專利名稱：一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鹿血活性肽，具體地說是一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶
(angiotensin-converting enzyme, ACE)抑制劑及其制備，本發(fā)明制備的鹿 血活性肽具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性和增強(qiáng)免疫力活性。
背景技術(shù)：
鹿血中蛋白質(zhì)含量占13%以上，是鹿血中的主要成分。蛋白質(zhì)是由肽 組成的，具有生理作用的肽類化合物稱為功能肽或生物活性肽，活性肽具 有抗氧化、降血壓、提高免疫力、抗腫瘤、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收等活性，不同 來源的蛋白質(zhì)制備具有各種功能的活性肽已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)(參考 文獻(xiàn)l: Hannu Korhonen， Anne Pihlanto; Bioactive peptides: Production and functionality, /她r"ario"a/Da—丄訓(xùn)""6 (2006) 945—960)。具有保健功 能的鹿血中豐富的蛋白質(zhì)是理想的活性肽原料。
高血壓是我國發(fā)病率非常高的常見心血管疾病，是引發(fā)心、腦、腎和眼 血管等各種并發(fā)癥并導(dǎo)致中風(fēng)、促進(jìn)動脈粥樣硬化、冠心病的一個(gè)重要危 險(xiǎn)因子。高血壓早期一般沒有不適癥狀，直至發(fā)生臨床現(xiàn)象一心臟發(fā)病、 腦血管破裂，因此有高血壓家族史及輕微癥狀者的早期保健就至關(guān)重要。
血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)抑制劑是現(xiàn) 今治療高血壓與心力衰竭的主要藥物(參考文獻(xiàn)2: YANJUNYANQ EWAD. MARCZAK, MEGUMI YOKOO, HACHIRO USUI, AND MASAAKI YOSHIKAWA; Isolation and Antihypertensive Effect of Angiotensin I-Converting Enzyme (ACE) Inhibitory Peptides from Spinach Rubisco ， 《/ jgr/c. Food C/ze/w. 2003, 51, 4897-4902 4897)。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶可將不具活性的
十肽血管緊張素i轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)烈收縮血管作用的八肽血管緊張素n，導(dǎo)致
血壓升高，因此ACE抑制劑可有效控制高血壓而且在心力衰竭等疾病的治 療中發(fā)揮重要作用。肽類化合物是一類重要的ACE抑制劑，肽類ACE抑制 劑對高血壓患者有降壓作用而對血壓正常者無作用，因此是理想的潛在高 血壓患者的保健品。
天然蛋白質(zhì)的酶解是制備具有ACE抑制活性的肽的主要方法，溫和的 酶解條件對于已知有保健作用的鹿血來說不會破壞其固有的活性而且可產(chǎn) 生新的活性肽類化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑及其制備；其以鹿血 活性肽為活性成份，鹿血活性肽具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性和增強(qiáng)免 疫力活性。本發(fā)明通過酶解的方法制備鹿血活性肽，制備工藝簡單、條件溫和，具有良好的應(yīng)用前景
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，其以鹿血活性肽為活性成份，鹿血活 性肽具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性和增強(qiáng)免疫力活性。
所述血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的制備方法，以新鮮的鹿血為原料，鹿血 經(jīng)離心分離后，取上清，上清即為血漿蛋白，血漿蛋白經(jīng)化學(xué)或熱變性、 變性后的蛋白質(zhì)冷凍干燥，用pH2 9的磷酸緩沖液溶解成重量濃度1 50 %的溶液，加入蛋白質(zhì)水解酶，酶的加入量為酶蛋白質(zhì)重量比=1: 10
500，在20 8(TC溫度下酶解0.5 24小時(shí)，再冷凍干燥得到鹿血多肽，活 性肽檢測具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性和免疫增強(qiáng)活性。
所述離心分離過程為，以新鮮的鹿血為原料，取1 2升鹿血，在4。C、 鹿血經(jīng)3000 15000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下離心0.1 2小時(shí)，沉淀為血細(xì)胞，上清 為鹿血血漿蛋白用于制備活性肽。
所述化學(xué)變性過程為于鹿血血漿蛋白中加入尿素至終濃度為 8-10mol/L，攪拌10-20分鐘；所述熱變性過程為將鹿血血漿蛋白加熱至 60-100 °C 10-60分鐘。
蛋白質(zhì)水解酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性 蛋白酶或中性蛋白酶。
本發(fā)明將鹿血經(jīng)離心即可得到蛋白質(zhì)含量、純度較好的血槳蛋白，省 略了繁瑣的分離純化步驟；血漿蛋白是由肽、免疫蛋白和許多微量元素組 成的具有免疫功能鹿血組分，酶解的方法保留了其本身具有活性的功能。
本發(fā)明的特點(diǎn)如下
1. 活性肽的生理活性顯著。采用本發(fā)明制備工藝，首次從鹿血中獲得 具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性和免疫增強(qiáng)活性的肽類物質(zhì)。
2. 反應(yīng)條件溫和、方法簡便可行。本發(fā)明活性肽的制備是通過酶解的 方法，反應(yīng)條件溫和，既可制備活性肽又保留鹿血中原有的活性組分，反 應(yīng)方法簡單可行。
3. 具有良好的應(yīng)用前景。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑可降低高血壓患者 的血壓，通過本發(fā)明制備的活性肽有可能成為降血壓保健品同時(shí)又具有提 高免疫力的功能，因此具有良好的應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備的鹿血活性肽分子量分布圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
以新鮮鹿血為原料，按照以下工藝制備鹿血多肽
取l升新鮮鹿血，在4。C、 3000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下離心1小時(shí)，取上清在 10(TC變性4小時(shí)，變性后的蛋白質(zhì)冷凍千燥，干燥的蛋白質(zhì)粉末用pH=2 的磷酸緩沖液溶解成濃度為1%的溶液，加胃蛋白酶，酶的加入量為酶蛋白質(zhì)=1: 100，在2(TC溫度下水解0.5小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后冷凍干燥，得到 粉末狀鹿血活性肽。
通過基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI—MS)所測定的本發(fā)明實(shí)施 例1制備的活性肽的分子量分布如圖1所示，酶解所得的肽分子量主要分 布在2000道爾頓以下，說明通過本工藝可將大分子量的蛋白質(zhì)水解為分子 量較小的肽類化合物。
鹿血活性肽的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性為IC5Q=0.4mg/ml，小鼠的 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明在濃度為10ug/ml時(shí)，免疫增強(qiáng) 活性呈陽性。
ACE抑制活性及增強(qiáng)免疫活性過程為 將上述方法制備的活性肽進(jìn)行ACE抑制活性和免疫增強(qiáng)活性檢測， 結(jié)果如下 一
1) ACE抑制活性檢測方法采用文獻(xiàn)(B. A.Murray, D.J.Walsh, R.J. Fitzgerald, Modification of the fUranacryloyl-L-phenylalanyglycylglycine assay for determination of angiotensin-I-converting enzyme inhibiotory activity, Journal of biochemical and biophysical methods, 2004， 59: 127-137)所報(bào)道& 方法，檢測活性肽ACE抑制活性，以肽FAGG為底物，ACE將FAGG轉(zhuǎn) 化為FA和GG兩個(gè)肽，在340nm紫外吸光度的變化得到ACE的活性，將 加入活性肽與未活性肽時(shí)ACE活性相比可得到活性肽的ACE抑制率。通 過該方法制備的活性肽的ACE抑制率為90% ，而未酶解的血漿蛋白的ACE 抑制率為10%。
2) 增強(qiáng)免疫活性的檢測通過ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)， 以MTT法進(jìn)行檢測。當(dāng)T淋巴細(xì)胞受ConA刺激后發(fā)生母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，活細(xì) 胞特別是增殖細(xì)胞通過線粒體水解酶將MTT (—種淡黃色的唑氮鹽)分解 為蘭紫色結(jié)晶而顯色，其光密度值能反映細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果采用方差 分析，加入活性肽的實(shí)驗(yàn)組小鼠脾淋巴細(xì)胞增值顯著(P<0.05)，說明活性 肽具有增強(qiáng)免疫活性。
實(shí)施例2
取1升新鮮鹿血，在4°C、 15000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下離心0.1小時(shí)，取上清 加入尿素480克，變性1小時(shí)后取出蛋白質(zhì)冷凍干燥，干燥的蛋白質(zhì)粉末 用pH8的磷酸緩沖液溶解成濃度為50X的溶液，加中性蛋白酶，酶的加入 量為酶蛋白質(zhì)=1: 500，在8(TC溫度下水解24小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后冷凍千 燥，得到粉末狀鹿血活性肽。
活性肽的活性檢測結(jié)果與實(shí)施例1相同。
權(quán)利要求
1. 一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，其特征在于其以鹿血活性肽為活性成份，鹿血活性肽具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性和增強(qiáng)免疫力活性。
2. —種權(quán)利要求1所述血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的制備方法，其特征 在于以新鮮的鹿血為原料，鹿血經(jīng)離心分離后，取上清，上清即為血漿 蛋白，血漿蛋白經(jīng)化學(xué)或熱變性、變性后的蛋白質(zhì)冷凍干燥，用pH2 9的磷酸緩沖液溶解成重量濃度1 50%的溶液，加入蛋白質(zhì)水解酶，酶的加入 量為酶蛋白質(zhì)重量比=1: 10 500，在20 8(TC溫度下酶解0.5 24小 時(shí)，再冷凍干燥得到鹿血多肽，活性肽檢測具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活 性和免疫增強(qiáng)活性
3. 按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述離心分離過程為，在4。C、鹿血經(jīng)3000 15000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下離心0.1 2小時(shí)，沉淀為 血細(xì)胞，上清用于制備活性肽。
4. 按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于 所述化學(xué)變性過程為于鹿血上清中加入尿素至終濃度為8-0mol/L，攪拌10-20分鐘；所述熱變性過程為將鹿血上清加熱至60-10(TC 10-60分 鐘。
5. 按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于蛋白水解酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶或中性蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及鹿血活性肽，具體地說是一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑及其制備，其以鹿血活性肽為活性成份，鹿血活性肽具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性和增強(qiáng)免疫力活性。本發(fā)明通過酶解的方法制備鹿血活性肽，制備工藝簡單、條件溫和，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K38/57GK101461939SQ200710159029
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者唐樹友, 鄒漢法, 艷 靳 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所