專利名稱：：一種丹參總酚酸的制備方法及其在防治糖尿病及并發(fā)癥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種水溶性提取物丹參總酚酸的制備方法及其在制藥領(lǐng)域的新用途。具體地說(shuō)，即丹參的水溶性提取物丹參總酚酸的制備方法，以及該提取物在防治糖尿病及其并發(fā)癥上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：丹參(RadixSalviae)，別名血生根、赤參、血參、紅根。英文名RootofDan-Shen，為唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)的干燥根及根莖，是著名的活血化瘀中藥，神農(nóng)本草經(jīng)列為上品。丹參的化學(xué)成分主要分為脂溶性和水溶性兩類。水溶性成分主要是丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸A、B、C、D、E、F、G等。這些成分多具有酚酸性結(jié)構(gòu)，最早發(fā)現(xiàn)的丹參素化學(xué)名為P-3,4-二羥苯乳酸(D(+)(3，4-Dihydroxyphenyl)lacticacid)是各種丹酚酸的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)，丹酚酸A(salvianolicacidA)是一分子丹參素與兩分子咖啡酸縮合而成；丹酚酸B(salvianolicacidB)為三分子丹參素與一分子咖啡酸縮合而成；丹酚酸C(salvianolicacidC)則為二分子丹參素縮合而成，丹參的脂溶性成分大多為共軛醌、酮類化合物，具有特征的橙黃色和橙紅色。丹參素為丹參的主要活性成分，具有抗心肌缺血的作用，為治療冠心病的主要成分，它能明顯擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，使其血流量顯著增加；原兒茶醛為抗心絞痛的主要成分；總酚酸類成分具有很強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化和清除自由基等作用，并有縮小腦梗塞面積、減輕腦水腫的功效，離體研究發(fā)現(xiàn)其抗氧化作用極為明顯。近年的研究進(jìn)一步表明丹酚酸類的抗肝臟損傷、抗動(dòng)脈粥樣硬化及細(xì)胞凋亡以及改善記憶功能障礙等方面有著顯著的活性，對(duì)艾滋病病毒具有抑制作用，實(shí)驗(yàn)表明，丹酚酸類成分在低濃度時(shí)可以抑制細(xì)胞病變、抑制病毒抗原表達(dá)和病毒的產(chǎn)生。其中含量最高的兩個(gè)成分丹酚酸A(SalA)和丹酚酸B(SalB)活性最強(qiáng)，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化引起的細(xì)胞膜損傷有明顯的保護(hù)作用(中國(guó)專利CN01110378,7)。糖尿病是現(xiàn)代疾病中的第二殺手，其對(duì)人體的危害僅次于癌癥。糖尿病本身并不可怕，可怕的是糖尿病的并發(fā)癥，糖尿病帶來(lái)的危害，幾乎都來(lái)自它的并發(fā)癥。糖尿病的并發(fā)癥包括急性并發(fā)癥和慢性并發(fā)癥，慢性并發(fā)癥有糖尿病腎病、糖尿病眼病、糖尿病神經(jīng)病變、糖尿病足、糖尿病心、腦大血管病變，主要是由于血糖長(zhǎng)期異常，日積月累而引起的一種改變，包括大血管、微血管和神經(jīng)病變，可使人們健康水平和勞動(dòng)能力大大下降。甚至造成殘廢或過(guò)早死亡。預(yù)防糖尿病只是我們的第一道防線；當(dāng)這道防線被擊潰后，我們還有第二道防線，預(yù)防糖尿病并發(fā)癥；還有第三道防線，降低糖尿病慢性并發(fā)癥引起的殘廢和早亡。由于糖尿病本身及其合并癥對(duì)人們的身心健康危害越來(lái)越大，因此，我們有必要尋找更好的藥物和治療方法來(lái)攻克這一世界難題。在我國(guó)，糖尿病腎病的發(fā)病率大約為40%。糖尿病腎病的發(fā)生是由多因素共同作用的結(jié)果糖代謝紊亂、腎臟血流動(dòng)力學(xué)的改變、多種細(xì)胞因子以及遺傳背景均起非常重要的作用。目前，糖尿病腎病的治療措施包括控制血糖，控制血壓，蛋白質(zhì)攝入限制，控制血脂，透析，腎移植等。目前已有大量涉及丹參治療糖尿病并發(fā)癥的報(bào)道，中國(guó)專利CN1534010A在2004年公開了丹參水提物用于治療高血壓伴糖尿病腎病的用途，該提取物主要包含有丹參酚酸B、丹參素、原紫草酸三種丹參酚酸在內(nèi)的丹參酚酸成分；中國(guó)專利CN1651433A在2005年公開了丹酚酸黃連素復(fù)合鹽在防治糖尿病慢性并發(fā)癥上的用途。丹參能改善糖、脂代謝，降低患者空腹血糖和糖化血紅蛋白水平，有改善血管內(nèi)皮、降低動(dòng)脈粥樣硬化的形成等功效(《中成藥》Vol.27.No.12:附7-附8，2006)。丹參可清除自由基，抗脂質(zhì)過(guò)氧化糾正6-keto-PGFla/TXB2失衡，抑制血小板活化和聚集，增加神經(jīng)的血液灌注，改善神經(jīng)缺氧缺血，長(zhǎng)期應(yīng)用可以有效地防治糖尿病神經(jīng)病變和糖尿病其他慢性并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展(《中成藥》Vol.28.No.5:701-702，2006)，同時(shí)丹參能改善2型糖尿病患者血管病變、神經(jīng)病變和受損的血管平滑肌舒張功能，治療ED，改善性功能。(《中成藥》Vol.28N0.7:1084-1086，2006)。丹參可以使糖尿病腎病治療組大鼠TGF-J31、CTGF、PAI-1等細(xì)胞因子的表達(dá)較糖尿病腎病模型組有明顯下降，說(shuō)明丹參可顯著降低糖尿病腎病大鼠腎臟TGF-J31、CTGF、PAI-l等細(xì)胞因子的表達(dá)水平、減少ECM的沉積、縮小腎小球體積、減少尿白蛋白的排泄，從而起到較好的保護(hù)腎臟的作用。(《中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)》Vol.3，No.6:459-462，2005)。但是目前用于糖尿病并發(fā)癥的丹參制劑大部分屬于中藥復(fù)方制劑、復(fù)鹽制劑或丹參浸膏初提物及某一種單體，如丹酚酸A、丹酚酸B，治療效果不甚明顯；同時(shí)，缺乏目前臨床上常用藥物的比較數(shù)據(jù)。而本發(fā)明通過(guò)精制提取得到的丹參總酚酸，不僅含有較多的丹酚酸B，還含有接近相同比例的丹酚酸A，兩者在該總酚酸中的比例高達(dá)90%。相比于其他提取物制劑，該總酚酸不僅能溫和地降低血糖，而且可以通過(guò)改善血脂紊亂、降低血液流變性等機(jī)制，更好地發(fā)揮丹參防治糖尿病并發(fā)癥的作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過(guò)精制提取得到的丹參總酚酸，更好地發(fā)揮了丹參總酚酸防治糖尿病并發(fā)癥的作用，主要是糖尿病腎病、肝損傷及患者血液流變性的改變。本發(fā)明的丹參總酚酸提取工藝包括如下步驟(1)提取丹參粗粉，加410倍量的水或醇水溶液提取24次，每次1.02.O小時(shí)，濾過(guò)；(2)柱層析純化總酚酸合并濾液離心(4000轉(zhuǎn)/分鐘)10分鐘，取上清液過(guò)D1400型大孔吸附樹脂柱，先用水洗至糖檢測(cè)反應(yīng)為陰性，改用1035%醇水溶液洗210倍柱體積；(3)用4080%醇水溶液洗脫，收集洗脫液，同時(shí)分析測(cè)定洗脫液中丹酚酸A和丹酚酸B的含量，當(dāng)?shù)し铀酇:丹酚酸B=0.901.10:1時(shí)，收集該部分洗脫液，6(TC減壓濃縮洗脫液至無(wú)醇味；(4)調(diào)PH值，有機(jī)溶劑萃取加鹽酸調(diào)節(jié)PH值至35，用洗脫液12倍量體積的有機(jī)溶劑萃取24次，合并有機(jī)溶劑相；(5)濃縮干燥減壓濃縮萃取液至浸膏狀，6(TC真空干燥6小時(shí)，得黃色粉末，即丹參總酚酸。該工藝提取的丹參總酚酸中主要成分為丹酚酸A和丹酚酸B，兩者的比例為丹酚酸A:丹酚酸B二O.901.10:1，兩者在總提取物中含量高達(dá)90%。步驟(1)、(2)、(3)里的醇水溶液指的是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇的水溶液，或它們的混合物。步驟(4)中所述的有機(jī)溶劑指的是乙酸酯類。可以是乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯或它們的混合物。用該提取工藝得到的丹參總酚酸結(jié)合藥學(xué)上可以接受的輔料和(或)載體可制成各種制劑，如丹酚酸膠囊制劑、片劑、注射劑。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，相對(duì)于其他治療糖尿病及并發(fā)癥的藥物，利用本發(fā)明制備的提取物制成的丹酚酸膠囊制劑具有更好的安全性和療效。通過(guò)藥理試驗(yàn)表明，給予高、中、低劑量丹酚酸膠囊能顯著降低2型糖尿病大鼠低切、中切、高切的全血粘度，降低紅血漿粘度、卡松粘度和紅細(xì)胞電泳指數(shù)，改善血液流變性，有較強(qiáng)的活血化瘀作用；并通過(guò)改善2型糖尿病大鼠的血液流變性，來(lái)改善其糖代謝異常、改善脂代謝紊亂、改善肝腎功能、改善自由基代謝異常等作用，從而使2型糖尿病的并發(fā)癥得到明顯的改善，其肝、腎等組織得到保護(hù)作用，有效防止或延緩2型糖尿病的并發(fā)癥進(jìn)一步發(fā)展。利用本發(fā)明制備的提取物制成的丹酚酸膠囊制劑可以通過(guò)降低NO和N0S的產(chǎn)生，降低尿酸(UA)、腎小球肌酐清除率(Ccr)、U-TP排泄率、U-ALB排泄率和尿糖排泄率等藥理作用防治糖尿病腎病。連續(xù)8周給予高、中劑量丹酚酸膠囊可明顯降低在血清中ALT水平(P〈0.05，P〈0.01)，且呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系，高劑量丹酚酸膠囊在肝組織保護(hù)作用上強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組；說(shuō)明丹酚酸膠囊有改善肝功能的作用。與鹽酸羅格列酮比較，丹酚酸膠囊雖然在降糖降脂作用弱于5mgkg—'鹽酸羅格列酮，但在改善2型糖尿病大鼠的血液流變性、降低血小板聚集的作用，改善脂代謝和蛋白代謝、保護(hù)對(duì)肝、腎功能和防止或延緩2型糖尿病的并發(fā)癥進(jìn)一步發(fā)展均優(yōu)于5mgkg—'鹽酸羅格列酮，尤其是防止或延緩2型糖尿病的并發(fā)癥，丹酚酸膠囊的治療效果更佳。同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果中各種指標(biāo)的改善均優(yōu)于目前市場(chǎng)上或文獻(xiàn)報(bào)道試驗(yàn)中使用的各種丹參制劑。丹酚酸膠囊的安全藥理性研究表明，該制劑具有良好的安全性，相關(guān)毒理學(xué)研究結(jié)果如下1、"丹酚酸膠囊"對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞無(wú)微核誘發(fā)作用。2、丹酚酸膠囊長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)表明，SD大鼠連續(xù)六個(gè)月經(jīng)口給予高達(dá)相當(dāng)于大鼠有效劑量的30倍、人臨床擬用劑量的168倍的"丹酚酸膠囊"對(duì)SD大鼠無(wú)明顯的毒副反應(yīng)，中毒靶器官和中毒劑量也未明顯顯示，毒副反應(yīng)劑量為4.5g/(kg.d)，并呈可逆性，安全劑量為1.5g/(kg.d)，無(wú)毒(影響)劑量為0.5g/(kg.d)。3、根據(jù)丹酚酸膠囊大鼠、小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明健康清潔級(jí)SD大鼠和ICR小鼠分別單次經(jīng)口(po)和腹腔注射(ip)給予丹酚酸膠囊，對(duì)大、小鼠經(jīng)口給予丹酚酸膠囊的最大耐受量為(l).大鼠>15.0g/kg，(2).小鼠〉10.Og/kg;對(duì)大、小鼠腹腔注射(ip)給予丹酚酸膠囊的急性半數(shù)致死量(LD5U)及95%可信限值分別為(l).大鼠1.11(0.941.32)g/kg，(2).小鼠1.99(1.652.40)g/kg4、小鼠經(jīng)口給予丹酚酸膠囊在高達(dá)46倍動(dòng)物等效劑量條件下顯示對(duì)個(gè)別小鼠精神神經(jīng)系統(tǒng)有輕微影響，主要表現(xiàn)為自主活動(dòng)數(shù)略增加。對(duì)犬心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和體溫也無(wú)明顯影響。對(duì)小鼠精神神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)明顯影響；對(duì)犬心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和體溫也無(wú)明顯影響。5、根據(jù)丹酚酸膠囊長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)，Beagle犬連續(xù)九個(gè)月經(jīng)口給予相當(dāng)于犬等效劑量16倍的丹酚酸膠囊未見明顯的不良反應(yīng)，中毒靶器官和中毒劑量未明顯顯示，丹酚酸膠囊對(duì)Beagle犬的安全劑量大于0.8g/(kg.d)綜上可見本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明提出了一種新方法提取丹參總酚酸的新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。2.本發(fā)明的丹參總酚酸提取物是從常用中草藥中分離提取得到的，安全性高，藥理作用強(qiáng)，有著很好的藥用前景。3.本發(fā)明的化合物采用的提取技術(shù)所得的化合物有效成分含量高，原料來(lái)源廣泛，適合大生產(chǎn)的工藝要求。4.用本發(fā)明的提取物制備的藥物具有較明顯的改善2型糖尿病并發(fā)癥的作用，低劑量的情況下即具有一定的藥效，并呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系。5.本發(fā)明的物質(zhì)在改善大部分2型糖尿病并發(fā)癥的作用上明顯優(yōu)于目前市場(chǎng)上常用的5mgkg—'鹽酸羅格列酮。6.本發(fā)明的物質(zhì)經(jīng)過(guò)安全藥理試驗(yàn)證明其具有良好的安全性。圖說(shuō)明1丹酚酸A對(duì)照品2丹酚酸B對(duì)照品3實(shí)施例l產(chǎn)品4實(shí)施例2產(chǎn)品5實(shí)施例3產(chǎn)品6實(shí)施例4產(chǎn)品高效液相含量測(cè)定圖高效液相含量測(cè)定圖高效液相含量測(cè)定圖高效液相含量測(cè)定圖高效液相含量測(cè)定圖高效液相含量測(cè)定圖具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例l:丹參總酚酸的制備1、水提取(溫浸法)丹參粗粉1000g，力卩8倍量水8(TC溫浸3次，每次l.O小時(shí)，濾過(guò)。2、柱層析純化總酚酸合并濾液離心(4000轉(zhuǎn)/分鐘)10分鐘，取上清液過(guò)D1400型大孔吸附樹脂柱，先用水洗至糖檢測(cè)反應(yīng)為陰性，改用20%乙醇洗脫10倍柱體積。(3)用50%的乙醇洗脫，收集洗脫液，同時(shí)分析測(cè)定洗脫液中丹酚酸A和丹酚酸B的含量，當(dāng)?shù)し铀酇:丹酚酸B=0.901.10:1時(shí)，收集該部分洗脫液，6(TC減壓濃縮洗脫液至無(wú)醇味；(4)調(diào)PH值，有機(jī)溶劑萃取加鹽酸調(diào)節(jié)PH值至3，用洗脫液1.5倍量體積的有機(jī)溶劑萃取4次，合并有機(jī)溶劑相；附5、濃縮干燥減壓濃縮萃取液至浸膏狀，6CTC真空千燥6小時(shí)，得淡黃色粉末，即丹參總酚酸步驟(3)中洗脫液的含量測(cè)定方法同產(chǎn)物的含量測(cè)定方法，具體如下使用儀器類型高效液相色譜儀檢測(cè)器紫外檢測(cè)器儀器型號(hào)Agilent1100檢測(cè)波長(zhǎng)285nm柱型號(hào)KromasilKR100-7C18柱(250X4.6mm)梯度方法恒流積分方法面積歸一法所得的丹參總酚酸中丹酚酸A和丹酚酸B的比例為0.99:1實(shí)施例2與實(shí)施例1基本相同，所不同的是提取過(guò)程為60%乙醇水溶液回流提取。具體方法如下丹參粗粉，加10倍量60%乙醇回流提取3次，每次1.5小時(shí)，濾過(guò)。所得的丹參總酚酸中丹酚酸A和丹酚酸B的比例為0.96:1實(shí)施例3與實(shí)施例l基本相同，所不同的是柱層析純化總酚酸時(shí)用20%乙醇洗脫8倍柱體積。所得的丹參總酚酸中丹酚酸A和丹酚酸B的比例為0.96:1實(shí)施例4與實(shí)施例l基本相同，所不同的是調(diào)PH值，有機(jī)溶劑萃取時(shí)加鹽酸調(diào)節(jié)PH值至5。所得的丹參總酚酸中丹酚酸A和丹酚酸B的比例為0.96:1實(shí)施例1-4的含量測(cè)定結(jié)果見表1表l:實(shí)施例l-4所得的丹參總酚酸的含量測(cè)定結(jié)果<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例5將實(shí)施例l中得到的丹參總酚酸浸膏粉末50g，加入淀粉100g，混合均勻，75%乙醇為潤(rùn)濕劑，混合均勻，濕法制粒，烘干、整粒，加入1%硬脂酸鎂，填入膠囊殼即得丹酚酸膠囊。實(shí)施例6將實(shí)施例1中得到的丹參總酚酸浸膏粉末(丹酚酸膠囊)進(jìn)行相關(guān)藥效學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果詳見丹酚酸膠囊對(duì)2型糖尿病大鼠的影響，具體如下1、實(shí)驗(yàn)方法取體重為300土20g的雄性SD大鼠100只，用30mgkg—'的鏈尿佐菌素(STZ)尾靜脈注射加高脂高糖飼料飼喂造成2型糖尿病大鼠模型，7天后篩選血糖在24-28iranol/L的糖尿病大鼠60只，按血糖值和體重隨機(jī)分成5組，即模型對(duì)照組、高(200mgkg—'丹酚酸浸膏粉)、中(100mgkg—'丹酚酸浸膏粉)、低(50mgkg—1丹酚酸浸膏粉)劑量的丹酚酸膠囊組、陽(yáng)性對(duì)照組(5mgkg—'鹽酸羅格列酮)；每組12只，另取12只正常大鼠作正常對(duì)照組。高、中、低劑量組分別灌胃給予相應(yīng)劑量丹酚酸膠囊，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予5mgkg—'鹽酸羅格列酮，模型對(duì)照組和正常對(duì)照組灌胃給予生理鹽水10ml，kg—嘴重，每日給藥一次，連續(xù)給藥8周，每周稱大鼠體重、測(cè)定空腹血糖，隔周取血測(cè)定TC、TG、HDL-c、LDL-c、F麗、T-P、ALB、BUN、Crea、UA、AST、ALT和代謝試驗(yàn)取尿測(cè)定U-GLU、U-TP、U-ALB等生化指標(biāo)，給藥結(jié)束后，進(jìn)行血液流變學(xué)、血小板聚集率及血清SOD、MDA、NO、NOS等指標(biāo)測(cè)定和肝臟、腎臟等組織進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)分析，觀察丹酚酸膠囊對(duì)大鼠2型糖尿病及其并發(fā)癥的影響；并與陽(yáng)性對(duì)照品鹽酸羅格列酮5mgkg-'進(jìn)行比較。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)論2.1改善血液流變性對(duì)試驗(yàn)大鼠進(jìn)行了血液流變學(xué)測(cè)定結(jié)果表明，2型糖尿病模型大鼠的血液粘滯性和紅細(xì)胞流變性發(fā)生異常，在低切、中切、高切三種狀態(tài)下的全血粘度增高，血漿粘度、卡松粘度、血小板聚集率、紅細(xì)胞剛性指數(shù)和紅細(xì)胞電泳時(shí)間均有不同程度升高，以上說(shuō)明血液粘滯性和紅細(xì)胞流變性發(fā)生變化；給予丹酚酸膠囊可顯著降低2型糖尿病模型大鼠在低切、中切、高切三種狀態(tài)下的全血粘度，可不同程度地降低血漿粘度、卡松粘度、血小板聚集率和紅細(xì)胞電泳時(shí)間(見表2)，且呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系，高、中劑量丹酚酸膠囊明顯強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組；證明丹酚酸膠囊能改善2型糖尿病大鼠血液的"粘"、"濃"、"凝"、"聚"狀態(tài)，具有的活血化瘀作用。表2丹酚酸膠囊對(duì)2型糖尿病大鼠血液流變性的影響(X±s)組別(藥物與劑量)=2纟工細(xì)胞頓鵬血漿粘度，、聽大聚集率電泳時(shí)間高切中切低切(即as.s)卡松粘度(%)(mPa.s)(mPa.s)(mPa.s)正常對(duì)照組44.1119.484.925.7211.751.142.14±10.08±2.83±0.42±0.51±1.31±0.22±0.17模型對(duì)照組61.1123.105.967.0813.931.442.55±7.22"±2.49"±0.75"±0.92"±1.62"±0.10"±0.27"低劑量組57.0919.865.306.2812.561.252.38±11.59±2.13*±0.57*±0.69*土1.2CT±0.13"±0.20中劑量組53.0018.965.065.9711.941.262.26±8.62*±1.53"±0.4廣±0.5(T±0.98"±0.12**±0.25*高劑量組49.6717.944.875.7611.821.232.21±10.63*士1.7廣±0.52"±0.65w±1.33"±0.14"±0.2廣陽(yáng)性對(duì)照組58.1719.405.266.2312.461.292,38±7.54±1.88—±0.51*±0.63*±1.13'±0.14*±0.18注--與正常對(duì)照組比較，卞<0.05，"P<0.01;與模型對(duì)照組比較組，卞<0.05，，<0.01。2.2控制血糖本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病大鼠與正常對(duì)照組比較，血糖(GLU)和糖化血清蛋白(F麗)持續(xù)顯著升高(P〈0.0D，雖然丹酚酸膠囊在降糖作用要弱于陽(yáng)性對(duì)照組，但是連續(xù)給藥8周，高、中劑量丹酚酸膠囊的糖尿病大鼠血糖和果糖胺明顯降低(P〈0.01)，且呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系；同時(shí)能改善糖尿病大鼠精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，毛豎無(wú)光澤，動(dòng)作遲緩，尾部粘稠，多飲多尿等的癥狀，從而使糖尿病的血糖得到較好的控制，并使2型糖尿病并發(fā)癥漸趨穩(wěn)定和改善。2.3改善脂代謝紊亂2型糖尿病某些并發(fā)癥腎病、脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)與脂代謝紊亂亦有密切關(guān)系，并且這種紊亂在2型糖尿病早期就己存在。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病大鼠總膽固醇TC、甘油三酯TG、低密度脂蛋白膽固醇(LDH-c)和TC/HDL-c比值顯著升高(P〈0.01)，本研究結(jié)果顯示，雖丹酚酸膠囊降脂作用要弱于陽(yáng)性對(duì)照組，但是連續(xù)給藥8周，高、中劑量丹酚酸膠囊可明顯降低糖尿病大鼠血清甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和TC/HDL-c比值水平，且呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系(見表3)，說(shuō)明對(duì)脂質(zhì)代謝具有一定的改善作用。表3丹酚酸膠囊對(duì)2型糖尿病大鼠脂代謝紊亂的影響(第8周)(X士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注與正常對(duì)照組比較，AP<0.05，"P〈0.01;與模型對(duì)照組比較組，*P〈0.05，，〈0.01。2.4改善腎功能紊亂糖尿病腎病大鼠的血尿酸(UA)水平明顯上升，同時(shí)腎小球肌酐清除率(Ccr)、U-TP排泄率、U-ALB排泄率和尿糖排泄率顯著升高，本研究結(jié)果顯示，連續(xù)8周給予高、中劑量丹酚酸膠囊可明顯降低尿酸(UA)、腎小球肌酐清除率(Ccr)、U-TP排泄率、U-ALB排泄率和尿糖排泄率(P<0.05，P<0.01)，且呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系(見表4)，高、中、低丹酚酸膠囊與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)或強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組；同時(shí)具有降低血肌酐的趨勢(shì)，同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)給予丹酚酸膠囊后糖尿病大鼠的BUN有明顯升高的趨勢(shì)，且劑量越高BUN升高的趨勢(shì)越明顯，其升高原因可能是給予丹酚酸膠囊后促進(jìn)糖尿病大鼠體內(nèi)蛋白合成增加。表4丹酚酸膠囊對(duì)2型糖尿病大鼠腎功能紊亂的影響(第8周)(X±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注與正常對(duì)照組比較，AP<0.05,"P〈0.01;與模型對(duì)照組比較組，*P<0.05，**P<0.01。2.5改善肝功能2型糖尿病大鼠血清中ALT水平明顯上升，連續(xù)8周給予高、中劑量丹酚酸膠囊可明顯降低在血清中ALT水平(P<0.05，P〈0.01)，且呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系，高劑量丹酚酸膠囊在肝組織保護(hù)作用上強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組；說(shuō)明丹酚酸膠囊有改善肝功能的作用。2.6NO和NOS參與改善腎小球?yàn)V過(guò)率2型糖尿病大鼠血清NO和NOS生成顯著高于正常對(duì)照組，表明糖尿病腎病大鼠的濾過(guò)率明顯升高，與臨床表現(xiàn)一致。連續(xù)8周給予高、中、低劑量丹酚酸膠囊的糖尿病大鼠能明顯降低N0和N0S的產(chǎn)生(P〈0.05，P<0,01)(見表4)，提示糖尿病腎病大鼠的腎小球?yàn)V過(guò)狀態(tài)的得到明顯的改善作用。2.7改善自由基代謝異常糖尿病模型對(duì)照組大鼠血清中MDA水平顯著升高，同時(shí)SOD水平顯著下降，連續(xù)8周給予高、中劑量總酚酸膠囊具有顯著降低血清MDA和升高SOD水平，且呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系(見表5)，高劑量丹酚酸膠囊在清除自由基和抗氧化作用上要強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組，提示丹酚酸膠囊能改善自由基代謝異常，抑制自由基的脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)抗氧化酶的活性，增強(qiáng)自由基的清除，保護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，保護(hù)血管內(nèi)皮的作用，使大鼠2型糖尿病的癥狀得到明顯的改善作用。表5丹酚酸膠囊對(duì)2型糖尿病大鼠血清S0D、MDA、NO和NOS的影響(S±s)組別SODMDANONOS(藥物與劑量)(Uml—')o(ymoll墨')(Uml—')正常對(duì)照組125.16±8.129.19±1.5625.68±4.6840.18±1.42模型對(duì)照組96.46±18.07"12.41±1.81"37.59±8.72"53.10±6.94"低劑量組106.76±20.1810.80±3.8036.84土12.5151.75±5.30中劑量組120.39±8.99**9.49±1.67**35.95±7.4544.33±2.8廣高劑量組121.94±6.34**9.00±0.79**33.11±5.0847,10±3.50*陽(yáng)性對(duì)照組120.41±4.73**9.52±1.04**27.61±8.04*44.85±7.24*注與正常對(duì)照組比較，&P<0.05,"P〈0.01;與模型對(duì)照組比較組，*P<0.05，"P<0.01。2.8改善糖尿病大鼠肝腎組織的病理學(xué)變化模型對(duì)照組大鼠腎臟大量腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變，腎小球體積顯著增大，腎小球內(nèi)細(xì)胞增多，基底膜增厚，且有細(xì)胞性新月體開始形成。與模型對(duì)照組相比，丹酚酸膠囊各給藥組均有不同程度改善腎臟病理變化，低、中劑量組大鼠腎臟腎小球體積輕度增大，基底膜增厚較模型組輕，未見新月體形成。與陽(yáng)性對(duì)照(羅格列酮)組相比，中劑量組丹酚酸膠囊對(duì)糖尿病大鼠腎臟的病理改變作用與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)，高劑量組大鼠腎臟對(duì)腎臟改善作用顯著，優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。模型對(duì)照組大鼠腎臟部分腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變，腎小球體積增大，系膜增生，基底膜顯著增厚，染色呈強(qiáng)陽(yáng)性。與模型對(duì)照組相比，丹酚酸膠囊低劑量給藥組大鼠腎臟PAS染色陽(yáng)性物質(zhì)減少，中、高劑量丹酚酸膠囊組PAS染色陽(yáng)性物質(zhì)減少顯著，高劑量組大鼠腎臟基底膜輕微增生，PAS染色陽(yáng)性物質(zhì)接近正常。丹酚酸膠囊中劑量組大鼠腎臟PAS染色陽(yáng)性物質(zhì)略少于或相當(dāng)于陽(yáng)性對(duì)照(羅格列酮)組，基底膜均輕度增生，丹酚酸膠囊高劑量組大鼠腎臟PAS染色陽(yáng)性物質(zhì)較陽(yáng)性對(duì)照組少，接近正常組。模型組大鼠肝臟大量肝細(xì)胞濁腫，細(xì)胞內(nèi)大量細(xì)小脂滴，胞質(zhì)呈網(wǎng)絲狀，且部分肝細(xì)胞呈氣球樣變。丹酚酸膠囊各劑量組肝臟與模型對(duì)照組大鼠肝臟相比均有不同程度改善，肝細(xì)胞濁腫數(shù)目減少，脂滴空泡化減輕，與陽(yáng)性對(duì)照(羅格列酮)組大鼠肝臟比較，丹酚酸膠囊中、高劑量組大鼠肝臟脂滴空泡化程度較輕。本發(fā)明所要求保護(hù)的具體技術(shù)方案，不限于上述實(shí)施例所表達(dá)的技術(shù)方案的具體組合。權(quán)利要求1、一種丹參總酚酸的制備方法及其在防治糖尿病及并發(fā)癥中的應(yīng)用，所述的丹參總酚酸的制備方法，包括如下步驟(1)提取丹參粗粉，加4～10倍量的水或醇水溶液提取2～4次，每次1.0～2.0小時(shí)，濾過(guò)；(2)柱層析純化總酚酸合并濾液離心(4000轉(zhuǎn)/分鐘)10分鐘，取上清液過(guò)D1400型大孔吸附樹脂柱，先用水洗至糖檢測(cè)反應(yīng)為陰性，改用10～35％醇水溶液洗2～10倍柱體積；(3)用40～80％醇水溶液洗脫，收集洗脫液，同時(shí)分析測(cè)定洗脫液中丹酚酸A和丹酚酸B的含量，當(dāng)?shù)し铀酇∶丹酚酸B＝0.90～1.10∶1時(shí)，收集該部分洗脫液，60℃減壓濃縮洗脫液至無(wú)醇味；(4)調(diào)PH值，有機(jī)溶劑萃取加鹽酸調(diào)節(jié)PH值至3～5，用洗脫液1～2倍量體積的有機(jī)溶劑萃取2～4次，合并有機(jī)溶劑相；(5)濃縮干燥減壓濃縮萃取液至浸膏狀，60℃真空干燥，得黃色粉末，即丹參總酚酸，其中丹酚酸A和丹酚酸B的總含量在90％以上，丹酚酸A∶丹酚酸B＝0.90～1.10∶1。2、權(quán)利要求1所述的丹參總酚酸的制備方法，步驟(1)、(2)、(3)中所述的醇水溶液指的是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇的水溶液，或它們的混合物。3、權(quán)利要求1所述的丹參總酚酸的制備方法，步驟(4)中所述的有機(jī)溶劑指的是乙酸酯類。4、權(quán)利要求3所述的丹參總酚酸的制備方法，其中乙酸酯類可以是乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯或它們的混合物。5、由權(quán)利要求1所述的丹參總酚酸的制備方法得到的丹參總酚酸在防治糖尿病及并發(fā)癥中的應(yīng)用，所述的糖尿病指的是2型糖尿病。6、權(quán)利要求4所述的丹參總酚酸在防治糖尿病及并發(fā)癥中的應(yīng)用，其中所述的并發(fā)癥指的是糖尿病腎病、糖尿病肝病及糖尿病引起的患者血液流變性的改變。全文摘要本發(fā)明涉及一種丹參總酚酸的制備方法及其在制藥領(lǐng)域的新用途。本發(fā)明所述的丹參總酚酸的制備方法包括以下步驟丹參粗粉加水或醇水溶液提?。恢鶎游黾兓偡铀?；醇水溶液洗脫，減壓濃縮洗脫液；調(diào)節(jié)pH值，有機(jī)溶劑萃?。粷饪s干燥，即得丹酚酸A和丹酚酸B總含量在90％以上的丹參總酚酸。藥效和藥理研究表明，利用本發(fā)明的丹參總酚酸，可以制備具有很好的防治2型糖尿病及其并發(fā)癥的藥物，包括糖尿病腎病、肝病及糖尿病引起的患者血液流變性的改變。研究表明，本發(fā)明的丹參總酚酸及其制劑藥理作用強(qiáng)，安全可靠，具有很好的藥用前景。文檔編號(hào)A61K31/343GK101095720SQ200710070020公開日2008年1月2日申請(qǐng)日期2007年7月16日優(yōu)先權(quán)日2007年7月16日發(fā)明者柴建國(guó),王木蘭,黎豫杭申請(qǐng)人:正大青春寶藥業(yè)有限公司