專(zhuān)利名稱(chēng)：治療乙型肝炎的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種治療乙型肝炎的藥物組合物，其制備方法，以及該藥物組合物在制備抗乙型肝炎抑制劑藥物和抗乙型肝炎藥物中的應(yīng)用
背景技術(shù)：
乙型肝炎是嚴(yán)重危害人體健康的病毒性傳染病。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)屬DNA嗜肝病毒科，主要是通過(guò)血液制品、母嬰和性接觸等途徑傳播，且易轉(zhuǎn)成慢性肝炎，是引發(fā)肝硬化、肝癌的主要病因之一。乙型肝炎病毒的復(fù)制過(guò)程涉及5步結(jié)合、侵入、轉(zhuǎn)錄、翻譯、基因復(fù)制和包裝。首先病毒顆粒通過(guò)受體附著于肝細(xì)胞，侵入胞漿后脫去外膜，形成核心顆粒。核心顆粒移至肝細(xì)胞核，HBV DNA核心顆粒脫殼而出，在細(xì)胞核內(nèi)形成cccDNA。cccDNA是乙型肝炎病毒復(fù)制的模板，是肝細(xì)胞長(zhǎng)期持續(xù)受感染的關(guān)鍵物質(zhì)。cccDNA有2種功能，其一是合成病毒顆粒的各種構(gòu)件，如HbsAg(hepatitis B virus surface antigens，表面抗原，構(gòu)成外膜)，HBcAg(hepatitis virus c antigens，核心抗原，構(gòu)成內(nèi)膜)，HBeAg(hepatitis Bvirus e antigens，e抗原，分泌到血液中)；其二是合成下一代HBVDNA。大部分新合成的HBV DNA用于新病毒顆粒的包裝，部分則重新進(jìn)入肝細(xì)胞核，成為cccDNA的另一個(gè)來(lái)源。部分新合成的HBVDNA首先與HBcAg組裝成核心顆粒，進(jìn)而與HBsAg組裝成完整的HBV顆粒，向細(xì)胞外釋放。過(guò)剩的HBsAg有時(shí)獨(dú)自釋放入血液，形成小球型顆?；蚬苄皖w粒。研究報(bào)道中，草藥中的具有抗HBV活性的植物大多是抑制HBsAg，而對(duì)HBeAg作用明顯的植物提取物或單體化合物的報(bào)道較少。目前對(duì)乙型肝炎尚缺乏專(zhuān)屬性較強(qiáng)的治療藥物。國(guó)外對(duì)治療病毒性肝炎新藥的研制側(cè)重于開(kāi)發(fā)抗肝炎病毒藥，在抗肝炎病毒藥物的研究中取得一些進(jìn)展。80年代曾經(jīng)進(jìn)行試驗(yàn)的阿糖腺苷、磷酸阿糖腺苷、阿昔洛韋、齊多夫定，因療效不佳，毒性反應(yīng)大，在國(guó)外已不再用于治療乙肝。近幾年開(kāi)發(fā)了多種核苷類(lèi)藥物，對(duì)HBV有明顯的抑制作用，如拉米夫定(lamivudine)，泛昔洛韋(famciclovir)，洛布卡韋(lobucavir)，阿地福韋(adefovir)，F(xiàn)TC(二脫氧氟硫代胞嘧啶)，F(xiàn)MAU(氟甲阿糖尿嘧啶)，F(xiàn)DDC(氟二脫氧胞嘧啶)，BMS 200475(環(huán)氧羥碳脫氧鳥(niǎo)苷)，這些藥物具有下列共同點(diǎn)均為核苷類(lèi)的衍生物；分別為胞嘧啶，尿嘧啶，鳥(niǎo)嘧啶或嘌呤化合物，在體外或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)HIV、HBV或HCV等病毒有抑制作用。其作用機(jī)制為藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)成為三磷酸化合物，通過(guò)對(duì)底物的競(jìng)爭(zhēng)，對(duì)病毒的聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶抑制，最終抑制病毒DNA的合成及病毒的增殖；經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的治療后，病毒可能出現(xiàn)變異和耐受性；短期應(yīng)用僅有暫時(shí)的效果，需長(zhǎng)期用藥，如與不同作用靶點(diǎn)的其他藥物聯(lián)合應(yīng)用，可提高療效，降低耐藥性發(fā)生。綜上所述，抗肝炎藥物有非常大的市場(chǎng)需求，但是現(xiàn)在臨床應(yīng)用的抗肝炎藥物普遍存在耐藥性的問(wèn)題，成功地開(kāi)發(fā)出能解決藥物的耐藥性，臨床效率高且毒副作用較小的新一代抗乙型肝炎的藥物，將具有很強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力和市場(chǎng)前景。迄今，現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有二氫白屈菜紅堿化合物作為有效成分的藥物組合物的報(bào)道，也沒(méi)有該化合物或其藥物組合物應(yīng)用在制備或治療乙型肝炎藥物中的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于治療乙型肝炎藥物組合物，其中含有治療乙型肝炎有效量的式(I)二氫白屈菜紅堿及藥用載體和/或賦形劑，提供該藥物組合物的制備方法，該化合物或其藥物組合物在制備抗乙型肝炎抑制劑藥物和在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案用于治療乙型肝炎的藥物，其中含有式(I)化合物二氫白屈菜紅堿(dihydrochelerythrine)及可藥用載體和/或賦形劑。
本發(fā)明制備含二氫白屈菜紅堿的藥物的方法是取巖黃連，干燥，粉碎，用90％乙醇回流提取3次，每次2-3小時(shí)，合并醇提液，過(guò)濾，減壓回收乙醇至無(wú)醇味，該提取液懸浮于2％HCl水溶液中，攪拌，過(guò)濾；濾液用25％的氨水溶液調(diào)pH值至10，用氯仿萃取得氯仿部分；氯仿萃余液再用飽和的10％NaOH溶液調(diào)pH至12，用正丁醇萃取得正丁醇部分，氯仿部分用氯仿-甲醇溶解吸附于硅膠上，室溫放置揮干，研碎，經(jīng)硅膠干柱柱層析，用2∶1的氯仿∶甲醇洗脫，分為四部分，其中第一部分用減壓柱層析，以15∶1-2∶1的石油醚∶乙酸乙脂梯度洗脫得化合物二氫白屈菜紅堿，加入可藥用載體和/或賦形劑即可。
本發(fā)明同時(shí)提供了本發(fā)明藥物化合物二氫白屈菜紅堿在制備抗乙型肝炎抑制劑藥物中和制備抗乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。該藥物組合物含有0.1-99％，優(yōu)選為0.5-90％的本發(fā)明化合物，其余為藥物學(xué)上可接受的，對(duì)人和動(dòng)物無(wú)毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
所述的藥用載體或賦形劑是一種或多種固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明的藥物可經(jīng)注射(靜注、肌注)和口服兩種形式給藥。
具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面將用本發(fā)明的試驗(yàn)例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明式(I)化合物二氫白屈菜紅堿的藥理作用結(jié)果，但不以此試驗(yàn)例來(lái)限定本發(fā)明。
試驗(yàn)例1二氫白屈菜紅堿對(duì)Hep G2.2.15細(xì)胞的藥物毒性和對(duì)HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用1材料和方法1.1材料二氫白屈菜紅堿來(lái)自巖黃連(Corydalis saxicola)、白屈菜(Chelidonium majus)、飛龍掌血(Toddalia aculeata)的根和莖；拉米夫定(lamivudine)(葛蘭素史克制藥(蘇州)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20030581)；Hep G2.2.15細(xì)胞(引自廣州空軍醫(yī)院)；高糖DMEM(GIBICO)；G418(GIBICO)；胎牛血清(天津血研所)；L-谷氨酰胺(AMRESCO)；青霉素，鏈霉素(石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司)。
1.2 Hep G2.2.15細(xì)胞，用高糖DMEM液培養(yǎng)，培養(yǎng)液添加10％胎牛血清，0.03％L-谷氨酰胺，100mg/L G418，105IU/L青酶素，100mg/L鏈霉素，5％NaCO3調(diào)pH至6.8-7.0。
1.3儀器酶標(biāo)儀Bio-RAD 680(美國(guó))；CO2培養(yǎng)箱Thermo Forma3310(美國(guó))；倒置生物顯微鏡XD-101型(南京)等。
1.4實(shí)驗(yàn)過(guò)程用胰蛋白酶將Hep G2.2.15細(xì)胞消化，用添加了0.03％L-谷氨酰胺，100mg/L G418，100 IU青酶素，100 IU鏈霉素的高糖DMEM液制成單細(xì)胞懸液，每孔按3×105×0.1mL-1分種于96孔板，0.1mL/孔，24h后換用含2％的胎牛血清，380μg/mL的含藥培養(yǎng)液，每種藥物設(shè)四個(gè)藥物濃度，每個(gè)濃度設(shè)三孔，四倍稀釋?zhuān)瑫r(shí)設(shè)三孔不加藥物的細(xì)胞對(duì)照組及一孔空白細(xì)胞組，并以拉米夫定做陽(yáng)性藥物對(duì)照；7d后收集上清，用ELISA法測(cè)定HBsAg和HBeAg的分泌情況。同時(shí)用MTT法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞的毒性。
1.5藥物對(duì)細(xì)胞半數(shù)毒性濃度(CC50)的測(cè)定 根據(jù)Mosmann建立的MTT法檢測(cè)藥物的細(xì)胞毒性(Y.Nakajima，Y.Saton，M.Katsumata，K.Tsujiyama，Y.Ida，and J.Shoji，Phytochemistry 1994，36，119-127)。具體方法是向吸去上清的細(xì)胞孔中加入0.4mg/mLMTT，0.1mL/孔，37℃5％CO2培養(yǎng)4h，去上清，每孔加入0.1mL二甲基亞砜，孵育10min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定溶液在490nm下的吸光度值。藥物對(duì)細(xì)胞的破壞百分率ηdestroy＝(A細(xì)胞對(duì)照組-A供試樣品組)/(A細(xì)胞對(duì)照組-A空白組)×100，50％毒性濃度(CC50)為實(shí)驗(yàn)孔存活細(xì)胞為對(duì)照孔50％時(shí)的藥物濃度。CC50＝Anti 1g[(C50-＜50％破壞率的百分?jǐn)?shù))/(＞50％破壞率的百分?jǐn)?shù)-＜50％破壞率的百分?jǐn)?shù))×C+1g B]，A；破壞率大于50％的藥物濃度；B破壞率小于50％的藥物濃度；C＝1g A-1g B。
1.6藥物對(duì)細(xì)胞半數(shù)抑制濃度的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定。藥物對(duì)HBsAg、HBeAg的抑制百分率ηinhibitory＝(A細(xì)胞對(duì)照組-A供試樣品組)/A細(xì)胞對(duì)照組-A空白組)×100，50％抑制濃度(IC50)為HBsAg或HbeAg以抑制率為50％時(shí)的藥物濃度，計(jì)算方法同CC50。
2.結(jié)果最終結(jié)果以選擇指數(shù)(SI，為評(píng)價(jià)藥物臨床應(yīng)用前景的參數(shù)，SI＝CC50/IC50)來(lái)評(píng)價(jià)，其中SI＞2為無(wú)毒有效，1＜SI＜2為有毒有效，SI＜1為有毒無(wú)效。具體結(jié)果見(jiàn)表1、表2和表3表1二氫白屈菜紅堿對(duì)Hep G2.2.15細(xì)胞的毒性作用

表2.二氫白屈菜紅堿對(duì)Hep G2.2.15細(xì)胞HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用

表3.二氫白屈菜紅堿對(duì)Hep G2.2.15細(xì)胞HBsAg、HBeAg的抑制效果

3.結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二氫白屈菜紅堿在體外對(duì)Hep G2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg有一定的抑制作用。
以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明的制備方法及藥物組成。
實(shí)施例1二氫白屈菜紅堿的制備二氫白屈菜紅堿的提取分離采集巖黃連，其學(xué)名經(jīng)鑒定為Corydalis saxicola Bunting，室溫陰干，粉碎。取5.5kg干粉，用90％乙醇回流提取3次，每次3小時(shí)，合并醇提液，過(guò)濾，減壓回收乙醇至無(wú)醇味。該提取液懸浮于2％HCl水溶液中，快速攪拌，然后過(guò)濾；濾液用25％的氨水溶液調(diào)pH值至10，用氯仿萃取，得氯仿部分(93.6g)；氯仿萃余液再用飽和的10％NaOH溶液調(diào)pH至12，用正丁醇萃取得正丁醇部分(63.6g)。氯仿部分用氯仿-甲醇溶解吸附于硅膠上，室溫放置揮干，研碎，經(jīng)硅膠干柱柱層析，用氯仿-甲醇(2∶1)洗脫，分為四部分，其中第一部分用減壓柱層析，以石油醚-乙酸乙脂(15∶1-2∶1)梯度洗脫得一黃色粉末(86mg)。通過(guò)分析該化合物的1H，13C NMR及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，與文獻(xiàn)報(bào)道的二氫白屈菜紅堿(dihydrochelerythrine)(Oechslin，S.M.，Knig，GM.，Oechslin-Merkel，K.，Wright，A.D.，Kinghorn，A.D.，Sticher，O.，1991.An NMR study of four benzophenanthridine alkaloids.J.Nat.Prod 54，519-524)一致。二氫白屈菜紅堿的提取分離制備方法也適用于從白屈菜、飛龍掌血等含有該成分的植物中提取分離制備。
二氫白屈菜紅堿結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)熔點(diǎn)用北京泰克儀器有限公司的X-4數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)儀測(cè)定；旋光經(jīng)SEPA-300儀測(cè)定；紅外光譜用Bruker Tensor 27型紅外光譜儀測(cè)定，采用KBr壓片；質(zhì)譜(MS)用VG Auto Spec-3000型質(zhì)譜儀測(cè)定，采用FAB-MS技術(shù)；核磁共振譜(1H NMR和13C NMR)用BrukerAM-400超導(dǎo)核磁共振儀測(cè)定，TMS作內(nèi)標(biāo)；青島海洋化工廠出品的200-300目和10-40μm硅膠作為柱層析材料；薄層層析用青島海洋化工廠出品的硅膠板指導(dǎo)分離。
展開(kāi)劑A氯仿-甲醇(2∶1，v/v)；B石油醚-乙酸乙酯(7∶3，v/v)。顯色劑改良碘化鉍鉀生物堿顯色劑。
結(jié)構(gòu)如圖所示 分子式C21H19NO4分子量349性狀黃色粉末(氯仿)mp 169-171℃[α]D20-10°(c 0.2，氯仿)。
IR(KBr)Vmax2920，2846，1625，1605，1495，1464，1272，1247，1220，1072，1039cm-1。
FAB-MS(m/z)350[M+H]+(100)。
1H NMR(C5D5N)δ7.92(1H，d，J＝8.5Hz，H-11)，7.89(1H，s，H-1)，7.70(1H，d，J＝8.4Hz，H-10)，7.65(1H，d，J＝8.5Hz，H-12)，7.38(1H，s，H-4)，7.05(1H，d，J＝8.4Hz，H-9)，6.06(2H，s，OCH2O-2，3)，4.42(2H，s，H-6)，3.86(3H，s，OCH3-8)，3.78(3H，s，OCH3-7)，2.60(3H，s，NCH3)。
13C NMR(C5D5N)δ104.9(CH，C-1)，148.7(C，C-2)，148.2(C，C-3)，101.1(CH，C-4)，127.0(C，C-4a)，143.2(C，C-4b)，49.2(CH2，C-6)，126.5(C，C-6a)，146.7(C，C-7)，153.0(C，C-8)，111.9(CH，C-9)，119.2(CH，C-10)，126.4(C，C-10a)，124.9(C，C-10b)，120.8(CH，C-11)，124.4(CH，C-12)，131.5(C，C-12a)，55.8(CH3，OCH3-7)，60.9(CH3，OCH3-8)，101.8(CH2，OCH2O-2，3)，41.4(CH3，NCH3)。
實(shí)施例2按實(shí)施例1的方法先制得二氫白屈菜紅堿，用少量的DMSO溶解后，按常規(guī)加注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。
實(shí)施例3按實(shí)施例1的方法先制得二氫白屈菜紅堿，用少量的DMSO溶解后，將其溶于無(wú)菌注射用水中，攪拌使溶解，用無(wú)菌抽濾漏斗過(guò)濾，再無(wú)菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無(wú)菌熔封得粉針劑。
實(shí)施例4將所分離得到的二氫白屈菜紅堿，按其與賦形劑重量比為9∶1的比例加入賦形劑，制成粉劑。
實(shí)施例5按實(shí)施例1的方法先制得二氫白屈菜紅堿，按其與賦形劑重量比為5∶1的比例加入賦形劑，制粒壓片。
實(shí)施例6按實(shí)施例1的方法先制得二氫白屈菜紅堿，按常規(guī)口服液制法制成口服液。
實(shí)施例7按實(shí)施例1的方法先制得二氫白屈菜紅堿，按其與賦形劑重量比為5∶1的比例加入賦形劑，制成膠囊。
實(shí)施例8按實(shí)施例1的方法先制得二氫白屈菜紅堿，按其與賦形劑重量比為3∶1的比例加入賦形劑，制成膠囊。
權(quán)利要求
1.治療乙型肝炎的藥物，含有式(I)化合物二氫白屈菜紅堿(dihydrochelerythrine)及可藥用載體和/或賦形劑。
2.制備權(quán)利要求1藥物的方法，其特征在于取巖黃連，干燥，粉碎，用90％乙醇回流提取3次，每次2-3小時(shí)，合并醇提液，過(guò)濾，減壓回收乙醇至無(wú)醇味，該提取液懸浮于2％HCl水溶液中，攪拌，過(guò)濾；濾液用25％的氨水溶液調(diào)pH值至10，用氯仿萃取得氯仿部分，氯仿萃余液再用飽和的10％NaOH溶液調(diào)pH至12，用正丁醇萃取得正丁醇部分，氯仿部分用氯仿-甲醇溶解吸附于硅膠上，室溫放置揮干，研碎，經(jīng)硅膠干柱柱層析，用2∶1的氯仿∶甲醇洗脫，分為四部分，其中第一部分用減壓柱層析，以15∶1-2∶1的石油醚∶乙酸乙脂梯度洗脫得化合物二氫白屈菜紅堿，加入可藥用載體和/或賦形劑即可。
3.式(I)化合物二氫白屈菜紅堿在制備抗乙型肝炎抑制劑藥物中的應(yīng)用。
4.式(I)化合物二氫白屈菜紅堿在制備抗乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
用于治療乙型肝炎藥物，含有治療乙型肝炎有效量的化合物二氫白屈菜紅堿及藥用載體和/或賦形劑，該藥物化合物二氫白屈菜紅堿的制備方法，以及在制備抗乙型肝炎抑制劑藥物和治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101019866SQ200710065709
公開(kāi)日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2007年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月13日
發(fā)明者陳紀(jì)軍, 吳穎瑞, 趙友興, 馬云保, 姚淑英, 周俊 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所