisherScientific,Bachem;Reanal(匈牙利)；SaxonBichemicalsGMBH(德國)。除了4-曱基二苯甲基氨基聚合物外，其購自瑞士Novabiochem。HPLC-級溶劑DCM,DMF(用4A分子篩進(jìn)行儲存)，MeCN和MeOH用于合成和純化。其他試劑是試劑級的。在Boetiushotplate(德國)上測定熔點。肽(2,3,4,5)的合成利用NPS-4000半自動合成儀(NeosystemLaboratories,法國)(其使用在MBHA樹脂上的標(biāo)準(zhǔn)BOC/Bzl保護基團策略(standardBOC/BzlprotectinggrouptacticsonMBHAresin))通過固相方法而進(jìn)行。氨基酸殘基的ot-氨基官能用BOC保護基團保護，并且反應(yīng)性側(cè)鏈官能團進(jìn)行如下保護Ac基團用于D-Lys;Fmoc基團用于D-Dab和D-Orn;和2-溴千氧基羰基(2-Br-Z)用于Tyr氨基酸殘基。Asn的側(cè)鏈?zhǔn)俏幢Ｗo的。用酰胺化的C末端將所有肽構(gòu)建在4-曱基二苯甲基胺樹脂(0.6mmol/g樹脂取代)上。將3倍過量的Boc-氨基酸用于偶聯(lián)反應(yīng)。利用在二曱基曱酰胺中的N,N'-二異丙基碳二亞胺進(jìn)行氨基酸的偶聯(lián)，以便在6-Cl-HOBt存在下將氨基酸殘基偶聯(lián)到生長肽樹脂上。在偶聯(lián)2小時之后，在每個階段，通過標(biāo)準(zhǔn)茚三酮測試監(jiān)測酰化的完成。在不完全偶聯(lián)的情況下，在除去Boc保護基團之前重復(fù)該偶聯(lián)過程。在DCM中的三氟乙酸(65%(體積/體積))用于選擇性斷裂N-保護基團，然后用在DMF中的三乙胺(5%(體積/體積))進(jìn)行中和。肽的側(cè)鏈氨基基團的乙?；ㄟ^用在DCM中的10%Ac20溶液(還包含三乙胺)的處理而達(dá)到。最后的去保護以及肽從樹脂的斷裂通過在苯硫基曱烷和乙烷二硫醇存在下用1M在TFA中的三氟曱烷^璜酸溶液的處理而進(jìn)^f亍。合成的肽通過凝力交過濾進(jìn)行脫鹽，通過RP-HPLC進(jìn)行純化并通過質(zhì)譜和氨基酸分析進(jìn)行表征。凝膠過濾在ToyopearlTSKHW-40柱上進(jìn)行。在iPrOH中的0.1M12NH4HC03溶液用于洗脫肽。最后的純化通過RP-HPLC在裝配了用于分析色譜法的Lunad8柱(4.6xl50mm)和裝配了用于制備色語法的VydacC!8柱(22x250mm)的SystemGoldChromatograph(Beckman,美國)上獲得。肽分別用梯度的在0.1。/。H3PO4中的乙腈以lml/分鐘的流速(分析柱)和用梯度的在0.1%TFA中的乙腈以1Oml/分鐘的流速(制備柱)進(jìn)行洗脫。在230nm進(jìn)行UV檢測。氨基酸衍生物的純度在預(yù)涂敷(precoated)的MerckF254板(德國)上在下列色譜系統(tǒng)中通過TLC進(jìn)行控制1:3的1%氨-仲丁醇，9:2的氯仿-甲醇，和90:7:3的氯仿-曱醇-乙酸。合成的肽的純度在下列系統(tǒng)中進(jìn)行測定nBuOH-AcOH-H20(4:l:l);CHCl3-MeOH-AcOH-H2O(30:20:4:6);(60:18:2:3)。通過在254nm的UV照射，通過用茚三酮溶液或使用氯/聯(lián)苯胺試劑噴射，顯現(xiàn)色層語。在密封的安瓿中的肽水解(在U0。C,24小時)之后在MicrotechnaT339M分析儀(捷克共和國)上進(jìn)行氨基酸分析。質(zhì)譜在電噴霧離子化(FINEPKhF)和反射模式的MX-5303飛行時間質(zhì)語儀上進(jìn)行記錄。生物學(xué)生物學(xué)活性的實施例腦啡肽類似物(l)的心臟保護作用根據(jù)本發(fā)明的腦啡肽類似物(l)的心臟保護作用已經(jīng)在體重在200-250g的145只雄性大白鼠上進(jìn)行測試。通過結(jié)扎左冠狀動脈產(chǎn)生了急劇的心肌缺血。冠狀動脈閉塞30分鐘之后以0.05mg/kg和0.5mg/kg的劑量對動物進(jìn)行腹膜內(nèi)注射研究化合物。對硝化甘油和anaprilinum作為用于心肌梗塞治療的傳統(tǒng)藥物進(jìn)行測試用于對比。接受了注射生理溶液的具有急劇心肌缺血的大鼠用于對照實驗。在結(jié)扎冠狀動脈6和24小時后處死動物，并且取血樣和心臟組織樣品用于研究。/人血液中洗滌心臟，左心室與右心室分離，并且切成4-5塊一致的橫向段。所有段在37。C在pH7.4的磷酸鹽緩沖液中的0.1%的氮藍(lán)四唑溶液中培養(yǎng)15分鐘。心肌的壞死區(qū)域尺寸通過重力方法(gravitationmethod)進(jìn)行測定。缺血損害率根據(jù)在血液中肌酸磷酸激酶(CPK)水平和它的心臟分?jǐn)?shù)(heartfraction)(HF-CPK)進(jìn)行估計。使用標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(Boehringer,德國)來測試和計算兩種激酶(CPK+HF-CPK)的活性。獲得的結(jié)果利用Student's標(biāo)準(zhǔn)(Student'scriterion)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。據(jù)測定，冠狀動脈閉塞有助于在6小時后可檢測的壞死區(qū)域的出現(xiàn)，壞死區(qū)域在接下來的24小時中逐漸地擴展。觀察到在血液中的特征性代謝改變。乳酸鹽含量增加，這表明缺血程度和循環(huán)性缺氧。CPK和HF-CPK的酶活性增加，其反映了缺血性心肌細(xì)胞(cardiomyocite)損害(表2)。與對照組大鼠相比，在具有心肌梗塞的大鼠中通過腹膜給藥腦啡肽類似物(l)引起的冠狀動脈閉塞后的6小時之前和之后的壞死區(qū)域尺寸之間在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著的區(qū)別。然而，與對照組動物相比，用新腦啡肽類似物(l)注射的動物的心肌壞死區(qū)域尺寸在24小時實驗結(jié)束時在統(tǒng)計學(xué)上更小(表1)。表l.腦啡肽類似物對于具有冠狀動脈結(jié)扎的大鼠的心肌壞死尺寸的影響號動物組動物數(shù)量觀察時間6小時12小時MI+生理溶液MI+Tyr-D-Om(Ac)-Gly-Phe(N02)-NH20.05mg/kgMI+Tyr-D-Orn(Ac)-Gly-Phe(N02)-NH20.5mg/kgMI+辨化甘油Ml+anaprilinum151515151543.07±2.9140.70±1.52P>0.0540.05±1.93P>0.0555.80±1.7147.51±1.63P>0.0546.64±2.20P>0.0554.04±1.76P>0.0553.80±1.90P>0.05血液中的乳酸鹽含量是心肌梗塞發(fā)展的主要可靠指數(shù)。據(jù)測定0.05mg/kg劑量的新腦啡肽類似物(l)減少了在血液中的CPK和HF-CPK酶的血乳酸過多癥和活動過強的發(fā)展。心臟和肝的糖原(主要能量儲存)水平提高(表2)。這證實了化合物(l)對于病理過程的有益影響。實驗動物的降低的致死率恰好是對于此的證據(jù)(見表3)。還表示新腦啡肽類似物(l)提高了對于依賴氧的病理狀態(tài)的生物體穩(wěn)定性(例如，中風(fēng)，缺血，流血等)。表2.對具有急性心肌缺血的動物的血液和組織(包含生理溶液，腦啡肽類似物(l)或硝化甘油)測試的代謝結(jié)果動物組對照Ml+生理溶液MI+化合物(1)MI+硝化甘油數(shù)據(jù)6小時n=1224小時n=116小時n=1124小時n=1024小時n=12乳酸鹽(mmol/l)1.44±0.074.03±1.26P<0.052.01±0.05PO.051.61±0.45P>0.051.70±0.09P<0.051.80±0.09PO.05CPK單位/]68.3±5.8134.6±7,6P<0.05108.8±6.2P<0.0593,5±5.3PO.0586.6±4.9P<0.05101.1±6.1P<0.05HF-CPK單位/111.9±1.118.1±0.6P<0.0526.6±2.1P<0.0515.3±0.7P<0.0512.3±0.7P<0.0519.8±1.1PO.05心臟糖原，g勾1.35±0.130.41±0.06P<0.050.46±0,07P<0.051.00±0.12P>0.05.1.11±0.17P>0.05肝糖原，g/kg6.94±0.444.85±0.62PO.056.98±1.02P>0.05表3.具有急劇心肌梗塞的包含生理溶液和腦啡肽類似物(1)的大鼠的致死率動物組N致死率%MI+生理溶液3053MI+化合物(1)，0.05mg/kg3033MI+化合物(1),0.5mg/kq3027結(jié)果顯示根據(jù)本發(fā)明的新腦啡肽類似物(1)具有對實驗性心肌梗塞的過程的有利的影響。形態(tài)學(xué)研究和血液中酶水平的研究證實了心臟保護作用和限制心15肌壞死區(qū)域尺寸的擴展的能力。使用最高治療劑量的硝化甘油和anaprilinum以與傳統(tǒng)用于心肌梗塞治療的藥物比較。顯示出注射了硝化甘油和anaprilinum的動物的高酵素血癥(hyperfermentemia)的衰減速率(decrementrate)和心肌壞死區(qū)域尺寸的衰減(表1和2)比注射新腦啡肽類似物(1)時小得多。得出結(jié)論，新腦啡肽類似物(l)比已知的心臟保護化合物、硝化甘油和anaprilinum更有效地降低心肌缺血損害的程度。新腦啡肽類似物(l)具有抗缺血作用和提高生物體對缺氧的穩(wěn)定性。它限制了有實驗性心肌梗塞的動物的心肌的壞死區(qū)域尺寸的擴展并且降低了實驗動物的致死率。腦啡肽類似物(4)的體內(nèi)心臟保護活性測定用于本研究的大鼠來自實-瞼室動物飼養(yǎng)中心(LabAnimalsBreedingCentre),并且根據(jù)俄羅斯科學(xué)院(IBCRAS)的生物有機化學(xué)研究所(Branch)實驗室動物護理和使用委員會(CommitteeonCareandUseofLaboratoryAnimalsoftheInstituteofBioorganicChemistry(Branch),RussianAcademyofSdence)的立場(position)的策略和指南而伺養(yǎng)。測"i式設(shè)備遵循實驗室標(biāo)準(zhǔn)操作程序(StandardOperatingProcedures)(SOPs)中闡明的要求。心臟缺血大鼠模型動物準(zhǔn)備外科手術(shù)和左冠狀動脈閉塞(LCAO)體重280-380g的雄性Sprague-Dawley(CD)大鼠用于本研究。大鼠通過i.p.給藥烏拉坦(urethane)(l-1.5g/kg)而進(jìn)行麻醉。進(jìn)行氣管切開術(shù)，并且動物的氣管用與嚙齒動物呼吸才幾(型號UGOBASILE7025)相連的套管進(jìn)行插管。利用加熱墊使體溫保持在37。C,并且利用與數(shù)字溫度計相連的在直腸放置的溫度探針進(jìn)行監(jiān)測。體溫被監(jiān)測并被保持在37±1。C。股動脈被分離并且被插管以通過與計算機相連的BP轉(zhuǎn)換器(型號PN:1891-E45,DTXTM,新加坡)測量血壓(BP)。通過特定軟件計算平均動脈壓和心率。右股靜脈被插管以允許給藥肽或鹽水和亞甲藍(lán)染料。進(jìn)行了左胸廓切開術(shù)以在第五肋間空間暴露心臟。除去心包，并且在肺流出道和左心室之間的溝中的左冠狀動脈之下縫合。利用置于心肌表面的管，結(jié)扎線可圍繞左冠狀動脈被拉緊并且被夾緊以提供容易地可逆的血流閉塞。血液動力學(xué)和體溫在過程中#皮監(jiān)測。在經(jīng)受心肌缺血-再灌注的烏拉坦麻醉的開胸大鼠中實施的實驗方案圖示于圖l(見附錄)。所有動物經(jīng)受25分鐘的閉塞和2小時的再灌注。閉塞之前5分鐘給予幾種劑量(0.1ng/kg-lpg/kg)的肽(4)。通過在縫線上拉起并且用塑料管夾住它而閉塞所有大鼠中的冠狀動脈。在25分鐘時，凝塊(clump)被釋放并且允許冠狀動脈再灌注。左心室表面變成粉紅色(pinksup)。120分鐘的再灌注之后，結(jié)扎線再次拉緊以閉塞左冠狀動脈，并且注射2%亞曱藍(lán)染料(0.4ml的10。/。w/v鹽水中)。一旦染料已經(jīng)染色了心臟，除了在危險區(qū)域，清楚地劃界出總的危險區(qū)域(AAR)的界線，然后心臟從動物中快速除去，并且在水中沖洗，并將心房，瓣膜材料和右心室壁除去，僅僅留下左心室。然后將左心室橫向切片為2-mm切片。定義為正常(染為藍(lán)色)的區(qū)域從AAR(未染為藍(lán)色)中分離，并且通過在PH7.4緩沖液中的1%2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetmzoliumchloride)中在37°C下培養(yǎng)15分鐘而染色切片。在2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色之后梗塞的區(qū)域表現(xiàn)為微白色，而非梗塞或存活區(qū)域顏色上表現(xiàn)為微紅色。然后切片浸入10%福爾馬林中5分鐘以固定(fixing)。危險區(qū)域和梗塞尺寸的測量對切片攝相。對于每個切片，梗塞區(qū)域(拒絕2,3,5-三苯基氯化四氮唑)和危險區(qū)域(2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色的)利用計算機化測面法技術(shù)進(jìn)行描繪和數(shù)字化。利用計算機化測面法("ImageTool"程序)估計每個區(qū)^或的面積。梗塞面積除以危險面積以確定梗塞面積/危險面積的比例(IS/AAR)。數(shù)據(jù)被表示為作為AAR的百分比的梗塞尺寸(IS)(即，％IS/AAR),用于統(tǒng)計學(xué)分析心臟保護作用(降低的％IS/AAR)。與載體(vehicle)對照進(jìn)行體內(nèi)梗塞降低的統(tǒng)計學(xué)比較。實驗方案肽(4)的心臟保護效果的劑量-響應(yīng)曲線(與載體對比(11=12))利用在LCAO之前5分鐘以大丸劑的lml/kg劑量(dosingvolume)i.v.給藥肽(4)17劑量0.01(『6)，0.1(n=12),1.0(n=12)pg/kg,和0.005(n=12)mg/kg而得到。肽(4)對于缺血后再灌注損害的影響通過在除去LCAO之后馬上(O分鐘；n=6)給藥l.Opg/kg肽(4)(lml/kg大丸劑)進(jìn)行評價。結(jié)果對心臟保護作用的^t擬劑量-響應(yīng)曲線。對照動物顯示了42.9±2.7的平均梗塞尺寸。當(dāng)在缺血之前5分鐘時給藥，肽(4)顯著降低了被表示為危險區(qū)域的Q/。(IS/AAR)(PO.05;表4)的梗塞尺寸，并且小于在0.2ng/kg和3.2pg/kg之間的劑量時的30%。肽(4)的作用在1.0pg/kg劑量時最大(26.0土3.5Q/())。以0.01pg/kg的低劑量靜脈內(nèi)給藥肽(4)對于梗塞尺寸沒有作用(45.1±4.6%)(附錄的表4和圖2)。肽(4)對于再灌注損害的影響當(dāng)除去LCAO之后馬上給藥時(即，在120分鐘再灌注期開始時)，肽(4)相比對照顯著降低了缺血損害的水平(32.5±2.4%,平均值土S.E.M.;圖3,見附錄)。得出結(jié)論當(dāng)在25分鐘閉塞和120分鐘再灌注期之前5分鐘i.v.給藥雄性Sprague-Dawley大鼠時，肽(4)限制了在體內(nèi)缺血性損害。肽(4)(劑量1.0pg/kg)與鹽水處理的對照相比減小了梗塞面積大約39%(表4)。對于梗塞尺寸的有益效果顯示了對于外科手術(shù)引起的缺血之前和突發(fā)事件中的臨床應(yīng)用的可能性。1表4.在用肽(4)處理的大鼠心臟中的梗塞尺寸數(shù)據(jù)。梗塞尺寸以危險<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>抗缺氧作用新腦啡肽類似物(l)的抗缺氧作用通過測量在正常氣壓的低氧性缺氧條件下的小鼠的生命期而確定。實驗在體重為20到22g的BALB-bread小鼠上進(jìn)行。通過將動物置于包含吸收過量二氧化碳的Ca(OH)2的密封暗室中模擬正常氣壓的低氧性缺氧條件。在將動物置于暗室中之前，腹膜內(nèi)注射研究物質(zhì)1分鐘。肽以1.0mg/kg的劑量進(jìn)行使用。據(jù)發(fā)現(xiàn)，所述劑量對于研究肽的抗缺氧性質(zhì)是最佳的。以最高治療劑量的羥基丁酸鈉(sodiumoxybutyrate)用作對比化合物。生命期以當(dāng)動物停止呼吸運動時的時間進(jìn)行估計。結(jié)果顯示于表5中。表5.腦啡肽類似物和羥基丁酸鈉對于處于低氧性缺氧(hypoxigenation)的小鼠的生命期的影響編號注射的化合物劑量mg/kg動物數(shù)量生命期分鐘P對照(生理溶液)2010.7±0.41Tyr-D-Orn(Ac)-Gly-Phe(N02)-NH21.02216.9±1.10.01對照2012.5±0.3羥基丁酸鈉1000.02015.5±0.40.01注射了新腦啡肽類似物(l)的動物的壽命比對照實驗中的長57%。羥基丁酸鈉的注射與對照實驗相比提高了動物生命期24%。腦啡肽類似物(l)的體內(nèi)止痛活性試驗"尾部夾痛"方法腦啡肽類似物的止痛活性通過"尾部夾痛(tai1pinch)"方法進(jìn)行測定[UedaH.;AmanoH.;ShiomiH.;TakagiH.(1979).Eur.J.Pharmacol.,56,265-268]。通過與對體重為18-22g的遠(yuǎn)系繁殖的雄性小鼠腦池內(nèi)和靜脈內(nèi)給藥的嗎啡、[LeuS]-和[Met"-腦啡肽的比較進(jìn)行研究止痛效果。在每個實驗中使用十只小鼠。將研究的物質(zhì)溶解于無菌生理溶液中并且在J形針頭中以10)^1的劑量注射入清醒的小鼠的腦中。對照動物接受10pl無菌生理溶液。靜脈內(nèi)給藥到尾靜脈。通過用具有200g壓力的動脈夾夾痛小鼠尾巴來測試止痛活性。選擇在施加夾痛之后一秒鐘之內(nèi)咬該夾子的小鼠用于測定。止痛活性定義為大于6秒的咬響應(yīng)(bitingresponse)的潛伏期(latency)。給藥之后5，15,30,60和90分鐘時和然后每30分鐘進(jìn)行止痛測試直到止痛反應(yīng)停止。肽的止痛活性表示為不顯示咬響應(yīng)的小鼠的百分比。結(jié)果總結(jié)于表6和7中。止痛活性以相對于嗎啡進(jìn)行顯示(嗎啡=1)。20表6.腦池內(nèi)給藥時的腦啡肽類似物的止痛活性("尾部夾痛"方法)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>如表6所示，新腦啡肽類似物(l)具有顯著的止痛作用，它比天然腦啡肽(化合物a)、b))有效得多，并且在腦池內(nèi)給藥后效力是阿片樣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)-嗎啡的60倍。不像天然腦啡肽，新腦啡肽類似物(l)在靜脈內(nèi)給藥后是活性的。在靜脈內(nèi)給藥后它的活性是嗎啡的2倍(見表7)。腦啡肽類似物(l,2,3,4,5)的體內(nèi)止痛活性試驗"熱板"法本研究根據(jù)目前的美國FDA的非臨床實驗研究的良好實驗室作業(yè)(GLP)規(guī)范(U.S.FDAGoodLaboratoryPractice(GLP)RegulationsforNon-clinicalLaboratoryStudies)(21CFRPart58)而進(jìn)4亍。實,瞼i殳備遵循實驗室標(biāo)準(zhǔn)操作程序(StandardOperatingProcedures)(SOPs)中規(guī)定要求。肽(l-5)的止痛活性在CD-I雄性小鼠中通過在靜脈內(nèi)給藥后的熱板測試(G.Woolfe和A.D.Macdonald,J.Pharmacol.Exp.Ther.,80,300(1944))進(jìn)行測定。嗎啡已經(jīng)作為對照化合物進(jìn)^f亍測試。度:18-26。C，8a.m,8p.m.亮-暗循環(huán))，接受標(biāo)準(zhǔn)實驗室飲食(LaboratoryRodentDietPK-120)和隨意自來水。小鼠僅僅被測試一次。熱板儀(Hot-plate-meter)表示恒溫可控制的、電加熱的由透明壁(L:25cm,W:25cm,H:35cm)界定的表面。該裝置的前面板裝配了控制時間和溫度才莫式的4安鈕(ColumbusInstruments)。用于靜脈內(nèi)(i.v.)給藥的所有肽和嗎啡溶解于鹽水中。以大丸劑注射的i.v.給藥通過尾靜脈來進(jìn)行。對于所有動物的劑量根據(jù)個體體重的最終值進(jìn)行計算。i.v.注射鹽水或肽之后，將動物準(zhǔn)確地置于預(yù)加熱的熱板(55士0.5。C)上，并且測量首次舔足和首次跳躍的潛伏期。其他行為反應(yīng)被忽略。首次跳3夭之后動物/人熱表面移走。利用180s的截止時間(cut-offtime)避免組織損害。為評價熱板測試響應(yīng)，在注射鹽水或肽之后分別地測定對照潛伏期(t0)和測試潛伏期(ti)。最大可能作用百分比(％MPE)以。/oMPEKt廣to)/(trto)xlOO進(jìn)行計算，其中截止時間(t2)為180s。在熱板測試中首次跳躍的潛伏期被認(rèn)為是最有指示性。表示為跳躍潛伏期的肽(l-5)(劑量8pmol/kg)的止痛活性表示于圖4中(見附錄)。時間-響應(yīng)曲線之下的面積通過別處描述的方法進(jìn)行計算(CiceroandMeyer,1973),以評價抗痛的等級(圖5,見附錄)。與嗎啡對比的結(jié)果示于圖6(見附錄)。還對該參數(shù)計算了半數(shù)止痛劑量(ED5。)。在靜脈內(nèi)給藥后15分鐘的時間點在小鼠熱板測試中肽(l,2,3,5)的止痛活性的結(jié)果示于表8中。如圖4所示(見附錄)，在向小鼠i.v.給藥后("熱板"法)，腦啡肽類似物(l-5)具有持續(xù)最多90-300分鐘的顯著的止痛作用。肽(1)和(5)顯示出類似的表現(xiàn)(profiles),然而肽(3)顯示出15分鐘的遲延效果并且在那以后具有與肽(1)和(5)類似表現(xiàn)。肽(4)顯示出顯著的止痛作用，并在30分鐘時顯示最大值。但是，肽(4)的止痛作用比其他四種測試的肽的作用更弱。22表8.靜脈給藥之后在15分鐘的時間點在小鼠熱板測試中肽(1,2，3,5)的止痛活性<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在熱板測試中，肽(l-5),新合成的腦啡肽類似物具有顯著的止痛活性。肽(3)和(5)顯示了幾乎與嗎啡相似的止痛能力。肽(l)(ED》1.27mg/kg)和肽(2)(ED5o丄7mg/kg)被證明為最活性的。肽(1)和(2)的止痛活性分別是嗎啡2和1.5倍(表8)。體外止痛活性試驗GPI和MVD生物試-險肽對于外周阿片樣物質(zhì)受體的作用通過抑制具有腸系膜神經(jīng)叢的豚鼠回腸的縱肌和小鼠輸精管的電刺激引起的片段收縮能力進(jìn)行測定[PatonW.D.M.;VisiE.S.(1969).Brit.J.Pharmacol.,35,10-28]。來自任何性別豚鼠(體重350-550g)的回腸縱肌與下面的環(huán)狀肌中仔細(xì)地分離并且置于具有36°C的Krebs溶液的小池中。持續(xù)對溶液充氣。對組織應(yīng)用0.2g的恒定的負(fù)荷。利用環(huán)狀鉑電極通過0.1Hz頻率1iusec持續(xù)時間的單脈沖刺激該組織。在與NihonKohden多道記錄儀(polygraph)相連的TB-611T記錄器上記錄等長收縮。將小鼠(體重2孓30g)輸精管置于具有31°C的改性Krebs溶液(不包含硫酸鎂))的池中。將研究的物質(zhì)溶解于蒸餾水中。通過累積劑量、在不洗滌時添加漸增濃度的化合物進(jìn)行測定化合物的抑制活性。制劑的活性表示為IC50(nmol/l)。在8-10個測試中獲得的結(jié)果利用Student's標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。表9顯示了具有P0.05的可靠區(qū)間的IC50。表9.腦啡肽類似物在豚鼠回腸(GPI)和d、鼠輸精管(MVD)中的阿片類物質(zhì)活性<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>在GPI試驗中(主要是p-型阿片類物質(zhì)受體)腦啡肽類似物(1)顯示了高效力水平。它的p-親和性是[Leu勺-腦啡肽的親和性的23倍。腦啡肽類似物(1)也比嗎啡活躍一個數(shù)量級(order)。結(jié)論因此我們顯示了新肽的顯著心臟保護活性(降低梗塞尺寸24-39%),比其他已知心臟保護藥物例如硝化甘油和(3-腎上腺素阻斷劑anaprilinum提供的更好的對心肌的缺血損害的保護，比已知的藥理學(xué)藥物(如羥基丁酸鈉)顯著的抗缺氧作用，和比靜脈給藥的嗎啡更顯著和更持久的止痛活性。權(quán)利要求1.包含以下四肽結(jié)構(gòu)的化合物A-B-C-D其中，氨基酸殘基A的N-末端NH2的每個氫任選地可獨立地被C1-5烷基和C1-5?；〈?，A-是芳族氨基酸殘基，其中芳族環(huán)任選地可用一個或多個硝基取代，B-是二氨基酸殘基，其中側(cè)鏈氨基基團用C1-5?；珻1-5烷基，-B’-C1-5?；?B’-C1-5烷基取代，其中B’是任選地可用一個或多個硝基取代的氨基酸殘基，C-是Gly，其中肽N-H任選地可被改變?yōu)镹-甲基，D-是Phe，其在芳族環(huán)上用至少一個硝基取代并且任選地在芳族環(huán)上進(jìn)一步用一個或多個獨立選自硝基，氟代，氯代，溴代，碘代，CF3或CN的基團取代，其中肽N-H任選地可被改變?yōu)镹-甲基，和氨基酸殘基D的C-末端C＝O用NH2，NHC1-5烷基，NH-NH2，NH-NHC1-5烷基，或O-C1-5烷基取代；或C-末端是COOH或CH2OH，或其藥學(xué)上可接受的鹽。2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中N-末端NH2未被取代。3.如前述權(quán)利要求任一項所述的化合物，其中A-選自Tyr,Thyronine,Phe或Trp,其中芳族環(huán)任選地可用一個或多個硝基取代，優(yōu)選地A是未被取代的Tyr。4.如前述權(quán)利要求任一項所述的化合物，其中B-是Dap,Dab，Orn,Lys,4,5-脫氫-賴氨酸或2,6-二氨基-4-己炔酸，其中側(cè)鏈氨基基團用Cw酰基，Cw烷基，-B，-Cw酰基或-B，-Cw烷基取代。5.如前述權(quán)利要求任一項所述的化合物，其中，B-是Dab,Orn或Lys,其中側(cè)鏈氨基基團用?；?，Cw烷基，-B，-Cw?；?B，-d.5烷基取代，并且優(yōu)選地B是用C"5酰基取代的Orn。6.如前述權(quán)利要求任一項所述的化合物，其中B的側(cè)鏈氨基基團用d-5酰基或-B，-d-5?；?，優(yōu)選地d.5?；?，更優(yōu)選地乙?；〈?。7.如前述權(quán)利要求任一項所述的化合物，其中B，-是Gly,Ala,Pro,Leu,Asn或Met，優(yōu)選地Gly或Asn。8.如前述權(quán)利要求任一項所述的化合物，其中C-是未被取代的Gly。9.如前述權(quán)利要求任一項所述的化合物，其中D-是Phe,其在對位用硝基取代，并且任選地進(jìn)一步在芳族環(huán)上用一個或多個獨立選自硝基，氟代，氯代，溴代，碘代，CFs或CN的基團取代，其中肽N-H任選地可浮皮改變?yōu)镹-甲基，并且優(yōu)選地在芳族環(huán)上唯一的取代基是對-硝基。10.如前述權(quán)利要求任一項所述的化合物，其中氨基酸殘基D的C-末端C=0用NH2取代。11.如權(quán)利要求1所述的化合物，其包含下列結(jié)構(gòu)Tyr-D-Orn(Ac)-Gly-Phe(p-N02)-NH2。12.藥物組合物，其包含如前述權(quán)利要求任一項所述的化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑，載體或賦形劑。13.用作藥物的權(quán)利要求1-11任一項中所述的化合物或權(quán)利要求12所述的藥物組合物。14.權(quán)利要求1-11任一項所述的化合物用于制備用于組織保護治療，優(yōu)選地心臟保護治療的藥物的用途。15.權(quán)利要求1-11任一項所述的化合物用于制備用于抗缺氧治療的藥物的用途。16.權(quán)利要求l-ll任一項所述的化合物用于制備用于止痛治療的藥物的用途。17.權(quán)利要求l-ll任一項所述的化合物用于制備用于抗缺血治療的藥物的用途。18.權(quán)利要求1-11任一項所述的化合物用于制備用于與抗缺氧或止痛治療兩者之一或與這兩者的結(jié)合的組織保護治療，優(yōu)選地心臟保護治療的藥物的用途。19.實施在權(quán)利要求14-18任一項中所說明的治療的方法，其包括向需要治療的受試者給藥有效量的如權(quán)利要求1-11任一項所述的化合物或如權(quán)利要求12中所述的藥物組合物。全文摘要組織保護化合物包括四肽結(jié)構(gòu)A-B-C-D，其中氨基酸殘基A的N-末端NH₂的每個氫任選地可獨立地被C_1-5烷基和C_1-5?；〈?，A-是芳族氨基酸殘基，其中芳族環(huán)任選地可用一個或多個硝基取代，B-是二氨基酸殘基，其中側(cè)鏈氨基基團用C_1-5?；?，C_1-5烷基，-B’-C_1-5?；?B’-C_1-5烷基取代，其中B’是任選地可用一個或多個硝基取代的氨基酸殘基，C-是Gly，其中肽N-H任選地可被改變?yōu)镹-甲基，D-是Phe，其在芳族環(huán)上用至少一個硝基取代并且在芳族環(huán)上任選地進(jìn)一步用獨立選自硝基，氟代，氯代，溴代，碘代，CF3或CN的一個或多個基團取代，其中肽N-H任選地可被改變?yōu)镹-甲基，并且氨基酸殘基D的C-末端C＝O用NH₂，NHC_1-5烷基，NH-NH₂，NH-NHC_1-5烷基，或O-C_1-5烷基取代；或C-末端是COOH或CH₂OH，或其藥學(xué)上可接受的鹽。文檔編號A61P9/00GK101506225SQ200780030604公開日2009年8月12日申請日期2007年8月17日優(yōu)先權(quán)日2006年8月17日發(fā)明者I·博布羅瓦申請人:埃里比斯藥品公司