專利名稱：用于促進Ⅰ型膠原蛋白產(chǎn)生的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有促進人體皮膚纖維芽細胞產(chǎn)生的I型膠原蛋白產(chǎn)生 的效果的組合物。
背景技術(shù)：
膠原蛋白約占生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的1/3，大量存在于血管、皮膚、骨骼 中，作為細胞的基礎(chǔ)對這些組織的形成、構(gòu)建起重要作用。膠原蛋白因基 本不被消化酶分解，所以曾被認為是營養(yǎng)價值低的蛋白質(zhì)，但有如下報道 指出，通過攝取膠原蛋白可促進新陳代謝(專利文獻1)、促進頭發(fā)的生發(fā) (非專利文獻l)、作為關(guān)節(jié)病治療用藥劑利用(專利文獻2)等，因此其 有效性被重新認識。且因膠原蛋白隨年齡增加而減少，所以血管的脆化、 皮膚彈性、柔軟性的減少是引起皺紋、松弛產(chǎn)生的原因之一。利用膠原蛋白的熱變性體明膠的高度的粘性、凝固性及保水性，將其 作為食品的口感改良劑和化妝品(專利文獻3)利用。但是，未經(jīng)處理的 膠原蛋白及明膠因粘性高、易凝固，所以多使用經(jīng)部分水解處理后的物質(zhì)。 且因其是蛋白質(zhì)，所以具有抗原性，在過敏體質(zhì)的人的攝取上還存在問題。 為此，有如下報道，將膠原蛋白通過膠原酶低分子化，來用于失去抗原性 的面向過敏患者的蛋白資源或輸液制劑成分(專利文獻4)。對于通過膠原 酶分解的膠原蛋白分解物的生理活性，已知有血纖維蛋白凝集抑制活性 (專利文獻5)、麻醉作用(非專利文獻2)。且有如下報道，對于通過來 自溶組織梭菌(Clostridium Histolyticum)的膠原酶分解的膠原蛋白的分 解產(chǎn)物，其生成的三肽的36%是Gly—Pro—Hyp，為最多(非專利文獻3)。以抗皺等抗皮膚老化為目的，嘗試使用以包括Gly—Pro—Hyp在內(nèi)的通過膠原酶分解的膠原蛋白分解物為有效成分的皮膚外用劑(專利文獻 6)。且開發(fā)出含有包括Gly—Pro—Hyp在內(nèi)的通過膠原酶分解的膠原蛋 白分解物、特別是分子量為400以下的物質(zhì)的生物體膠原蛋白產(chǎn)生促進劑 (專利文獻7)。通過膠原酶分解的膠原蛋白分解物，成為生物體膠原蛋白的原料，促 進膠原蛋白合成。其他，作為促進膠原蛋白產(chǎn)生的肽，開發(fā)出了來自cd 膠原蛋白分解物的五肽Lys—Thr—Thr—Lys—Ser (非專利文獻4)、來自 a2膠原蛋白的分解物的三肽Gly—His—Lys (非專利文獻5)、來自免疫球 蛋白G (immunoglobulin G)的分解物的四肽Gly—Glu—Pro—Arg (非專 利文獻6)等。另外，還發(fā)現(xiàn)了不作為生物體膠原蛋白的原料起作用，而是促進膠原 蛋白產(chǎn)生的成分。例如，開發(fā)出維甲酸、其衍生物視黃醇(非專利文獻7) 及來自水飛薊提取物的成分水飛薊素(專利文獻8)等。且已證明了維甲 酸、其衍生物視黃醇(非專利文獻8)及來自水飛薊提取物的成分水飛薊 素(專利文獻9)抑制作為膠原蛋白分解酶的膠原酶。因維甲酸、其衍生物視黃醇在以皮膚刺激性為首的安全性方面存在問 題(非專利文獻9)，且穩(wěn)定性差，所以一般不實用。雖開發(fā)出為使生物體膠原蛋白增加的各種成分及組合物，但均未達到 兼具安全性且十分有效的作用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)與各自單獨使用相比，并用水飛薊賓及各種肽具有協(xié)同促 進I型膠原蛋白產(chǎn)生的作用，從而完成了本發(fā)明。專利文獻l:日本特開平7-278012專利文獻2:日本特開昭63-39821專利文獻3:日本特開昭52-l 11600專利文獻4:日本特開平7-82299專利文獻5:日本特開平6-46875專利文獻6:日本專利第3504205號專利文獻7:日本特開2001-1310844專利文獻8:W 0 2004/085429專利文獻9:日本特開2002-173424專利文獻10:日本特開平5-286864號公報專利文獻ll:日本專利第2948818號專利文獻12:日本特開2000-169328號公報專利文獻13:日本特開2000-169332號公報專利文獻14:日本特愿2002-255448號專利文獻15:日本特公平5-9406號公報專利文獻16:日本特公昭63-41396號公報專利文獻17:日本特開2002-255847號公報非專利文獻l:Nutrition Reports International, 13, 579, 1976 非專利文獻2:Br丄Pharmaco1. ，69,551,1980非專利文獻3:J.Biochem. ，50,486,1961非專利文獻4:3101.0^111.，268(14)，9941-9944，1993非專利文獻5:Ann,NYAced. ScL,580,p573非專利文獻6:Int J Pept Protein Res.，17(4),p430-435.,1981非專利文獻7:J.Invest.Dermato1., Vol.94，No.5,p717-723，1990非專利文獻8:Varani J.， et al.， J Invest. Dermatol.， 116, 480-486， 2000非專禾1」文獻9:Zouboulis,C.C.，Retinoids:Is there a New Approach , IFSCC Magazine, Vol.3,No.3,2000非專利文獻10: Wagner,H.,etal.，Arznein.Forsch，24，466,1974.非專利文獻ll:Tittel，G.,etal.，J.Chromatogr.,135,499，1977.非專利文獻12:Tittel，G.,etal.,J.Chromatogr.,153，227，1978.非專禾ll文獻13 :Quercia，V.，etal.'Chromatography in Biochemistry, Medicine and Environmental Research, Frigerio A.(Ed)" ElsevierScientificPublishing Company,Amsterdam, 1983 ，p 1.非專利文獻14:Lowiy，0.et.al.,J.Biol.Chem. ，193,265,1951 非專利文獻15 :MJ.Barttek，etal.，J.Invest.Dermatol.,58， 114,1972發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明以提供促進人體皮膚纖維芽細胞的I型膠原蛋白產(chǎn)生的組合 物為課題。本發(fā)明者進行了為更有效地提高I型膠原蛋白的產(chǎn)生的研究。其結(jié) 果，發(fā)現(xiàn)并用作為膠原蛋白的原料起作用的促進膠原蛋白產(chǎn)生的來自膠原 蛋白的肽及水飛薊賓時，可協(xié)同促進I型膠原蛋白的產(chǎn)生，從而完成了本 發(fā)明。即本發(fā)明涉及l(fā).用于促進I型膠原蛋白產(chǎn)生的組合物，其特征在于， 含有水飛薊賓及促進膠原蛋白產(chǎn)生的肽；2.本發(fā)明1中所述的組合物，其 中，促進膠原蛋白產(chǎn)生的肽是從Gly—Pro—Hyp、 Gly—His—Lys、 Lys— Thr—Thr—Lys—Ser或Gly—Glu—Pro—Arg的氨基酸序列所組成的肽中 選擇的1種或2種以上；3.本發(fā)明1 2中任一項所述的組合物，其用于 預防及/或改善皺紋、松弛、暗淡、斑點。4.化妝料，其特征在于，含有 水飛薊賓及從Gly—Pro—Hyp、Gly—His—Lys、Lys—Thr—Thr—Lys—Ser、 或Gly—Glu—Pro—Arg的氨基酸序列所組成的肽中選擇的1種或2種以 上。5.食品，其特征在于，含有水飛薊賓及從Gly—Pro—Hyp、 Gly—His —Lys、Lys—Thr—Thr—Lys—Ser或Gly—Glu—Pro—Arg的氨基酸序列所 組成的肽中選擇的1種或2種以上。6.本發(fā)明1或2中所述的組合物，其 用于動物。本發(fā)明可提供通過并用水飛薊賓和促進膠原蛋白產(chǎn)生的肽，在促進人 體皮膚纖維芽細胞的I型膠原蛋白產(chǎn)生上效果優(yōu)異的組合物。通過將本發(fā)明的組合物用于化妝料或作為食品攝取，可使皮膚的張 力、彈性提高，期待能預防、防止、改善皺紋和松弛。且本發(fā)明的組合物對皮膚來說安全性非常高。

圖1是在水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊亭的三維皮膚模型中通過Western印跡法檢測I型膠原蛋白產(chǎn)生的示意圖。圖2是將圖1的結(jié)果通過圖像分析處理后數(shù)值化的示意圖。圖3是在Gly-Pro-Hyp(記為G-P-Hyp)序列的三肽的三維皮膚模型中通 過Western印跡法檢測I型膠原蛋白產(chǎn)生的示意圖。圖4是將圖3的結(jié)果通過圖像分析處理后數(shù)值化的示意圖。將 Gly-Pro-Hyp記為G-P-Hyp。圖5是在Gly-Pro-Hyp(記為G-P-Hyp)序列的三肽及水飛薊賓的三維皮 膚模型中通過Western印跡法檢測I型膠原蛋白產(chǎn)生的示意圖。圖6是將圖5的結(jié)果通過圖像分析處理后數(shù)值化的示意圖。將 Gly-Pro-Hyp記為G-P-Hyp。圖7是在Lys-Thr-Thr-Lys-Ser(記為K-T-T-K-S)、 Gly-His-Lys(記為 G-H-K)、 Gly-Glu-Pro-Arg(記為G-Q-P-R)序列的肽及水飛薊賓的三維皮膚 模型中通過Western印跡法檢測I型膠原蛋白產(chǎn)生的示意圖。圖8是將圖7的結(jié)果通過圖像分析處理后數(shù)值化的示意圖。將 Lys-Thr-Thr-Lys-Ser記為K-T-T-K-S 、將Gly-His-Lys記為G-H-K 、將 Gly-Glu誦Pro-Arg記為G-Q-P-K圖9是在并用Lys-Thr-Thr-Lys-Ser(記為K-T-T-K-S)、Gly-His-Lys(記為 G-H-K)、 Gly-Glu-Pro-Arg(記為G-Q-P-R)序列的肽及水飛薊賓時的三維皮 膚模型中通過Western印跡法檢測I型膠原蛋白產(chǎn)生的示意圖。圖10是將圖9的結(jié)果通過圖像分析處理后數(shù)值化的示意圖。將 Lys-Thr-Thr-Lys-Ser記為K-T-T-K-S 、將Gly-His-Lys記為G-H-K 、將 Gly-Glu-Pro-Arg記為G-Q-P-R具體實施方式
水飛薊素(Silymarin;CAS No.65666-07-1)是從菊科水飛薊(學名Silibum marianum Gaertn、別名大薊、大翅薊、乳薊;CAS No.84604-20-6)中提取的黃酮木脂素的總稱，是含有用分子式C25H2201Q表示的水飛薊賓 (Silybin;CAS No.22888-70-6)、水飛薊寧(Silydianin;CAS No.29782國68-l)、 水飛薊亭(Silychristin;CAS No.33889-69-9)、異水飛薊賓(Isosilybin;CAS No.72581-71-6)等的組合物(非專利文獻10)。本發(fā)明中，與以往技術(shù)相同， 將含有水飛薊提取物中所含有的這些黃酮木脂素的組合物稱為水飛薊素 。且水飛薊素如上所述是黃酮木脂素的混合物，水飛薊素在植物提取物、 植物中的含量可通過分光光度計測定的方法(非專利文獻11)、通過薄層色 譜法的方法(非專利文獻9)、通過高效液相色譜法的方法(非專利文獻12 14)測定。這些測定法中，通過分光光度計測定的方法之一 2，4-二硝基苯肼 分析法已被德國藥局[關(guān)于水飛薊(Silybum marianum)果實的專題論文] 報道，并廣泛應用。本發(fā)明中，上述成分的混合組合物的定量使用2，4-二硝基苯肼分析法， 用換算成水飛薊賓的質(zhì)量％標記。水飛薊素在歐洲從古至今都用于預防及治療肝臟疾病，且作為抗氧化 劑廣為人知。作為對皮膚有效的組合物，已開發(fā)出干癬及特應性皮炎的治 療制劑(專利文獻10)，含有以黃酮木脂素和磷脂的復合物為活性成分， 對紅斑、燙傷、皮膚或粘膜的營養(yǎng)不良狀態(tài)、皮炎等的治療、皮膚的老化 防止及對放射線、風、太陽等外部環(huán)境刺激的保護非常有效的組合物(專 利文獻11)，表皮滲透屏障強化劑(專利文獻12)，皮脂分泌抑制劑(專 利文獻13)，預防、防止、改善表皮扁平化的用于防止皮膚老化的組合物 (專利文獻14)，利用抗氧化能力的用于防止皮膚老化的化妝料(專利文 獻15)，人體皮膚纖維芽細胞及三維皮膚模型中用于促進I型膠原蛋白產(chǎn) 生的組合物(專利文獻8)。將水飛薊素從水飛薊的果實中高純度分離的方法，已報道的有以70 80%的純度分離的方法及以90 96%的純度分離的方法(專利文獻16)。 水飛薊素通常是用乙醇、乙酸乙酯、丙酮等從水飛薊的種實中提取，再通 過噴霧干燥制成干燥粉末后作為提取物原料市售。本發(fā)明中使用的水飛薊 賓可直接使用如上述制備、市售的含有水飛薊賓的水飛薊素，也可使用從水飛薊中濃縮水飛薊賓后的提取物及將水飛薊賓分離、精制后作為化合物 使用。本發(fā)明中含有水飛薊賓的植物體，可使用葉、莖、芽、花、木質(zhì)部、 木皮部(樹皮)等的地上部、根、塊莖等的地下部、種子、樹脂等的所有 部位。本發(fā)明中水飛薊賓及含有水飛薊賓的植物體，可使用使其自身干燥后 的干燥物及使用各種溶劑將其溶解后的溶解物。例如，可使用以水或乙醇、甲醇等的醇類、丙二醇、1， 3 — 丁二醇等的多元醇、醚、丙酮、乙酸乙 酯等的有機溶劑溶解的溶解物。本發(fā)明中含有水飛薊賓的植物體，可直接使用天然干燥、熱風干燥、 冷凍干燥或發(fā)酵處理后的產(chǎn)物。制備植物提取物時可依照通常方法，使用 通過提取、濃縮、粉末化等處理后獲得的產(chǎn)物。本發(fā)明的促進膠原蛋白產(chǎn)生的肽，優(yōu)選Gly—Pro—Hyp、 Gly—His— Lys、Lys—Thr—Thr—Lys—Ser或Gly—Glu—Pro—Arg的氨基酸序列所組 成的肽。已知Gly—Pro—Hyp是將膠原蛋白成分或明膠成分通過膠原酶特異 性分解后得到的肽組合物，可比以往的膠原蛋白、明膠或其水解物更快更 有效地被消化吸收(專利文獻17)。如前所述的報道，對于通過來自溶組 織梭菌(Clostridium Histolyticum)的膠原酶分解的膠原蛋白的分解產(chǎn)物， 其生成的三肽的36%是Gly—Pro—Hyp，為最多(非專利文獻3)，所以 是制造Gly-Pro—Hyp的特別高效的方法。本發(fā)明中使用的Gly—Pro— Hyp也可使用化學合成后的產(chǎn)物。本發(fā)明中使用的Gly—His—Lys，可使用將a2前膠原蛋白通過膠原酶 等的膠原蛋白分解酶分解的產(chǎn)物，也可使用化學合成后的產(chǎn)物。本發(fā)明中使用的Lys—Thr—Thr—Lys—Ser，可使用將al前膠原蛋白 通過膠原酶等的膠原蛋白分解酶分解的產(chǎn)物，也可使用化學合成后的產(chǎn) 物。本發(fā)明中使用的Gly — Glu — Pro — Arg，可使用將免疫球蛋白G(immunoglobulin G)通過胰蛋白酶等的分解酶分解的產(chǎn)物，也可使用化 學合成后的產(chǎn)物。本發(fā)明的用于促進I型膠原蛋白產(chǎn)生的組合物，可促進構(gòu)成真皮的細 胞外基質(zhì)的主要蛋白質(zhì)I型膠原蛋白的產(chǎn)生，提高皮膚的張力、彈性，預 防、防止、改善由增齡、紫外線照射等引起的皺紋、松弛的形成，使皮膚 保持年輕。本發(fā)明的用于促進I型膠原蛋白產(chǎn)生的組合物，可作為化妝料等的皮 膚外用劑、經(jīng)口用食品來制造?；瘖y料，可將水飛薊賓、作為水飛薊賓供給源的水飛薊素、含有水飛 薊賓的植物體或其植物提取物的任一種以及從Gly—Pro—Hyp、 Gly—His _Lys、 Lys—Thr—Thr—Lys—Ser、 Gly—Glu—Pro—Arg中選擇的肽直接 或添加于小麥胚芽油或橄欖油等中，作為化妝料成分使用，以制造化妝料。食品，可將水飛薊賓、作為水飛薊賓供給源的水飛薊素、含有水飛薊 賓的植物體或其植物提取物的任一種以及從Gly—Pro—Hyp、 Gly—His— Lys、 Lys—Thr—Thr—Lys—Ser、 Gly—Glu—Pro—Arg中選擇的肽直接或 添加各種營養(yǎng)成分后作為食品使用，也可配合在所需的食品中。例如，可 添加淀粉、乳糖、麥芽糖、植物油脂粉末、可可脂粉末、硬脂酸等的適當 的輔助劑后，使用常用的方法制成適于食用的形態(tài)，例如顆粒狀、粒狀、 片劑、膠囊、糊狀等作為健康補助食品、保健功能食品等。且可添加于各 種食品，例如火腿、香腸等的肉食加工食品，魚糕、圓筒狀魚糕等的水產(chǎn) 加工食品，面包、點心、黃油、奶粉、發(fā)酵乳制品中，也可添加于水、果 汁、牛乳、清涼飲料等的飲料中使用。本發(fā)明的用于促進I型膠原蛋白產(chǎn)生的組合物中，水飛薊賓與各種肽 的配合比率(摩爾比)，可根據(jù)各種成分的配制法、制劑的形態(tài)等適當選 擇決定，無特別限定，水飛薊賓為l時，優(yōu)選將各種肽以2 6的比例配合o本發(fā)明的向用于促進I型膠原蛋白產(chǎn)生的組合物、化妝料、食品中添 加的水飛薊賓及促進膠原蛋白產(chǎn)生的肽的有效配合量，根據(jù)各種成分的配制法、制劑的形態(tài)等適當選擇決定，無特別限定，但作為皮膚外用劑使用時，優(yōu)選使水飛薊賓及促進膠原蛋白產(chǎn)生的肽分別含有O. 01 2重量％。 另外，作為片劑、飲料等、作為食品使用時，優(yōu)選含有O. 1 10重量％。本發(fā)明的用于促進I型膠原蛋白產(chǎn)生的組合物、化妝料、食品的有效 適用量，可通過適用途徑、適用日程、制劑形態(tài)等適當決定。例如，可在 每天O. 01g 10g的范圍適當調(diào)節(jié)，分l次或數(shù)次使用。作為食品，可直接或添加各種營養(yǎng)成分后使用。例如，可添加淀粉、 乳糖、麥芽糖、植物油脂粉末、可可脂粉末、硬脂酸等適當?shù)妮o助劑后使 用常用的手段，制成適合食用的形態(tài)，例如顆粒狀、粒狀、片劑、膠囊、 糊狀等，作為健康補助食品、保健功能食品等用于食用，或也可添加于各 種食品，例如火腿、香腸等的肉食加工食品，魚糕、圓筒狀魚糕等的水產(chǎn) 加工食品，面包、點心、黃油、奶粉、發(fā)酵乳制品中使用，也可添加于水、 果汁、牛乳、清涼飲料等的飲料中使用。上述制劑、食品，可通過通常采 用的制劑化技術(shù)制造。作為化妝料，可直接或添加于小麥胚芽油或橄欖油等中作為化妝料的 成分使用，使用這些物質(zhì)可制造化妝料。適合非經(jīng)口用的組合物，例如可適用水溶液、油劑、乳液、懸濁液等 的液劑，凝膠、霜劑等的半固體劑，粉末、顆粒、膠囊、微膠囊、固體等 的固體劑的形態(tài)。用以往的公知方法配制成這些形態(tài)，可制成洗液、乳劑、 凝膠劑、霜劑、軟膏、硬膏、巴布劑、氣霧劑、坐劑、注射劑、粉末劑等 的各種劑型。上述制劑可適用于向身體涂布、粘貼、噴霧等。特別是這些 劑型中，洗液、乳劑、霜劑、軟膏劑、硬膏劑、巴布劑、氣霧劑等可適用 于皮膚外用劑?；瘖y料，可制成化妝水、乳液、面霜、面膜等的皮膚化妝 料、化妝用基礎(chǔ)化妝水、化妝用面霜、乳液狀或奶油狀或軟膏型的粉底、 口紅、眼影、胭脂類的化妝用化妝料、護手霜、美腿霜、潤膚液等的身體 用化妝料等。制成與增量劑混合的組合物的狀態(tài)可便于使用。增量劑可使用葡萄 糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖等的糖類、山梨糖醇等的糖醇、糊精、環(huán)狀糊精等的加工淀粉、小麥淀粉、玉米淀粉等的淀粉類、酪蛋白、大豆蛋白質(zhì) 等的蛋白質(zhì)、阿拉伯膠、海藻酸鈉、酪蛋白鈉、明膠、果膠、粉末纖維素、 羧甲基纖維素等的高分子穩(wěn)定劑、卵磷脂、蔗糖脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸 酯、甘油脂肪酸酯等的乳化劑、鈣粉末等。本發(fā)明的用于促進I型膠原蛋白產(chǎn)生的組合物、化妝料、食品中可含 有具有抗氧化作用的化合物。具有抗氧化作用的化合物無特別限定，例如各種維生素類、蘆丁等的各種多酚類、生育三烯酚、補酶Q10及含有這些 物質(zhì)的天然成分等。本發(fā)明的用于促進I型膠原蛋白產(chǎn)生的組合物、化妝料、食品中可含 有促進除去生物體內(nèi)異常蛋白質(zhì)積累的成分。促進除去生物體內(nèi)異常蛋白 質(zhì)積累的成分，無特別限定，例如可列舉為大豆皂角苷、羽衣甘藍提取物、 白芨提取物、水菖蒲提取物等。其他可根據(jù)用途、劑型添加以下物質(zhì)。油脂類，例如可為山茶油、月見草油、澳洲胡桃油、橄欖油、菜籽油、 玉米油、芝麻油、荷荷巴油、胚芽油、小麥胚芽油、三辛酸甘油酯等的液 體油脂，可可脂、椰子油、氫化椰子油、棕櫚油、棕櫚核油、木蠟、木蠟 核油、氫化油、氫化蓖麻油等的固體油脂，蜂蠟、小燭樹蠟、棉蠟、糠蠟、 羊毛脂、醋酸羊毛脂、液狀羊毛脂、蔗蠟等的蠟類。烴類，例如可為液體石蠟、角鯊烯、角鯊烷、微晶蠟等。高級脂肪酸，例如可為月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、 亞油酸、亞麻酸、二十二碳六烯酸(DHA)、 二十碳五烯酸(EPA)等。高級醇，例如可為月桂醇、硬脂醇、十六烷醇、十八十六醇等的直鏈 醇，十八垸基甘油醚、羊毛醇、膽固醇、植物甾醇、辛基十二垸醇等的支 鏈醇等。硅酮，例如可為鏈狀聚硅氧垸的二甲基聚硅氧垸、甲基苯基聚硅氧垸 等，環(huán)狀聚硅氧烷的十甲基環(huán)五硅氧垸等。陰離子表面活性劑，例如可為月桂酸鈉等的脂肪酸鹽、月桂基硫酸鈉等的高級烷基硫酸酯鹽、POE月桂基硫酸三乙醇胺等的烷基醚硫酸酯鹽、 N-?；“彼帷⒒腔晁猁}、N-酰基氨基酸鹽等。陽離子表面活性劑，例如可為十八烷基三甲基氯化銨等的烷基三甲基 銨鹽、氯化苯甲烴銨、芐索氯銨等。兩性表面活性劑，例如可為烷基甜菜堿、酰胺甜菜堿等的甜菜堿系表 面活性劑等。非離子表面活性劑，例如可為失水山梨醇單油酸酯等的失水山梨醇脂 肪酸酯類、氫化蓖麻油衍生物等。防腐劑，例如可為對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯等。金屬離子封鎖劑，例如可為乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸、乙二 胺四乙酸鈉鹽等的乙二胺四乙酸鹽等。高分子，例如可為阿拉伯膠、西黃蓍膠、半乳聚糖、瓜爾豆膠、卡拉 膠、果膠、瓊脂、榲梓子、葡聚糖、普魯蘭多糖、羧甲基淀粉、膠原蛋白、 酪蛋白、明膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、羧甲基 纖維素鈉(CMC)、海藻酸鈉、聚羧乙烯(Carboxyvinylpolymer) (CARBOPOL等)等的乙烯類高分子等。增粘劑，例如可為卡拉膠、西黃蓍膠、揾梓子、酪蛋白、糊精、明膠、 羧甲基纖維素鈉(CMC)、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、聚羧乙烯、瓜 爾豆膠、黃原膠、膨潤土等。粉末成分，例如可為滑石粉、高嶺土、云母、二氧化硅、沸石、聚乙 烯粉末、聚苯乙烯粉末、纖維素粉末、無機白色顏料、無機紅色系顏料、 云母鈦珠光顏料、氧化鈦包覆的滑石粉、著色型云母鈦珠光顏料等的珠光 顏料、紅色201號、紅色202號等的有機顏料等。紫外線吸收劑，例如可為對氨基苯甲酸、水楊酸苯酯、對甲氧基肉桂 酸異丙酯、對甲氧基肉桂酸辛酯、2,4-二羥基二苯甲酮等。紫外線屏蔽劑，例如可為氧化鈦、滑石粉、胭脂紅、膨潤土、高嶺土、氧化鋅等。保濕劑，例如可為聚乙二醇、丙二醇、二丙二醇、1， 3-丁二醇、1，2-戊二醇、甘油、雙甘油、聚甘油、木糖醇、麥芽糖醇、麥芽糖、山梨糖 醇、葡萄糖、果糖、硫酸軟骨素鈉、透明質(zhì)酸鈉、乳酸鈉、吡咯烷酮羧酸、環(huán)糊精等。藥效成分，例如可為維生素A油、視黃醇等的維生素A類，核黃素 等的維生素B2類、吡哆醇鹽酸鹽等的B6類，L-抗壞血酸、L-抗壞血酸磷 酸酯、L-抗壞血酸單棕櫚酸酯、L-抗壞血酸二棕櫚酸酯、1^-抗壞血酸-2-葡萄糖苷等的維生素C類，泛酸鈣等的泛酸類，維生素D2、維生素D3等 的維生素D類；a-維生素E、醋酸維生素E、 DL-(x-維生素E煙酸酯等的 維生素E類等的維生素類等。且可為胎盤提取物、谷胱甘肽、虎耳草提取物等的美白劑，蜂王漿、 山毛櫸提取物等的皮膚活化劑，辣椒素、姜酮、斑蝥素、魚石脂、咖啡因、 單寧酸、Y-谷維素等的血流促進劑，甘草酸衍生物、甘草次酸衍生物、甘 菊環(huán)等的消炎劑，精氨酸、絲氨酸、亮氨酸、色氨酸等的氨基酸類，常駐 菌控制劑的麥芽糖蔗糖縮合物、氯化溶菌酶等。并且，還可為洋甘菊提取物、荷蘭芹提取物、山毛櫸提取物、葡萄酒 酵母提取物、葡萄柚提取物、金銀花提取物、米提取物、葡萄提取物、啤 酒花提取物、米糠提取物、枇杷提取物、黃檗提取物、薏米仁提取物、當 藥提取物、草木樨提取物、樺樹提取物、甘草提取物、芍藥提取物、肥皂 草提取物、絲瓜提取物、辣椒提取物、檸檬提取物、龍膽提取物、紫蘇提 取物、盧薈提取物、迷迭香提取物、鼠尾草提取物、鋪地百里香提取物、 茶提取物、海藻提取物、黃瓜提取物、丁香提取物、胡蘿卜提取物、歐洲 七葉樹提取物、金縷梅提取物、桑樹提取物等的各種提取物。以下可列舉試驗例、實施例更詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的效果不 限于這些試驗例、實施例。[藥劑的配制]在培養(yǎng)液中適量添加將水飛薊賓(Silibin; SigmaAldrich)通過生物 化學用試劑級別的二甲亞砜(DMSO;和光純藥)溶解的溶液，對三維皮膚模型進行處理。在培養(yǎng)液中適量添加將水飛薊素(Sigma Aldrich)通過生物化學用 試劑級別的二甲亞砜(DMSO;和光純藥)溶解的溶液，對三維皮膚模型 進行處理。水飛薊寧、水飛薊亭用如下方法進行分離。將2g水飛薊素(Sigma Aldrich)溶解到10 ml乙醇中，在200 ml ODS色譜柱(FUJISILYSIA CHEMICALDM1020T)中，用水比甲醇的比率為1比1的溶劑條件分離， 得到水飛薊寧粗畫分、水飛薊亭粗畫分。水飛薊寧粗畫分、水飛薊亭粗畫分分別在200ml硅膠色譜中，用氯仿 比甲醇的比率為95比5的溶劑條件分離，得到17mg水飛薊亭精制物、 34mg水飛薊寧精制物。在培養(yǎng)液中適量添加將水飛薊亭精制物、水飛薊 寧精制物通過生物化學用試劑級別的二甲亞砜(DMSO;和光純藥)溶解 的溶液，對三維皮膚模型進行處理。GLY-PRO-HYP使用了市售品(銷售廠家;和光純藥，制造廠家;Bachem AQSwitzerland)。Lys—Thr—Thr—Lys—Ser、 Gly—His—Lys、 Gly—Glu—Pro—Arg委 托Nikka Techno Service Co" LTD.,[日語原名「日化亍夕乂廿一f義(株)」]使用通常方法合成。合成后通過反相HPLC精制。證實通過根據(jù) 氨基酸分析及反相HPLC的純度分析，合成了 90%以上純度的目的肽。 在培養(yǎng)液中適量添加將這些肽通過生物化學用試劑級別的二甲亞砜(DMSO;和光純藥)溶解的溶液，對三維皮膚模型進行處理。[人體皮膚三維模型]人體皮膚三維模型是人體皮膚的仿真模型，廣泛用于安全性評價、有 效性評價。人體皮膚三維模型使用人造皮膚(TESTSKIN) (LSE-high)(東洋紡績)。[各藥劑處理的人體皮膚三維模型提取樣品的制備]在人造皮膚(TESTSKIN) (LSE-high)的外側(cè)孔中添加培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時。之后在更換培養(yǎng)液的同時，將10(Vl各藥劑添加在檢驗環(huán)(assay ring)內(nèi)的組織上，培養(yǎng)36小時。回收組織，加入組織提取用溶液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、 0.5%(Octylphenoxy)polyethoxyethanol(Sigma-Aldrich)}， 用氟碳樹脂制均質(zhì)器均質(zhì)。10，000xG、30分鐘離心除去組織片后，在蒸餾 水中4'C透析一夜。其后通過冷凍干燥除去水分。加入組織提取用溶液至 20倍濃縮，三維皮膚模型提取樣品用于Western印跡法。[通過Western印跡法的促進I型膠原蛋白產(chǎn)生的作用的評價]用人體皮膚三維模型提取樣品，每泳道使用(apply) 10嗎蛋白質(zhì)， 用SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。將轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜浸 入封閉溶液(用含有0.1%聚氧乙烯(20)失水山梨醇單月桂酸酯的PBS 溶解脫脂奶，使脫脂奶為5%的濃度的溶液)，4"C下封閉一晝夜。用洗滌 液{含有0.1%的聚氧乙烯(20)失水山梨醇單月桂酸酯的PBS)洗滌后， 浸入一次抗體{用洗滌液配制的500ng/ml抗I型膠原蛋白的多克隆抗體 (Rockland )}，室溫反應1小時。洗滌后浸入二次抗體(用洗滌液配制 成250ng/ml的辣根過氧化物酶標記抗兔免疫球蛋白G)，室溫反應1小時。 洗滌后，使用ECL Plus Western印跡法檢測試劑(Amersham Biosciences 公司)檢測。且檢測出的條帶使用圖像掃描儀(Image Scanner) (Amersham Biosciences公司)輸入后，通過ImageMaster軟件(Amersham Biosciences 公司)分析并數(shù)值化。實施例1有關(guān)水飛薊素中含有的促進I型膠原蛋白產(chǎn)生的有效成分的評價用10(ag/ml水飛薊素、分別用10)iM濃度的水飛薊賓、水飛薊亭、水 飛薊寧對人體皮膚三維模型進行處理，通過Western印跡法測定I型膠原 蛋白的量。檢測出的條帶如圖l所示，將檢測出的條帶數(shù)值化后的圖如圖 2所示。用10pg/ml水飛薊素、10pM水飛薊素中所含有的成分水飛薊賓處理 時，與無處理對照相比，I型膠原蛋白的產(chǎn)生被促進，分別為2.3倍及3.2倍(圖1及圖2)。另外，用10pM水飛薊素中所含有的成分水飛薊亭、水 飛薊寧處理時，與無處理對照相比，I型膠原蛋白的產(chǎn)生分別為0.95倍及 0.9倍(圖l及圖2)。因此可表明，水飛薊素中所含有的有關(guān)促進I型膠原 蛋白產(chǎn)生的有效成分是水飛薊賓。實施例2單獨使用Glv-Pro-Hvp及并用Glv-Pro-Hyp與水飛薊賓時對促進I型 膠原蛋白產(chǎn)生作用的評價用5、 10、 30pM濃度的Gly-Pro-Hyp對人體皮膚三維模型進行處理， 通過Western印跡法測定I型膠原蛋白的量。檢測出的條帶如圖3表示， 將檢測出的條帶數(shù)值化的圖如圖4所示。同樣，單獨使用30pM Gly-Pro-Hyp、單獨使用5pM水飛薊賓、并用30pM Gly-Pro-Hyp和5pM 水飛薊賓進行測定。所得到的條帶如圖5所示，其數(shù)值化的圖如圖6所示用5、 10、 30pM Gly-Pro-Hyp處理時，與無處理對照相比，I型膠原 蛋白的產(chǎn)生分別為1.05倍、1.15倍及1.25倍(圖3及圖4)。因此可表明， 即使單獨使用Gly-Pro-Hyp也具有促進I型膠原蛋白產(chǎn)生的作用，但其作 用不太強。單獨使用30pM Gly-Pro-Hyp、單獨使用5pM水飛薊賓、并用30, Gly-Pro-Hyp和5pM水飛薊賓時，與無處理對照相比，I型膠原蛋白的產(chǎn) 生分別為1.25倍、1.85倍及4.25倍(圖5及圖6)。因此可表明，與各自 單獨使用相比，并用Gly-Pro-Hyp及水飛薊賓能協(xié)同促進I型膠原蛋白產(chǎn) 生。實施例3分別單獨使用Lvs—Thr—Thr—Lvs—Ser、 Glv—His—Lys、 Glv—Glu —Pro—Arg及將Lvs—Thr—Thr—Lvs—Ser、 Glv—His—Lvs、 Gly—Glu— Pro—Am分別與水飛薊賓并用時對促進I型膠原蛋白產(chǎn)生作用的評價分別用10及30pM濃度的Lys—Thr—Thr—Lys—Ser、Gly—His—Lys、 Gly—Glu—Pro—Arg對人體皮膚三維模型進行處理，通過Western印跡法測定I型膠原蛋白的量。檢測出的條帶如圖7所示，將檢測出的條帶數(shù)值 化后的圖如圖8所示。同樣，分別單獨使用10pM Lys—Thr—Thr—Lys —Ser、 Gly—His—Lys、 Gly—Glu—Pro—Arg，單獨使用5nM水飛薊賓， 將10, Lys—Thr—Thr—Lys—Ser、 Gly—His—Lys、 Gly—Glu—Pro—Arg分別與5pM水飛薊賓并用，對人體皮膚三維模型進行處理，測定I型 膠原蛋白產(chǎn)生量。所得到的條帶如圖9所示，將其數(shù)值化的圖如圖10所不。分別用10及30pM Lys—Thr—Thr—Lys—Ser、 Gly_His—Lys、 Gly 一Glu—Pro—Arg處理時，與無處理對照相比，I型膠原蛋白產(chǎn)生在用10 及30pM的Lys—Thr—Thr—Lys—Ser處理時為1. 80倍、2. 45倍，用 10及30pM的Gly—His—Lys處理時為1. 75倍、2. 70倍，用10及30一 的Gly—Glu—Pro—Arg處理時為2. 15倍及3. 55倍(圖7及圖8)。因 此可表明，Lys—Thr—Thr—Lys—Ser、 Gly—His—Lys、 Gly—Glu—Pro— Arg促進I型膠原蛋白產(chǎn)生的效果，分別為濃度依賴型促進效果。且分別單獨用lOpMLys—Thr—Thr—Lys—Ser、 Gly—His—Lys、 Gly 一Glu—Pro—Arg及單獨用5^iM水飛薊賓處理時，與無處理對照相比，I 型膠原蛋白的產(chǎn)生分別為1. 80倍、1. 75倍、2. IO倍及I. 95倍(圖9 及圖10)，而分別用lO(iM Lys—Thr—Thr—Lys—Ser、 Gly—His—Lys、 Gly—Glu—Pro—Arg與5pM水飛薊賓并用時，與無處理對照相比，I型 膠原蛋白產(chǎn)生分別為5. 75倍、5. 35倍、4. 95倍(圖9及圖10)。因此 可表明，與各自單獨使用相比，通過使Lys—Thr—Thr—Lys—Ser、 Gly— His—Lys、 Gly—Glu—Pro—Arg分別與水飛薊賓并用能協(xié)同促進I型膠原 蛋白產(chǎn)生。以下表示本發(fā)明的處方例，但本發(fā)明不限于這些處方例。處方例l膠囊劑的制造混合下述成分，充填到混合有明膠及甘油的膠囊基質(zhì)中，得到軟膠囊。(組成) (配合量;mg)水飛薊提取物(含有35%水飛薊賓) 25大豆提取物(含有80%大豆皂角苷) 25Gly-Pro-Hyp (膠原蛋白分解精制物) 25生育三烯烴 30蜂蠟 10葡萄籽油 110處方例2片劑的制造混合下述成分，壓片，得到片劑。(組成) (配合量;mg)水飛薊提取物(含有35%水飛薊賓) 25大豆提取物(含有80%大豆皂角苷) 25Gly-Pro-Hyp (膠原蛋白分解精制物) 25纖維素 40淀粉 20蔗糖脂肪酸酯 2處方例3片劑的制造 混合下述成分，壓片，得到片劑。(組成) (配合量;mg)水飛薊提取物(含有35%水飛薊賓) 25大豆提取物(含有80%大豆皂角苷) 25Lys-Thr隱Thr-Lys畫Ser (肽) 25纖維素 40淀粉 20蔗糖脂肪酸酯 2處方例4片劑的制造混合下述成分，壓片，得到片劑。(組成) (配合量;mg)水飛薊提取物(含有35%水飛薊賓) 25大豆提取物(含有80%大豆皂角苷) 25Gly-His-Lys (肽) 25纖維素 40淀粉 20蔗糖脂肪酸酯 2處方例5片劑的制造混合下述成分，壓片，得到片劑。(組成) (配合量;mg)水飛薊提取物(含有35°/。水飛薊賓) 25大豆提取物(含有80%大豆皂角苷) 25Gly隱Glu-Pro畫Arg (肽) 25纖維素 40淀粉 20蔗糖脂肪酸酯 2處方例6果汁的制造(組成) (配合;質(zhì)量％)果糖葡萄糖液糖 5.00擰檬酸 10.40L-抗壞血酸 0.20香料 0.02色素 0.10水飛薊提取物(含有35%水飛薊賓) 1.00Gly-Pro-Hyp (膠原蛋白分解精制物) 1.00大豆提取物(含有85%大豆皂角苷) 1.00水 81.28處方例7霜劑的制造將下述成分(1) (12)在8(TC下加熱溶解成為油相。將成分(13) (15)在70。C下加熱溶解成為水相。在油相中緩緩加入水相進行乳化，攪 拌的同時冷卻到40'C，進一步攪拌冷卻到3(TC后得到霜劑。(組成) (配合;質(zhì)量％)(1)硬脂醇6,0(2)硬脂酸2.0(3)氫化羊毛脂 '4.0(4)角鯊垸9.0(5)辛基十二烷醇10.0(6) POE (25)十六垸醇醚3.0(7)單硬脂酸甘油酯2.0(8)白芨提取物0.1(9)水飛薊提取物(含有85%水飛薊賓)0.7(10) Gly-Pro-Hyp (膠原蛋白分解精制物)0.1(11)防腐劑適量(12)香料適量(13) 1, 3丁二醇6.0(14) PEG 15004.0(15)精制水剩余處方例8霜劑的制造將下述成分(1) (12)在8(TC下加熱溶解成為油相。將成分(13) (15)在7(TC下加熱溶解成為水相。在油相中緩緩加入水相進行乳化，攪 拌的同時冷卻到4(TC，進一步攪拌冷卻到3(TC后得到霜劑。(組成) (配合;質(zhì)量％)(1) 硬脂醇 6.0(2) 硬脂酸 2.0(3) 氫化羊毛脂 4.0(4) 角鯊烷 9.0(5) 辛基十二烷醇 10.0(6) POE (25)十六烷醇醚 3.0(7) 單硬脂酸甘油酯 2.0(8) 白芨提取物 0.1(9) 水飛薊提取物(含有85%水飛薊賓) 0.7(10) Lys-Thr國Thr畫Lys-Ser (肽) 0.1(11) 防腐劑 適量(12) 香料 適量(13) 1, 3丁二醇 6.0(14) PEG 1500 4.0(15) 精制水 剩余處方例9霜劑的制造將下述成分(1) (12)在80'C下加熱溶解成為油相。將成分(13) (15)在70'C下加熱溶解成為水相。在油相中緩緩加入水相進行乳化，攪 拌的同時冷卻到4(TC，進一步攪拌冷卻到3(TC后得到霜劑。(組成) (配合;質(zhì)量％)(1)硬脂醇6.0(2)硬脂酸2.0(3)氫化羊毛脂4,0(4)角鯊垸9.0(5)辛基十二烷醇10.0(6) POE (25)十六垸醇醚3.0(7)單硬脂酸甘油酯2.0(8)白芨提取物0.1(9)水飛薊提取物(含有85°/。水飛薊賓)0.7(10) Gly畫His-Lys (肽)0.1(11)防腐劑適量(12)香料適量(13) 1， 3丁二醇6.0(14) PEG 15004.0(15)精制水剩余處方例IO霜劑的制造將下述成分(1) (12)在8(TC下加熱溶解成為油相。將成分(13) (15)在7(TC下加熱溶解成為水相。在油相中緩緩加入水相進行乳化，攪 拌的同時冷卻到40°C，進一步攪拌冷卻到30'C后得到霜劑。(組成) (配合;質(zhì)量％)(1)硬脂醇6.0(2)硬脂酸2.0(3)氫化羊毛脂4.0(4)角鯊烷9.0(5)辛基十二垸醇10.0(6) POE (25)十六烷醇醚3.0(7)單硬脂酸甘油酯2.0(8)白芨提取物0.1(9)水飛薊提取物(含有85%水飛薊賓)0.7(10) Gly-Glu-Pro-Arg (肽)0.1(11)防腐劑適量(12)香料適量(13) 1， 3丁二醇6,0(14) PEG 15004.0(15)精制水剩余
權(quán)利要求
1.用于促進I型膠原蛋白產(chǎn)生的組合物，其特征在于，含有水飛薊賓及促進膠原蛋白產(chǎn)生的肽。
2. 權(quán)利要求1中所述的組合物，其中，促進膠原蛋白產(chǎn)生的肽是從 Gly—Pro—Hyp、 Gly—His—Lys、 Lys—Thr—Thr—Lys—Ser或Gly—Glu 一Pro—Arg的氨基酸序列所組成的肽中選擇的1種或2種以上。
3. 權(quán)利要求1 2中任一項所述的組合物，其用于預防及/或改善鈹 紋、松弛、暗淡、斑點。
4. 化妝料，其特征在于，含有水飛薊賓及從Gly—Pro—Hyp、 Gly— His—Lys、 Lys—Thr—Thr—Lys—Ser或Gly—Glu—Pro—Arg的氨基酸序 列所組成的肽中選擇的1種或2種以上。
5. 食品，其特征在于，含有水飛薊賓及從Gly—Pro—Hyp、 Gly—His 一Lys、Lys—Thr—Thr—Lys—Ser或Gly—Glu—Pro—Arg的氨基酸序列所 組成的肽中選擇的1種或2種以上。
6. 權(quán)利要求1或2中所述的組合物，其用于動物。
全文摘要
本發(fā)明以提供促進人體皮膚纖維芽細胞的I型膠原蛋白產(chǎn)生的組合物為目的，涉及含有水飛薊賓及促進膠原蛋白產(chǎn)生的肽(Gly-Pro-Hyp、Gly-His-Lys、Lys-Thr-Thr-Lys-Ser或Gly-Glu-Pro-Arg的氨基酸序列所組成的肽)的用于促進I型膠原蛋白產(chǎn)生的組合物。
文檔編號A61K31/357GK101277713SQ20068003617
公開日2008年10月1日 申請日期2006年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月29日
發(fā)明者宮田智, 海野優(yōu)卡里 申請人:株式會社芳珂