專利名稱：：用于流感診斷和治療的方法和組合物的制作方法用于流感診斷和治療的方法和組合物相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/696，221(2005年7月1日提交)、美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/726,377(2005年10月13日提交)、60/765,292(2006年2月2日提交)和60/792,274(2006年4月14日提交)的優(yōu)先權(quán)，上述各申請(qǐng)均在此完整引入作為參考。
背景技術(shù)：
：流行性病毒感染造成世界范圍內(nèi)嚴(yán)重的喪失生命并引起人類疾病，范圍從普通感冒到危及生命的流感、西尼羅河病毒(WestNile)和HIV感染。及時(shí)的檢測(cè)、診斷和治療是在流行性、廣泛流行性和動(dòng)物流行性背景中限制疾病傳播的關(guān)鍵。快速篩查和診斷方法對(duì)減少患者患病和群體風(fēng)險(xiǎn)是特別有用。同樣地，快速抑制病毒組裝和增殖的治療劑特別適用于治療方案。最近，流感A已經(jīng)顯示成為對(duì)人群潛在的嚴(yán)重風(fēng)險(xiǎn)。禽類株已經(jīng)交叉到人類，越來(lái)越多的證據(jù)表明人和人之間的傳播很快就可能發(fā)生、禽流感株對(duì)人群影響的實(shí)例是最近出現(xiàn)的超強(qiáng)毒禽流感株H5N1(鳥(niǎo)流感)，其中大約50%的感染個(gè)體(42人)死亡，在中國(guó)、印度尼西亞和越南由于屠宰上百萬(wàn)家禽導(dǎo)致食物短缺。跟蹤流行的可能性，世界衛(wèi)生組織在2005年7月考慮將全球威脅水平提高到4或者5(共6個(gè)級(jí)別)。一位輿論領(lǐng)袖(叩inionleader)最近在媒體上表示，對(duì)禽流感的"檢測(cè)、監(jiān)督、預(yù)防和治療"...(是)..."與時(shí)間的競(jìng)賽"1。因?yàn)楹苌購(gòu)娜祟惙蛛x出禽類株，并且人類中的死亡率很高，看來(lái)在全世界人群中實(shí)際上不存在免疫力。因此，存在世界范圍大流行的可能。對(duì)比來(lái)說(shuō)，在1918年全球流感流行造成大約2-4千萬(wàn)人死亡。今天隨著人口密度的增加，可能會(huì)有更高的死亡率。在病毒安全參考實(shí)驗(yàn)室中，例如滿足防護(hù)級(jí)別4(ContainmentGroup4)病原體的要求，用于流感A感染的檢測(cè)和確認(rèn)的病毒學(xué)試驗(yàn)方法是耗時(shí)耗力并且高風(fēng)險(xiǎn)的，目卩，包括在含胚雞蛋中的病毒分離4-7天；從死亡或者瀕死胚胎中收集尿囊液；在紅細(xì)胞凝集和紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散試驗(yàn)中檢測(cè)上述液體；禾P，利用專fl制備的單一特異性抗血清，在過(guò)夜免疫擴(kuò)散分析中通過(guò)紅細(xì)胞凝集,和神經(jīng)氨酸苷酶，對(duì)液體中的病毒進(jìn)行最終分型?，F(xiàn)有的分型包括鑒定16個(gè)不同的可能的病毒紅細(xì)胞凝集素蛋白的每一種與9個(gè)不同的可能的病毒神經(jīng)氨酸苷酶蛋白的組合。令人遺憾的是，因?yàn)橹挥泻苌俚牧鞲蠥致病株在當(dāng)時(shí)危及經(jīng)濟(jì)和健康，這種耗時(shí)的工作很多可能是不需要的和浪費(fèi)的。現(xiàn)有的流感抗原的快速免疫診斷檢測(cè)，像"BinaxNOWFIuAandFluBTM"(Binax,Inc.,Porltand，ME)，"DirectigenFluA+BTM"(BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)，"FluOIATM"(BiostarInc.,Boulder,CO)，"QuickVueTM"(Quidel,SandDiego,CA)，"InfluABQuick"(DenkaSiekenCo.，Ltd.,Japan)禾口"XpectFluA&B"(RemelInc.,Le證a,KS)，據(jù)報(bào)道能夠檢測(cè)流感A或者區(qū)別流感A和B，但重要地是，不能區(qū)別不同的流感A亞型或者流感A的致病和非致病株。該檢測(cè)形式的復(fù)雜性可能要求專業(yè)訓(xùn)練。此外，通常需要大量的病毒顆粒以獲得陽(yáng)性試驗(yàn)結(jié)果，這限制了它們?cè)诓《九欧潘阶罡邥r(shí)的短暫窗口期的使用。分析敏感度也是可變的，在某些分析中產(chǎn)生高達(dá)20%假陰性試驗(yàn)結(jié)果，成為當(dāng)前的重要關(guān)注36(例如，參見(jiàn)"WHOrecommendationsontheuseofrapidtestingforinfluenzadiagnosis(WHO推薦使用流感診斷的快速檢測(cè))"，2005年7月)。最近引入基于逆轉(zhuǎn)錄PCR的診斷(RT-PCR)用于確認(rèn)流感A病毒，使檢測(cè)能力產(chǎn)生重要進(jìn)步36，但是費(fèi)力，且需要高度受訓(xùn)的人員，使得當(dāng)場(chǎng)(on-site)和野外檢測(cè)(field-testing)困難。因?yàn)榉崔D(zhuǎn)錄酶的相對(duì)低效，有效檢測(cè)病毒RNA可能需要大量病毒(例如，104病毒顆粒)和多至20個(gè)引物。盡管存在這些顯著的障礙，但在美國(guó)、加拿大和香港的12個(gè)不同的參與檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室之間，最近記載了參考實(shí)驗(yàn)室中高水平熟練的RT-PCR流感A檢測(cè)36。利用RT-PCR和HA引物，Lee等人"描述了H5和H7亞型病毒間的定量鑒別。Munch等人"報(bào)告了利用NP引物，在RT-PCR中，相似的可能差異特異性。令人遺憾的是，RT-PCR不易于適合流行背景中對(duì)象的高通量篩査，或者在農(nóng)業(yè)或者醫(yī)護(hù)點(diǎn)(point-of-care)背景中的現(xiàn)場(chǎng)使用。此外，新流感株的復(fù)雜性、多樣性和快速出現(xiàn)使高風(fēng)險(xiǎn)株的診斷困難，因此快速反應(yīng)在現(xiàn)在幾乎是不可能的。對(duì)流行病學(xué)家來(lái)說(shuō)，高突變率和基因重配造成的多樣性，使得難以預(yù)期新品系在何處出現(xiàn)和及時(shí)做出反應(yīng)引入新的PCR診斷引物。因而，(目前)流感的多樣性表明了多重PCR方法的必要性。禽流感病毒(H5N1)被認(rèn)為是通過(guò)水生野禽中流感病毒的突變和部分重配進(jìn)化的2'3。"患病"鳥(niǎo)類中的高致病性疾病可以不同，從疾病的明顯病征很少的突然死亡到伴有呼吸癥狀、過(guò)度流淚、竇炎、頭部水腫、無(wú)羽表皮的發(fā)紺和腹瀉的更具特征的疾病，即，OIE在其健康指導(dǎo)中采用的"患病"的診斷病征(ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals(陸生動(dòng)物診斷分析和疫苗手冊(cè))，第五版，2004，WorldOrganizationforAnimalHealth(世界動(dòng)物衛(wèi)生組織〉)。在被感染的鳥(niǎo)類中，流感A病毒僅在2-3天內(nèi)就排放4，5?？紤]到人類中的高死亡率，快速檢測(cè)對(duì)隔離感染的禽類和人類對(duì)象和保護(hù)人群是必要的。在本領(lǐng)域，禽流感(birdflu)的人類病例歷史上發(fā)生于東南亞地區(qū)，那里缺乏復(fù)雜的診斷分析設(shè)備、病毒安全參考BL4實(shí)驗(yàn)室和方法的順暢通路。因此，在個(gè)體患者水平評(píng)估群體風(fēng)險(xiǎn)現(xiàn)在是非常成問(wèn)題的。在其他目標(biāo)中，本發(fā)明提供這些問(wèn)題的解決方案。支持農(nóng)業(yè)和公眾健康所需的快速診斷分析，被證明是挑戰(zhàn)性的一即，對(duì)于抗病毒宿主應(yīng)答(抗體)的血清學(xué)檢測(cè)或者樣本中病毒蛋白(抗原)的鑒定。流感A亞型的檢測(cè)也是復(fù)雜的，因?yàn)?i)流行病學(xué)的范圍和公眾健康的需要，即，對(duì)于環(huán)境樣本中和感染家畜，(例如豬流感)，家禽(例如禽流感(avianflu))和人類(例如禽流感(birdflu))中病毒檢測(cè)的潛在需要；和，(ii)可能檢驗(yàn)的樣品范圍廣，可能包括血清，鼻咽、咽喉含漱、鼻或者喉部的樣本(人類)；和，泄殖腔、糞便和氣管的樣本(鳥(niǎo)類)。因?yàn)楦呶２《緝A向于快速傳播，速度極為重要。高親合力的特異性結(jié)合試劑無(wú)疑是關(guān)鍵和必需的。在其他目標(biāo)中，本發(fā)明解決這些關(guān)鍵需求。通過(guò)紅細(xì)胞凝集-抑制(HI)的經(jīng)典流感血清試驗(yàn)(用于抗體)相對(duì)簡(jiǎn)單，但在農(nóng)業(yè)實(shí)踐中這些試驗(yàn)對(duì)于免疫或者自然感染后檢測(cè)禽抗體是相對(duì)不敏感的，因?yàn)檠蹇贵w在感染后傾向于快速下降。在最優(yōu)條件下，例如Xu等人"最近描述了一種膠乳凝集試驗(yàn)，g卩，利用完全熱滅活的疫苗病毒和來(lái)自免疫鳥(niǎo)類的血清。據(jù)報(bào)道后一HI-試驗(yàn)具有88%的靈敏度(12%假陰性)和98%的特異性，在這種情況下，對(duì)這種危險(xiǎn)病毒病原體的農(nóng)業(yè)或者公共衛(wèi)生檢測(cè)來(lái)說(shuō)假陰性率太高。同樣地，利用中國(guó)禽類場(chǎng)所的樣品，最近Jin等人4描述了重組流感NP抗原在ELISA分析中的可能應(yīng)用。這些研究者注意到病毒排放從第2天開(kāi)始，但抗病毒抗體的滴度在2周時(shí)最高。遺憾的是，在檢測(cè)被感染的動(dòng)物之前后者的"滯后"在當(dāng)前世界范圍的危機(jī)中是無(wú)法接受的。展示進(jìn)一步可能的復(fù)雜因素，后者研究中的數(shù)據(jù)顯示低劑量的病毒只產(chǎn)生非常低滴度的抗體，即，說(shuō)明隱性感染可能檢測(cè)不到。流感即流感B常規(guī)診斷方法中的現(xiàn)有局限性在Steininger等人41發(fā)表的數(shù)據(jù)中有記錄。在后來(lái)的研究中，使用不同的試驗(yàn)方法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)A型流感儲(chǔ)存病毒制品；和，有下列發(fā)現(xiàn)即，基于酶的快速分析比常規(guī)病毒分離法檢測(cè)的靈敏度低大約1000倍；而常規(guī)病毒分離法又比RT-PCR的靈敏度低大約1000倍。盡管后者有靈敏度的總量限制，但ELISA仍然正確鑒別出62%的陽(yáng)性樣本和88%取自小于5歲的流感B患者的樣本。作為差樣本對(duì)分析性能影響的實(shí)例，對(duì)商業(yè)可用的流感試驗(yàn)分析其在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)性感染的志愿者的鼻咽樣本中病毒抗原的靈敏度。報(bào)道的結(jié)果表明，分析靈敏度對(duì)于Directigen流感分析43(BectonDickinson)來(lái)說(shuō)大約是60%;禾卩，對(duì)流感光學(xué)免疫測(cè)定(FLUOIA;ThermoBioStar/Biota)44來(lái)說(shuō)在48-100°/。范圍內(nèi)。重要的是，(不管后來(lái)的分析的明顯局限性)，Sharaia等人"報(bào)道了A型流感病毒感染的快速確認(rèn)(i)減少不相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)，例如尿分析和白細(xì)胞檢驗(yàn)，以及，(ii)抗生素在發(fā)燒嬰兒和幼兒中的不恰當(dāng)使用。因此，在臨床實(shí)踐中靈敏度相對(duì)較差的篩查分析仍然是有用的，因?yàn)樵摲治稣_鑒別出那些需要額外隨診的患者。顯而易見(jiàn)，為了非參考實(shí),室的使用，需要對(duì)用戶友善性、速度、分辨性和絕對(duì)定量靈敏度進(jìn)行改進(jìn)，艮P，即使用于常規(guī)流感檢測(cè)。同樣地，常規(guī)流感檢測(cè)對(duì)于提示如何獲得所需分析性能的方法沒(méi)有特別的幫助，所述檢測(cè)性能是檢測(cè)患者樣本中高危流感A株所需要的。H5N1和H7禽流感A病毒呈現(xiàn)的毒力因子和H9N2流感病毒動(dòng)物流行病的傳播和它們與哺乳動(dòng)物宿主因子的相互作用已經(jīng)被綜述5。在流感惡性禽類株編碼的蛋白中，NS1(非結(jié)構(gòu)蛋白-l)早期在感染細(xì)胞中表達(dá)，但與HA和NA不同，它與病毒粒子無(wú)關(guān)，只表達(dá)為胞內(nèi)蛋白。NS1由基因組片段8編碼，是增強(qiáng)病毒mRNA翻譯的病毒調(diào)節(jié)因子；干擾宿主細(xì)胞mRNA的成熟和轉(zhuǎn)運(yùn)6;結(jié)合宿主mRNA的poly(A)尾；改變宿主細(xì)胞基因表達(dá)的內(nèi)在小干擾RNA(siRNA)控制7;預(yù)防抗病毒蛋白激酶R的ds-RNA誘導(dǎo)；抑制干擾素o//3(IFN-/]8)的抗病毒作用的誘導(dǎo)s和拮抗其抗病毒作用9'1Q;和，通過(guò)巨噬細(xì)胞"和樹(shù)突狀細(xì)胞12刺激促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。INF-o://3在先天性和獲得性免疫應(yīng)答以及發(fā)病機(jī)理中的作用已經(jīng)被綜述13。感染細(xì)胞中NS1蛋白的分布表明優(yōu)選核定位，即，在細(xì)胞質(zhì)、核糖體和多聚核糖體部分22-24的量較少。高毒力禽H5N1株的NS1蛋白在體外顯著抑制人細(xì)胞的干擾素應(yīng)答25。一些機(jī)理研究表明，NS1中羧基末端缺失可能減弱野生型A/Swine/Texas/4199-2/98(TX/98)病毒26以及馬流感病毒27的體內(nèi)毒力。有趣地是，缺失NS1基因的流感A似乎在干擾素-缺陷型細(xì)胞系中復(fù)制得最好28，向作者提示INF-a//3的NS1抑制可能是高效病毒增殖必需的。此外，據(jù)報(bào)道高毒力H5N1-NS1基因重重配到毒力較低的H1N1-A株中降低了雜交病毒的肺清除率，并還引起炎性細(xì)胞因子的水平升高29。Tumpey等人4()報(bào)道了檢測(cè)抗NS1抗體可能可用于區(qū)別已接種的和已感染的家禽，即，因?yàn)镹S1只在感染細(xì)胞中表達(dá)，而不在滅活的梯度純化疫苗病毒中表達(dá)。令人遺憾的是，后來(lái)基于抗體的血清試驗(yàn)方法遇到上面和HI試驗(yàn)相同的普遍問(wèn)題即，低靈敏度和不能在病毒排放和感染潛在傳播前檢測(cè)到病毒。利用H7N3株，Cattoli等人42報(bào)告評(píng)估了對(duì)來(lái)自實(shí)驗(yàn)和自然感染火雞的氣管樣本中病毒檢測(cè)的計(jì)時(shí)、特異性和敏感性，即，抗原-捕獲ELISA，RT-PCR和實(shí)時(shí)RT-PCR，(即，后兩個(gè)試驗(yàn)針對(duì)M基因)。在后來(lái)相對(duì)受控的實(shí)驗(yàn)室條件下，早在感染后3-5天就可以特異性和高靈敏度良好地檢測(cè)病毒。他們總結(jié)出只要有足夠的檢測(cè)靈敏度，理論上應(yīng)該可能在感染第3-5天檢測(cè)到至少這種特定的禽類病毒和或許其他更高毒力的禽類株。因此，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域仍然明顯需要能夠檢測(cè)具體致病病毒株的改進(jìn)的、廉價(jià)的、快速的、精確的和有鑒別力的方法，所述致病病毒最經(jīng)常涉及引起醫(yī)學(xué)上重大的疾病。還特別需要簡(jiǎn)單的分析方法，其能夠在不發(fā)達(dá)國(guó)家、市場(chǎng)、診所、醫(yī)生和獸醫(yī)辦公室、學(xué)校和食品加工廠由相對(duì)未受過(guò)訓(xùn)練的人員常規(guī)使用。考慮到新流感A變異體的傳播在世界范圍內(nèi)造成的威脅，臨床領(lǐng)域需要新的和改進(jìn)的抗病毒藥劑。本發(fā)明滿足了這些需求。發(fā)明簡(jiǎn)述在一方面，本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)患者樣本中是否存在A型流感病毒的NS1蛋白，存在表明患者感染了A型流感病毒，從而提供鑒定患者是否感染A型流感病毒的方法。檢測(cè)步驟能包括將患者樣本與特異結(jié)合A型流感病毒蛋白NS1的試劑接觸；并檢測(cè)該試劑和NS1蛋白的特異結(jié)合，特異結(jié)合表明A型流感病毒的存在。備選或者此外，該檢測(cè)可以包括檢測(cè)編碼NS1蛋白的PDZ配體模體(PL)的mRNA的存在，并由mRNA的存在推斷出NSl蛋白的存在。優(yōu)選的PL具有以下模體S/T-X-V/I/L，其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸和X是任意氨基酸。優(yōu)選，該試劑是至少一種PDZ多肽?；蛘?，該試劑可以是至少一種抗體。對(duì)于泛-特異(pan-specific)性抗體，抗體可以是對(duì)NS1蛋白的保守區(qū)域特異。優(yōu)選，接觸步驟包括將患者樣本與特異結(jié)合A型流感病毒蛋白NS1不同表位的第一和第二試劑接觸，第一試劑固定在支持物上，檢測(cè)步驟檢測(cè)其中第一和第二試劑與NS1蛋白特異結(jié)合的夾心，表明病毒的存在。第一和第二試劑可以是第一和第二抗體，但優(yōu)選第一試劑是一種或者多種PDZ多肽，第二試劑是一種或者多種抗體。第一試劑可以是一種或者多種PDZ多肽和一種或者多種抗體的混合物?？贵w可以是對(duì)A型流感病毒NS1的全部亞型特異的抗體。一種或者多種PDZ多肽可以是下列的一種或者多種外膜，PSD95(PDZ#2)，PSD95(PDZ#1,2,3),DLG1(PDZ#1),DLG1(PDZ#1,2),DLG1(PDZ#2),DLG2(PDZ#1),DLG2(PDZ#2)，Magi3(PDZ#1)，PTN3(PDZ#1),MAST2(PDZ弁l)，NeDLG(PDZ#1，2)，Shankldl，Shank2dl,Shank3dl,Syntrophinla，Syntrophinyl,Magil(PDZ#1),Magil(PDZ#4)，Tipl;PTPL1(PDZ#1),Mint3(PDZ#1)，LymMystique(PDZ弁l),DLG2(PDZ#3),MUPPl(PDZ#8)，NeDLG(PDZ#1)，DLG5(PDZ#1)，PSD95(PDZ#1),NumBP(PDZ#3),LIMK1(PDZ#1)，KIAA0313,DLGl(PDZ#2)，Syntenin(PDZ#2)，Pickl,MAST2，PTN3(PDZ#1),NOSl(PDZ#1,2，3)，MINT1(PDZ#2)，ZO-1(PDZ#2)，NSP和RIM212?；颊邩颖究梢允窍铝械娜我庖环N血液，組織，鼻分泌物，肺滲出液，泄殖腔樣本，糞便樣本，喉拭子和唾液。優(yōu)選，患者是人，鳥(niǎo)類，豬，馬，或者哺乳動(dòng)物。PDZ多肽優(yōu)選包括PL結(jié)合區(qū)(80-100氨基酸區(qū))，例如PSD95d2的PL結(jié)合區(qū)于SEQIDNO:l提供。為了進(jìn)行亞型特異測(cè)定，PDZ多肽優(yōu)選的是PSD95dl,PSD95d2,PSD95d3,INADL8dl，Magildl,DLGld2，DLGld3，NeDLGldl,或者NeDLGld2。在另一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)鑒定亞型特異性流感A型病毒蛋白NS1PDZ配體模體(PL)區(qū)的存在，對(duì)A型流感感染進(jìn)行診斷和分型的方法。優(yōu)選PL具有以下模體S/T-X-V/I/L，其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸和X是任意氨基酸。在一方面，本發(fā)明提供檢測(cè)待測(cè)樣本中包含PL區(qū)的A型流感病毒蛋白的存在和量的方法，該方法通過(guò)在適于結(jié)合的條件下，將等份的待測(cè)樣本與至少一種PDZ肽和至少一種PDZ配體(PU檢測(cè)試劑混合；和測(cè)定PDZ肽和PL檢測(cè)試劑之間的結(jié)合，結(jié)合的降低表明待測(cè)樣本中A型流感病毒蛋白的存在。優(yōu)選，A型流感病毒蛋白是NP，HA，M1或者NS1。優(yōu)選，PL檢測(cè)試劑包括來(lái)自A型流感病毒蛋白C末端的PL模體，所述蛋白選自NP,HA,M1和NS1。優(yōu)選PL模體是S/T-X-V/I/L，其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸和X是任意氨基酸。在另一方面，本發(fā)明提供鑒定患者是否感染A型流感病毒的方法，該方法通過(guò)檢測(cè)患者的鼻分泌物、痰樣本或者喉拭子中是否存在A型流感病毒的NS1蛋白，存在表明患者感染A型流感病毒。在一方面，本發(fā)明提供在待測(cè)樣本中檢測(cè)包含PL區(qū)的A型流感病毒蛋白的存在和量的方法，該方法通過(guò)混合等份的待測(cè)樣本和至少一種PDZ肽；和檢測(cè)PDZ肽和PLA型流感病毒蛋白之間的結(jié)合，結(jié)合表明待測(cè)樣本中A型流感病毒蛋白的存在。在另一方面，本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)患者是否感染流感A，提供檢測(cè)患者是否感染流感A致病株的方法，如果患者被感染，檢測(cè)患者樣本中具有PL模體的非結(jié)構(gòu)蛋白的存在，存在表明患者感染了A型流感病毒的致病株。在一方面，本發(fā)明提供鑒定患者樣本中A型流感病毒特異性亞型存在的方法，該方法通過(guò)將患者樣本與至少一種PDZ多肽或者至少一種捕獲抗體接觸，所述PDZ多肽或捕獲抗體與對(duì)流感病毒A亞型特異的NS1蛋白的PL模體特異結(jié)合；并檢測(cè)PDZ多肽或者捕獲抗體是否與樣本中的PL模體特異結(jié)合，特異結(jié)合表明該亞型的存在。優(yōu)選，該接觸步驟包括將患者樣本與大量PDZ多肽接觸，所述PDZ多肽特異結(jié)合多個(gè)NS1蛋白中的多個(gè)PL模體，所述NS1蛋白對(duì)流感病毒A的多個(gè)亞型特異；并且檢測(cè)包括確定哪種PDZ多肽特異結(jié)合其PL模體，與一種或者多種PDZ多肽的結(jié)合從而表明亞型的存在。優(yōu)選，捕獲抗體識(shí)別NS1的羧基末端。優(yōu)選，捕獲抗體或者PDZ多肽識(shí)別一種或者多種PDZ配體模體(PLs):ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4),TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7)，RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:10),NICI(SEQIDNO:11),TICI(SEQIDNO:12)，RICI(SEQIDNO:13),DMAL(SEQIDNO:14)，DMTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18)，SEV,SEI,SKV,和SKI。優(yōu)選，PDZ多肽至少是下列的一種外膜，PSD95(PDZ#2),PSD95(PDZ#1,2,3),DLGl(PDZ#1),DLGl(PDZ#1,2)，DLGl(PDZ#2),DLG2(PDZ#1),DLG2(PDZ#2)，Magi3(PDZ#1)，PTN3(PDZ#1),MAST2(PDZ#1),NeDLG(PDZ#1，2)，Shankldl，Shank2dl,Shank3dl，Syn加phinla,Syntrophinyl,Magil(PDZ#1),Magil(PDZ#4),Tipl;PTPLl(PDZ#1)，Mint3(PDZ#1)，LymMystique(PDZ弁l)，DLG2(PDZ#3)，MUPP1(PDZ弁8)，NeDLG(PDZ弁l)，DLG5(PDZ#1),PSD95(PDZ#1),NumBP(PDZ#3),LIMK1(PDZ#1),KIAA0313,DLGl(PDZ#2)，Syntenin(PDZ#2),Pickl,MAST2,PTN3(PDZ#1),NOS1(PDZ#1,2,3),MINT1(PDZ#2),ZO-1(PDZ#2),NSP和RIM2?；颊邩颖究梢允潜欠置谖?，痰樣本，喉拭子，泄殖腔樣本，糞便樣本，肺滲出液，或者唾液。如果該方法用于鑒定亞型，則該亞型優(yōu)選禽流感A并且PL是PL模體ESEV/I/A(SEQIDN0:19)?；蛘撸瑏喰褪荋3N2和PL是PL模體RSKV(SEQIDNO:8)?；蛘?，PL是PL模體ESKV(SEQIDNO:4)。或者，亞型是H1N1和PL是PL模體RSEV(SEQIDNO:7)。該方法還能夠包括將樣本與檢測(cè)抗體接觸。優(yōu)選，檢測(cè)抗體包括信號(hào)發(fā)生化合物，并且不抑制PL與PDZ的結(jié)合或者捕獲抗體與NS1的結(jié)合。PDZ多肽或者抗體可以固定在固相支持物上。如果固相支持物是毛細(xì)管流動(dòng)分析裝置，接觸步驟包括將小棒浸在患者樣本中。優(yōu)選，毛細(xì)管流動(dòng)測(cè)定是免疫測(cè)定法。優(yōu)選，固相支持物是側(cè)向流測(cè)定。在一方面，本發(fā)明提供用于患者樣本中流感A病毒的鑒定和分亞型的試劑盒，所述試劑盒包括與固定在固相支持物上的流感A病毒NS1特異結(jié)合的試劑。優(yōu)選，該試劑是抗體，PDZ多肽，寡核苷酸適配體，或者混合物。在另一方面，本發(fā)明提供用于患者樣本中流感A病毒鑒定和/或分亞型的試劑盒，包括與流感A病毒編碼蛋白特異結(jié)合的試劑；和與NS1蛋白特異結(jié)合的試劑。優(yōu)選，特異結(jié)合NS1蛋白的試劑與蛋白上的PL區(qū)結(jié)合。優(yōu)選，該試劑是抗體，PDZ多肽，寡聚核苷酸適配體，或者混合物。優(yōu)選，流感A病毒編碼蛋白是NS1。在一方面，本發(fā)明提供用于患者樣本中流感A病毒鑒定和/或分亞型的試劑盒，包括與NS1在非PL模體處特異結(jié)合的試劑和與NS1在PL模體處特異結(jié)合的試劑。在一方面，本發(fā)明提供具有大量PDZ多肽的試劑盒，所述PDZ多肽對(duì)多個(gè)流感A病毒的多個(gè)NS1蛋白的多個(gè)PL模體特異。在一方面，本發(fā)明提供鑒定能夠特異結(jié)合流感病毒PDZ配體(PL)的PDZ多肽的方法，通過(guò)將流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白PL與具有PDZ結(jié)構(gòu)域的候選多肽在適于結(jié)合的條件下接觸；檢測(cè)PL與候選多肽的特異結(jié)合；并確認(rèn)PL結(jié)合到PDZ結(jié)合位點(diǎn)。在一方面，本發(fā)明提供分離的抗體，該抗體與A型流感病毒NS1蛋白中的羧基末端模體特異結(jié)合。優(yōu)選，具有PL模體的羧基末端模體是ESEV(SEQIDNO:2),ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7)，RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9),GSKV(SEQIDNO:10),NICI(SEQIDNO:ll)，TICI(SEQIDNO:12)'RICI(SEQIDNO:13)，DMAL(SEQIDNO:14)，DMTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16)，DLDY(SEQIDNO:17)，SICL(SEQIDNO:18)，SEV,SEI，SKV，或者SKI。優(yōu)選，抗體是單克隆抗體或者抗體片段。優(yōu)選；PL模體是ESEV/I/A(SEQIDNO:19)。'在一方面，本發(fā)明提供對(duì)感染A型流感病毒或者具有感染風(fēng)險(xiǎn)的患者進(jìn)行治療或者預(yù)防的方法，該方法通過(guò)對(duì)患者使用有效方案的藥劑來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述藥劑抑制病毒的NSl蛋白與細(xì)胞的PDZ蛋白的相互作用，從而作用于感染的治療或者預(yù)防。優(yōu)選，該藥劑是與A型流感病毒NS1蛋白的PL模體特異結(jié)合的抗體。優(yōu)選，藥劑是反義寡核苷酸，小分子，siRNA或者鋅指蛋白，并且該藥劑抑制流感ANSl蛋白或者PDZ蛋白的表達(dá)。優(yōu)選，NSl的PL模體是ESEV(SEQIDNO:2),ESEI(SEQIDNO:3)，ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7)，RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9),GSKV(SEQIDNO:10)，NICI(SEQIDNO.ll)，TICI(SEQIDNO:12),RICI(SEQIDNO:13)，DMAL(SEQIDNO:14),DMTL(SEQIDNO:15),DIAL(SEQIDNO:16)，DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18),SEV,SEI，SKV,或者SKI。優(yōu)選，藥劑是PDZ多肽并且它包括至少與PLSEQIDNO:1相互作用的結(jié)合區(qū)。優(yōu)選，PDZ多肽下面的至少一種外膜，PSD95(PDZ#2),PSD95(PDZ#1,2,3)，DLGl(PDZ#1)，DLGl(PDZ#1，2)，DLGl(PDZ#2)，DLG2(PDZ#1)，DLG2(PDZ#2),Magi3(PDZ#1)，PTN3(PDZ#1)，MAST2(PDZ#1),NeDLG(PDZ#1,2),Shankldl,Shank2dl,Shank3dl,Syntrophinla,Syntrophiny1,Magil(PDZ#1)，Magil(PDZ#4)，Tipl;PTPLl(PDZ#1)，Mint3(PDZ#1),LymMystique(PDZ#1)，DLG2(PDZ#3)，MUPPl(PDZ#8),NeDLG(PDZ#1),DLG5(PDZ#1)，PSD95(PDZ#1),NumBP(PDZ#3),LIMK1(PDZ#1),KIAA0313,DLGl(PDZ#2)，Syntenin(PDZ#2),Pickl，MAST2,PTN3(PDZ#1),NOSl(PDZ#1,2，3)，MINT1(PDZ#2)，ZO-1(PDZ#2)，NSP和RIM2。在另一方面，本發(fā)明提供篩選抗病毒劑的方法，該方法通過(guò)在待測(cè)化合物存在或者缺失的條件下，將PDZ多肽和流感病毒PDZ配體(PL)接觸；和將待測(cè)化合物存在條件下較之缺失條件下的PDZ/PL結(jié)合量作比較，優(yōu)選抗病毒劑減少PDZ/PL結(jié)合，并還可能包括在體內(nèi)或者胞內(nèi)檢測(cè)試劑以鑒定其是否干擾干擾素的產(chǎn)生。在一方面，本發(fā)明提供非天然的PDZ配體(PL)肽診斷試劑，其具有選自流感A蛋白C端氨基酸序列內(nèi)的氨基酸線性陣列，因此PL能夠結(jié)合哺乳動(dòng)物PDZ多肽。優(yōu)選，PL具有以下模體S/T-X-V/I/L，其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸和X是任意氨基酸。優(yōu)選，流感ANSI蛋白陣列包括以下至少一種ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4),TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6)，RSEV(SEQIDNO:7)，RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9),GSKV(SEQIDNO:10),NICI(SEQIDNO:11),TICI(SEQIDNO:12),RICI(SEQIDNO:13),DMAL(SEQIDNO:14),DMTL(SEQIDNO:15),DIAL(SEQIDNO:16)，DLDY(SEQIDNO:17)，SICL(SEQIDNO:18),SEV',SEI,SKV或者SKI。還能包括診斷試劑，例如陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照"分析標(biāo)準(zhǔn)品，分析校準(zhǔn)品(calibrator)，競(jìng)爭(zhēng)性分析配體，標(biāo)記的肽檢測(cè)劑或者固相捕獲劑。還能包括合成肽，重組多肽，基本上純化的天然PL多肽，基本上純化的天然PL多肽的片段，模擬PL的肽，寡核苷寧適配體PL或者多肽適配體PL。優(yōu)選，PL肽來(lái)自流感ANSI蛋白。在一方面，本發(fā)明提供一種非天然的PDZ多肽診斷試劑，用于檢測(cè)生物樣本中的流感APL，所述生物樣本包含能夠結(jié)合流感ANSI蛋白的非天然PDZ多肽，優(yōu)選的PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白診斷試劑選自陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、分析標(biāo)準(zhǔn)品、分析校準(zhǔn)品、競(jìng)爭(zhēng)性配體、標(biāo)記的蛋白檢測(cè)結(jié)合伴侶和捕獲劑的診斷試劑，優(yōu)選外膜，PSD95(PDZ#2)，PSD95(PDZ#1,2,3),DLG1(PDZ#1)，DLG1(PDZ#1,2),DLG1(PDZ#2),DLG2(PDZ#1)，DLG2(PDZ#2)，Magi3(PDZ#1),PTN3(PDZ#1)，MAST2(PDZ#1),NeDLG(PDZ#1，2),Shankldl,Shank2dl,Shank3dl,Syntrophinla,Syntrophiny1,Magil(PDZ弁l)，Magil(PDZ#4),Tipl;PTPL1(PDZ#1)，Mint3(PDZ#1),LymMystique(PDZ#1)，DLG2(PDZ#3),MUPPl(PDZ#8),NeDLG(PDZ#1),DLG5(PDZ#1)，PSD95(PDZ#1)，NumBP(PDZ#3),LIMK1(PDZ弁l),KIAA0313,DLGl(PDZ#2),Syntenin(PDZ#2)，Pickl,MAST2，PTN3(PDZ#1)，NOS1(PDZ#1,2,3),MINT1(PDZ#2),ZO-1(PDZ#2)，NSP或者RIM2。在另一方面，本發(fā)明提供用于檢測(cè)待測(cè)樣本中流感A蛋白的信號(hào)發(fā)生結(jié)合劑，所述待測(cè)樣本包含非天然PL或者非天然PDZ，其中PL或者PDZ均是與信號(hào)發(fā)生化合物共價(jià)連接的肽或者多肽。在一方面，本發(fā)明提供鑒定患者是否感染致病流感A的方法，該方法通過(guò)檢測(cè)患者樣本中是否存在A型流感病毒的NS2蛋白，該蛋白在70位具有絲氨酸，其存在表明患者感染流感A的致病株。優(yōu)選的檢測(cè)步驟是將患者樣本與特異結(jié)合具有絲氨酸70的序列的試劑接觸。優(yōu)選試劑是抗體或者核酸。在一方面，提供鑒定患者是否感染致病A型禽流感病毒的方法，該方法包括，將患者樣本與PSD-95PDZ蛋白接觸；和檢測(cè)PSD-95PDZ蛋白與樣本之間的特異結(jié)合，特異結(jié)合表明A型流感病毒的存在，該存在表明患者感染致病A型禽流感病毒。優(yōu)選，致病A型流感病毒是H5N1。優(yōu)選，PSD-95PDZ蛋白是PSD-95的結(jié)構(gòu)域2。優(yōu)選，流感NS1蛋白PL具有以下模體ESKV，ESEI(SEQIDNO:3)，或者ESEV(SEQIDNO:2)。在一方面，接觸步驟包括將患者樣本與PSD-95PDZ蛋白和抗體接觸，所述抗體與A型流感病毒蛋白NS1的不同抗原表位而不是PSD-95PDZ蛋白特異結(jié)合，PSD-95固定在支持物上，檢測(cè)步驟檢測(cè)NS1蛋白與抗體的特異結(jié)合。在另一方面，該方法包括將患者樣本與第二PDZ蛋白接觸的另外步驟，INADLd8作為對(duì)照并檢測(cè)特異結(jié)合，第一PDZ-95蛋白相對(duì)于第二PDZ蛋白特異結(jié)合更高表明患者感染了致病A型禽流感病毒。附圖簡(jiǎn)述圖1是顯示禽類、人類和其他哺乳動(dòng)物中NS1PL序列ESEV(SEQIDNO:2)出現(xiàn)的時(shí)程圖。，圖2是顯示禽類、人類和其他哺乳動(dòng)物中NS1PL序列EPEV(SEQIDNO:27)出現(xiàn)的時(shí)程圖。圖3是顯示禽類、人類和其他哺乳動(dòng)物中NS1PL序列RSKV(SEQIDNO:8)出現(xiàn)的時(shí)程圖。圖4顯示對(duì)檢驗(yàn)6個(gè)人流感A陽(yáng)性樣本的鼻分泌物的結(jié)果。圖5顯示感染A/PR/8/34的MDCK細(xì)胞中的NSl表達(dá)。圖6顯示細(xì)胞中PDZ與NS1的相互作用。圖7顯示細(xì)胞中INADLd8與H3N2NS1的相互作用。圖8顯示利用PDZ捕獲劑和單克隆抗體檢測(cè)劑AU-4B2，用于NS1診斷的側(cè)向流形式。圖9顯示利用單克隆抗體捕獲劑和單克隆抗體檢測(cè)劑AU-4B2的側(cè)向流形式。圖10a-k是11個(gè)示范性側(cè)向流流感檢測(cè)形式。定義除非另外定義，所有此處使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解含義相同的。下列文獻(xiàn)給技術(shù)人員提供了本發(fā)明使用的許多術(shù)語(yǔ)的一般定義Singleton等人，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY(微生物和分子生物)(第二版，1994);THECAMBRIDGEDICTIONARYOFSCIENCEANDTECHNOLOGY(劍橋科技詞典)(Walker編著，1988);和Hale&Marham,THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY(HARPERCOLLINS生物詞典)(1991)。盡管與此處描述的方法相似或者等同的任何方法和材料都可用于本發(fā)明的實(shí)踐或者檢測(cè)，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。按照邏輯(而不是字母)順序提供定義以幫助讀者實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，即，如下也就是，"試劑"包括任何物質(zhì)，分子，元素，化合物，實(shí)體，或者其組合，包括但不限于，例如，蛋白，多肽，小的有機(jī)分子，多糖-肽嵌合分子，核苷酸-肽嵌合分子等。試劑的典型實(shí)例包括非天然狀態(tài)的天然產(chǎn)物，合成肽化合物，化合物，以及兩種或更多種天然或者非天然化合物。除非另作說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"試劑"，"物質(zhì)"，和"化合物"可以互換使用。"禽流感A"是指A亞型流感，其感染禽類對(duì)象并在禽類對(duì)象之間傳染。禽流感血凝素(hemmagglutinin)亞型的典型實(shí)例包括H5,H6，H7,H9和H10，典型菌株包括H5N1，H6N2,H7N3，H7N7,H9N2，H10N4和H畫(huà)5。"禽類對(duì)象"是指適合進(jìn)行檢測(cè)或者治療的對(duì)象，包括所有種類的鳥(niǎo)類，包括野生鳥(niǎo)類(例如野禽)和家養(yǎng)種類(例如家禽)。優(yōu)選，要檢測(cè)或者治療的禽類對(duì)象選自雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、鴕鳥(niǎo)、鴯鹋和外來(lái)鳥(niǎo)類例如鸚鵡、美冠鸚鵡和雞尾鸚鵡。更優(yōu)選，要檢測(cè)的禽類對(duì)象是雞，火雞，鵝或者鵪鶉。"非天然"用來(lái)指在自然界不存在的組合物。非天然組合物的典型實(shí)例包括基本上純化的組合物，以及，那些包含著在自然界的相同化學(xué)形式中不會(huì)出現(xiàn)的化合物的組合物，例如，化學(xué)和基因修飾蛋白、核酸等。此處使用的"調(diào)節(jié)"是指例如通過(guò)激動(dòng)結(jié)合活性的上調(diào)(即，活化或者剌激)，和例如通過(guò)拮抗結(jié)合活性的下調(diào)(即抑制鳴者遏制)二者。此處使用的術(shù)語(yǔ)"PDZ配體結(jié)合調(diào)節(jié)劑"是指能夠改變包含PDZ結(jié)構(gòu)域的多肽與PDZ配體(即，"PL")結(jié)合的試劑。調(diào)節(jié)劑包括，但不限于，活化劑例如激動(dòng)劑和抑制劑例如拮抗劑二者。抑制劑可能引起部分或者完全的結(jié)合抑制。當(dāng)用于區(qū)別不同的流感病毒株情況下，"流感A的致病株"是指根據(jù)OIE世界動(dòng)物衛(wèi)生組織、世界衛(wèi)生組織或者它們指定的代表提出的指南的"須通報(bào)禽流感"(NAI)病毒，例如，在OIE"ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals,5thedition,(陸生動(dòng)物診斷分析和疫苗手冊(cè)，第五版)2004(www.oie.inf)中提出的指南。此外，該致病株在毒力或者H5或者H7病毒的典型試驗(yàn)中具有"高致病性"，所述H5或者H7病毒具有流感A血凝素(HA)前體蛋白HAO切割位點(diǎn)的氨基酸序列，所述氨基酸序列與在毒性病毒中觀察到的任何HAO切割位點(diǎn)氨基酸序列相似，SP，如OIE或者代表性的相似國(guó)家或者國(guó)際組織或者行業(yè)協(xié)會(huì)所規(guī)定。流感A毒性H5和H7株中HAO切割位點(diǎn)氨基酸序列的典型實(shí)例包括病毒前體血凝素蛋白切割位點(diǎn)處的多個(gè)堿性氨基酸(精氨酸或者賴氨酸)，例如，其中H7病毒的低毒株具有-PEIPKGR*GLF-(SEQIDNO:20)或者-PENPKGR*GLF-(SEQIDNO:21)，高致病株具有-PEIPKKKKR*GLF-(SEQIDNO:22)，-PETPKRKRKR*GLSF-(SEQIDNO:23),-PEIPKICREKR*GLF-(SEQID1^0:24)或者孑￡??？&101101*007-(SEQIDNO:25)?，F(xiàn)在典型的毒力試驗(yàn)包括用感染性病毒接種4-8周齡雞，其中如果病毒株在10天內(nèi)造成大于75%的死亡率，則該病毒株被認(rèn)為是髙致病性的；和/或，靜脈內(nèi)致病性指數(shù)(IVPI)大于1.2的任意病毒，其中靜脈內(nèi)接種的鳥(niǎo)類在10天期間每24小時(shí)檢査；正常，記分為"O";患病為"l";嚴(yán)重患病為"2";死亡為"3";禾口，計(jì)算平均分作為IVPI。后來(lái)的高致病性病毒株被OIE稱為"高致病性NAI病毒"(HPNIA)?，F(xiàn)有的NAI典型實(shí)例包括流感A的H5和H7株。現(xiàn)在HPNIA的典型實(shí)例包括H5N1。"流感A的低致病株"表示須通報(bào)的禽流感A，g卩，NAI分離物(上文)，但其對(duì)雞不具有致病性并且不具有HAO切割位點(diǎn)氨基酸序列，所述序列與在毒性病毒中觀察到的任何HAO切割位點(diǎn)氨基酸序列相似，即，該病毒株被OIE稱為"低致病性禽流感(LPAI)"。"PDZ結(jié)構(gòu)域"是指與腦突觸蛋白￡SD-S>5、果蠅(Qrosophila)分隔連接蛋白Discs-Large(SLG)和/或上皮細(xì)胞緊密連接蛋白^01(^01)具有大約90個(gè)連續(xù)氨基酸同源的氨基酸序列；優(yōu)選大約80-90個(gè)；更優(yōu)選，大約70-80個(gè)，更優(yōu)選大約50-70個(gè)氨基酸。PDZ結(jié)構(gòu)域的典型實(shí)例在本領(lǐng)域還已知有Discs-Large同源性重復(fù)("DHRs")和"GLGF"重復(fù)(SEQIDNO:26)。在各種膜相關(guān)蛋白中發(fā)現(xiàn)了PDZ結(jié)構(gòu)域的實(shí)例，包括鳥(niǎo)苷酸化激酶同系物的MAGUK家族的成員，幾種蛋白磷酸酯酶和激酶，神經(jīng)元一氧化氮合成酶(neuronalnitricoxidesynthase)，月中瘤抑制蛋白，和幾種抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白，總稱為sy;rophins。該P(yáng)DZ結(jié)構(gòu)域包括天然和非天然的氨基酸序列。PDZ結(jié)構(gòu)域的典型實(shí)例包括PDZ蛋白的多態(tài)變異體，以及，包含兩個(gè)不同PDZ蛋白等部分的嵌合PDZ結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選，該P(yáng)DZ結(jié)構(gòu)域包含與下列公開(kāi)的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/485,788(2004年2月3日提交)，國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US03/285/28508(2003年9月9日提交),國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/USOl/44138(2001年11月9日提交)，在此完整引入作為參考。典型的非天然PDZ結(jié)構(gòu)域包括那些氨基酸序列的對(duì)應(yīng)遺傳密碼已經(jīng)突變的PDZ結(jié)構(gòu)域，例如，用于產(chǎn)生改變(增強(qiáng)或者減弱)與PL結(jié)合或者與PL結(jié)合特異性的氨基酸改變。任選PDZ結(jié)構(gòu)域或者其變異體與來(lái)自腦突觸蛋白PSD-95、果蠅分隔連接蛋白Discs-Large(DLG)和/或上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZOl(ZOl)和動(dòng)物同系物中至少一種的PDZ結(jié)構(gòu)域具有至少50、60、70、80或者90%的序列一致性。任選天然PDZ結(jié)構(gòu)域的變異體與天然PDZ結(jié)構(gòu)域具有至少90%的序列一致性。PDZ結(jié)構(gòu)域的序列一致性由PDZ結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少70個(gè)氨基酸確定，優(yōu)選80個(gè)氨基酸，和更優(yōu)選80-90或者80-100個(gè)氨基酸。當(dāng)類似物和人序列進(jìn)行最大限度比對(duì)時(shí)，類似物的氨基酸指定為天然人序列中相應(yīng)氨基酸的相同編號(hào)。類似物通常與天然存在的肽在一個(gè)、兩個(gè)或者幾個(gè)位置存在不同，經(jīng)常借助于保守置換。術(shù)語(yǔ)"等位基因變異體"用于指相同種類中不同個(gè)體基因之間的變異和該基因編碼的蛋白中相應(yīng)的變異。PSD-95d2的示范性PDZ結(jié)構(gòu)域如SEQIDNO:l所示。"PDZ蛋白"，與"包含PDZ結(jié)構(gòu)域的多肽"和"PDZ多肽"可以互換使用，是指具有PDZ結(jié)構(gòu)域(上文)的天然存在或者非天然存在的蛋白。以前(上文)已經(jīng)公開(kāi)了PDZ蛋白的典型實(shí)例，包括CASK,MPPl,DLG1，DLG2，PSD95,NeDLG，TIP-33，TIP-43,LDP,LIM,LIMK1,LIMK2，MPP2,AF6,G0RASP1，INADL,KIAA0316，KIAA1284，MAGIl，MAST2,MINT1，NSP,N0S1，PAR3，PAR3L,PAR6/3,PICK1,Shank1,Shank2,Shank3,SITAC-18,TIP1,和Z0-1。用于篩查分析的該非天然PDZ結(jié)構(gòu)域多肽可以包含例如比天然PDZ結(jié)構(gòu)域小的PDZ結(jié)構(gòu)域。例如非天然PDZ結(jié)構(gòu)域可任選包含"GLGF"模體，即，具有GLGF氨基酸序列(SEQIDNO:26)的模體，其通常位于PDZ結(jié)構(gòu)域附近，例如通常在N端大約10-20個(gè)氨基酸內(nèi)。PDZ結(jié)合活性通常需要GLGF模體(SEQIDNO:26)和緊挨著GLGF模體(SEQIDNO:26)N端的3個(gè)氨基酸。同樣地，非天然PDZ結(jié)構(gòu)域可以構(gòu)建為PDZ結(jié)構(gòu)域C-末端缺失/3-折疊，即，通常可以從天然PDZ結(jié)構(gòu)域刪除這一區(qū)域而不影響PL的結(jié)合。提供了一些示范性的PDZ蛋白，括號(hào)內(nèi)是GI或者檢索號(hào)(accessionnumbers):PSMD9(9184389)，af6(430993)，AIPC(12751451),ALP(2773059)，APXL-1(13651263)，MAGI2(2947231)，CARDI1(1282772),CARDI4(13129123)，CASK(3087815),CNK1(3930780),CBP(3192908)，Densin180(16755892),DLG1(475816),DLG2(12736552),DLG5(3650451),DLG6剪接變異體(splicevar)1(14647140),DLG6剪接變異體2(AB053303),DVLI(2291005)，DVL2(2291007),DVL3(6806886)，ELFIN1(2957144)，ENIGMA(561636),ERBIN(8923908),EZRIN結(jié)合蛋白50(3220018),FLJOOOll(10440342),FU11215(11436365),FLJ12428(BC012040),FLJ12615(10434209),FLJ20075Semcap2(7019938),FLJ21687(10437836),FLJ31349(AK055911),FLJ32798(AK057360),GoRASPl(NM031899),GoRASP2(13994253),GRIP1(4539083),GTP酶活化酶(2389008)，鳥(niǎo)嘌呤交換因子(6650765),HEMBA1000505(10436367),HEMBA1003117(7022001),HSPC227(7106843)，HTRA3(八Y0楊94),HTRA4(AL576444),INADL(2370148)，KIAA0147Vartul(1469875)，KIAA0303MAST4(2224546)，KIAA0313(7657260),KIAA0316(6683123)，KIAA0340(2224620),KIAA0380(2224700),KIAA0382(7662087),KIAA0440(2662160),KIAA0545(14762850)，KIAA0559(3043641),KIAA0561MAST3(3043645),KIAA0613(3327039),KIAA0751RIM2(12734165),KIAA0807MAST2(3882334)，KIAA0858(4240204),KIAA0902(4240292),KIAA0967(4589577)，KIAA0973SEMCAP3(5889526),KIAA1202(6330421),KIAA1222(6330610)，KIAA1284(6331369)，KIAA1389(7243158),KIAA1415(7243210)，KIAA1526(5817166)，KIAA1620(10047316),KIAA1634MAGI3(10047344)，KIAA1719(1267982),LIMMystique(12734250)，LIM(3108092)，LIMK1(4587498),LIMK2(1805593)，LIM-RIL(1085021)，LU層1(U52111)，MAGI1(3370997),MGC5395(BC012477)，MINT1(2625024),MINT3(3169808)，MPP1(189785),MPP2(939884),MPP3(1022812)，MUPP1(2104784),NeDLG(10853920)，NeurabinII(AJ401189)，N0S1(642525)，新PDZ基因(7228177)，新絲氨酸蛋白酶(1621243)，Numb結(jié)合蛋白(AK056823):外膜蛋白(7023825),p55T(12733367),PAR3(8037914),PAR3-樣(AF428250),PAR6(2613011)，PAR6p(13537116),PAR6y(13537118)，PDZ-73(5031978)，PDZK1(2944188),PICK1(4678411)，PIST(98394330),prlL16(1478492),PSAP(6409315)，PSD95(3318652)，PTN-3(179912),PTN-4(190747),PTPL1(515030)，RGS12(3290015),RGS3(18644735)，Rho-GAPIO(NM020824),Rhophilin-樣(14279408),絲氨酸蛋白酶(2738914),Shank2(6049185),Shank3(AC000036),Sliroom(18652858),與GRASP65相似(14286261)，與Numbpx2的配體相似(BC036755),與PIT同系物相似(21595065)，SIP1(2047327),SITAC-18(8886071)，SNPCIIA(20809633),Shank1(7025450)，Syntenin(2795862),Syntrophin1a(1145727),Syntrophinj82(476700),Syntrophiny1(9507162)，Syntrophiny2(9507164)，TAX2-樣蛋白(3253116)，TIAM1(4507500),TIAM2(6912703)，TIP1(2613001),TIP2(2613003),TIP33(2613007),TIP43(2613011)，X-ll/3(3005559),ZO-1(292937),ZO-2(12734763),ZO-3(10092690)。"PDZ配體"，縮寫(xiě)為"PL"，表示一種天然存在的蛋白，該蛋白具有與PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合并與其形成分子間相互作用復(fù)合物的氨基酸序列。之前在現(xiàn)有的美國(guó)和國(guó)際專利申請(qǐng)(上文)中已經(jīng)披露了PL的典型實(shí)例。流感APL的其他實(shí)例在下面實(shí)施例部分中提供。"PDZ試劑"用來(lái)指一種化合物，其與那些不包括PDZ試劑的對(duì)照相比，在檢測(cè)分析中干擾至少20%的PDZ配體多肽和包含PDZ結(jié)構(gòu)域多肽之間發(fā)生的結(jié)合相互作用，例如，至少30%，至少40%。，至少50%，至少60%，至少70%,至少80%，至少卯％，至少95%，享到大約99%或者100%。盡管不希望受限于任何具體的作用機(jī)理，但該P(yáng)DZ劑可能起干擾作用，例如通過(guò)結(jié)合到否則將與流感NS1配體結(jié)合的PDZ結(jié)構(gòu)域；或者，它可以直接結(jié)合NS1配體以阻止其結(jié)合PDZ蛋白。通常，后來(lái)的PDZ試劑是那些在特定分析中表現(xiàn)出IC50在大約lmM或者更低范圍內(nèi)的PDZ試劑。顯示更低IC50的化合物，例如，通常其IC50為大約100jmM，10/iM，1/iM，100nM，10nM,lnM甚或更低。后來(lái)的PDZ試劑可用于治療和預(yù)防藥物組合物，給藥以減輕、治療或者預(yù)防由流感A病毒感染引起的一種或者多種疾病的癥狀。"PL調(diào)節(jié)劑"在用于PDZ試劑(上文)背景時(shí)，是指結(jié)合流感ANSI蛋白并調(diào)節(jié)其與PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合的化合物。"PDZ調(diào)節(jié)劑"在用于PDZ試劑(上文)背景時(shí)，是指結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域并調(diào)節(jié)流感NS1蛋白在對(duì)象PDZ結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)結(jié)合的化合物。該P(yáng)DZ調(diào)節(jié)劑和PL調(diào)節(jié)劑可以分別是設(shè)計(jì)成結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域或者PL的肽、模擬肽或者小分子模擬物。下面的實(shí)施例部分非常詳細(xì)地描述了檢測(cè)PDZ調(diào)節(jié)劑是否結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域的分析法。同樣地，還闡明了用于檢測(cè)PL調(diào)節(jié)劑是否結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域的分析法，例如，重組PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白與重組NS1融合蛋白結(jié)合。"PDZ介導(dǎo)的病癥"是指流感A感染對(duì)象中的一種或者多種癥狀，由流感A病毒蛋白PL在宿主細(xì)胞PDZ結(jié)構(gòu)域的結(jié)合引起。后來(lái)的癥狀起因于病毒感染，包括，但不限于發(fā)燒，咳嗽，喉嚨痛，肌肉疼痛，結(jié)膜炎，呼吸問(wèn)題，氣道中過(guò)度粘液產(chǎn)生，對(duì)繼發(fā)性細(xì)菌感染的易感性增加，肺炎，神經(jīng)感染等。"患病"用在此處是指禽類對(duì)象時(shí)，包括的體征和癥狀可以從幾乎沒(méi)有明顯病征的猝死到具有呼吸征象、過(guò)度流淚、竇炎、頭部水腫、無(wú)羽表皮發(fā)紺和腹瀉的更具特征的疾病。OIE在它們的衛(wèi)生指南"ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals,第五版，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織"中披露了"患病"的典型診斷體征、樣本和檢驗(yàn)。此處使用的"類似物"是指結(jié)構(gòu)上類似感興趣的天然PDZ或者PL分子的分子，但其已經(jīng)被修飾，例如，通過(guò)取代或者化學(xué)修飾一種或者多種所選的氨基酸取代基。與起始分子比較，類似物可能顯示相同、相似或者改進(jìn)的功用。合成和篩選類似物以鑒定具有改進(jìn)特征的已知化合物的變異體在醫(yī)藥領(lǐng)域是公知的，例如，增強(qiáng)結(jié)合親合力，改變與目標(biāo)結(jié)合的選擇性，減少與非目標(biāo)分子的結(jié)合，改進(jìn)體外和體內(nèi)穩(wěn)定性，和改進(jìn)藥理學(xué)性質(zhì)。"接觸"具有其正常含義，是指結(jié)合兩種或更多種試劑從而使成分合并，例如，待測(cè)樣本中的PL與PDZ合并。接觸可以在體外發(fā)生，例如，PDZ蛋白與細(xì)胞裂解產(chǎn)物在試管或者其他容器中合并，或者，原位，例如，借助于細(xì)胞的天然生物合成活性，天然宿主細(xì)胞PDZ蛋白和天然病毒PL在流感感染的細(xì)胞中合并?；蛘撸ㄟ^(guò)例如將PDZ結(jié)構(gòu)域編碼序列轉(zhuǎn)染到流感A感染細(xì)胞中，而合并重組PDZ與病毒PL。"多聚體"用于指一種或者多種類型重復(fù)單元的連續(xù)陣列，而不管來(lái)源。多聚體可以在生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，特別包括多肽和多核苷酸，以及，包含氨基酸、核苷酸或者其類似物的化合物。術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"是指任意長(zhǎng)度核苷酸或者其類似物的多聚體，包括長(zhǎng)度范圍從10-100個(gè)核苷酸的寡核苷酸和長(zhǎng)度大于100個(gè)核苷酸的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)"多肽"是指具有任意長(zhǎng)度的氨基酸連續(xù)排列的多聚體，優(yōu)選連續(xù)排列中從大約12個(gè)到大約50個(gè)氨基酸范圍；和，最優(yōu)選的大于大約50個(gè)氨基酸。"多肽"和"蛋白"互換使用，包括氨基酸(其中天然肽鍵骨架被替換為非天然合成骨架)和多肽(其中一種或者多種天然氨基酸被替換為一種或者多種非天然存在或者合成的模擬氨基酸)的聚合連續(xù)陣列。"融合蛋白"是指由來(lái)源于兩種或更多種天然蛋白的氨基酸序列組成的多肽，其表達(dá)為單個(gè)重組蛋白，即，在其天然狀態(tài)不連接的兩種或更多種氨基酸序列在重組蛋白中連接在一起，例如利用它們各自的氨基和羧基末端通過(guò)肽鍵，從而形成單一連續(xù)的氨基酸序列。融合蛋白可以是兩個(gè)、三個(gè)或者甚至四個(gè)或者更多個(gè)不同的天然或者非天然蛋白的組合。典型融合蛋白包括那些具有兩個(gè)或者更多個(gè)異源的，艮口，無(wú)關(guān)的，氨基酸序列；那些兼具異源和同源的，即，相關(guān)的，序列。融合蛋白還由下列氨基酸序列組成有或者沒(méi)有N端甲硫氨酸殘基的氨基酸序列，那些標(biāo)簽用于抗原的抗原表位鑒定的氨基酸序列，以及，那些具有信號(hào)發(fā)生化合物作為融合伴侶的氨基酸序列，例如，具有熒光伴侶的融合蛋白；酶伴侶例如/3-半乳糖苷酶；化學(xué)發(fā)光伴侶例如熒光素酶；等。"捕獲試劑"，當(dāng)用于診斷分析試劑或者方法的背景時(shí)，是指在結(jié)合相互作用和適用于診斷分析形式的時(shí)間段內(nèi)，能夠結(jié)合流感病毒分析物的試劑，所述相互作用具有足夠的強(qiáng)度(例如測(cè)定為結(jié)合親合力)和特異性，該特異性允許從不同病毒分析物的混合物中濃縮病毒分析物；所述適用于診斷分析形式的時(shí)間段，即，通常大約5分鐘到大約90分鐘；優(yōu)選大約5分鐘到大約60分鐘；和，最優(yōu)選的大約5分鐘到大約30分鐘。根據(jù)本發(fā)明的可選實(shí)施方式，該捕獲試劑包含PDZ結(jié)構(gòu)域或者PL。典型的捕獲試劑在下面實(shí)施例部分說(shuō)明。捕獲試劑通常"特異結(jié)合"一種或者多種病毒分析物，例如，包含PL的蛋白，而排斥其他分析物，例如，不包含PL的蛋白。優(yōu)選，該捕獲試劑結(jié)合該病毒分析物的解離常數(shù)(KD)小于大約1(T6M，優(yōu)選，小于大約10'7M;和，最優(yōu)選的，小于大約10—8M。"特異結(jié)合"，當(dāng)用于該天然和非天然PDZ結(jié)構(gòu)域與PL試劑之間的結(jié)合相互作用時(shí)，用于指捕獲或者檢測(cè)試劑優(yōu)先結(jié)合特定病毒分析物的能力，所述特定病毒分析物存在于不同病毒分析物的混合物中。在某些實(shí)施方式中，該特異結(jié)合相互作用能夠辯別具有或者缺失PL的蛋白，即，在一些實(shí)施方式中鑒別能力大于大約IO到約IOO倍；和，優(yōu)選大于約1000到約10,000倍。術(shù)語(yǔ)"基本上一致"是指當(dāng)最優(yōu)比對(duì)時(shí)，例如利用缺省缺口權(quán)重(defaultgapweight)通過(guò)程序GAP或者BESTFIT，兩個(gè)肽序列共有至少65%的序列一致性，優(yōu)選至少80%或者90%的序列一致性，更優(yōu)選至少95%的序列一致性或者更高(例如，99%的序列一致性或者更高)。優(yōu)選，不同的殘基位置區(qū)別在于保守氨基酸取代。"結(jié)合干擾"用于涉及PDZ結(jié)構(gòu)域與PL的第一結(jié)合相互作用，從而在診斷分析形式中形成復(fù)合物；其中，隨后在必要的^二結(jié)合相互作用中檢測(cè)該復(fù)合物，即，當(dāng)?shù)谝唤Y(jié)合相互作用抑制第二結(jié)合相互作用導(dǎo)致信號(hào)發(fā)生化合物產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度減弱時(shí)，產(chǎn)生干擾。本發(fā)明方法中該組合物發(fā)生的信號(hào)受到的結(jié)合干擾小于15%;優(yōu)選，小于10%;和，最優(yōu)選小于大約5%。"捕獲劑/分析物復(fù)合物"是由捕獲試劑，例如PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白，和分析物，例如含有PL的流感病毒蛋白，特異結(jié)合產(chǎn)生的復(fù)合物。在"適于特異結(jié)合的條件下"，捕獲試劑和分析物特異結(jié)合，S卩，一個(gè)與另一個(gè)，其中這種物理化學(xué)條件可以便利地根據(jù)例如鹽濃度、pH、去污劑濃度、蛋白濃度、溫度和時(shí)間表示。該條件適合于例如在溶液中使得結(jié)合發(fā)生；或者可選地，結(jié)合成員中的一種被固定到固相上。這種合適的典型條件在診斷領(lǐng)域是公知的，例如參見(jiàn)，Harlow和Lane,"Antibodies:ALaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)。合適的條件優(yōu)選導(dǎo)致結(jié)合相互作用的解離常數(shù)(KD)小于大約1(^M;優(yōu)選，小于大約1(^M;禾卩，最優(yōu)選小于大約10—8M。"表面結(jié)合捕獲試劑"與"固相捕獲試劑"互換使用，用來(lái)指固定在固體基質(zhì)表面的PDZ結(jié)構(gòu)域或者PL捕獲劑，所述固體基質(zhì)例如，片層，珠子，或者其他結(jié)構(gòu)，例如在下面更詳細(xì)說(shuō)明的帶孔板等。在某些實(shí)施方式中，此處使用的捕獲劑的集合存在于相同支持物的表面上，例如，以其中表面上的特定位置對(duì)應(yīng)于存在的特定表面結(jié)合捕獲劑的陣列形式。"分離的"或者"純化的"通常指物質(zhì)(化合物，多核苷酸，蛋白，多肽，多肽組合物)的分離，使得該物質(zhì)在其存在的樣本中占有顯著的百分比(例如，大于2%，大于5%，大于10%，大于20%,大于50%，或者更高，通常直到大約90%-100%)。在某些實(shí)施方式中，基本上純化的成份包括樣本的至少50%,80%-85%，或者90-95%。用于純化感興趣的多核苷酸和多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的，包括，例如，離子交換層析，親合層析和密度沉降。通常，當(dāng)相對(duì)于樣本的其他成份，一種物質(zhì)在該樣本中存在的量是在自然界未發(fā)現(xiàn)的，則該物質(zhì)被純化。"評(píng)價(jià)"，當(dāng)用于該試驗(yàn)的背景時(shí)，是指評(píng)估試驗(yàn)結(jié)果和/或進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)定，以確定流感A病毒分析物是否存在于待測(cè)樣本中。典型的評(píng)估包括"確定(determining)"，"測(cè)定(rneasuring)"，"評(píng)估(evaluating)"和"分析(assaying)"，它們可以互換使用，包括定量和/或定性測(cè)定。評(píng)價(jià)可以是相對(duì)的或者絕對(duì)的。"評(píng)價(jià)結(jié)合"包括檢測(cè)結(jié)合相互作用的量或者程度，以及，檢測(cè)是否發(fā)生特定結(jié)合相互作用，S卩，結(jié)合是否存在。"治療"，是指將本發(fā)明的化合物對(duì)需要其的對(duì)象給藥，目的是達(dá)到所需的藥理和/或生理作用，例如，預(yù)防或者減輕一種或者多種疾病的癥狀(上文)。該治療可以采用預(yù)防方式給藥，S卩，預(yù)防一種或者多種疾病癥狀的發(fā)展；和/或，治療以緩解或者消除疾病的癥狀。需要其治療的對(duì)象包括人類和家養(yǎng)動(dòng)物。此處使用的"受試者"，是指人類和家養(yǎng)動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物，魚(yú)，鳥(niǎo)，爬行動(dòng)物，兩棲動(dòng)物等等。."信號(hào)發(fā)生化合物"，縮寫(xiě)為"SGC"，是指可以連接到PL或者PDZ的分子(例如利用下面披露的化學(xué)連接方法)，并且能夠在本公開(kāi)的分析法中反應(yīng)形成可檢測(cè)的化學(xué)或者物理實(shí)體(即，反應(yīng)產(chǎn)物)。反應(yīng)產(chǎn)物的典型實(shí)例包括沉淀物、熒光信號(hào)、具有顏色的化合物，等等。典型SGC包括例如，生物發(fā)光化合物(例如，熒光素酶)，熒光團(tuán)(例如，如下文)，生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光化合物，放射性同位素(例如，1311，125I，14C，3H，35S，32P，等等)，酶(例如，如下文)，結(jié)合蛋白(例如，生物素，抗生物素蛋白，鏈霉親和素等等)，磁性顆粒，化學(xué)反應(yīng)性化合物(例如，著色染劑)，標(biāo)記的寡核苷酸；分子探針(例如，CY3，ResearchOrganics,Inc.),等等。典型的熒光團(tuán)包括異硫氰酸熒光素，琥珀酰熒光素，若丹明B，麗絲胺(lissamine)，9，10-二苯基蒽，二萘嵌苯，紅熒烯，芘和其熒光衍生物例如異氰酸酯，異硫氰酸酯，酰氯或者磺酰氯，傘形酮，鑭系元素例如銪(Eu)的稀土螯合物，等等?？捎糜谛盘?hào)發(fā)生結(jié)合物的典型SGC包括下列中的酶1類IUB，尤其是i丄i和1.6(例如，乙醇脫氫酶，甘油脫氫酶，乳酸脫氫酶，蘋(píng)果酸脫氫酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，甘油醛-3-磷酸膠氫酶等等)；1.11.1類IUB(例如，過(guò)氧化氫酶，過(guò)氧化物酶，氨基酸氧化酶，半乳糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，抗壞血酸氧化酶，心肌黃酶，尿素酶等等)；2類IUB，尤其是2.7和2.7.1(例如，己糖激酶等等)；3類IUB，尤其是3.2.1和3丄3(例如，a淀粉酶，纖維素酶，^-半乳糖透明質(zhì)酸酶(galacturonidase),淀粉葡萄糖苷酶，/3-葡糖醛酸酶，堿性磷酸酶，酸性磷酸酶等等)；4類IUB(例如，裂解酶)；5類IUB，尤其是5.3和5.4(例如，磷酸葡糖異構(gòu)酶，磷酸丙糖酶異構(gòu)酶(triosphosphataseisomerase)，磷酸葡糖變位酶等等)。信號(hào)發(fā)生化合物還包括其產(chǎn)物可以通過(guò)熒光和化學(xué)發(fā)光波長(zhǎng)檢測(cè)的SGC，例如，熒光素酶，熒光發(fā)射金屬例如l52Eu，或者鑭系的其他；化合物例如魯米諾，異魯米諾，吖啶鑰鹽，等等；生物發(fā)光化合物例如熒光素；熒光蛋白；等等。熒光蛋白包括，但不限于下列即，(i)綠色熒光蛋白(GFP),即，包括但不限于，GFP的"人源化"形式，其中天然存在的核苷酸序列的密碼子被改變成更密切匹配人密碼子偏差；(ii)源于維多利亞多管水母(A叫uoriavictoria)的GFP和其衍生物，例如，"人源化"衍生物例如增強(qiáng)的GFP，它是商品化提供的，例如，來(lái)自Clontech，Inc.;(iii)來(lái)自其他種類例如海腎(Renillareniformis),Renillamulleri,或者Ptilosarcusguernyi的GFP，如WO99/49019和Peelle等人(2001)J.ProteinChem.20:507-519所描述；(iv)"人源化"重組GFP(hrGFP)(Stratagene);和，(v)來(lái)自珊瑚蟲(chóng)(Anthozoan)種類的其他熒光和有色蛋白，例如Matz等人(1999)NatureBiotechnol17:969-973所描述那些；等等。該信號(hào)發(fā)生化合物可以偶聯(lián)到PL或者PDZ結(jié)構(gòu)域多肽。可以通過(guò)金屬螯合基團(tuán)例如EDTA實(shí)現(xiàn)某些SGC與蛋白的連接。該SGC都具有允許檢測(cè)和/或定量待測(cè)樣本中流感PL分析物的共同特性。利用目視法可以檢測(cè)該SGC;優(yōu)選，適于自動(dòng)化的方法例如分光光度法，熒光法，化學(xué)發(fā)光法，電納米方法(electricalnanometricmethod)包括例如，電導(dǎo)、阻抗、電阻等等的變化和磁場(chǎng)方法。此處使用的"固相"是指可以靜電、疏水或者共價(jià)連接一種或者多種反應(yīng)物的表面。典型的固相包括例如尼龍6;尼龍66;聚苯乙烯；膠乳珠；磁性珠；玻璃珠；聚乙烯；聚丙烯；聚丁烯；丁二烯-苯乙烯共聚物；硅橡膠；聚酯；聚酰胺；纖維素和衍生物；丙,酸酯；甲基丙烯酸酯；聚乙烯；氯乙烯；聚氯乙烯；聚氟乙烯；聚苯乙烯共聚物；硅凝膠；硅片玻璃；瓊脂糖；右旋糖苷；脂質(zhì)體；不溶蛋白金屬；和，硝化纖維素。典型的固相包括形成為珠子、管、條帶、圓盤(pán)、濾紙、板等等的那些。濾器可用于捕獲分析物例如作為濾液，或者通過(guò)截留起作用，或者通過(guò)將PL或者PDZ共價(jià)結(jié)合到濾器上起作用(例如，參見(jiàn)下面的實(shí)施例部分)。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，配給用戶的固相捕獲試劑可以由包被"捕獲試劑"(下文)的固相(上文)組成，并進(jìn)行包裝(例如，在氮?dú)鈿夥障?以保存和/或最大化捕獲試劑與生物樣本中流感PL分析物的結(jié)合。"捕獲試劑"是指能夠結(jié)合流感PL的固定PDZ多肽(或者肽)。該捕獲試劑可以由PDZ溶液；或者修飾以促進(jìn)其與固相結(jié)合的PDZ;或者已經(jīng)固定在固相表面上的PDZ組成，所述固定在固相表面上的PDZ例如，通過(guò)靜電力、范德華力、疏水力、共價(jià)化學(xué)鍵等等(如下面進(jìn)一步披露)將PDZ連接到固相(上文)來(lái)固定。PDZ捕獲試劑的典型實(shí)例在下面的實(shí)施例部分公開(kāi)，包括活動(dòng)的固相PDZ捕獲試劑，例如固定在活動(dòng)的膠乳珠上的PDZ，例如在膠乳珠浸染棒(dipstick)分析中。"檢測(cè)試劑"是指一種結(jié)合物，包含連接到PL或者PDZ多肽或者肽的SGC;或者，連接到能夠特異結(jié)合PL或者PDZ的抗體的SGC。該檢測(cè)試劑的典型實(shí)例包括一種或者多種PL或者PDZ與一種或者多種SGC化合物的復(fù)合物，即，高分子復(fù)合物。有關(guān)檢測(cè)試劑包括活動(dòng)的固相檢測(cè)試劑，例如膠乳珠浸染棒分析中活動(dòng)的膠乳珠。"生物樣本"是指從活的(或者死的)生物體，例如，哺乳動(dòng)物、魚(yú)、鳥(niǎo)、爬行動(dòng)物、有袋類動(dòng)物等等獲得的樣本。生物樣本包括組織液，組織切片，空氣或者水中帶有的生物材料，并例如通過(guò)過(guò)濾、離心等等從中收集，例如，用于評(píng)價(jià)生物恐怖威脅等等。備選的生物樣本可以取自胎兒或者卵，卵黃和羊水。典型生物液體包括，例如尿液，血液，血漿，血清，腦脊液，精液，肺灌洗液，糞便，痰，粘液，含水生物材料等等?；蛘撸飿颖景ū茄驶蛘呖谘适米?，鼻灌洗液，來(lái)自氣管、肺、肺泡、腸、脾、腎、大腦、肝和心臟的組織，痰，粘液，含水生物材料，泄殖腔拭子，痰，鼻和口腔粘液，等等。典型的生物樣本還包括食品，例如，肉、加工食品、家禽、豬等等的樣本。生物樣本還包括污染的溶液(例如，食品加工溶液等等)，來(lái)自門(mén)診場(chǎng)所、醫(yī)院、診所、食品加工場(chǎng)所(例如，飯店，屠宰場(chǎng)，冷藏庫(kù)，超級(jí)市場(chǎng)包裝等等)的拭樣。生物樣本還可以包括原位組織和體液(即，不是收集用于檢驗(yàn)的樣本)，例如，該方法可用于檢測(cè)眼睛中病毒感染的存在或者嚴(yán)重性，例如，利用滴眼劑，將測(cè)試條(teststrips)直接用于結(jié)膜；或者，通過(guò)例如將指示劑膠囊置于檢驗(yàn)對(duì)象的口或者鼻咽，檢測(cè)肺感染的存在或者程度?；蛘撸米踊蛘邷y(cè)試條可以置于口中。生物樣本可以來(lái)源于對(duì)象的任意組織，器官或者細(xì)胞群。在一些實(shí)施方式中，從對(duì)象獲得刮片、活組織切片或者灌洗液。生物樣本可以包括體液例如血液，尿液，痰液，和口腔液體；和樣本例如鼻洗滌液、拭子或者抽吸物，氣管抽吸物，下疳拭子，和大便樣本。適于目標(biāo)個(gè)體病原體檢測(cè)的生物樣本的收集方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如鼻咽樣本例如鼻拭子、洗滌液或者抽吸物，或者，在涉及呼吸系統(tǒng)疾病的高危流感A病毒情況下的氣管抽吸物，口腔拭子等等。因此，本發(fā)明的實(shí)施方式提供可用于檢測(cè)各種不同類型的生物樣本中流感A污染或者感染的存在或者量的方法。任選，生物樣本可以懸浮在包含抗生素例如青霉素、鏈霉素、慶大霉素和制霉菌素的等滲溶液中。此處使用的"配體"是指能夠結(jié)合PDZ結(jié)合位點(diǎn)的PL化合物。配體的典型實(shí)例包括包含PL的復(fù)合病毒顆粒(上文)，該顆粒發(fā)現(xiàn)于各種不同的流感A株中。該配體能夠填滿PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點(diǎn)處的三維空間，使得靜電斥力被最小化，靜電引力被最大化，疏水性和氫鍵鍵合力被最大化。配體以特異和可飽和的方式結(jié)合PDZ多肽，并且結(jié)合親合力可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的配體結(jié)合檢測(cè)法測(cè)定，例如下面所公開(kāi)的。"特異性"，當(dāng)用于本發(fā)明實(shí)施方式的分析背景時(shí)，是指根據(jù)本發(fā)明步驟進(jìn)行的該分析，能夠從一組生物樣本(例如，100個(gè)樣本的組)中正確鑒定出樣本的"指示"百分比。該樣本組全部包含一種或者多種胞壁質(zhì)分析物(例如，細(xì)菌或者真菌污染的陽(yáng)性對(duì)照樣本)。優(yōu)選該"指示"特異性大于85%，(例如，分析法能夠指示100個(gè)樣本中大于85個(gè)包含一種或者多種胞壁質(zhì)分析物)，并最優(yōu)選，該分析法的指示特異性大于90%。任選，該分析法能夠鑒別"真正的非流感A病例"，艮P，從生物樣本組(例如，100個(gè)樣本的組)中檢測(cè)出陰性樣本的"指示"百分比。優(yōu)選，本發(fā)明的該步驟能夠正確鑒定出"真正的非禽流感A病例"；和最優(yōu)選，本發(fā)明的該步驟能夠正確鑒定出"真正的低致病性禽流感A病例"。在不同的實(shí)施方式中，樣本的陰性對(duì)照組或者不包含流感APL分析物；或者，包含非禽流感APL分析物；或者，包含非致病的流感PL。優(yōu)選該特異性大于85%，(例如，分析法能夠指出100個(gè)樣本中超過(guò)85個(gè))，和最優(yōu)選，該檢測(cè)法的特異性大于90%。"特異性"，當(dāng)用于本發(fā)明實(shí)施方式的背景時(shí)，是指根據(jù)本發(fā)明步驟進(jìn)行的該分析法能夠從一組包含陽(yáng)性對(duì)照(上文)和陰性對(duì)照(即，缺失PL分析物)的樣本組中鑒定出"指示"百分比的包含流感PL分析物的那些樣本。優(yōu)選該"指示"的靈敏度大于85%和最優(yōu)選大于90%。任選，該分析法能夠從一組樣本中以包含流感PL分析物的那些樣本的"指示"百分比鑒定出"真正的流感A病例"。優(yōu)選，本發(fā)明的該步驟能夠正確的鑒定出"真正的禽流感A病例"；禾Q，最優(yōu)選，本發(fā)明的該步驟能夠正確的鑒定出"真正的致病性禽流感A病例"。在不同的實(shí)施方式中，樣本的陽(yáng)性對(duì)照組包含流感APL分析物；或者，包含禽流感APL分析物；或者，包含高致病性的流感APL。優(yōu)選該"指示"靈敏度大于大約70%和更優(yōu)選大于大約80%。甚至更優(yōu)選，靈敏度大于大約85%和最優(yōu)選大于對(duì)照靈敏度的大約90%?；蛘撸撿`敏度可以參照鑒定相同蛋白的PCR反應(yīng)的靈敏度測(cè)定。就特異性和靈敏度而言，任選可以運(yùn)用下列定義"陽(yáng)性預(yù)測(cè)值"，縮寫(xiě)為PPV，是指在本方法中檢測(cè)為陽(yáng)性并且是真正禽流感A病例的樣本的百分比。優(yōu)選，本方法的PPV大于約65%，和最優(yōu)選的大于約80%。."陰性預(yù)測(cè)值"，縮寫(xiě)為NPV，是指檢測(cè)為陰性并且是真正陰性流感A病例的樣本的百分比。優(yōu)選，本方法的NPV大于約85y。，和最優(yōu)選大于約90%。當(dāng)涉及生物樣本時(shí)，"真正陽(yáng)性流感A"是指兩個(gè)或者更多個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)確認(rèn)的包含流感A病毒顆粒的樣本，所述試驗(yàn)例如，在含胚雞卵中分離和培養(yǎng)，在商業(yè)化免疫測(cè)定法、免疫擴(kuò)散、紅細(xì)胞凝集和/或紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)中鑒定病毒抗原來(lái)鑒別HA和/或NA亞型，在呼吸器官標(biāo)本的細(xì)胞中病毒RNA的RT-PCR檢測(cè)或者流感A抗原的免疫熒光檢測(cè)。當(dāng)涉及生物樣本時(shí)，"真正陽(yáng)性禽流感A"是指兩個(gè)或者更多個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)確認(rèn)的包含禽流感A病毒顆粒的樣本，所述試驗(yàn)例如，在含胚雞卵中分離和培養(yǎng)，在商業(yè)化免疫分析試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散、紅細(xì)胞凝集禾口/或紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)中鑒定病毒抗原來(lái)鑒別HA和/或NA亞型，在呼吸器官標(biāo)本的細(xì)胞中病毒RNA的RT-PCR檢測(cè)或者禽流感A抗原的免疫熒光檢測(cè)。當(dāng)涉及生物樣本時(shí)，"真正陽(yáng)性高致病性禽流感A"是指如上文定義并由兩個(gè)或者更多個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)確認(rèn)的包含高致病性禽流感A病毒顆粒的樣本，所述試驗(yàn)例如，在含胚雞卵中分離和培養(yǎng)，在商業(yè)化免疫分析試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散、紅細(xì)胞凝集和/或紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)中鑒定病毒抗原來(lái)鑒別HA和/或NA亞型，在呼吸器官標(biāo)本的細(xì)胞中病毒RNA的RT-PCR檢測(cè)或者禽流感A抗原的免疫熒光檢測(cè)。當(dāng)涉及生物樣本時(shí)，"陰性禽流感A，，是指兩個(gè)或者更多個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)確認(rèn)的不包含禽流感A病毒顆粒的樣本，所述試驗(yàn)例如，在含胚雞卵中分離和培養(yǎng)，在商業(yè)化免疫分析試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散、紅細(xì)胞凝集和/或紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)中鑒定病毒抗原來(lái)鑒別HA禾n/或NA亞型，呼吸器官標(biāo)本的細(xì)胞中病毒RNA的RT-PCR檢測(cè)或者流感A抗原的免疫熒光檢測(cè)。當(dāng)涉及生物樣本時(shí)，"真正陰性禽禽流感A"是指兩個(gè)或者更多個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)確認(rèn)的不包含禽流感A病毒顆粒的樣本，所述試驗(yàn)例如，在含胚小雞卵中分離和培養(yǎng)，在商業(yè)化免疫分析試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散、紅細(xì)胞凝集和/或紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)中鑒定病毒抗原鑒別HA和/或NA亞型，呼吸器官標(biāo)本的細(xì)胞中病毒RNA的RT-PCR檢測(cè)或者流感A抗原的免疫熒光檢測(cè)。在這種情況下，生物樣本可能包含除了禽流感A病毒顆粒以外的流感A病毒顆粒，即，如上文定義。當(dāng)涉及生物樣本時(shí)，"真正陰性高致病性禽流感A"是指如上定義并且由兩個(gè)或者更多個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)確認(rèn)的不包含高致病性禽流感A病毒顆粒的樣本，所述試驗(yàn)例如，在含胚小雞卵中分離和培養(yǎng)，在商業(yè)化免疫分析試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散、紅細(xì)胞凝集和/或紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)中鑒定病毒抗原來(lái)鑒別HA和/或NA亞型，呼吸器官標(biāo)本的細(xì)胞中病毒RNA的RT-PCR檢測(cè)或者流感A抗原的免疫熒光檢測(cè)。但是該樣本可能包含上文定義的流感A病毒顆?；蛘咻^低致病性的禽流感A病毒顆粒。當(dāng)用于本發(fā)明實(shí)施方式的試驗(yàn)法情況下時(shí)，"背景"是指試驗(yàn)結(jié)果中的不確定性，(有時(shí)表示為假陽(yáng)性或者假陰性結(jié)果的百分比或者通過(guò)測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果的置信度)，是由試驗(yàn)中存在可能干擾分析的正確運(yùn)行的物質(zhì)時(shí)產(chǎn)生的?？赡芷鸶蓴_作用的物質(zhì)，即，干擾物質(zhì)、混淆(confounding)物質(zhì)等的典型實(shí)例包括內(nèi)源性PDZ結(jié)合多肽，信號(hào)發(fā)生化合物的抑制劑或者底物，例如，酶抑制劑，自由基反應(yīng)性化合物，內(nèi)源性過(guò)氧化物等等。此處使用的"基本上純化的"是指包含非天然狀態(tài)的天然PDZ或者PL多肽或者肽的制劑，例如其純度高于自然界中的水平。典型的比天然樣本中記載的更高水平的純度包括PDZ和PL多肽和其片段，相對(duì)于存在于天然來(lái)源材料中的水平，它們被富集大于約10倍到約25倍，優(yōu)選的大于約26倍到約50倍，和最優(yōu)選大于約100倍。該制劑還優(yōu)選包含小于約10%的雜質(zhì)，和最優(yōu)選小于約5%的可檢測(cè)雜質(zhì)，例如通過(guò)SDS-PAGE或者反相HPLC。先前已經(jīng)確定并在NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中電子儲(chǔ)存的核酸和蛋白序列在此通過(guò)Genbank檢索號(hào)(GI)引入作為參考。在那些Genbank項(xiàng)目中披露的序列集合為了一切目的在此完整引入作為參考。申請(qǐng)人明確保留以后修改說(shuō)明書(shū)以具體列舉一種或者多種這些序列、或者其任意標(biāo)明部分的權(quán)利。此處涉及的各種生化和分子生物學(xué)方法都是本領(lǐng)域公知的，并且描述于，例如，Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.第二(1989)和第三(2000)版，禾卩CurrentProtocolsinMolecularBiology,(A醫(yī)bel,F.M.等人編著)JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork(1987-1999)。核酸可以是DNA或者RNA，和單鏈或者雙鏈。寡核苷酸可以是天然存在或者合成的，但通常通過(guò)合成方法制備。優(yōu)選的本發(fā)明的核酸包括DNA片段，或者它們的互補(bǔ)序列(complement)，包括如表12所示的包含Ser70的NS2序列中的任意一個(gè)。該片段通常在5和100個(gè)連續(xù)堿基之間，并且范圍經(jīng)常在5，10，12，15，20，或者25個(gè)核苷酸到10，15，30，25，20，50或者100個(gè)核苷酸之間。5-10,5-20，10-20,12-30,15-30，10-50,20-50或者20-100個(gè)堿基之間的核酸是常見(jiàn)的。多態(tài)性位點(diǎn)可以存在于片段內(nèi)的任意位置。該片段可以來(lái)自于表12所示的NS2的任意等位基因形式。為了在表中簡(jiǎn)便起見(jiàn)，符號(hào)T用于代表DNA中的胸腺嘧啶和RNA中的尿嘧啶。因此，在RNA寡核苷酸中，符號(hào)T應(yīng)解釋為表示尿嘧啶殘基。雜交探針能夠以堿基特異方式結(jié)合核酸的互補(bǔ)鏈。這種探針包括核酸，月太核酸，如Nielsen等人于Science254，1497-1500(1991)的描述。'術(shù)語(yǔ)引物是指一種單鏈寡核苷酸，它能夠在合適條件(即，存在4種不同的核苷三磷酸和聚合劑，例如，DNA或者RNA聚合酶或者逆轉(zhuǎn)錄酶)、合適緩沖液和合適溫度下，作為模板指導(dǎo)的DNA合成起始點(diǎn)。引物的適合長(zhǎng)度取決于引物的打算用途，但范圍通常在15到40個(gè)核苷酸之間。短的引物分子通常需要較冷的溫度以便與模板形成足夠穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。引物無(wú)須反映模板的精確序列，但必須足夠互補(bǔ)以便與模板雜交。術(shù)語(yǔ)引物位點(diǎn)是指與引物雜交的靶DNA區(qū)域。術(shù)語(yǔ)引物對(duì)是指包括5'上游引物和3'下游引物的引物組，5'上游引物與待擴(kuò)增的DNA序列的5'端雜交，3'下游引物與待擴(kuò)增的序列的3'端互補(bǔ)序列雜交。多態(tài)性是指病毒種群中兩種或更多遺傳確定的可變序列或者等位基因的存在。第一個(gè)鑒定的等位基因形式被隨意命名為參照形式，而其他等位基因形式被命名為可變或者變體等位基因。在這種情況下，多態(tài)性包括70位，其中甘氨酸被替換為絲氨酸。單核苷酸多態(tài)性發(fā)生在被單核苷酸占據(jù)的多態(tài)性位點(diǎn)，這是等位基因序列之間的變異位點(diǎn)。該位點(diǎn)通常在等位基因高度保守序列(例如，種群成員中變化小于1/100或者1/1000的序列)的前后。單核苷酸多態(tài)性通常由于多態(tài)性位點(diǎn)處一個(gè)核苷酸取代另一個(gè)而產(chǎn)生。轉(zhuǎn)換(transition)是一種嘌呤被另一種嘌呤或者一種嘧啶被另一種嘧啶替換。顛換(transversion)是一種嘌呤被一種嘧啶替換，或者反之亦然。單核苷酸多態(tài)性還可以源于相對(duì)于參照等位基因的核苷酸的缺失或者核苷酸的插入。一組多態(tài)性是指至少2個(gè)，和有時(shí)5個(gè)，或者更多的如表12或者13禾口/或表3a-e所示的多態(tài)性。雜交通常在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行，該條件允許寡核苷酸和靶DNA之間的特異結(jié)合，靶DNA包含如表12或者13和/或表3a-e所示的多態(tài)性位點(diǎn)中的一種。嚴(yán)謹(jǐn)條件定義為任意合適的緩沖液濃度和溫度以及任意去除寡核苷酸非特異性結(jié)合的洗滌條件，所述緩沖液濃度和溫度允許寡核苷酸能夠與高度同源的序列特異雜交，該序列跨越至少一個(gè)如表12或者13所示的多態(tài)性位點(diǎn)。例如，5xSSPE(750mMNaCl，50mM磷酸鈉，5mMEDTA,pH7.4)和溫度25-3(TC的條件適于等位基因特異探針的雜交。通常洗滌條件的范圍從室溫到60°C。術(shù)語(yǔ)引物是指一種單鏈寡核苷酸，它能夠在合適條件(即，存在4種不同的核苷三磷酸和聚合試劑，例如，DNA或者RNA聚合酶或者逆轉(zhuǎn)錄酶)、合適緩沖液和合適溫度下，作為模板指導(dǎo)的.DNA合成起始點(diǎn)。引物的適合長(zhǎng)度取決于引物的打算用途，但范圍通常在15到30個(gè)核苷酸之間，盡管也可以使用更短或者更長(zhǎng)的引物。短的引物分子通常需要較冷的溫度以便與模板形成足夠穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。引物無(wú)須反映模板的精確序列，但必須足夠互補(bǔ)以便與模板雜交。術(shù)語(yǔ)"引物位點(diǎn)"是指與引物雜交的靶DNA區(qū)域。術(shù)語(yǔ)"引物對(duì)"是指包括5'上游引物和3'下游引物的引物組，5'上游引物與待擴(kuò)增的DNA^列的5'端雜交，3'下游引物與待擴(kuò)增DNA序列的3'端互補(bǔ)序列雜交。為將氨基酸取代分類為保守或者非保守，氨基酸分組如下組I(疏水性側(cè)鏈)正亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸；組II(中性親水性側(cè)鏈)半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸；組III(酸性側(cè)鏈)天冬氨酸，谷氨酸；組IV(堿性側(cè)鏈)天門(mén)冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸；組V(影響鏈取向的殘基)甘氨酸，脯氨酸；和組VI(芳香族側(cè)鏈)色氨酸，酪氨酸，苯丙氮酸。保守取代包括同類氨基酸之間的取代。非保守取代是由這些類型中一種的成員交換另一成員構(gòu)成。此處敘述的方法可以按照所敘述事件的任意次序進(jìn)行，即，達(dá)到這樣的順序邏輯上可行的程度。此外，當(dāng)提供范圍數(shù)值時(shí)，應(yīng)當(dāng)清楚，在所述范圍上下限之間的每個(gè)居間值，以及落在該范圍內(nèi)的任意其他提及的或者居間的值都包括在本發(fā)明內(nèi)。同時(shí)，預(yù)期所述的本發(fā)明改變的任何任選特征可以闡明并獨(dú)立提出權(quán)利要求，或者與此處描述的任意一個(gè)或者多個(gè)特征結(jié)合。指示單個(gè)物品包括存在有多個(gè)相同物品的可能性。更具體地，如此處和所屬權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式"一個(gè)"、"所述(said)"和"該(the)"包括復(fù)數(shù)指示，除非上下文明顯另有規(guī)定。還應(yīng)注意，可以起草權(quán)利要求以排除任何任選元素。因而，對(duì)于權(quán)利要求元素的敘述相關(guān)的排它術(shù)語(yǔ)如"唯一""只有"等的使用，或者"負(fù)性"限制的使用，本聲明意在作為前提基礎(chǔ)。發(fā)明詳述本發(fā)明的前提部分基于注意到流感NS1蛋白具有PL區(qū)，該P(yáng)L區(qū)與哺乳動(dòng)物PDZ蛋白相互作用，并且不同的PL模體與不同的PDZ蛋白特異性相互作用。本發(fā)明的前提還部分地基于以下結(jié)果在身體分泌物例如鼻分泌物中能夠發(fā)現(xiàn)可檢測(cè)水平的NS1PL蛋白。流感A奪取正常宿主細(xì)胞的功能，并引起導(dǎo)致致病性的變化。已發(fā)現(xiàn)某些致病性流感株具有非結(jié)構(gòu)NS1蛋白，該蛋白含有結(jié)合哺乳動(dòng)物PDZ蛋白的配體模體。作為急性毒力因子，NS1蛋白可能干擾或者轉(zhuǎn)變宿主細(xì)胞高分子蛋白復(fù)合物的PDZ蛋白組裝。因?yàn)镻DZ蛋白還通常參與分子伴侶、內(nèi)吞和分泌過(guò)程，此處公開(kāi)的證據(jù)有力支持以下觀點(diǎn)毒性流感株破壞基于細(xì)胞PDZ的調(diào)節(jié)機(jī)制。本發(fā)明提供新的診斷組合物和方法，以及，治療性抗病毒耙位和候選化合物。本結(jié)果顯示特異PDZ蛋白與流感NS1的結(jié)合具有高親合力和特異性。PDZ蛋白與毒性而不是非毒性流感A株中的C端三-和四-肽NS1模體結(jié)合。為了說(shuō)明該方法，利用重組PDZ蛋白和交叉反應(yīng)的抗NS1單克隆抗體，構(gòu)建嵌合分析以區(qū)別致病性和非致病性流感A株(又稱為毒性的和非毒性的)。該分析方法包括將對(duì)象的待測(cè)樣本與包含PDZ結(jié)構(gòu)域的多肽接觸，并檢測(cè)樣本中的致病性流感ANSIPJ)Z配體是否結(jié)合PDZ配體多肽。包含PDZ的多肽和病毒PDZ配體乏間的結(jié)合表明NS1來(lái)自于流感A的毒性株。當(dāng)對(duì)患者樣本進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，該結(jié)果表明對(duì)象感染了流感A病毒的致病株。該分析特別適合于鑒定H5和/或H7致病株。更優(yōu)選該分析鑒定至少一種致病株，包括H5N1、H7N2、H7N7、H10N7，并最優(yōu)選該分析鑒定H5N1株。更優(yōu)選，該分析鑒定禽類株的致病株，例如當(dāng)前造成禽流感的H5N1，其具有NS1PL模體ESEV(SEQIDN0:2)。不同的流感A株編碼具有不同PDZ配體(PL)的蛋白。因此不同的流感A株可以根據(jù)它們的PL進(jìn)行區(qū)分。因此，本發(fā)明還提供通過(guò)與特異NS1PL類型的關(guān)系，確定流感病毒亞型的方法。還提供檢測(cè)人類對(duì)象是否感染禽流感病毒H5N1株的方法。還提供鑒定抗病毒劑的分析法。因?yàn)樵摲椒z測(cè)只在感染細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生的病毒NS1抗原，所以該方法可用于篩查，以檢測(cè)當(dāng)前被感染的對(duì)象。該方法是特別有利的，因?yàn)榕c其他方法不同，它可以區(qū)別已免疫和被感染的對(duì)象。被感染的對(duì)象具有病毒NS1抗原，而已免疫的則沒(méi)有。最優(yōu)選，該方法能夠區(qū)別禽流感A病毒的不同亞型，以鑒定(即，具有陽(yáng)性分析結(jié)果)一種或者多種高致病性禽流感A株，如果它們存在于生物樣本中。優(yōu)選，該分析方法包括例如，在商業(yè)化屠宰場(chǎng)、農(nóng)場(chǎng)或者養(yǎng)殖場(chǎng)監(jiān)控禽類對(duì)象感染高致病性禽流感A株例如H5N1或者H7的步驟，。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明通過(guò)鑒定被感染的動(dòng)物并除去和/或銷毀和/或治療它們以預(yù)防傳染其他對(duì)象，而提供預(yù)防在大量對(duì)象中流行的流感A病毒傳播的方法。優(yōu)選，該方法包括區(qū)分感染了高致病性流感A株，例如禽類亞型如H5N1，與那些感染了較低致病性株的禽類和人類對(duì)象。此外本發(fā)明提供檢測(cè)對(duì)象是否感染流感病毒；和/或，受試者是否感染高危流感A病毒的禽類株的方法。該方法包括將來(lái)自對(duì)象的待測(cè)樣本與特異識(shí)別NS1PL的PDZ結(jié)構(gòu)域多肽、抗體和/或適配體和/或其他試劑接觸，并檢測(cè)待測(cè)樣本中的分析物與PDZ結(jié)構(gòu)域多肽、抗體和/或適配體之間是否發(fā)生結(jié)合相互作用。評(píng)價(jià)和檢測(cè)該結(jié)合相互作用可用于確定待測(cè)樣本包含流感病毒PL;從而確認(rèn)受試者被感染。該方法還可以在流感A病毒株之間進(jìn)行區(qū)分，例如評(píng)價(jià)對(duì)象是否感染高危禽流感病毒株(致病性)例如H5N1，或者，感染較低危的H1N1株(無(wú)致病性)。還提供在鑒定藥物抗病毒化合物，例如藥物開(kāi)發(fā)中有用的篩選分析法。因此，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了在各種診斷和治療應(yīng)用中的用途。I.流感病毒流感病毒屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，并基于它們核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(Ml)的抗原差異分為A、B和C組。進(jìn)一步分型到株通?；趯?duì)存在于兩個(gè)毒粒糖蛋白中的抗原類型，即，紅細(xì)胞凝集素(HA;H)和神經(jīng)氨酸苷酶(NA;N)進(jìn)行評(píng)價(jià)。HA和NP是毒性因子，介導(dǎo)病毒粒子與宿主細(xì)胞表面的連接。Ml蛋白被認(rèn)為在病毒組裝和出芽中起作用，而NP在RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起作用。除這些毒粒蛋白之外，兩個(gè)其他非結(jié)構(gòu)(即非毒粒)蛋白在病毒感染細(xì)胞中表達(dá)，它們被稱為非結(jié)構(gòu)蛋白l和2(NS1;NS2)。非結(jié)構(gòu)病毒蛋白NS1具有多重功能，包括調(diào)節(jié)剪接和核輸出細(xì)胞mRNAs和刺激翻譯，以及抵抗宿主干擾素能力。在流感病毒中已經(jīng)鑒定和測(cè)序了NS1蛋白，該序列可以在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查到。其他流感病毒中的NS1蛋白，是指與在已知流感亞型中鑒定為NS1的蛋白之一具有最大序列相似性的蛋白，使用的序列例如，genbank檢索號(hào)，CY003340，CY003324，DQ266101，等等。全部禽流感病毒分類為A型。已經(jīng)從人，豬，馬和海洋哺乳動(dòng)物以及家養(yǎng)和野生鳥(niǎo)類中分離出A型病毒。禽流感病毒是發(fā)生人流感大流行的關(guān)鍵因素，因?yàn)?957年的亞洲流行性感冒和1968年的香港流感都是由據(jù)認(rèn)為是禽類來(lái)源的病毒引起。近年來(lái)，H5N1和H7N7亞型的純種禽流感病毒已經(jīng)在香港和荷蘭直接造成致命的人類疾病(Horimoto，T.和Kawaoka,Y.(2001)Clin.Microbiol.Rev.14:129-149;Guan，Y.等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:8156-8161)。II.PL區(qū)下面的實(shí)施例顯示，流感病毒病原體包含具有PDZ配體的模體的病毒蛋白，所述PDZ配體結(jié)合PDZ蛋白。具有PL模體的病毒蛋白，包括紅細(xì)胞凝集素(HA),核蛋白(NP)，基質(zhì)l(Ml)和非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)蛋白。但是，II型PL模體(全部，單除了NS1蛋白)顯示與PDZ蛋白較弱的結(jié)合。通常在蛋白最后3或者4個(gè)C末端氨基酸處發(fā)現(xiàn)PL模體。在大多數(shù)流感NS1蛋白中發(fā)現(xiàn)的可鑒別模體是S/T-X-V/I/L,其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸，X是任意氨基酸。.各特異性模體的頻率在實(shí)施例l和表3a-e中顯示。盡管EPEV(SEQIDNO:27)禾QKMAD(SEQIDNO:28)不對(duì)應(yīng)于典型的PL模體，但它們?cè)谝欢ǔ潭壬辖Y(jié)合PDZ，并且也能用于鑒定。表3a-e和圖1-3的結(jié)果顯示了通過(guò)H和N抗原鑒別的亞型和相應(yīng)NS1PL模體之間的非隨機(jī)關(guān)系。特異NS1PL模體此處被稱為NS1PL類。III.PDZ蛋白最近已經(jīng)顯示PDZ結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞質(zhì)膜蛋白復(fù)合物的主要組織者。最初鑒定PDZ結(jié)構(gòu)域?yàn)橥挥|后密度蛋白PSD95/SAP90、果蠅腫瘤抑制物dig-A和緊密連接蛋白ZO-1內(nèi)的保守序列元件。盡管最初被稱為GLGF(SEQIDNO:26)或者DHR模體，但現(xiàn)在它們己知為代表前3個(gè)包含PDZ的蛋白(PDZ:PSD95/DLG/ZO-l)的縮寫(xiě)?，F(xiàn)在這些80-90個(gè)氨基酸的序列己在超過(guò)75種蛋白中得到了很好的鑒定，并在單個(gè)蛋白內(nèi)特征性地多拷貝表達(dá)。PDZ結(jié)構(gòu)域被國(guó)家生物技術(shù)信息中心(theNationalCenterforBiotechnologyInformation)(www.ncbi.gov)i只另U為家族，例如在Pfam中。還發(fā)現(xiàn)它們存在于不同生物體的整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育中，如多細(xì)胞動(dòng)物、植物和細(xì)菌。這種廣泛的物種分布好象是只有這種結(jié)構(gòu)域特有的，但或許PDZ結(jié)構(gòu)域最區(qū)別性特征在于觀察到絕大多數(shù)包含它們的蛋白與胞質(zhì)膜相關(guān)。盡管在許多不同結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了PDZ結(jié)構(gòu)域，但各PDZ蛋白通常局限于特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)域，例如突觸；細(xì)胞-細(xì)胞接觸；或者頂端、底部或者側(cè)部的細(xì)胞表面。這引出一種推測(cè)，即PDZ結(jié)構(gòu)域進(jìn)化早，在組織胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)域中發(fā)揮主要作用。PDZ結(jié)構(gòu)域最普遍的功能可能是將它們的配體定位到合適的胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)域。在極化上皮細(xì)胞中，PDZ蛋白清楚地定位在不同的頂端、底部-側(cè)部和結(jié)合的膜結(jié)構(gòu)域，并且在大部分情況下，與它們的跨膜和細(xì)胞溶質(zhì)結(jié)合伴侶共定位。顯然PDZ蛋白還具有一個(gè)基本作用，在特定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)域內(nèi)空間簇聚集和錨定跨膜蛋白。PDZ結(jié)構(gòu)域包含約80-90個(gè)殘基，它們折疊成具有5-6個(gè)鏈和兩個(gè)a螺旋的|3-夾心結(jié)構(gòu)。肽配體結(jié)合在由/3鏈(bB)、a螺旋和結(jié)合肽的羰基的環(huán)組成的疏水性裂縫(cleft)中。肽以反平行模式與bB鏈結(jié)合，C末端殘基占據(jù)疏水性袋。PDZ雜二聚體形成線性的頭尾(head-to-tail)排列，參與伴侶蛋白之一上內(nèi)部構(gòu)件(internal)的識(shí)別。PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白在本領(lǐng)域是已知的，通過(guò)蛋白測(cè)序和鑒定PDZ結(jié)構(gòu)域的存在，新的蛋白能夠被鑒定為具有PDZ結(jié)構(gòu)域。2004年8月2日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)10/485,788詳細(xì)解釋了PDZ蛋白，并給出了大量實(shí)例?；蛘?，懷疑是PDZ蛋白的蛋白可以檢測(cè)與各種PL蛋白或者NS1PL類的結(jié)合。IV.PDZ/PL相互作用來(lái)自流感的包含PL模體的NS1蛋白與實(shí)施例中所示的PDZ蛋白結(jié)合。實(shí)施例2顯示了用于鑒定結(jié)合的方法。2004年8月2日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)10/485,788和2003年11月14日提交的10/714,537詳細(xì)描述了檢測(cè)PDZ結(jié)構(gòu)域多肽和候選PDZ配體多肽之間結(jié)合的兩個(gè)互補(bǔ)分析(A和G分析)。在兩個(gè)不同分析的每一種中，檢測(cè)具有對(duì)應(yīng)于預(yù)期結(jié)合一種或者多種PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白的C末端的序列的肽(即候選PL肽)，和PDZ結(jié)構(gòu)域多肽(通常是包含PDZ結(jié)構(gòu)域的融合蛋白)之間的結(jié)合。A.檢測(cè)PDZ結(jié)構(gòu)域多肽和NMDA受體PL蛋白之間相互作用的分析建立了兩個(gè)稱為"A"和"G"的互補(bǔ)分析來(lái)檢測(cè)PDZ結(jié)構(gòu)域多肽和候選PDZ配體之間的結(jié)合。在兩個(gè)不同分析的每一種中，檢測(cè)具有對(duì)應(yīng)于預(yù)期結(jié)合一種或者多種PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白C末端的序列的肽(即候選PL肽)和PDZ結(jié)構(gòu)域多肽(通常是包含PDZ結(jié)構(gòu)域的融合蛋白)之間的結(jié)合。在"A"分析中，固定候選PL肽并檢測(cè)可溶PDZ結(jié)構(gòu)域多肽與固定肽的結(jié)合("A"分析的命名是因以下事實(shí)在一個(gè)實(shí)施方式中用抗生物素蛋白表面(旦vidin)固定肽)。在"G"分析中，固定PDZ結(jié)構(gòu)域多肽，并檢測(cè)可溶PL肽的結(jié)合("G"分析的命名是因?yàn)橛肣ST-結(jié)合表面固定PDZ結(jié)構(gòu)域多肽)。下面描述示范性的分析。I."A分析"利用固定PL肽檢測(cè)PDZ配體結(jié)合。分析包括下列步驟(1)將生物素化的候選PL肽固定在抗生物素蛋白包被的表面上。然后測(cè)定PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白與該表面的結(jié)合。(2)抗生物素蛋白與表面，例如蛋白結(jié)合表面結(jié)合。任選，通過(guò)每孔添加100ML溶于不含鈣和鎂的磷酸鹽緩沖鹽水pH7.4("PBS"，GibcoBRL)的20/xg/mL的抗生物素蛋白(Pierce)，在4°C12小時(shí)，將抗生物素蛋白結(jié)合到聚苯乙烯96孔板(例如，NuncPolysorb(cat#—475094))。然后通過(guò)每孔添加200/aLPBS，在4°C2小時(shí)，對(duì)板進(jìn)行處理以阻斷非特異性的相互作用，所述PBS每100mL含有2g無(wú)蛋白酶牛血清白蛋白("PBS/BSA")。然后對(duì)板的每孔重復(fù)添加每孔200/xLPBS，用PBS洗板3次，然后將板的內(nèi)含物倒入廢液器中，在干燥表面上輕叩板。(3)通過(guò)每孔添加50jtiL溶于PBS/BSA的0.4/iM肽，在4'C30分鐘，將生物素化的PL肽(或者候選PL肽)固定在板的孔表面上。通常，各個(gè)不同的肽添加到至少8個(gè)不同的孔，因此能夠做出多重測(cè)量(例如，雙份重復(fù)，并且還利用不同的GST/PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白和單獨(dú)的GST陰性對(duì)照)，并且還準(zhǔn)備其他的陰性對(duì)照孔，其中沒(méi)有肽被固定。在PL肽固定到表面上后，用PBS洗板3次。(4)通過(guò)每孔添加50/iL包含溶于PBS/BSA的5/ig/mLGST/PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白的溶液，在4。C2小時(shí)，使得GST/PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白與表面反應(yīng)。作為陰性對(duì)照，添加單獨(dú)的GST(即不是融合蛋白)到指定孔，通常每個(gè)固定肽至少2個(gè)孔(即雙份重復(fù)測(cè)量)。反應(yīng)2小時(shí)后，用PBS洗板3次以去除未結(jié)合的融合蛋白。(5)可以利用本領(lǐng)域已知的各種方法和檢測(cè)器檢測(cè)GST/PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白與抗生物素蛋白-生物素化肽表面的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方式中，板中每孔添加50/xL溶于PBS/BSA的抗GST抗體(例如2.5/ig/mL多克隆山羊抗GST抗體，Pierce)，使其在4。C反應(yīng)20分鐘。用PBS洗板3次，添加第二種可檢測(cè)的標(biāo)記抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，板中每孔添加50piL2.5/ig/mL辣根過(guò)氧化酶(HRP)偶聯(lián)的多克隆兔抗山羊免疫球蛋白抗體，使其在4'C反應(yīng)20分鐘。用包含0.2%Tween20的50mMTrispH8.0洗板5次，通過(guò)每孔添加100/iLHRP底物溶液(TMB，Dako)，在室溫(RT)20分鐘顯色。通過(guò)每孔添加100jaL1M硫酸終止HRP和其底物的反應(yīng)，在450nm讀出板上各孔的光密度(O.D.)。(6)通過(guò)對(duì)來(lái)自PL肽和PDZ結(jié)構(gòu)域多肽組合的孔中信號(hào)與背景信號(hào)進(jìn)行比較，檢測(cè)PL肽和PDZ結(jié)構(gòu)域多肽的特異結(jié)合。背景信號(hào)是陰性對(duì)照中發(fā)現(xiàn)的信號(hào)。典型的特異或者選擇性反應(yīng)至少兩倍于背景信號(hào)，更典型的超過(guò)5倍于背景信號(hào)，和最典型的是IO倍于或者更多倍于背景信號(hào)。此外，統(tǒng)計(jì)上有顯著意義的反應(yīng)包括多次測(cè)量的信號(hào)和背景相差至少兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤差的反應(yīng)，更典型的是4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤差，和最典型的是6個(gè)或者更多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤差。相應(yīng)地，比較信號(hào)的重復(fù)測(cè)定與背景的重復(fù)測(cè)定的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)(例如T-檢驗(yàn))將得出p值0.05，更典型的是p值〈0.01，和最典型的是p值O.OOl或者更低。如所述，在"A"分析的實(shí)施方式中，來(lái)自GST/PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白與未接觸(即未被覆蓋)PL肽的抗生物素蛋白表面相結(jié)合的信號(hào)是一個(gè)合適的陰性對(duì)照(有時(shí)稱為"B")。來(lái)自單獨(dú)GST多肽(即不是融合蛋白)與已經(jīng)接觸(即被覆蓋)PL肽的包被抗生物素蛋白的表面相結(jié)合的信號(hào)是第二種合適的陰性對(duì)照(有時(shí)稱為"B2")。因?yàn)樗械臋z測(cè)都進(jìn)行多次(即至少兩次)，用幾次檢測(cè)的算術(shù)平均值(或者，相當(dāng)于，'平均)確定結(jié)合，用平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差確定結(jié)合檢測(cè)中的概率誤差。'N次檢測(cè)的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差等于下列的平方根各檢測(cè)值和平均值之間差值的平方和，除以(N)和(N-l)的乘積。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)將特定PL-PDZ組合的平均信號(hào)("平均S")和信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)誤差("SE")與平均值B1和/或平均值B2進(jìn)行比較，確定PDZ蛋白與板結(jié)合PL肽的特異結(jié)合。II."G分析"一利用固定PDZ結(jié)構(gòu)域融合多肽的PDZ配體結(jié)合檢在一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)法，其中GST/PDZ融合蛋白被固定在表面上("G"分析)。然后測(cè)量標(biāo)記PL肽(例如圖3a-e中所列那些中的一種)與該表面的結(jié)合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，該分析法按下列步驟進(jìn)行(1)將PDZ結(jié)構(gòu)域多肽結(jié)合到表面，例如蛋白結(jié)合表面。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，包含一個(gè)或多個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域的GST/PDZ融合蛋白與聚苯乙烯96孔板結(jié)合。能夠通過(guò)任意不同的標(biāo)準(zhǔn)方法將GST/PDZ融合蛋白結(jié)合到板上，盡管需要小心操作使融合蛋白結(jié)合到板的步驟不改變PDZ結(jié)構(gòu)域的配體結(jié)合性質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，GST/PDZ融合蛋白通過(guò)包被在96孔板上的抗GST抗體來(lái)結(jié)合。當(dāng)按下列操作時(shí)可以實(shí)現(xiàn)與板的充分結(jié)合a.聚苯乙烯96孔板(例如，NuncPolysorb)中每孔添加100/iL溶于PBS的5/xg/mL山羊抗GST多克隆抗體(Pierce)，在4°C12小時(shí)。b.每孔添加200jliLPBS/BSA，在4'C2小時(shí)，對(duì)板進(jìn)行封閉。c.用PBS洗板3次。d.板上每孔添加50pL溶于PBS/BSA的5/xg/mLGST/PDZ融合蛋白或者作為陰性對(duì)照的單獨(dú)GST多肽(即不是融合蛋白)，在4'C2小時(shí)。e.再用PBS洗板3次。(2)通過(guò)每孔添加50/iL溶于PBS/BSA的20/iM生物素化的肽溶液，使生物素化的PL肽與表面在4'C反應(yīng)IO分鐘，然后再在25'C孵育20分鐘。用冰冷的PBS洗板3次。(3)可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法和檢測(cè)器檢測(cè)生物素化的肽與GST/PDZ融合蛋白表面的結(jié)合。在一個(gè)示范性步驟中，每孔添加100/xL溶于BSA/PBS的0.5/xg/mL鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合物，在4。C反應(yīng)20分鐘。然后用包含0.2%Tween20的50mMTrispH8.0洗板5次，通過(guò)每孔添加100jtiLHRP底物溶液(TMB，Dako)在室溫(RT)20分鐘顯色。通過(guò)每孔添加100/iL1M硫酸終止HRP和其底物的反應(yīng)，在450nm處讀出板上各孔的光密度(O.D.)。(4)通過(guò)對(duì)來(lái)自PL肽和PDZ結(jié)構(gòu)域多肽組合的孔中的信號(hào)與背景信號(hào)進(jìn)行比較，確定PL肽和PDZ結(jié)構(gòu)域多肽的特異結(jié)合。背景信號(hào)是陰性對(duì)照中發(fā)現(xiàn)的信號(hào)。典型的特異性或者選擇性反應(yīng)至少兩倍于背景信號(hào)，更典型的超過(guò)5倍于背景信號(hào)，和最典型的是10倍于或者更多倍于背景信號(hào)。此外，統(tǒng)計(jì)上有顯著意義的反應(yīng)包括多次測(cè)量得到信號(hào)和背景相差至少兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤差的反應(yīng)，更典型的是4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤差，和最典型的是6個(gè)或者更多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤差。相應(yīng)地，'比較信號(hào)的重復(fù)測(cè)定與背景的重復(fù)測(cè)定的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)(例如T-檢驗(yàn))將得出p值<0.05，更典型的是p值O.Ol，和最典型的是p值O.OOl或者更低。如所述，在"G"分析的實(shí)施方式中，來(lái)自給定PL肽與固定的(表面結(jié)合的)單獨(dú)GST多肽結(jié)合的信號(hào)是合適的陰性對(duì)照(有時(shí)稱為"B1")。因?yàn)樗械臏y(cè)定都進(jìn)行多次(即至少兩次)，用幾次檢測(cè)的算術(shù)平均值(或者，相當(dāng)于，平均)確定結(jié)合，并用平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差確定結(jié)合測(cè)定中的概率誤差。N次檢測(cè)平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差等于下列的平方根各檢測(cè)值和平均值之間差值的平方和，除以(N)和(N-l)的乘積。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)將特定PL-PDZ組合的平均信號(hào)("平均S")和信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)誤差("SE")與平均值B1進(jìn)行比較，確定PDZ蛋白與板結(jié)合肽的特異結(jié)合。i)"G'分析"和"G"分析"上文描述的"G分析"特定條件的兩種特定改變尤其有用。改變的分析法使用更少量的標(biāo)記PL肽，并且相對(duì)上文描述的特定分析條件，對(duì)PDZ配體結(jié)合的檢測(cè)的生化要求略有不同。為了方便起見(jiàn)，本章節(jié)描述的分析條件稱為"G'分析"和"G"分析",而在前面章節(jié)中描述的G分析特定條件稱為"&分析"。"G'分析"與"Ge分析"相同，除了步驟(2)中肽濃度是10mM而不是20]hM。這導(dǎo)致檢測(cè)親合力較低和/或離解速率較快的相互作用時(shí)靈敏度略低。相應(yīng)地，它稍微增加了以下情況的確定性，即被檢測(cè)的相互作用具有足夠的親合力和半衰期，從而具有生物學(xué)重要性并且是有用的治療目標(biāo)。"G"分析"與"GG分析"相同，除了步驟(2)中肽濃度是l/xM而不是20/xM，并且在25"C孵育60分鐘(而不是，例如，4°C10分鐘然后是25'C20分鐘)。這導(dǎo)致對(duì)親合力低、離解速率快、和/或親合力在25'C比在4'C更低的相互作用的靈敏度較低。如果(我們發(fā)現(xiàn)通常對(duì)PDZ配體結(jié)合來(lái)說(shuō)是成立的)反應(yīng)熵是負(fù)的(即產(chǎn)物的熵小于反應(yīng)物的熵)，則相互作用在25'C的親合力比在4r時(shí)低。相反，在"G"分析"和"GG分析"中，對(duì)結(jié)合和離解速率慢的相互作用，PDZ-PL結(jié)合信號(hào)可能是相似的，因?yàn)镻DZ-PL復(fù)合物將在"G"分析"的較長(zhǎng)孵育期間積聚。因此"G"分析"和"GG分析"結(jié)果的比較可用于估算不同PDZ-PL相互作用的相對(duì)熵、焓和動(dòng)力學(xué)。(熵和焓通過(guò)等式AG-RTln(Kd)=AH-TAS與結(jié)合親合力建立聯(lián)系，其中AG、H和S分別是反應(yīng)自由能、焓和熵，T是凱氏度數(shù)的溫度，R是氣體常數(shù)，Kd是平衡解離常數(shù))。特別是，只能在"G11分析"中檢測(cè)到或者在"GQ分析"中檢測(cè)更強(qiáng)的相互作用通常在25'C具有快速的離解速率(tl/2"0分鐘)和負(fù)反應(yīng)熵，而在"G"分析"中檢測(cè)的同樣強(qiáng)的相互作用通常在25'C具有較慢的離解速率(0/2>10分鐘)。PDZ-PL相互作用的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)的大致估算(可通過(guò)上文概述的"G。分析"相對(duì)"G"分析"結(jié)果的比較實(shí)現(xiàn))可用于設(shè)計(jì)相互作用的有效抑制劑。例如，基于從給定PDZ結(jié)構(gòu)域緩慢解離(通過(guò)與"GG分析"相似的"G"分析"中的結(jié)合證明)的PL化學(xué)結(jié)構(gòu)的小分子抑制劑可能自身解離緩慢，因此具有高親合力。'采用這樣的方式，"G分析"步驟(2)溫度和持續(xù)時(shí)間的改變可用于了解PDZ配體結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)，并了解該反應(yīng)抑制劑的設(shè)計(jì)。本發(fā)明的可檢測(cè)標(biāo)記物可以是任意可檢測(cè)的化合物或者組合物，它們可以直接或者間接與分子結(jié)合(例如上面描述)。該標(biāo)記物能夠是本身可檢測(cè)(例如，放射性同位素標(biāo)記或者熒光標(biāo)記)或者，對(duì)酶標(biāo)記物來(lái)說(shuō)，可以催化底物化合物或者組合物可檢測(cè)的的化學(xué)變化。優(yōu)選的標(biāo)記物是酶標(biāo)記物，它催化非放射性顯色試劑的變色。有時(shí)，標(biāo)記物間接與抗體結(jié)合。技術(shù)人員知道用于間接結(jié)合的不同技術(shù)。例如，抗體可以與生物素結(jié)合，上述任意類型的標(biāo)記物可以與抗生物素蛋白結(jié)合，或者反之亦然(同樣參見(jiàn)上面的"A"和"G"分析)。生物素選擇性結(jié)合到抗生物素蛋白，因此，標(biāo)記物可以用這種間接方式與抗體結(jié)合。參見(jiàn)，Ausubd，上文，對(duì)涉及生物素-抗生物素蛋白結(jié)合和相似分析的技術(shù)的綜述?；蛘?，為實(shí)現(xiàn)標(biāo)記物與抗體的間接結(jié)合，抗體與小半抗原(例如地高辛)結(jié)合，上述不同類型標(biāo)記物中的一種與抗-半抗原抗體(例如抗-地高辛抗體)結(jié)合。因此，可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記物與抗體的間接結(jié)合。分析變化可以包括不同的洗滌步驟。"洗滌"表示將固相暴露于水溶液(通常是緩沖液或者細(xì)胞培養(yǎng)基)，以這種方法使未結(jié)合的材料(例如，未粘附細(xì)胞，未粘附捕獲劑，未結(jié)合配體，受體，受體構(gòu)建物，細(xì)胞裂解產(chǎn)物或者HRP抗體)從中去除。為減少背景噪聲，方便的是在洗滌液中包括去污劑(例如，TritonX)。通常，洗滌后從分析板的孔中倒出水性洗滌液。利用自動(dòng)化洗滌設(shè)備可以方便地實(shí)現(xiàn)洗滌。有時(shí)，可能需要幾個(gè)洗滌步驟(例如，在大約1到IO個(gè)洗滌步驟之間)。PDZ-PL檢測(cè)分析中還可以使用不同的緩沖液。例如，不同的阻斷緩沖液可用于降低分析背景。術(shù)語(yǔ)"阻斷緩沖液"是指包含至少一種阻斷化合物的水性pH緩沖溶液，其能夠結(jié)合沒(méi)有被包含PL或者PDZ的蛋白包被的基質(zhì)的暴露表面。阻斷化合物通常是蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)，明膠，酪蛋白或者奶粉，并且不與分析中的任何試劑交叉反應(yīng)。阻斷緩沖液的pH通常在大約7到7.5之間，合適的緩沖劑包括磷酸鹽和TRIS。在檢測(cè)PDZ-PL相互作用中，可以使用不同的酶-底物組合。酶-底物組合的實(shí)例包括，例如(i)辣根過(guò)氧化物酶(HRPO)與過(guò)氧化氫酶作為底物，其中過(guò)氧化氫酶氧化染料前體(例如鄰苯二胺[OPD]或者3,3',5，5'-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽[TMB])(如上所述)。(ii)堿性磷酸酶(AP)與對(duì)-硝基苯磷酸作為生色底物。(^)/3-0-半乳糖苷酶(/30-0^)與生色底物(例如對(duì)-硝基苯-/3-0-半乳糖苷酶)或者熒光底物4-甲基傘型酮-P-D-半乳糖苷酶。己有大量的其他酶-底物組合。對(duì)于這些組合的總體概述，可參見(jiàn)美國(guó)專利4，275,149和4,318,980，這兩篇均在此引入作為參考。下頁(yè)的表1和2，列出包含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白("PQZ蛋白")和PDZ配體("PL")，此處已經(jīng)鑒定出它們彼此結(jié)合。每個(gè),PL蛋白具有結(jié)合至少一種PDZ蛋白的親合力。表1的第2欄列出PL蛋白來(lái)源的流感A蛋白(例如，紅細(xì)胞凝集素(HA)，核蛋白(NP)，基質(zhì)(Ml)和非結(jié)構(gòu)蛋白l(NS1));第3欄列出PL模體氨基酸序列；第4欄提供與PL結(jié)合的PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白的GenBank識(shí)別號(hào)(GI號(hào))(該數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目在此引入作為參考，包括其中描述的任意注釋)。表1—PDZ-PL的相互作用*<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>PDZ蛋白可以產(chǎn)生為融合蛋白，只要它們包含活性PDZ結(jié)構(gòu)域。例如，已經(jīng)產(chǎn)生了PDZ結(jié)構(gòu)域克隆入載體(PGEX-3X載體)用于產(chǎn)生GST-PDZ融合蛋白(Pharmacia)，并在現(xiàn)有的美國(guó)和國(guó)際專利申請(qǐng)中有教導(dǎo)，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)10/485,788(2004年2月3日提交)，國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US03/285/28508(2003年9月9日提交)，國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/USOl/44138(2001年11月9日提交)，在此夷整引入作為參考。V.篩選PDZ蛋白篩選方法可以包括利用已知的用于序列分析和/或結(jié)構(gòu)域分析的任意計(jì)算機(jī)程序，使用序列分析鑒定PDZ結(jié)構(gòu)域。一旦鑒定出PDZ蛋白，可以篩選其與流感PL蛋白相互作用的能力。PDZ蛋白或者PDZ結(jié)構(gòu)域多肽是包含PDZ結(jié)構(gòu)域的任何蛋白。任意包含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白，無(wú)論是天然、重組、嵌合或者片段，都可篩選其結(jié)合流感PL結(jié)構(gòu)域的能力。美國(guó)專利申請(qǐng)10/485,788(2004年2月3日提交)，國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US03/285/28508(2003年9月9日提交)，國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US01/44138(2001年11月9日提交)給出了PDZ結(jié)構(gòu)域的鑒定方法，在此完整引入作為參考。VI.篩選其他PL結(jié)合劑適于在診斷分析中使用的PL結(jié)合劑包括特異結(jié)合一種或者多種PL模體的任意試劑。利用在篩選抗病毒劑方法中公開(kāi)的相同方法能夠鑒定這樣的試劑。例如，利用包含PL模體的蛋白能夠鑒定該試劑。利用任意類型的文庫(kù)，例如包括表達(dá)文庫(kù)和小分子文庫(kù)，能夠鑒定待測(cè)化合物。用于篩選治療劑或者治療先導(dǎo)物的待測(cè)化合物的優(yōu)選來(lái)源是噬菌體展示文庫(kù)。參見(jiàn)，例如，Devlin,W091/18980;Key,B.K.，等人編著,PhageDisplayofPeptidesandProteins,ALaboratoryManual,AcademicPress,SanDiego,CA，1996。噬菌體展示是一種強(qiáng)大的技術(shù)，使人能夠從包含108-109個(gè)不同序列的文庫(kù)中，使用噬菌體遺傳學(xué)選擇和擴(kuò)增具有所需特征的肽或者蛋白?？梢詫⑽膸?kù)設(shè)計(jì)為氨基酸序列在所需位置的選擇性上色(variegation)，使得文庫(kù)對(duì)所需特征偏好。設(shè)計(jì)文庫(kù)使肽表達(dá)為與噬菌體表面呈現(xiàn)的蛋白融合。挑選具有所需特征的噬菌體展示肽，能夠再生長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增。因?yàn)殡氖峭ㄟ^(guò)噬菌體的增殖擴(kuò)增的，可以方便地測(cè)序所選噬菌體的DNA，從而促進(jìn)所選肽的快速分析。通過(guò)篩選特異結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白和/或NS1PL的噬菌體，能夠挑選出編碼肽抑制劑的噬菌體。產(chǎn)生與蛋白融合的文庫(kù)，例如表達(dá)在噬菌體表面的基因II。文庫(kù)可以由不同長(zhǎng)度的、線性的或者通過(guò)包含兩個(gè)Cys氨基酸進(jìn)行限制的肽組成，與噬菌體蛋白融合或者還可以融合到其他作為支架的蛋白。還可以設(shè)計(jì)文庫(kù)偏好此處公開(kāi)的PL區(qū)或者偏好從初始文庫(kù)篩選的結(jié)合噬菌體得到的肽序列，所述初始文庫(kù)提供其他的分析抑制劑化合物。VII.用于診斷和治療用途的抗體本發(fā)明的NSl,NSlPL,PDZ和PDZPL結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽可用于產(chǎn)生在診斷和治療中使用的抗體?？贵w可以是多克隆抗體、不同的單克隆抗體或者具有不同表位特異性的集合單克隆抗體。采用依據(jù)抗體類型的標(biāo)準(zhǔn)方法，單克隆抗體由包含抗原的蛋白片段制備(參見(jiàn)，例如，Kohler，等人，Nature,256:495，(1975);和Harlow&Lane,Antibodies,ALaboratoryManual(C.S.H.P.,NY，1988)Queen等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA86:10029-10033(1989)和WO卯/07861;Dower等人，WO91/17271和McCafferty等人，WO92/01047(每項(xiàng)在此引入作為參考用于所有的目的)。噬菌體展示技術(shù)還可以用于誘變抗體的'CDR區(qū)，所述抗體先前顯示具有與本發(fā)明肽的親合力。一些抗體與存在于NS1或者PDZ蛋白的一種形式而不是其他形式中的抗原表位結(jié)合。例如，一些抗體與NSlC端PL位點(diǎn)內(nèi)的抗原表位結(jié)合。那些結(jié)合特異性NSlPL模體的抗體可被分為NS1PL類-特異抗體。此外，一些抗體與PDZ蛋白的PDZ結(jié)構(gòu)域內(nèi)的抗原表位結(jié)合。一些抗體與例如表1中所示的PDZ多肽特異結(jié)合，而不與其他結(jié)合?？梢约兓贵w，例如，通過(guò)與支持物結(jié)合和從其洗脫，所述支持物上結(jié)合有激發(fā)抗體的多肽或者肽。術(shù)語(yǔ)"抗體"或者"免疫球蛋白"用于包括完整的抗體和其結(jié)合片段。通常，片段與作為片段來(lái)源的完整抗體競(jìng)爭(zhēng)與抗原片段的特異結(jié)合，所述抗原片段包括分開(kāi)的重鏈，輕鏈Fab，F(xiàn)ab'F(ab')2，F(xiàn)abc和Fv。通過(guò)重組DNA技術(shù)或者通過(guò)酶或者化學(xué)分離完整的免疫球蛋白來(lái)產(chǎn)生片段。術(shù)語(yǔ)"抗體"還包括一種或者多種免疫球蛋白鏈，該免疫球蛋白鏈與其他蛋白化學(xué)結(jié)合，或者與其他蛋白表達(dá)為融合蛋白。術(shù)語(yǔ)"抗體"還包括雙特異性(bispecific)抗體。雙特異性或者雙功能抗體是一種人工雜交抗體，具有兩個(gè)不同的重/輕鏈對(duì)和兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)。可以通過(guò)各種方法包括雜交瘤融合或者Fab'片段連接產(chǎn)生雙特異性抗體。參見(jiàn)，例如，Songsivilai&Lachmann，Clin.Exp.Immunol,79:315-321(1990);Kostelny等人，J.Immunol.148，1547-1553(1992)?？贵w可以用作流感A感染和其亞型，尤其是禽流感A感染的預(yù)測(cè)和診斷的試劑(例如，在預(yù)包裝的試劑盒中)?？梢杂酶鞣N方法預(yù)測(cè)和診斷流感A感染。A.泛反應(yīng)性(Pan-reactive)抗體泛皿性或者泛特異性(pan-specific)抗體是單克隆或者多克隆抗體，它們與任意和所有的流感A病毒NS1蛋白結(jié)合，或者，與超過(guò)3種流感NS1蛋白結(jié)合，或者更優(yōu)選的超過(guò)5種。優(yōu)選，泛反應(yīng)性或者泛特異性抗體識(shí)別至少下列3種流感A株H5N1，H3N2和H1N1。泛反應(yīng)性抗體可用于鑒定流感A病毒的存在但不能鑒定它是何種亞型。因此，泛皿性單克隆抗體可以特異識(shí)別NS1蛋白的保守區(qū)，或者可以識(shí)別兩種或更多種NS1蛋白或者特異NS1PL類的PL區(qū)。優(yōu)選的NS1蛋白的保守區(qū)例如可以在RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)，在國(guó)家生物技術(shù)信息中心(theNationalCenterforBiotechnologyInformation)的網(wǎng)址上顯示為NCBIIVNS1ABP。然而，已經(jīng)顯示的PL區(qū)在病毒亞型之間是不同的，有可能鑒定出結(jié)合NS1區(qū)超過(guò)一種PL的單克隆抗體。但是，泛反應(yīng)性抗體的其他實(shí)施方式包括多克隆抗體和/或單克隆抗體的混合物，其作為一個(gè)整體來(lái)看能夠鑒定全部或者很多流感A病毒。這些抗體能夠識(shí)別NS1蛋白的保守或者非保守區(qū)。如果抗體識(shí)別NS1PL區(qū)，抗體混合物優(yōu)選識(shí)別還包含PL區(qū)的NS1:ESEV(SEQIDNO:2),ESEI(SEQIDNO:3)，ESKV(SEQIDNO:4),TSEV(SEQIDNO:5),GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7)，RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:IO),NICI(SEQIDNO:ll),TICI(SEQIDNO:12)，RICI(SEQIDNO:13),DMAL(SEQIDNO:14),DMTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18)，SEV，SEI,SKV和SKI。如果使用超過(guò)一種抗體和/或PDZ蛋白，PDZ蛋白優(yōu)選是至少一種選自表1或者2的蛋白，并且抗體優(yōu)選模擬至少一種PDZ蛋白。。B.PDZ蛋白的單克隆抗體替代品(surrogates)如上面和實(shí)施例中所示，存在多種識(shí)別并結(jié)合NS1蛋白上PL模體的PDZ蛋白。識(shí)別相同模體的抗體也可以用作這些PDZ蛋白的替代品。優(yōu)選，PDZ蛋白是下列的一種外膜蛋白，PSD95(PDZ#2);PSD95(PDZ#1,2,3);DLGl(PDZ#1);DLGl(PDZ#1,2);DLGl(PDZ#2);DLG2(PDZ#1);DLG2(PDZ#2);Magi3(PDZ#1);PTN3(PDZ#1);MAST2(PDZ#1);NeDLG(PDZ#1，2);Shankldl;Shank2dl;Shank3dl;Syntrophinla;Syntrophin化Magil(PDZ#1);Magil(PDZ#4);Tipl;PTPLl(PDZ#1);Mint3(PDZ#1);LymMystique(PDZ#1);DLG2(PDZ#3);MUPPl(PDZ#8);NeDLG(PDZ#1);DLG5(PDZ#1);PSD95(PDZ#1);NumBP(PDZ#3);LIMK1(PDZ#1);KIAA0313;DLGl(PDZ#2);Syntenin(PDZ弁2);Pickl或者類似物或者片段。更優(yōu)選，抗體模擬特異識(shí)別PLESEV(SEQIDNO:2)的任意PDZ蛋白。識(shí)別特異NS1PL模體的抗體替代品可命名為NS1PL類別-特異的。C.抗體和其他結(jié)合劑的混合物抗體和PDZ蛋白(和/或適配體)的混合物可用于任何分析。PDZ蛋白和抗體可以用于NS1不同亞型的鑒定，流感A病毒的鑒定，鑒別出與較低致病形式比較的致病形式。在一些分析中，混合抗體和PDZ蛋白，共同施用于一個(gè)樣本。在其他分析中，抗體和PDZ蛋白是分離的，以便結(jié)合不同的樣本以鑒定兩個(gè)不同的亞型或者對(duì)亞型的鑒定進(jìn)行確認(rèn)。VIII.適配體適藍(lán)體是在體外從大量隨機(jī)序列種群選擇的RNA或者DNA分子，通過(guò)形成結(jié)合袋(bindingpockets)識(shí)別特異的配體。變構(gòu)核糖酶是RNA酶，其活性通過(guò)效應(yīng)子分子與適顯體結(jié)構(gòu)域的結(jié)合而調(diào)節(jié)，所述適愿體結(jié)構(gòu)域位于活性位點(diǎn)外。這些RNA作為精確的分子開(kāi)關(guān)，受特異效應(yīng)子存在或者缺失的控制。適藍(lán)體能夠結(jié)合核酸，蛋白，甚至完整的生物體。適藍(lán)體不同于抗體，然而它們模擬抗體在各種診斷形式中的性質(zhì)。因此，適M體可以用于替代抗體和/或PDZ蛋白，或者與抗體和/或PDZ蛋白聯(lián)用，鑒定一般和特異NS1PL區(qū)的存在。IX.NS2序列和致病性的相關(guān)性流感A的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2都是由相同基因利用不同的剪接產(chǎn)生的。發(fā)生的剪接類型導(dǎo)致NS1和NS2蛋白羧基末端的差異。就NS1來(lái)說(shuō)，這導(dǎo)致羧基末端特殊的PL，而NS2在C端沒(méi)有PL。因?yàn)镹S1中PL區(qū)的特異序列能與致病性有關(guān)，對(duì)NS2蛋白的變化分析任意類型的相關(guān)性。分析致病株中由剪接產(chǎn)生的NS2序列，與那些不具有致病性比較進(jìn)行分析。表12和13在蛋白水平和核苷酸水平對(duì)序列進(jìn)行了分析。這些表顯示70位的甘氨酸到絲氨酸的取代與病毒的致病性和/或毒性高度相關(guān)，特別是關(guān)于1918年大流行的H1N1株。利用H5N1株描述了示范性的NS2序列，如國(guó)家生物技術(shù)信息中心(wWw.ncbi.gov)所述，例如AF144307，并且當(dāng)序列最大限度地比對(duì)時(shí)，并且對(duì)相應(yīng)的其他NS2蛋白進(jìn)行氨基酸和編碼氨基酸密碼子的編號(hào)。因?yàn)檫@種相關(guān)性，鑒定出一種方法，該方法利用NS2在Ser70處的多態(tài)性作為單獨(dú)的試驗(yàn)來(lái)分析一種給定的流感八株是否是致病性的。該方法還可用于鑒定特異流感株?；蛘撸琋S2多態(tài)性可以和此處公開(kāi)的NS1試驗(yàn)聯(lián)用，鑒定致病性或者確認(rèn)以不同方法鑒定的致病性。篩選NS2蛋白中Ser70序列變化的方法包括鑒定蛋白水平或者核苷酸水平變化的方法。1.基于蛋白的診斷試驗(yàn)本發(fā)明提供基于蛋白的診斷試驗(yàn)，以鑒定包括Ser70的NS2蛋白的存在，用于鑒定流感A病毒、流感A病毒株和致病性的流感A病毒株。利用NS2中Ser70多態(tài)性序列的診斷試驗(yàn)可以使用與NS1分析中相同的形式(參見(jiàn)章節(jié)vni和其他相關(guān)的章節(jié))。該試驗(yàn)鑒定位置70處絲氨酸的存在，如果絲氨酸存在，鑒定流感株為致病性的。如果絲氨酸不存在，則鑒定流感株為非致病性的。識(shí)別NS2蛋白中絲氨酸70變化的單克隆或者多克隆抗體可用于鑒定一種流感株為流感A，能夠鑒定特異流感A株，并且能夠鑒定一種病毒是否是致病性的?？梢援a(chǎn)生NS2抗體以識(shí)別絲氨酸70的存在，并可用于鑒定致病性的株。例如，能夠利用表12或者13中提供的肽產(chǎn)生抗體，所述抗體針對(duì)70位具有絲氨酸的NS2區(qū)。然后篩選絲氨酸70抗體以確定它們是否與70位具有甘氨酸或者其他氨基酸的肽發(fā)生交叉反應(yīng)?；蛘?，可以產(chǎn)生針對(duì)各病毒株識(shí)別包括絲氨酸70的特異序列的抗體，產(chǎn)生株-特異抗體(還可參見(jiàn)為NS1抗體提供的章節(jié)VIII)。在一些試驗(yàn)中，抗體用于鑒定一種病毒株為致病性的。在一些試驗(yàn)中，NS2抗體可代替NS1抗體。在一些試驗(yàn)中，NS2抗體與NS1抗體在任何使用NS1蛋白的試驗(yàn)中聯(lián)用。NS2抗體可用于鑒定特異性流感A病毒，鑒定一種病毒為流感A病毒，或者鑒定一種病毒是致病性的。或者，其他結(jié)合劑可用于替代抗體，例如通過(guò)噬菌體展示文庫(kù)技術(shù)選擇的肽。2.核酸診斷試驗(yàn)本發(fā)明還提供基于核酸的診斷試驗(yàn)，以鑒定編碼包括Ser70的蛋白的NS2核酸的存在。這些試驗(yàn)可以用于鑒定流感A病毒，流感A病毒株，和致病性的流感A病毒株。該診斷試驗(yàn)使用一種序列，該序列包括在各種形式的NS2中編碼Ser70的密碼子。例如，該診斷試驗(yàn)可以使用與編碼Ser70序列互補(bǔ)的探針或者引物。優(yōu)選，使用編碼表12中鑒定的肽的序列。如果絲氨酸70被鑒定為存在，則鑒定流感病毒為致病性的。檢測(cè)NS2中多態(tài)性的方法。能夠通過(guò)幾種方法確定樣本中堿基的同一性，所述堿基占據(jù)NS2核酸的包括表12所示Ser-70的序列，所述方法依次進(jìn)行描述。A.單堿基延伸方法例如，US5,846,710，US6,004,744,US5，888，819和US5,856,092描述了單堿基延伸方法。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，該方法通過(guò)與靶序列S補(bǔ)的引物雜交起作用，使得引物的3'端立即緊鄰但不跨越靶序列的潛在變異位點(diǎn)。也就是說(shuō)，該引物包括耙多核苷酸互補(bǔ)序列的子序列，所述子序列終止在緊鄰多態(tài)性位點(diǎn)5'端的堿基。雜交在一種或者多種標(biāo)記核苷酸存在的條件下進(jìn)行，所述標(biāo)記核苷酸與可能占據(jù)潛在變異位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)。例如，對(duì)于編碼NS2Ser70多態(tài)性的序列，可以使用一種或者多種標(biāo)記的核苷酸引物。針對(duì)各多態(tài)性的引物能夠包括不同的標(biāo)記以區(qū)分多態(tài)性。優(yōu)選，引物重疊或者部分編碼剪接位點(diǎn)。這表示剪接位點(diǎn)或者多態(tài)性區(qū)域的一些部分包含在引物中，優(yōu)選Ser70位點(diǎn)。在一些方法中，尤其是使用多重差異標(biāo)記的核苷酸的方法中，核苷酸是雙脫氧核苷酸。如果存在與占據(jù)靶序列中變異位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)的核苷酸，則在允許引物延伸的條件下進(jìn)行雜交。延伸合并標(biāo)記的核苷酸，從而產(chǎn)生標(biāo)記的延伸引物。如果使用多重差異標(biāo)記的核苷酸并且目標(biāo)是雜合體，則可以獲得多重差異標(biāo)記的延伸引物。檢測(cè)延伸的引物，提供指示哪些堿基占據(jù)目標(biāo)多核苷酸中的變異位點(diǎn)。B.等位基因-特異性探針例如Saiki等人(Nature324,163-166(1986);Dattagupta，EP235,726，Saiki,WO89/11548描述了用于分析多態(tài)性的Mit的設(shè)計(jì)和使用。利用該公開(kāi)的內(nèi)容，可以將探針設(shè)計(jì)為識(shí)別包括Ser70多態(tài)性的特定序列，所述特定序列與一種類型病毒或者病毒株的靶DNA片段雜交，而不與其他類型病毒或者病毒株的相應(yīng)片段雜交，這是由于兩種病毒中各自片段中存在的不同多態(tài)性形式造成的。雜交條件應(yīng)該足夠嚴(yán)謹(jǐn)，使Ser70區(qū)的等位基因之間的雜交強(qiáng)度存在顯著差異，優(yōu)選基本二元的反應(yīng)(binaryresponse)，其中探針只與一種等位基因雜交。一些探針設(shè)計(jì)為與靶DNA的片段雜交，使得Ser70的多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)探針的中心位置(例如，15mer中的第7位；16mer中的第8或者9位)。這種探針設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了來(lái)自不同病毒和/或株的編碼NS2蛋白的不同核酸之間雜交的良好區(qū)分。這些探針經(jīng)常成對(duì)使用，對(duì)子中的一個(gè)成員表現(xiàn)出與耙序列的一種參照形式完全匹配，而另一成員表現(xiàn)出與變異體形式或者不同的參照形式完全匹配。然后可以將幾對(duì)探針固定在相同的支持物上，用于相同靶序列內(nèi)多重多態(tài)性的同時(shí)分析。還可以通過(guò)與核酸陣列雜交鑒別多態(tài)性，W095/11995描述了其中的一些實(shí)例(在此完整引入作為參考用于所有目的)。C.等位基因特異的擴(kuò)增方法等位基因-特異性引物與靶DNA中重疊多態(tài)性的位點(diǎn)雜交，并且引物只擴(kuò)增與引物表現(xiàn)出完全互補(bǔ)的等位基因形成。參見(jiàn)Gibbs，NucleicAcidRes.17,2427-2448(1989)。這種引物與在遠(yuǎn)端位點(diǎn)雜交的第二引物聯(lián)用。擴(kuò)增起始于兩個(gè)引物，產(chǎn)生可檢測(cè)的產(chǎn)物，提示存在特異的等位基因形式。通常用第二對(duì)引物作為對(duì)照，其中一個(gè)在多態(tài)性位點(diǎn)顯示單個(gè)堿基錯(cuò)配，另一個(gè)顯示與遠(yuǎn)端位點(diǎn)的完全互補(bǔ)。單堿基錯(cuò)配阻止擴(kuò)增，沒(méi)有形成可檢測(cè)的產(chǎn)物。在一些方法寧，錯(cuò)配包括在與多態(tài)性相關(guān)的寡核苷酸的3'-端位置，因?yàn)檫@個(gè)位置對(duì)于從引物延長(zhǎng)是最不穩(wěn)定的。參見(jiàn)，例如，WO93/22456。在這種情況下，可以將等位基因特異引物設(shè)計(jì)為與NS2的剪接位點(diǎn)重疊，包括Ser70位置。D.直接測(cè)序本發(fā)明NS2多態(tài)性序列的直接分析可以利用雙脫氧鏈終止法或者M(jìn)axam-Gilbert方法實(shí)現(xiàn)(參見(jiàn)Sambrook等人，MolecularCloning,ALaboratoryManual(第二版，CSHP,NewYork1989);Zyskind等人，RecombinantDNALaboratoryManual,(Acad.Press,1988))。)E.變性梯度凝膠電泳利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物可以利用變性梯度凝膠電泳進(jìn)行分析。根據(jù)DNA在溶液中序列依賴性的不同熔解性質(zhì)和電泳遷移，可以鑒定NS2Ser70多態(tài)性的不同等位基因。Erlich編著，PCRTechnology,PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification,(W.H.FreemanandCo,NewYork,1992),Chapter7。F.單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析耙序列的等位基因可以利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析進(jìn)行區(qū)分，所述單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析通過(guò)單鏈PCR產(chǎn)物電泳遷移的變化鑒定堿基差異，如Orita等人描述，Pro"Nat.Acad.Sci.86，2766-2770(1989)。如上所述能夠產(chǎn)生擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，加熱或者變性，形成單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物。單鏈核酸可以重新折疊或形成部分取決于堿基序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物不同的電泳遷移率可能與靶序列等位基因之間的堿基序列差異相關(guān)。3.NS2治療劑一此處公開(kāi)的篩針對(duì)NSl和PDZ蛋白的抗病毒治療劑和篩選抗病毒治療劑的方法同樣可以用于鑒定NS2的結(jié)合伴侶，鑒定阻斷NS2和結(jié)合伴侶之間相互作用的治療劑，和治療毒性流感A感染的患者。(參見(jiàn)章節(jié)XI藥物組合物)。鑒定針對(duì)NS2的治療劑的靶標(biāo)包括，在包含Ser70的重疊區(qū)阻斷結(jié)合伴侶和NS2相互作用的試劑，阻斷NS2PL(內(nèi)部位點(diǎn))和PDZ結(jié)合伴侶之間相互作用的試劑，和磷酸化Ser70的絲氨酸激酶，導(dǎo)致抑制相互作用。X.診斷試驗(yàn)本發(fā)明的實(shí)施方式提供診斷捕獲劑和檢測(cè)劑，它們可用于在各種不同類型的生物樣本中鑒定流感A病毒和其產(chǎn)物的檢測(cè)法。可用于檢測(cè)流感病毒的代表性試驗(yàn)形式包括酶聯(lián)固相吸附試驗(yàn)，放射性標(biāo)記結(jié)合試驗(yàn)，PDZ-和PL-結(jié)合試驗(yàn)，時(shí)間分辨PDZ和PL熒光試驗(yàn)，以及，夾心和酶-級(jí)聯(lián)試驗(yàn)形式。示例性的方法，可以從免疫測(cè)定領(lǐng)域用于該試驗(yàn)的方法修改，包括均相和多相試驗(yàn)形式；競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)形式；酶連接固相試驗(yàn)形式，熒光試驗(yàn)形式，時(shí)間分辨熒光試驗(yàn)形式，生物發(fā)光試驗(yàn)形式，級(jí)聯(lián)酶試驗(yàn)等等。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，一種或者多種PDZ蛋白被用作捕獲劑從生物樣本分離一種或者多種PL分析物。在其它可選的實(shí)施方式中，一種或者多種PDZ蛋白與一種或者多種信號(hào)發(fā)生化合物結(jié)合，用作鑒定生物樣本中一種或者多種PL分析物的存在或者量的檢測(cè)劑。在其他實(shí)施方式中，PL蛋白和PL肽與信號(hào)發(fā)生化合物(PL-SGC)結(jié)合，用于競(jìng)爭(zhēng)性配體抑制試驗(yàn)，即，其中病毒PL的存在與一種或者多種PL-SGC競(jìng)爭(zhēng)與PDZ的結(jié)合。優(yōu)選，PDZ蛋白是下列至少一種外膜蛋白，PSD95(PDZ#2);PSD95(PDZ#1,2,3);DLG1(PDZ#1);DLG1(PDZ#1,2);DLG1(PDZ#2);DLG2(PDZ#1);DLG2(PDZ#2);Magi3(PDZ#1);PTN3(PDZ#1);MAST2(PDZ#1);NeDLG(PDZ#1,2);Shankldl;Shank2dl;Shank3dl;Syntrophinla;Syntrophin化Magil(PDZ#1);Magil(PDZ#4);Tipl;PTPL1(PDZ#1);Mint3(PDZ#1);LymMystique(PDZ#1);DLG2(PDZ#3);MUPPl(PDZ#8);NeDLG(PDZ#1);DLG5(PDZ#1);PSD95(PDZ#1);NumBP(PDZ#3);LIMK1(PDZ弁l);KIAA0313;DLGl(PDZ#2);Syntenin(PDZ#2);Pickl或者類似物或者片段。對(duì)那些常規(guī)鑒定流感A的試驗(yàn)，可以使用PDZ蛋白和抗體的混合物。對(duì)于這些試驗(yàn)，PDZ蛋白可能包括將上述一種蛋白與識(shí)別其他病原體特異的或者流感A特異的PL模體的其他蛋白混合。本發(fā)明提供檢測(cè)樣本中病原體PL蛋白的方法，并發(fā)現(xiàn)其在診斷對(duì)象病毒感染中的用途。在許多實(shí)施方式中，從受試者處獲得生物樣本,檢測(cè)樣本中病原體PL蛋白的存在。樣本中可檢測(cè)量的病原體PL蛋白的存在表明個(gè)體感染了特定病毒。在其他實(shí)施方式中，檢測(cè)生物樣本中病原體PL蛋白的水平，與樣本中的對(duì)照量進(jìn)行比較。樣本中病原體PL蛋白的相對(duì)量指示病原體感染的嚴(yán)重性。該方法通常包括對(duì)流感APL蛋白特異的兩種結(jié)合伴侶，其中一個(gè)是如上所述的PDZ結(jié)構(gòu)域多肽。通常，該方法包括a)利用結(jié)合伴侶之一從樣本分離病原體PL，和b)用另一種結(jié)合伴侶檢測(cè)病原體PL蛋白。對(duì)亞型特異性試驗(yàn)或者NS1PL類別特異性試驗(yàn)，待鑒定的PL優(yōu)選是下面一種ESEV(SEQIDNO:2),ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4),TSEV(SEQIDNO:5),GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7),RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:10),NICI(SEQIDNO:ll),TICI(SEQIDNO:12)'RICI(SEQIDNO:13),DMAL(SEQIDNO:14)，DMTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17)，SICL(SEQIDNO:18),SEV，SEI，SKV和SKI。對(duì)亞型特異性試驗(yàn)，使用的PDZ蛋白優(yōu)選是下面的至少—種PSD95(PDZ#2);PSD95(PDZ#1,2,3);DLG1(PDZ#1);DLG1(PDZ弁1,2);DLG1(PDZ弁2);DLG2(PDZ弁l);DLG2(PDZ#2);Magi3(PDZ#1);PTN3(PDZ#1);MAST2(PDZ#1);NeDLG(PDZ#1，2);Shankldl;Shank2dl;Shank3dl—;Syntrophinla;Syntrophinyl;Magil(PDZ#1);Magil(PDZ糾)；Tipl;PTPLl(PDZ#1);Mint3(PDZ#1);LymMystique(PDZ#1);DLG2(PDZ#3);MUPPl(PDZ#8);NeDLG(PDZ#1);DLG5(PDZ#1);PSD95(PDZ#1);NumBP(PDZ#3);LIMK1(PDZ#1);KIAA0313;DLG1(PDZ#2);Syntenin(PDZ#2);Pickl或者類似物或者片段。NSIPL可以高度預(yù)測(cè)病毒的H和A抗原和亞型。對(duì)病原體特異性試驗(yàn)，待鑒定的NS1PL優(yōu)選是下面的至少一種ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3)，ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6)，RSEV(SEQIDNO:7),RSKV(SEQIDNO:8)，GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:10)，NICI(SEQIDNO:11)，TICI(SEQIDNO:12)，RICI(SEQNO:13),DMAL(SEQIDNO:14),DMTL(SEQIDNO:15),DI^JL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17)，SICL(SEQIDNO:18),SEV，SEI,SKV和SKI。對(duì)病原體特異性試驗(yàn)，使用的PDZ蛋白優(yōu)選是選自表l或者2中的至少一種或者類似物或者片段。對(duì)流感A特異性試驗(yàn)，待鑒定的NS1PL優(yōu)選是下面的至少一種ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3)，ESKV(SEQIDNO:4),TSEV(SEQIDNO:5),GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7),RSKV(SEQIDNO:8)，GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:10)，NICI(SEQIDNO:11),TICI(SEQIDNO:12)，RICI(SEQIDNO:13)，DMAL(SEQIDNO:14)，畫(huà)TL(SEQIDNO:15),DIAL(SEQIDNO:16)，DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18)，SEV，SEI,SKV和SKI。對(duì)病原體特異性試驗(yàn)，使用的PDZ蛋白優(yōu)選是選自表1或者2中的至少一種或者類似物或者片段。A.ELISA夾心多相分析形式如下面實(shí)施例部分所述，利用該P(yáng)DZ捕獲和單克隆抗NS1，構(gòu)建檢測(cè)生物樣本中高危流感A株的夾心分析形式。當(dāng)前皿的靈敏度范圍在l-l，000ng/ml之間即，對(duì)商業(yè)用于檢測(cè)生物樣本中流感A病毒類型或者量具有足夠的靈敏度，注意下列告誡艮口，a)免疫測(cè)定法能夠區(qū)別流感AH5N1，H1N1和H3N2株的NS1蛋白；b)不同分析形式的交叉反應(yīng)模式不同，并還取決于待檢測(cè)的特定流感A株，以及，包含細(xì)胞裂解產(chǎn)物的生物樣本中的絕對(duì)靈敏度；和，c)在診斷設(shè)備領(lǐng)域中確定不同分析形式的檢測(cè)限現(xiàn)在是相對(duì)常規(guī)的。盡管可以確定可能用于本方法的各種競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性分析形式，但現(xiàn)在優(yōu)選是夾心分析形式，因?yàn)橐呀?jīng)證明這些分析具有性能特征和各種良好建立的(wellestablished)信號(hào)放大策略。在當(dāng)前優(yōu)選的夾心免疫測(cè)定實(shí)施方式中，使用特異的高親合力非天然PDZ蛋白捕獲生物樣本中的天然病毒NS1抗原；用抗NS1小鼠單克隆抗體檢測(cè)結(jié)合的NS1抗原；和，利用信號(hào)發(fā)生化合物檢測(cè)結(jié)合的抗NS1抗體的存在，例如用偶聯(lián)酶的第二抗體(例如，偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的抗體；HRP)或者生物素化的第二抗體和鏈霉親和素-酶偶聯(lián)物(例如，HRP)。通常，本發(fā)明的方法包括以下步驟(i)利用第一結(jié)合劑即捕獲劑，從復(fù)雜生物樣本中分離(separating)(即，分離(isolating))天然病毒PL蛋白分析物；和，(ii)利用第二結(jié)合劑即檢測(cè)劑，檢測(cè)分離的PL分析物。分離和檢測(cè)步驟可以利用結(jié)合伴侶實(shí)現(xiàn)，所述結(jié)合伴侶對(duì)PL分析物具有不同水平的特異性，例如，如果捕獲劑是高特異性的，則可以要求檢測(cè)劑是較低特異性的，反之亦然。在某些實(shí)施方式中，捕獲劑優(yōu)選是PDZ結(jié)構(gòu)域多肽。更優(yōu)選，捕獲劑是表l和/或表2所列的一種。在其他實(shí)施方式中，第一結(jié)合伴侶是抗病原體PI^蛋白抗體或者抗體的混合物，條件是在這些實(shí)施方式中檢測(cè)劑的至^一種組分是PDZ多肽，例如，與捕獲/分離的PL分析物結(jié)合并且然后利用偶聯(lián)信號(hào)發(fā)生化合物的抗PDZ抗體檢測(cè)復(fù)合物中PL分析物的存在的PDZ蛋白檢測(cè)劑。在某些當(dāng)前優(yōu)選的實(shí)施方式中，直接的或者通過(guò)連接子，將PDZ捕獲劑結(jié)合在固相上。例如，在一個(gè)非限制性實(shí)施例中，PDZ結(jié)構(gòu)域多肽結(jié)合磁珠。在后面的實(shí)施例中，當(dāng)接觸生物樣本時(shí)，固定在磁珠上的PDZ捕獲劑能夠與樣本中的流感病毒PL蛋白有效形成PDZ-PL相互作用復(fù)合物。然后，施加磁場(chǎng)，從樣本分離包含結(jié)合的流感病毒PL的相互作用復(fù)合物。在另一個(gè)非限制性實(shí)施例中，將PDZ結(jié)構(gòu)域多肽捕獲劑固定在微量滴定板的表面上；將包含流感PL的生物樣本與固定的捕獲劑接觸，導(dǎo)致PL與板表面的結(jié)合；用緩沖液洗板，從板上去除非PL病毒分析物；和，因此，固定的PL分析物從生物樣本分離。各種分離(separation)/分離(isolation)方法都是已知的，例如，利用磁場(chǎng)、洗滌等等。采用的特定方法取決于特定的分析形式。例如，可以通過(guò)許多不同的方法進(jìn)行分離，包括但不限于洗滌；磁性方法；離心；過(guò)濾；層析法，包括分子篩、離子交換和親合層析；在電場(chǎng)中分離；毛細(xì)管作用例如在側(cè)向流測(cè)試條中；免測(cè)沉淀法；和，下面公開(kāi)的類似方法。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)將等份的生物樣本接觸測(cè)試條的一端，然后讓蛋白在測(cè)試條上遷移，例如通過(guò)毛細(xì)管作用例如側(cè)向流，從生物樣本中的其他病毒和細(xì)胞蛋白分離流感PL蛋白。該方法不同于先前的免疫測(cè)定法，因?yàn)樵诖嬖谝环N或者多種PDZ多肽試劑，抗體，和/或適配體的測(cè)定法中，例如，作為捕獲和/或檢測(cè)劑，這給予該測(cè)定法特異鑒定高危流感A病毒株的存在或者量的能力。該方法不同于先前的免疫測(cè)定法，在于以下事實(shí)它們鑒定存在于患者樣本中的病毒蛋白，而不是抗體。用于側(cè)向流分離、檢測(cè)和定量的方法和裝置是本領(lǐng)域已知的，例如，美國(guó)專利號(hào)6,942,981，5,569,608;6,297,020;和6,403,383，在此完整引入作為參考。在一個(gè)非限制性實(shí)施例中，測(cè)試條包括用于上樣的近端區(qū)域(上樣區(qū))和包含PDZ多肽捕獲劑和緩沖試劑和添加劑的遠(yuǎn)端試驗(yàn)區(qū)，所述緩沖試劑和添加劑適于遷移生物樣本中PDZ多肽和任意流感PL蛋白之間的結(jié)合相互作用。在其他實(shí)施方式中，測(cè)試條包括兩個(gè)試驗(yàn)區(qū)域，該區(qū)域包含不同的PDZ結(jié)構(gòu)域多肽，即，每個(gè)能夠特異地與不同的流感PL蛋白分析物相互作用。根據(jù)上面公開(kāi)的方法，從生物樣本中的其他蛋白分離流感PL蛋白分析物，即，采用這種方法使樣本中的分析物適合于檢測(cè)和/或定量。，利用PDZ多肽、偶聯(lián)信號(hào)發(fā)生化合物的PDZ多肽、抗體、適配體等等，本發(fā)明的實(shí)施方式提供檢測(cè)分離的流感PL蛋白的新方法。根據(jù)其他實(shí)施方式，利用對(duì)病原體PL蛋白特異的抗體，例如偶聯(lián)信號(hào)發(fā)生化合物的抗體，檢測(cè)與PDZ捕獲劑、抗體和/或適配體結(jié)合的流感PL分析物。當(dāng)然，各種檢測(cè)方法是診斷領(lǐng)域己知的，并且本(非限制性)公開(kāi)的目的不是為了闡明所有可選的公知方法。而是，本公開(kāi)是為了滿足闡明實(shí)施本發(fā)明最佳方式的要求，并作為可選方法的綜合參考指導(dǎo)。在某些實(shí)施方式中，在均相分析形式中，即，無(wú)需分離步驟，用偶聯(lián)了SGC(信號(hào)發(fā)生化合物)的PDZ結(jié)構(gòu)域檢測(cè)樣本中病原體PL蛋白分析物的存在。在該分析中，PL與PDZ結(jié)構(gòu)域的結(jié)合誘導(dǎo)SGC產(chǎn)生信號(hào)的變化，例如，熒光各向異性的變化。-在其他實(shí)施方式中，多相固相檢測(cè)模型(上文公開(kāi))可用于檢測(cè)生物樣本中的流感PL分析物。如上文背景部分所述，PDZ蛋白與包含PL的細(xì)胞蛋白結(jié)合。同樣地，在感染細(xì)胞中，包含PL的流感病毒蛋白與宿主細(xì)胞的PDZ蛋白結(jié)合。盡管通常預(yù)期這些相互作用將在診斷分析形式中競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，但在此還提供以下指導(dǎo)，即出乎意料地，這些后來(lái)天然相互作用的親合力和質(zhì)量平衡是非常弱的，或者在去污劑提取的細(xì)胞裂解產(chǎn)物中是被充分破壞的，或在該診斷分析形式中流感PL分析物是可檢測(cè)的。因此，在存在的去污劑例如Tween-20或者TritonX100小于約0.5%的條件下；優(yōu)選，小于約0.2%;和，最優(yōu)選，于大約0.1%的條件下，可以制備和測(cè)定裂解產(chǎn)物。在某些實(shí)施方式中，樣本中病毒PL蛋白的水平可以被定量和/或與對(duì)照進(jìn)行比較。合適的陰性對(duì)照樣本例如從已知是健康的個(gè)體獲得，例如，已知沒(méi)有流感病毒感染的個(gè)體。特異性對(duì)照可以從已知患有流感B感染的個(gè)體，或者感染較低毒性流感株，例如，H1N1、H3N2等等的個(gè)體收集。對(duì)照樣品可以來(lái)自與待測(cè)對(duì)象有遺傳關(guān)系的個(gè)體，但還可以來(lái)自遺傳無(wú)關(guān)的個(gè)體。合適的陰性對(duì)照樣本還可能是來(lái)自個(gè)體在感染早期的收集的樣本，即，時(shí)間點(diǎn)比取得待測(cè)樣本的時(shí)間點(diǎn)早。本發(fā)明的實(shí)施方式還包括非感染性陽(yáng)性對(duì)照，即，具有高危流感A病毒PL的氨基酸序列的重組蛋白。.初始Western印跡，(參見(jiàn)下面的實(shí)施例部分)，顯示生物樣本中NS1水平足以允許在各種不同的可行免疫分析形式中檢測(cè)這些抗原。但是，應(yīng)證明特定生物樣本中的NS1水平對(duì)于在特定免疫分析形式中檢測(cè)是有限的，然后，作為另一種選擇性的實(shí)施方式，通過(guò)體外感染細(xì)胞來(lái)擴(kuò)增生物樣本中的活病毒，即，病毒擴(kuò)增樣本中的NS1蛋白應(yīng)該在大約6小時(shí)到大約12小時(shí)內(nèi)可以檢測(cè)到。在其它的選擇性實(shí)施方式中，用于提高生物樣本和病毒擴(kuò)增樣本中NS1抗原收率的方法包括利用蛋白酶抑制劑和蛋白酶體抑制劑，例如MG132。B.試劑的制備PL肽，PDZ結(jié)構(gòu)域多肽，和適配體可以通過(guò)本領(lǐng)域己知的合成(即，利用設(shè)備)或者利用重組方法制備。例如，用于重組蛋白表達(dá)的方法和條件是本領(lǐng)域公知的，例如，參見(jiàn)Sambrook，上文，和Ausubel，上文。Wi畫(huà)cker"FromGenestoClones,VCHPublishers,N.Y.，N.Y.,1987";和Ausubel,上文，綜合討論了利用哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)多肽的用途。2003年7月29日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)10/630,590和公布為US20040018487和美國(guó)專利序列號(hào)6,942,981中也公開(kāi)了結(jié)合分析的細(xì)節(jié)?；诩?xì)胞的分析通常包括利用重組表達(dá)系統(tǒng)，共同產(chǎn)生(即，在相同細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，不管它們產(chǎn)生的時(shí)間)該P(yáng)DZ結(jié)構(gòu)域多肽和流感PL。用于在真核細(xì)胞中產(chǎn)生該多肽的合適細(xì)胞公開(kāi)在下面的實(shí)施例部分。有可能適于表達(dá)該P(yáng)DZ結(jié)構(gòu)域多肽和流感PL的細(xì)胞類型包括下列例如，猴腎細(xì)胞(COS細(xì)胞),SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVI細(xì)胞(COS-7，ATCCCRL1651);人胚腎細(xì)胞(HEK-293,Graham等人，J.GenVirol.36:59(1977));HEK-293T細(xì)胞；幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCCCCL10);中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO，Urlaub禾HChasin,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77:4216，(1980);小鼠塞爾托利細(xì)胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴腎細(xì)胞(CVIATCCCCL70);非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宮頸癌細(xì)胞(HELA,ATCCCCL2);犬腎細(xì)胞(MDCK，ATCCCCL34);布法羅大鼠肝細(xì)胞(BRL3A，ATCCCRL1442);人肺細(xì)胞(W138，ATCCCCL75);人肝細(xì)胞(hepG2，HB8065);小鼠乳腺瘤(MMT060562，ATCCCCL51);TRI細(xì)胞(Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci383:44-68(1982》;NIH/3T3細(xì)胞(ATCCCRL-1658);和小鼠L細(xì)胞(ATCCCCL-I)。其他的細(xì)胞系將是顯而易見(jiàn)的。各種各樣的細(xì)胞可得自美國(guó)典型微生物菌種保藏中心(mericanTypeCultureCollection)，10801UniversityBoulevard,Manassas,Va.20110-2209。C.樣本制備可以使用包含可檢測(cè)濃度的流感蛋白并優(yōu)選NS1的任意樣本?？墒褂脴颖镜膶?shí)例是，例如，肺滲出液，細(xì)胞提取物(呼吸器官，鼻內(nèi)上皮層)，血液，粘液，和鼻拭子。此處顯示，在豬和人的鼻拭子中能夠發(fā)現(xiàn)非常高濃度的NS1。這是令人驚奇的，因?yàn)镹Sl被認(rèn)為是一種胞內(nèi)蛋白。因此，優(yōu)選的用于NS1鑒定的樣本是鼻分泌物。實(shí)施例中顯示了PL蛋白與PDZ蛋白和域抗體的結(jié)合，該結(jié)合在高達(dá)0.05。/。SDS的存在下發(fā)生，包括0.03%和0.01%。因此，當(dāng)鼻或者其他身體分泌物不可能容易地用于側(cè)向流形式時(shí)，它可以用SDS處理。優(yōu)選，添加的SDS的量直到最終濃度為0.01%，更優(yōu)選為0.03%,甚至更優(yōu)選為0.05%。可以使用其他不干擾PDZ蛋白、抗體或者適體或者其他試劑與PL蛋白結(jié)合的去污劑和類似物?？梢允褂貌桓蓴_蛋白/蛋白相互作用的其他樣品處理方法，包括用緩沖液或者水稀釋。D.單獨(dú)或者聯(lián)用常規(guī)流感A試驗(yàn),該試驗(yàn)鑒定樣本中流感A的存在。因此，該試驗(yàn)可以使用利用抗體或者適配體等鑒定NS1保守區(qū)域存在的方法。優(yōu)選，單一單克隆抗體或者單一適配體鑒定全部NS1的變異體。當(dāng)利用識(shí)別NS1蛋白保守區(qū)域的抗體時(shí)，這是非常可能的。或者，可以使用超過(guò)一種抗體和/或適配體和/或PDZ蛋白或者其他結(jié)合劑來(lái)鑒定全部流感A亞型。該方法還可以根據(jù)NS1蛋白的存在，使用抗體和PDZ蛋白的混合物來(lái)鑒定全部流感A。常規(guī)流感A試驗(yàn)可以與更特異的試驗(yàn)聯(lián)用來(lái)分型病毒，這些試驗(yàn)可以順序或者同時(shí)進(jìn)行。如果在該試驗(yàn)中使用，還可以參見(jiàn)上面用于優(yōu)選的PL區(qū)和PDZ蛋白的泛特異抗體的說(shuō)明。E.致病性流感A試驗(yàn)該試驗(yàn)鑒定具有NS1蛋白PL模體的全部形式的病毒。此處確定了流感A的非致病株具有缺失禽類PL模體的NS1蛋白。因此，特異性鑒定致病性流感A病毒存在的方法可以鑒定包含禽類PL區(qū)的NSl的存在。一種或者多種PDZ蛋白和/或抗體可用于鑒定所有的各種PL區(qū)。例如，如果只使用PDZ蛋白，至少需要兩種PDZ蛋白來(lái)鑒定所有的NS1PL蛋白?；蛘?，使用能夠識(shí)別包含PL區(qū)的NS1蛋白的單個(gè)抗體。優(yōu)選，待鑒定的NSl的PL區(qū)是下列至少一種ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3)，ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6)，RSEV(SEQIDNO:7)，RSKV(SEQIDNO:8)，GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:10)，NICI(SEQIDNO:11)，TICI(SEQIDNO:12)，RICI(SEQIDNO:13)，DMAL(SEQIDNO:14),DMTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17)，SICL(SEQIDNO:18),SEV，SEI，SKV和SKI。優(yōu)選，待鑒定的PL區(qū)是包含禽類PL區(qū)的。優(yōu)選，一種或者多種PDZ蛋白選自表l或者2中的至少一種或者類似物或者活性片段。F.致病性A型禽流感病毒試驗(yàn)H5N1禽流感的NS1蛋白具有結(jié)合多樣化PDZ結(jié)構(gòu)域的C端序列，所述PDZ結(jié)構(gòu)域不能結(jié)合典型人流感例如H3N2的NS1。77%的禽流感H5N1分離物的NSl蛋白末端是ESEV(SEQIDNO:2)，此夕卜，ESEV(SEQIDNO:2)、ESKV(SEQIDNO:4)和ESEI(SEQIDNO:3)后兩個(gè)最常見(jiàn)的C端NS1序列，占禽流感分離物的另外17%,也與PSD-95以高親合力結(jié)合(即分別為45nM和200nM)。H3N2NSl的末端是RSKV(SEQIDNO:8)，該序列與PSD-95結(jié)合的親合力即使有的話也非常低。因此PSD-95可以用作禽流感的檢測(cè)劑，并從其他株例如H3N2區(qū)別禽流感。盡管可以使用PSD-95的任意部分，只要其具有PDZ結(jié)構(gòu)域，但PSD-95結(jié)構(gòu)域-l、-2和-3具有不同的結(jié)合特異性和親合力。作為鑒定的一部分，其中PDZ蛋白與禽流感H5N1PLs的親合力最高(參見(jiàn)實(shí)施例2和表4a-e)，發(fā)現(xiàn)PSD-95結(jié)構(gòu)域2PDZ結(jié)合的親合力最高。因此，分析中使用的PSD-95PDZ蛋白只需要包括蛋白的一種PDZ結(jié)構(gòu)域，和優(yōu)選包括至少來(lái)自結(jié)構(gòu)域2的PDZ或者足以進(jìn)行特異結(jié)合的其片段。PSD-95PDZ蛋白與樣本接觸。如果該樣本包含致病性流感病毒A，PSD-95PDZ與致病性流感病毒NS1蛋白的PL特異結(jié)合。可以使用例如圖8和11和實(shí)施例6所敘述的側(cè)向流形式，利用PDZ捕獲然后是單克隆抗體檢測(cè)，檢測(cè)禽類NS1PL蛋白。.或者，側(cè)向流形式可以使用單克隆抗體捕獲和PDZ檢測(cè)。利用一種寧者多種重組PDZ蛋白作為捕獲劑，沿著膜在特定位置沉積在膜上，可以產(chǎn)生側(cè)向流(參見(jiàn)實(shí)施例6)。側(cè)向流結(jié)果的分析可以定性或者定量的。優(yōu)選，使用來(lái)自鼻分泌物的患者樣本?？梢灶A(yù)先處理樣本，使其更容易在側(cè)向流形式使用的膜上流動(dòng)。患者樣本最初可以與偶聯(lián)信號(hào)分子的泛反應(yīng)性抗NS1單克隆抗體接觸。用于檢測(cè)的單克隆抗體優(yōu)選不與所使用PDZ蛋白相同的抗原表位結(jié)合，而是，代之以結(jié)合全部NS1蛋白共有的分離抗原表位。如果樣本中的NS1蛋白結(jié)合捕獲劑(沉積在膜上的PDZ蛋白)，PDZ蛋白在膜上沉積的位點(diǎn)出現(xiàn)條帶。利用這種側(cè)向流形式可以檢測(cè)對(duì)禽流感株特異的C端NS1模體。這些包括ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3)禾卩ESKV(SEQIDNO:4)。在一些情況下，可以使用EPEV(SEQIDNO:27)?；蛘呖梢允褂闷渌东@劑，包括只與NS1蛋白的一種PL模體特異結(jié)合的抗體。為了定性或者定量分析和為了質(zhì)量控制，可以包括下列對(duì)照的任意一種或者全部。對(duì)照帶由山羊抗小鼠抗體(GAM)組成。鑒通過(guò)將結(jié)合全部形式NS1蛋白的抗體沉積在膜上，來(lái)定是否存在任何流感A的泳道?？砂幮詫?duì)照，其包括具有除了PDZ結(jié)構(gòu)域以外全部結(jié)構(gòu)域的PSD-95蛋白。其他對(duì)照可以包括用于定量信號(hào)的對(duì)照，例如已知與膜上捕獲劑結(jié)合較弱、中等、較強(qiáng)或者根本不結(jié)合的純化形式的PL蛋白，優(yōu)選的捕獲劑是PDZ蛋白或者對(duì)一種或者多種PL特異的抗體?？梢园ㄓ糜诙啃盘?hào)的對(duì)照，以便分析結(jié)合強(qiáng)度來(lái)區(qū)別與PSD-95結(jié)合較弱或者中等的PL。例如，實(shí)施例6指出利用下列符號(hào)定量結(jié)合強(qiáng)度(-)是指沒(méi)有結(jié)合，(+)是指較弱的結(jié)合，(++)是指中等的結(jié)合和(+++)是指較強(qiáng)的結(jié)合。與特定PDZ蛋白結(jié)合的強(qiáng)度可用于區(qū)別具有NS1的H1N1，所述NS1末端是與PSD-95以中等親合力結(jié)合的RSEV。用于強(qiáng)結(jié)合的陽(yáng)性對(duì)照可以是來(lái)自H5N1的純化NS1，用于較弱結(jié)合的對(duì)照可以是來(lái)自H3N2的純化NS1，用于中等結(jié)合的對(duì)照可以是來(lái)自H1N1的純化NS1?；蛘?，可以使用其他PDZ蛋白進(jìn)一步區(qū)分結(jié)合PSD-95的株。例如，如實(shí)施例6所示，H5N1和H1N1都結(jié)合PSD-95。所以，使用INADLD8鑒定病毒株是否是H1N1或者H5N1，因?yàn)橹挥蠬1N1結(jié)合。與INADLD8的結(jié)合可以使得不容置疑地鑒定PL作為H5N1與PSD-95結(jié)合。在表4a-e和實(shí)施例2中可以發(fā)現(xiàn)結(jié)合H1N1但不結(jié)合H5N1的其他PDZ蛋白。G.特定NS1PL試驗(yàn)該試驗(yàn)通過(guò)特定NS1PL鑒定NS1PL類的特定類型。它還可以通過(guò)特定NS1PL類來(lái)鑒定亞型。雖然通常HA和NP抗原的類型與NS1PL區(qū)相關(guān)，但情況不總是這樣。有可能，例如，由于重配或者病毒能經(jīng)受的其他遺傳過(guò)程，來(lái)自例如H1N1病毒的NS1PL區(qū)可能轉(zhuǎn)移到H2N1病毒中。但是，不受特定理論限制，NS1PL區(qū)的存在可能對(duì)患者樣本中病毒的致病性更具有提示作用。這可能是因?yàn)镹S1在i染中所起的生物學(xué)作用。優(yōu)選的試驗(yàn)鑒定人的PLESEV(SEQIDNO:2)。優(yōu)選的試驗(yàn)鑒定禽流感ANS1PL，該P(yáng)Ls具有模體ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3),禾BESKV(SEQIDNO:4)。這鑒定病毒的高致病性株，并可以釆取合適測(cè)定來(lái)治療和隔離疾病。其他優(yōu)選的試驗(yàn)包括，例如，能夠使人特異鑒定NSlPL亞型的陣列。這類陣列還可以包括流感A的常規(guī)試驗(yàn)。這類試驗(yàn)還可以包括確定HA和NP蛋白類型的試驗(yàn)。優(yōu)選，待鑒定的PL是下列的一種ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5),GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7),RSKV(SEQIDNO:8)，GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:10),NICI(SEQIDNO:11),TICI(SEQIDNO:12),RICI(SEQIDNG:13),DMAL(SEQIDNG:14),DvlTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16)，DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18)，SEV，SEI,SKV和SKI.更優(yōu)選，待鑒定的NSlPL是ESEV(SEQIDNO:2)。優(yōu)選，所使用的至少一種PDZ蛋白選自表1或者2中的至少一種、片段或者類似物。更優(yōu)選，至少一種PDZ蛋白是下列的至少一種外膜蛋白，PSD95(PDZ#2);PSD95(PDZ#1,2,3);DLG1(PDZ#1);DLG1(PDZ#1,2);DLG1(PDZ#2);DLG2(PDZ#1);DLG2(PDZ#2);Magi3(PDZ#1);PTN3(PDZ#1);MAST2(PDZ#1);NeDLG(PDZ#1，2);Shank1dl;Shank2dl;Shank3dl;Syntrophinla;Syntrophin丫l;Magil(PDZ#1);Magil(PDZ#4);Tipl;PTPLl(PDZ#1);Mint3(PDZ#1);LymMystique(PDZ#1);DLG2(PDZ#3);MUPPl(PDZ#8);NeDLG(PDZ#1);DLG5(PDZ#1);PSD95(PDZ#1);NumBP(PDZ#3);LIMK1(PDZ#1);KIAA0313;DLG1(PDZ#2);Syntenin(PDZ#2);Pickl或者類似物或者片段和/或模擬任何PDZ蛋白的抗體(或者適配體)。H.血清抗體的試驗(yàn)可以在任何形式的診斷方法中使用鑒定血清抗體存在的試驗(yàn)，所述抗體結(jié)合特定的NSlPL模體和/或在70位具有絲氨酸的NS2蛋白?？梢栽趥?cè)向流或者其他形式中使用特定的包括重疊區(qū)的NS1PL肽作為捕獲劑，所述重疊區(qū)包含Ser70。I.流行環(huán)境中分析的用途分析靈敏度和特異性可以該變，以實(shí)現(xiàn)生物樣本中流感ANSI檢測(cè)的不同絕對(duì)水平，例如，通過(guò)在競(jìng)爭(zhēng)性分析形式中降低競(jìng)爭(zhēng)性配體的水平，改變夾心分析中捕獲和檢測(cè)劑的量等等。因此，本試驗(yàn)方法包括各種具有不同性能屬性的皿，以滿足不同用途中的不同要求，如下面實(shí)施例部分所述。例如，在禽類流行環(huán)境中，通常記錄到最高的PPV和陽(yáng)性試驗(yàn)結(jié)果更可能是真實(shí)的，g卩，最低的NPV和假陰性結(jié)果傾向于更可能。此外在監(jiān)控禽類對(duì)象中流感A的流行性時(shí)，將全部樣本提供給參考實(shí)驗(yàn)室用于檢驗(yàn)是目前的慣例。通過(guò)在本篩選分析中鑒定真正陽(yáng)性的樣本，例如，在野外或者護(hù)理點(diǎn)，本試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)了減少最終必須提交給參考實(shí)驗(yàn)室用于檢驗(yàn)的樣本數(shù)目的用途，即，在流行期間當(dāng)試驗(yàn)負(fù)擔(dān)高時(shí)具有特別的價(jià)值。因?yàn)槟壳岸际菍?shí)行宰殺所有動(dòng)物，而不管它們是否被感染，相對(duì)高的假陽(yáng)性率是可以接受的，但是它還必須還具有相對(duì)低的假陰性率。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供具有不同特異性、靈敏度、PPV和NPV的試驗(yàn)試劑盒，在流行期間使用，此處稱為"流行性試驗(yàn)方法"。優(yōu)選適合當(dāng)前需要，本流行性試驗(yàn)方法具有以下皿性能即，特異性大于約65%;靈敏度大于約90%;PPV大于約85。/。；NPV大于約65n/。；假陽(yáng)性值小于大約25%和假陰性率小于約5%。.相反，在禽類對(duì)象流感A發(fā)病率低的時(shí)候，通常記錄到最低的PPV，假陽(yáng)性試驗(yàn)結(jié)果更有可能，和最高的NPV，陰性試驗(yàn)結(jié)果傾向于更有可能和真實(shí)。在這些低發(fā)病率的時(shí)候，篩查目標(biāo)可以是快速鑒定可能被感染的動(dòng)物并隔離它們，直到例如在參考實(shí)驗(yàn)室中完成驗(yàn)證試驗(yàn)。因此，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供具有增強(qiáng)的靈敏度和NPV的試驗(yàn)方法，在低流感A發(fā)病率的時(shí)候使用，這時(shí)監(jiān)控是根本的，艮P，此處稱為"監(jiān)控試驗(yàn)方法"。優(yōu)選，該監(jiān)控試驗(yàn)方法具有以下分析性能-即，特異性大于約65%;靈敏度大于約90%;PPV大于約85。/o;NPV大于約65%;假陽(yáng)性率小于約20%和假陰性率小于約5%。當(dāng)該監(jiān)控試驗(yàn)方法用于篩查超過(guò)100個(gè)成員的禽群時(shí)，作為一個(gè)整體的禽群的PPV顯著高于任何特定分析中得到的預(yù)測(cè)值。因此，當(dāng)在監(jiān)控試驗(yàn)方法中得到陽(yáng)性試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，利用上文的流行性試驗(yàn)分析法重復(fù)檢測(cè)禽群成員可能證明是有益的。在人類而不是禽類中，試驗(yàn)?zāi)康漠?dāng)然是不同的。流感A感染的及時(shí)證據(jù)可能具有重要的病例管理意義，例如，盡早提示在兒童或者老年對(duì)象中施用抗病毒劑。通常對(duì)人的診斷產(chǎn)物要求高度的特異性和靈敏度，例如，大于90%的特異性和，和大于90。/。PPV的靈敏度。但是，在所定義的流行環(huán)境中，例如，游船感染，那里PPV高；假陽(yáng)性的可能性低，假陰性的可能性高；和，當(dāng)提交樣本進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)，可能需要較低的特異性例如65%，以便進(jìn)一步降低假陰性試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)目例如該值小于大約5%。J.診斷和治療試劑盒提供實(shí)施本方法的試劑盒。該試劑盒不同于免疫分析試劑盒，至少存在下列一種或者多種成分(i)PDZ結(jié)構(gòu)域多肽和(ii)打印的說(shuō)明書(shū)，用于指導(dǎo)利用PDZ結(jié)構(gòu)域多肽來(lái)鑒定生物樣本中高危流感A禽類病毒株的分析。該試劑盒允許鑒定患者樣本中的病毒蛋白而不是抗體，使其對(duì)被感染的個(gè)體更特異。該試劑盒任選包含一種或者多種試劑、緩沖液或者添加劑組合物或者上文公開(kāi)的試劑；和，在某些實(shí)施方式中，該試劑盒還可以包含對(duì)流感A病毒PL，優(yōu)選NS1特異的抗體。在其他實(shí)施方式中，該試劑盒還可以包括一種裝置，例如設(shè)備或者系統(tǒng)，用于從生物樣本的其他潛在干擾物質(zhì)中去除流感病毒PL。如果需要，該試劑盒還可以包括，一種或者多種對(duì)進(jìn)行分析有用的不同組分例如，一種或者多種分析容器；一種或者多種對(duì)照或者校準(zhǔn)試齊U;—種或者多種在其上進(jìn)行分析的固相表面；或者，一種或者多種緩沖液、添加劑或者檢測(cè)劑或者抗體；一種或者多種打印說(shuō)明書(shū)，例如包裝插入物和/或容器標(biāo)簽，標(biāo)明用于進(jìn)行分析的各組分的量，以及，用于評(píng)價(jià)分析結(jié)果的指導(dǎo)。該試劑盒能包含用于進(jìn)行各種不同類型分析形式的組分，包括例如測(cè)試條，夾心ELISA，Western印跡分析，膠乳凝集等等。該試劑盒內(nèi)的參照、對(duì)照和校準(zhǔn)物可以包含，例如，一種或者多種天然和非天然的流感PL蛋白，重組PL多肽，'合成PL肽，PDZ結(jié)構(gòu)域多肽，PDZ結(jié)構(gòu)域肽和/或用于評(píng)價(jià)本方法的性能和準(zhǔn)確度的合適比色和酶標(biāo)準(zhǔn)品。用于實(shí)施本方法的說(shuō)明書(shū)通常記錄在合適的記錄介質(zhì)上，并包括在試劑盒中，例如，作為包裝插入物。例如，說(shuō)明書(shū)可以打印在基質(zhì)例如紙或者塑料上。在其他實(shí)施方式中，說(shuō)明書(shū)可以數(shù)字'記錄在電子計(jì)算機(jī)可讀的存儲(chǔ)介質(zhì)上，例如CD-ROM，磁盤(pán)等等。在其他實(shí)施方式中，用戶能夠從遠(yuǎn)程數(shù)字源，例如在因特網(wǎng)網(wǎng)點(diǎn)，以可下載的文檔文件形式獲得用于進(jìn)行本方法的說(shuō)明書(shū)。任選，該試劑盒可以包括用于進(jìn)行流感A常規(guī)試驗(yàn)以及特異試驗(yàn)的試劑。例如側(cè)向流試驗(yàn)可以包括鑒定普通流感A病毒存在的道和鑒定病毒是否是禽流感A的道。常規(guī)試驗(yàn)可以是鑒定流感A病毒存在的任何試驗(yàn)，包括針對(duì)NS1存在的試驗(yàn)?？梢园ǖ钠渌愋偷钠胀鞲蠥可以鑒定任何流感A蛋白?；蛘吒鶕?jù)患者血液中抗體的存在可以鑒定流感A的存在。最后，通?？梢允褂肞CR試驗(yàn)鑒定流感A的存在。K.陣列在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供PDZ,抗體，和/或適配體陣列，所述陣列由固定在固相上可識(shí)別選定位置的不同PDZ多肽、抗體和/或適配體或者類似的結(jié)合劑組成。陣列中每個(gè)固定的PDZ多肽、抗體和/或適配體對(duì)PL配體都對(duì)PL配體具有明確的結(jié)合親合力和特異性，即，包括已鑒定的與流感病毒蛋白中.PL的結(jié)合相互作用。陣列的區(qū)分活性由下列因素確定(i)各自不同PDZ多肽、抗體和/或適配體的結(jié)合親合力；(II)各自不同PDZ多肽、抗體和/或適配體對(duì)PL的結(jié)合特異性；禾B，(iii)分析條件，例如，離子強(qiáng)度，時(shí)間，pH等等。PDZ結(jié)構(gòu)域是高度特異的，例如，MAST205中的PDZ結(jié)構(gòu)域能夠區(qū)別包含TDV和SDV的C端PL序列。同樣地，相同PDZ蛋白內(nèi)，不同的各自結(jié)構(gòu)域可能具有不同的結(jié)合特異性和親合力，即，PSD-95結(jié)構(gòu)域-1、-2和-3具有不同的結(jié)合特異性和親合力。申請(qǐng)人已經(jīng)在先前的美國(guó)專利申請(qǐng)中克隆、表達(dá)和公開(kāi)了超過(guò)255個(gè)不同的人PDZ結(jié)構(gòu)域的序列，所述PDZ結(jié)構(gòu)域包括了人類基因組中超過(guò)90%的全部PDZ結(jié)構(gòu)域。對(duì)PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白與不同的PL肽的相互作用作圖，構(gòu)成選擇本流感陣列特定成員的基礎(chǔ)。出乎意料地，陣列的選擇性基于以下發(fā)現(xiàn)(i)不同流感A株中有區(qū)別的不同NS1PL氨基酸序列模體，如下面實(shí)施例部分所述；和，聯(lián)合(ii)不同流感病毒蛋白中不同的PL序列模體，即，HA，NP，MA1，NS1等等。本發(fā)明的實(shí)施方式提供區(qū)別待測(cè)樣本中流感A病毒或者流感B的不同株的方法，根據(jù)是流感病毒蛋白中PL的組成結(jié)合性質(zhì)，例如，HA，NP，MA1，NS1等等，其中流感A和B的不同株和/或亞型在陣列中產(chǎn)生獨(dú)特的結(jié)合模式。該方法包括以下步驟(a)在陣列不同預(yù)定位置接觸等份待測(cè)樣本；(b)在陣列的特定位置檢測(cè)結(jié)合的存在或者缺失；(c)根據(jù)陣列中的結(jié)合模式確定(i)待測(cè)樣本中存在流感PL和(ii)陣列中PL結(jié)合的模式構(gòu)成流感A或者B病毒特定毒株的區(qū)別標(biāo)記。根據(jù)陣列可區(qū)別的流感A病毒的代表性實(shí)例包括例如H1N1，H2N2，H2N3,H2N5,H3N2，H3兩，H4N6,H5N1，H6N1,H6N2,H7N2,H7N3禾口H7N7。優(yōu)選，該陣列至少部分基于和NS1PL的結(jié)合。更優(yōu)選，PDZ、抗體和/或適配體陣列特異地鑒定至少一種NS1PL的存在，包括ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7),RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9),GSKV(SEQIDNO:10),NICI(SEQIDNO:ll),TICI(SEQIDNO:12)，RICI(SEQIDNO:13)，DMAL(SEQIDNO:14),DMTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17)，SICL(SEQIDNO:18)，SEV,SEI，SKV禾口SKI。更優(yōu)選，NS1PL是ESEV(SEQIDNO:2)。優(yōu)選，PDZ蛋白是選自表1或者2中的至少一種、片段或者類似物。更優(yōu)選，陣列包括至少一種PDZ蛋白，抗體或者模擬表1和2中所列任意PDZ蛋白的適體，類似物和活性片段。更優(yōu)選的，陣列包括PDZ蛋白，抗體模擬物和/或適配體，包括外膜蛋白，PSD95(PDZ#2);PSD95(PDZ#1,2,3);DLGl(PDZ#1);DLGl(PDZ#1,2);DLGl(PDZ#2);DLG2(PDZ#1);DLG2(PDZ#2);Magi3(PDZ#1);PTN3(PDZ#1);MAST2(PDZ#1);NeDLG(PDZ#1，2);Shankldl;Shank2dl;Shank3dl;Syntrophinla;Syntrophinyl;Magil(PDZ#1);Magil(PDZ#4);Tipl;PTPL1(PDZ#1);Mint3(PDZ#1);LymMystique(PDZ弁l);DLG2(PDZ#3);MUPPl(PDZ#8);NeDLG(PDZ#1);DLG5(PDZ#1);PSD95(PDZ#1);NumBP(PDZ#3);LIMK1(PDZ#1);KIAA0313;DLGl(PDZ#2);Syntenin(PDZ#2);Pickl或者類似物或者片段和/或模擬任何PDZ蛋白的抗體(或者適配體)。L.側(cè)向流設(shè)計(jì)類似于家庭妊娠試驗(yàn)，側(cè)向流裝置通過(guò)將液體施加于測(cè)試條起作用，所述測(cè)試條已經(jīng)經(jīng)過(guò)特異生物制劑處理。通過(guò)攜帶液體樣本，用相應(yīng)生物制劑標(biāo)記的熒光體流過(guò)測(cè)試條，當(dāng)它們進(jìn)入特異區(qū)時(shí)能被捕獲。測(cè)試條上發(fā)現(xiàn)的熒光體信號(hào)的量與靶分析物的量成比例。采用一些方法將懷疑含有流感A的樣本添加到側(cè)向流裝置中，令樣本通過(guò)擴(kuò)散移動(dòng)，線或者有色的區(qū)帶表明流感A的存在。側(cè)向流通常包括固相支持物(例如硝酸纖維素膜)，其包含3個(gè)特定區(qū)域樣本添加區(qū)，包含一種或者多種固定的PDZ蛋白和抗體的捕獲區(qū)，和包含一個(gè)或者多個(gè)區(qū)帶的讀出區(qū)，各區(qū)帶包含一種或者多種標(biāo)記物。側(cè)向流還可以包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照。因此，例如側(cè)向流裝置在某些實(shí)施方式中將按照如下進(jìn)行通過(guò)將等份生物樣本接觸測(cè)試條的一端，然后讓蛋白在測(cè)試條上遷移，例如通過(guò)毛細(xì)管作用例如側(cè)流，從生物樣本中的其他病毒和細(xì)胞蛋白分離流感PL蛋白。包括一種或者多種PL結(jié)合劑例如PDZ多肽試劑、抗體和/或適配體作為捕獲和/或檢測(cè)劑。用于側(cè)向流分離、檢測(cè)和定量的方法和裝置是本領(lǐng)域已知的，例如，美國(guó)專利號(hào)5,569,608;6,297,020;禾B6,403,383，在此完整引入作為參考。在一個(gè)非限制性實(shí)施例中，測(cè)試條包括用于上樣的近端區(qū)域(上樣區(qū))和包含PDZ多肽捕獲劑和緩沖試劑和添加劑的遠(yuǎn)端試驗(yàn)區(qū)，所述緩沖試劑和添加劑適于建立遷移的生物樣本中PDZ多肽和任何流感PL蛋白之間的結(jié)合相互作用。在其他實(shí)施方式中，測(cè)試條包括兩個(gè)試驗(yàn)區(qū)域，該區(qū)域包含不同的PDZ結(jié)構(gòu)域多肽，即，每個(gè)能夠特異地與不同的流感PL蛋白分析物相互作用。XI.藥物組合物上述篩查過(guò)程可以鑒定一種或者多種類型的化合物，所述化合物可以摻入藥物組合物。這些化合物包括試劑，所述試劑是至少一種NS1蛋白或者至少一種PDZ蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后處理的抑制劑。該試劑還可能抑制或者阻斷NS1和PDZ蛋白或者其混合物的結(jié)合。這些化合物還包括試劑，所述試劑是一種或者多種NS1蛋白/一種或者多種PDZ蛋白或者NS1和PDZ蛋白之間相互作用的抑制劑，并且所述試劑具有固有的呼吸和/或消化或者上皮細(xì)胞一特異活性或者成像活性。該化合物還包括偶聯(lián)物，其中藥劑或者成像組分與抑制劑連接，所述抑制劑是NSl、PDZ蛋白或者NS1蛋白和PDZ蛋白之間相互作用的抑制劑。還提供偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物包括具有藥物活性的試劑和相對(duì)單獨(dú)試劑對(duì)PDZ蛋白具有降低的底物能力的偶聯(lián)基團(tuán)，是為了減少該試劑轉(zhuǎn)運(yùn)入未感染細(xì)胞，在那里試劑將產(chǎn)生不需要的副作用。優(yōu)選，該化合物或者試劑抑制或者阻斷至少一種下列PL與PDZ蛋白的結(jié)合ESEV(SEQIDNO:2),ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4),TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6)，RSEV(SEQIDNO:7)，RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:10)，NICI(SEQIDNO:11)，TICI(SEQIDNO:12)，RICI(SEQIDNO:13),DMAL(SEQIDNO:14),DMTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18),SEV，SEI，SKV和SKI。更優(yōu)選，被阻斷或者抑制的NS1PL是ESEV。優(yōu)選，該化合物或者試劑抑制與至少一種來(lái)自表1或者2的PDZ蛋白的結(jié)合。更優(yōu)選，被抑制的PDZ蛋白或者相互作用是是下列至少一種PSD95(PDZ#2);PSD95(PDZ#1,2,3);DLG1(PDZ#1);DLG1(PDZ#1,2);DLG1(PDZ#2);DLG2(PDZ#1);DLG2(PDZ#2);Magi3(PDZ#1);PTN3(PDZ#1);MAST2(PDZ#1);NeDLG(PDZ#1,2);Shankldl;Shank2dl;Shank3dl;Syntrophinla;Syntrophinyl;Magil(PDZ#1);Magil(PDZ#4);Tipl;PTPLl(PDZ#1);Mint3(PDZ#1);LymMystique(PDZ#1);DLG2(PDZ#3);MUPPl(PDZ#8);NeDLG(PDZ#1);DLG5(PDZ#1);PSD95(PDZ#1);NumBP(PDZ#3);LIMK1(PDZ#1);KIAA0313;DLGl(PDZ#2);Syntenin(PDZ#2);Pickl或者類似物或者片段和/或模擬任何PDZ蛋白的抗體(或適配體)。一種或者多種上述實(shí)體可以與藥物可接受的、無(wú)毒的載體或者稀釋劑組合，所述載體或者稀釋劑定義為通常用來(lái)配制用于動(dòng)物或者人類給藥的藥物組合物的介質(zhì)。選擇稀釋劑以便不影響組合的生物活性。這類稀釋劑的實(shí)例是蒸餾水，緩沖水，生理鹽水，磷酸鹽緩沖液(PBS)，Ringer氏溶液，右旋糖溶液和Hank氏溶液。此外，藥物組合物或者制劑還可以包括其他載體，佐劑，或者無(wú)毒的非治療性非免疫性穩(wěn)定劑、賦形劑等等。組合物還可以包括其他物質(zhì)以接近生理?xiàng)l件，例如pH調(diào)節(jié)和緩沖齊U，毒性調(diào)節(jié)齊U，濕潤(rùn)齊U，去污劑等等(參見(jiàn)，例如，Remington'sPharmaceuticalSciences，MacePublishingCompanyPublishingCompany,Philadelphia,PA，第17版(1985);用于藥物投放方法的簡(jiǎn)要綜述可以參見(jiàn)，Langer,Science249:1527-1533(19卯)；這些參考文件中的每一篇均在此完整引入作為參考)。用于口服給藥的藥物組合物可以是例如下列形式，片劑，丸劑，粉劑，錠劑，袋劑，囊劑(catchet)，酏劑，懸浮液，乳劑，溶液，或者糖漿劑。合適賦形劑的一些實(shí)例包括乳糖，右旋糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯樹(shù)膠，磷酸鈣，藻酸鹽，黃芪膠，明膠，硅酸鈣，微晶纖維素，聚乙烯吡咯垸酮，纖維素，無(wú)菌水，糖漿，和甲基纖維素。還可以包括防腐劑例如甲基-和羥丙基苯甲酸鹽(pr叩ylhydroxy-benzoates);甜味劑；和調(diào)味劑。根據(jù)劑型，在對(duì)患者給藥后組合物可以提供快速的、持續(xù)的或者延遲的活性成分釋放。聚合材料可以用于口服緩釋投放(參見(jiàn)"MedicalApplicationsofControlledRelease,"Langer和Wise(編著)，CRCPres.,'BocaRaton,Florida(1974);"ControlledDrugBioavailability,"DrugProductDesignandPerformance,Smolen和Ball(編著)，Wiley,NewYork(1984);Ranger禾口Peppas，1983,JMacromol.Sci.Rev.MacromolChem.23:61;還可參見(jiàn)Levy等人，1985，Science228:190;During等人，1989,Ann.Neurol.25:351;Howard等人，1989，J.Ne藤urg.71:105)。通過(guò)將偶聯(lián)物包裹在膠囊內(nèi)或者緩慢溶解的多聚體內(nèi)，能夠?qū)崿F(xiàn)緩釋。優(yōu)選的多聚體包括羧甲基纖維素鈉，羥丙纖維素，羥丙基甲基纖維素和羥乙基纖維素(最優(yōu)選，羥丙基甲基纖維素)。其他優(yōu)選的纖維素醚已經(jīng)被描述(Alderman,Int.J.Pharm.Tech.&Prod.Mfr.,1984，5(3)1-9)。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了影響藥物釋放的因素(Bamba等人，Int.J.Pharm.，1979，2,307)。為了通過(guò)吸入給藥，根據(jù)此處公開(kāi)的內(nèi)容應(yīng)用的化合物采用氣溶膠噴霧制劑形式可以方便地投放，所述制劑來(lái)自增壓包裝或者噴霧器，借助于合適的噴射劑，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或者其他合適的氣體，或者來(lái)自無(wú)噴射劑的干粉吸入器。就增壓氣霧劑而言，劑量單位可以通過(guò)設(shè)置投放計(jì)量的閥來(lái)確定。例如在吸入器或者吹入器中使用的明膠的膠囊和藥筒，可以制成包含化合物和合適的粉末基質(zhì)例如乳糖或者淀粉的粉末混合物。根據(jù)幾個(gè)良好確立的方案的任意一個(gè)，容易確定藥物組合物的有效劑量和給藥方式(給藥的量和頻度)。例如，通常利用動(dòng)物研究(例如，小鼠，大鼠)確定生物活性試劑的每千克重量的最大耐受劑量。通常，至少一種被測(cè)的動(dòng)物種類是哺乳動(dòng)物。來(lái)自動(dòng)物研究的結(jié)果可以推斷確定在其他種類中使用的劑量，例如人類?？梢韵蚧颊呤┯没衔镉糜陬A(yù)防性和/或治療性處理。治療量是指無(wú)論以任何方式，足以治療疾病狀態(tài)或者癥狀，或者其它預(yù)防、阻止、延緩、或者逆轉(zhuǎn)疾病或者任何其他不良癥狀進(jìn)程的量。在預(yù)防性應(yīng)用中，向易感特定疾病或者感染或者處于該風(fēng)險(xiǎn)下的患者施用化合物。因此，"預(yù)防有效的"量是足以預(yù)防、阻止或者延緩疾病狀態(tài)或者其癥狀的量。在任一種情況下，組合物中包含的化合物的準(zhǔn)確量取決于患者的健康和體重情況。確定藥物組合物的合適劑量，例如，通常利用動(dòng)物研究(例如，小鼠，大鼠)確定生物活性試劑的每千克重量的最大耐受劑量。通常，至少一種被測(cè)的動(dòng)物種類是哺乳動(dòng)物。來(lái)自動(dòng)物研究的結(jié)果可以推斷確定在其他種類中使用的劑量，例如人類。藥物組合物的組分優(yōu)選是高純度的，并且基本上不含潛在有害的污染物(例如至少國(guó)家食品(NF)級(jí)的，通常至少分析級(jí)的，和更常見(jiàn)至少藥物級(jí)的)。為了給定化合物必須在使用前合成的程度，所得產(chǎn)物通常基本上不含任何潛在的毒劑，尤其是任何內(nèi)毒素，內(nèi)毒素可能在合成或者凈化步驟期間存在。通常在GMP條件下制備組合物。用于腸胃外給藥的組合物通常是無(wú)菌的和基本上等滲的。A.抗病毒劑適合本發(fā)明使用的藥物組合物包括其中包含有效劑量活性劑的組合物。抗病毒劑包括NS1、PDZ和/或NS1/PDZ相互作用的抑制劑，所述抑制劑優(yōu)選顯示出對(duì)NS1或者PDZmRNA或者蛋白水平的至少30，50，75，95，或者99%的抑制。利用特異結(jié)合蛋白的抗體然后檢測(cè)抗體和蛋白之間形成的復(fù)合物，可以通過(guò)建立免疫分析定量蛋白的表達(dá)?？梢酝ㄟ^(guò)例如，點(diǎn)印跡分析，原位雜交，RT-PCR，定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(即，稱為"TaqMan"方法)，Northern印跡和核酸探針陣列方法，定量mRNA水平。優(yōu)選，用于鑒定抑制劑的NS1PL是下列一種ESEV(SEQIDNO:2),ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5),GSEV(SEQIDNO:6)，RSEV(SEQIDNO:7),RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:10)，NICI(SEQIDNO:11),TICI(SEQIDNO:12)，RICI(SEQIDNO:13),DMAL(SEQIDNO:14)，DMTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16)，DLDY(SEQIDNO:17)，SICL(SEQIDNO:18),SEV,SEI,SKV和SKI。更優(yōu)選，用于鑒定抑制劑的NS1PL是ESEV(SEQIDNO:2)。優(yōu)選，用于鑒定抑制劑的PDZ蛋白是選自表1或者2中的至少一種、片段或者類似物。更優(yōu)選，用于鑒定抑制劑的PDZ蛋白是下列至少一種外膜蛋白，PSD95(PDZ#2);PSD95(PDZ弁1,2，3);DLGl(PDZ#1);DLGl(PDZ#1，2);DLGl(PDZ#2);DLG2(PDZ#1);DLG2(PDZ#2);Magi3(PDZ#1);PTN3(PDZ#1);MAST2(PDZ#1);NeDLG(PDZ#1,2);Shankldl;Shank2dl;Shank3dl;Syntrophinla;Syntrophinyl;Magil(PDZ#1);Magil(PDZ#4);Tipl;PTPLl(PDZ#1);Mint3(PDZ#1);LymMystique(PDZ#1);DLG2(PDZ#3);MUPP1(PDZ#8);NeDLG(PDZ#1);DLG5(PDZ#1);PSD95(PDZ#1);NumBP(PDZ#3);LIMK1(PDZ#1);KIAA0313;DLGl(PDZ#2);Syntenin(PDZ#2);Pickl或者類似物或者片段和/或模擬任意PDZ蛋白的抗體(或者適配體)?？共《緞┛梢园ń?jīng)鑒定與PDZ蛋白結(jié)合的PL肽治療劑，所述PDZ蛋白與流感NS1或者其他PL蛋白相互作用?？共《緞┌ɑ赑L模體或者PDZ結(jié)構(gòu)域的肽。用于抑制流感病毒PL和與PL結(jié)合的PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用的一些示范性肽顯示于表11(SEQIDNOS:89-987)。其他有用的肽是SEQIDNOS:2，48，53，996和997,如實(shí)施例所述。本發(fā)明的治療劑包括肽本身，包括從C端開(kāi)始的至少5、10、15或者20個(gè)連續(xù)殘基的其截短型，和所有這些肽的保守取代變異體和模擬物，任選將它們摻入藥物組合物中。保守取代，如果有的話，優(yōu)選發(fā)生于所述肽的C端3-4個(gè)氨基酸外。阻斷致病性流感PL與PDZ結(jié)合的肽可用于治療致病性流感。優(yōu)選，表ll所示的肽，其截短型、保守取代的變異體或者模擬物與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白肽(蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)在肽序列的N端連接。可以使用數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白肽序列，包括Tat和觸足蛋白(antennapedia)(參見(jiàn)實(shí)施例7)。抗病毒治療劑還包哮抑制病毒PL和PDZ之間相互作用的小分子，以及Cox2抑制劑(如此處表8中鑒定的)。己經(jīng)在此處的表9和10中鑒定了一些小分子抑制劑。B.篩選抗病毒劑的方法此處公開(kāi)了篩選與NS1PL蛋白和/或PDZ蛋白結(jié)，的試劑的方法。最初篩選的是與NS1PL或者PDZ蛋白的PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合的試劑。然后檢測(cè)它們抑制PDZ/PL相互作用的能力。在下面的"B:抗病毒劑分析"中也提供了這些方法?？梢栽隗w外利用天然或者合成的PL蛋白進(jìn)行結(jié)合分析?；蛘?，包含天然或者合成的PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白可用于鑒定能夠結(jié)合特定PDZ蛋白的試劑。此處公開(kāi)的篩選抗病毒劑的方法鑒定阻斷或者抑制病毒PL和任何與其有相互作用的PDZ蛋白之間相互作用的試劑。篩選抑制劑和編碼其的DNA的抑制NS1和/或PDZ表達(dá)的能力。進(jìn)行初篩，選擇能夠抑制或者終止PDZ/PL相互作用的試劑亞組。這樣的分析可以在體外進(jìn)行，利用分離的PDZ蛋白和PL蛋白或者其能夠彼此結(jié)合的片段。這樣的篩選鑒定的試劑然后能夠進(jìn)行功能分析。還可以在表達(dá)PL蛋白的細(xì)胞中篩選試劑，所述細(xì)胞或者天然表達(dá)PDZ蛋白，或者經(jīng)轉(zhuǎn)化表達(dá)PDZ蛋白。除了以上公開(kāi)和說(shuō)明的診斷試驗(yàn)外，實(shí)施方式提供鑒定能夠調(diào)節(jié)一種或者多種結(jié)合相互作用的候選抗病毒劑的分析法，所述結(jié)合相互作用發(fā)生在流感A感染的細(xì)胞中流感病毒PL和宿主細(xì)胞PDZ多肽之間。該方法包括在抗病毒劑存在下，檢測(cè)對(duì)照PL例如合成PL肽，與PDZ結(jié)構(gòu)域多肽例如重組PDZ融合蛋白的結(jié)合。候選抗病毒劑調(diào)節(jié)對(duì)照PL和PDZ結(jié)構(gòu)域多肽之間的結(jié)合。申請(qǐng)人之前在美國(guó)和國(guó)際專利申請(qǐng)中，例如在此完整引入作為參考的美國(guó)專利號(hào)5,569,608;6，297，020;和6,403,383中，己經(jīng)公開(kāi)了測(cè)定對(duì)照PL和PDZ結(jié)構(gòu)域多肽之間結(jié)合相互作用的分析。特別有用的篩選分析使用既表達(dá)一種或者多種流感NS1PL又表達(dá)一種或者多種PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白的細(xì)胞。這類細(xì)胞能夠通過(guò)用編碼蛋白的多核苷酸共轉(zhuǎn)染細(xì)胞重組產(chǎn)生，或者能夠通過(guò)用第二種蛋白轉(zhuǎn)染天然包含蛋白之一的細(xì)胞產(chǎn)生。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，這類細(xì)胞在多孔培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)，與不同濃度的待測(cè)化合物接觸預(yù)定的時(shí)間段，所述時(shí)間段能夠根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。分析全細(xì)胞裂解產(chǎn)物、培養(yǎng)基或者細(xì)胞膜對(duì)PL/PDZ相互作用的抑制。與對(duì)照相比顯著抑制活性的待測(cè)化合物被認(rèn)為是治療劑候選物。分離的PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白或者其PL結(jié)合片段，可以在任何的各種藥物篩選技術(shù)中用于篩選治療化合物?；蛘?，能夠使用包含PL模體的分離NS1PL蛋白或者片段。用于這類試驗(yàn)的蛋白可以是膜結(jié)合的，在溶液中游離的，固著在固相支持物上，帶在細(xì)胞表面的，或者位于細(xì)胞內(nèi)的。可以測(cè)定PDZ結(jié)構(gòu)域或者NS1PL和待測(cè)試劑之間結(jié)合復(fù)合物的形成。更具體地，如果相互作用比無(wú)待測(cè)化合物存在時(shí)測(cè)量的相互作用顯著更低，則待測(cè)化合物被認(rèn)為是PDZ/PL相互作用的抑制劑。在該背景下，術(shù)語(yǔ)"顯著更低"是指在待測(cè)化合物存在下，PDZ/PL相互作用與無(wú)待測(cè)化合物存在條件下測(cè)量的相互作用相比時(shí)顯著更低，在分析法的置信限內(nèi)。還可以篩選肽或者其他化合物的隨機(jī)文庫(kù)適合作為PDZ/PL結(jié)合的抑制劑，或者單純結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白或者NS1PL蛋白。許多類型的化合物都可以產(chǎn)生組合文庫(kù)，其可以釆用逐步方式合成。這類化合物包括多肽，/3-轉(zhuǎn)角模擬物，多糖，磷脂，激素，前列腺素，類固醇，芳香族化合物，雜環(huán)化合物，苯二氮平，低聚N-取代甘氨酸和低聚氨基甲酸酯(oligocarbamates)。通過(guò)編碼合成文庫(kù)(ESL)方法可以構(gòu)建化合物的大組合文庫(kù)，所述方法描述于Affymax,WO95/12608，Affymax，WO93/06121,ColumbiaUniversity,WO94/08051，Pharmacopeia,WO95/35503和Scripps,WO95/30642(各在此引入作為參考用于所有目的)。用于篩選治療劑或者治療先導(dǎo)物的待測(cè)化合物的優(yōu)選來(lái)源是噬菌體展示文庫(kù)。參見(jiàn)，例如，Devlin,W091/18980;Key,B.K.,等人編著，PhageDisplayofPeptidesandProteins,ALaboratoryManual,AcademicPress,SanDiego,CA,1996。噬菌體展示是一種強(qiáng)大的技術(shù)，能夠令人從包含108-109個(gè)不同序列的文庫(kù)中，使用噬菌體遺傳學(xué)選擇和擴(kuò)增具有所需特征的肽或者蛋白?？梢栽O(shè)計(jì)文庫(kù)，用于氨基酸序列在所需位置的選擇性上色(variegation)，允許文庫(kù)對(duì)所需特征的偏好。設(shè)計(jì)文庫(kù)使肽表達(dá)為與噬菌體表面展示的蛋白融合。挑選具有所需特征的噬菌體展示肽，并能再生長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增。因?yàn)殡氖峭ㄟ^(guò)噬菌體的增殖擴(kuò)增的，可以方便的測(cè)序所選噬菌體的DNA，從而促進(jìn)所選肽的快速分析。通過(guò)選擇特異結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白和/或NS1PL的噬菌體，能夠挑選出編碼肽抑制劑的噬菌體。產(chǎn)生融合到蛋白的文庫(kù)，例如表達(dá)在噬菌體表面上的基因II。文庫(kù)可以由不同長(zhǎng)度的、線性的或者通過(guò)包含兩個(gè)Cys氨基酸進(jìn)行限制的的肽組成，與噬菌體蛋白融合，或者還能夠融合到其他作為支架的蛋白。還能夠設(shè)計(jì)文庫(kù)偏好此處公開(kāi)的PL區(qū)或者偏好從初始文庫(kù)選擇的結(jié)合噬菌體得到的肽序列，所述初始文庫(kù)提供其他的待測(cè)抑制劑化合物。C.抗病毒劑的類型下面闡明的任意試劑可以用作藥物以及那些在篩選方法中鑒定者。抑制劑可以從任意類型的文庫(kù)鑒定，包括RNA表達(dá)文庫(kù)，噬菌體表達(dá)文庫(kù)，小分子文庫(kù)，肽文庫(kù)。還可以利用核酸和/或多肽的已知序列產(chǎn)生抑制劑。化合物還包括幾類已知調(diào)控基因表達(dá)的分子，例如鋅指蛋白，核糖酶，siRNAs和反義RNAs。(a)siRNA抑制劑siRNAs是相對(duì)較短的、至少部分雙鏈的RNA分子，其用于抑制互補(bǔ)mRNA轉(zhuǎn)錄體的表達(dá)。盡管實(shí)現(xiàn)本發(fā)明不需要理解機(jī)理，伹是認(rèn)為siRNAs通過(guò)誘導(dǎo)互補(bǔ)mRNA轉(zhuǎn)錄體的降解起作用。設(shè)計(jì)和使用siRNAs的原理通常描述于WO99/32619，Elbashir,EMBOJ.20，6877-6888(2001)禾卩Nykanen等人，Cell107,309-321(2001);WO01/29058。本發(fā)明的siRNAs由至少部分互補(bǔ)的RNA的兩條鏈形成，每條鏈優(yōu)選長(zhǎng)度為10-30,15-25,或者17-23或者19-21個(gè)核苷酸。所述鏈可以在全長(zhǎng)彼此完全互補(bǔ)，或者在另外雙鏈分子的一端或者兩端具有單鏈3'-突出端。單鏈突出端，如果存在，通常是l-6個(gè)堿基，優(yōu)選1或者2個(gè)堿基。選擇siRNA的反義鏈與NS1或者PDZ轉(zhuǎn)錄體的片段基本上互補(bǔ)(例如，至少80,卯，95°/。和優(yōu)選的100%)。任何錯(cuò)配的堿基優(yōu)選存在于siRNA鏈的末端或者在末端附近。末端錯(cuò)配的堿基能夠是脫氧核糖核苷酸。siRNA的有義鏈顯示與NS1或者PDZ轉(zhuǎn)錄體片段的互補(bǔ)體相似的關(guān)系。特別合適的siRNAs具有兩條鏈，每條具有19個(gè)堿基的完全互補(bǔ)性，并且在有義鏈的3'端具有兩個(gè)不配對(duì)的堿基，在反義鏈的3'端具有一個(gè)不配對(duì)的堿基。如果就這樣施用siRNA,因?yàn)榫幋asiRNA的DNA的形式不同，則siRNA的鏈可以包含一種或者多種核苷酸類似物。核苷酸類似物位于那些抑制劑活性基本上不受影響的位置，例如在5'-端和/或3'端區(qū)域，尤其是單鏈突出區(qū)。優(yōu)選核苷酸類似物是糖-或者骨架-修飾的核糖核苷酸。核酸堿基-修飾的核糖核苷酸，即核糖核苷酸，包含非天然存在的核酸堿基而不是天然存在的核酸堿基，例如5-位修飾的尿苷或者胞苷，例如5-(2-氨基)丙基尿苷，5-溴尿苷；8位修飾的腺苷和鳥(niǎo)苷，例如8-溴鳥(niǎo)苷；去氮核苷酸，例如7-去氮-腺苷；O-和N-垸基化核苷酸，例如N6-甲基腺苷也是合適的。在優(yōu)選的糖修飾核糖核苷酸中，2'OH-基團(tuán)被選自H，OR,R,鹵素，SH，SR,NH2，NHR,NR2或者CN的基團(tuán)取代:其中R是Cl-C6烷基，烯基或者炔基，鹵素是F，Cl，Br或者I。在優(yōu)選的骨架-修飾的核糖核苷酸中，與相鄰核糖核苷酸連接的磷酸酯基團(tuán)被修飾的基團(tuán)例如硫代磷酸酯基團(tuán)取代。在siRNA5'羥化殘基上的磷酸基中引入其他優(yōu)選的修飾。通過(guò)用ATP和T4激酶處理siRNA,可以引入這樣的基團(tuán)。還可以修飾天然RNA的磷酸二酯鍵，以包括至少一種氮或者硫雜原子?？梢允筊NA結(jié)構(gòu)中的修飾適合于特定的基因抑制，同時(shí)避免一些生物體中由dsRNA引起的常見(jiàn)恐慌反應(yīng)。同樣地，可以修飾堿基以阻斷腺苷脫氨酶的活性。NS1或者PDZ轉(zhuǎn)錄體內(nèi)的許多片段是設(shè)計(jì)siRNAs的合適目標(biāo)。當(dāng)NS1PL的選定片段用于選擇性靶定亞型時(shí)，該片段優(yōu)選顯示與轉(zhuǎn)錄體的其他NS1PL區(qū)缺少完全的序列同一性。優(yōu)選，NS1或者PDZ蛋白的選定片段顯示出與NS1PL的相應(yīng)片段(如果有的話)至少l、2、3、4或者更多個(gè)核苷酸差異?？梢詮腘S1或者PDZ的編碼區(qū)、5'UTR和3'UTR選擇靶位點(diǎn)，在一些情況下，NS1的PL位點(diǎn)是優(yōu)選的。優(yōu)選的靶位點(diǎn)是稱為NS1PL的siRNA(參見(jiàn)實(shí)施例)。該位點(diǎn)在C端，并對(duì)流感A病毒亞型特異。其他優(yōu)選的位點(diǎn)包括PDZ蛋白的PL結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)在一對(duì)啟動(dòng)子之間插入編碼siRNA的DNA片段，能夠重組合成siRNA，所述啟動(dòng)子定向驅(qū)動(dòng)插入片段從反方向的轉(zhuǎn)錄。這類啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)RNA鏈，該互補(bǔ)RNA鏈隨后能退火形成所需的dsRNA。用于這類系統(tǒng)的示范性質(zhì)粒包括質(zhì)粒(PCR4.0TOPO)(由Invitrogen提供)。另一個(gè)實(shí)例是載體pGEM-T(Promega,Madison,WI)，其中反向定向的啟動(dòng)子是T7和SP6;還可以使用T3啟動(dòng)子。或者，編碼siRNA鏈的DNA片段被插入到單啟動(dòng)子的下游。在該系統(tǒng)中，共轉(zhuǎn)錄siRNA的有義和反義鏈，產(chǎn)生自身互補(bǔ)的單RNA鏈,從而能夠形成dsRNA。編碼siRNAs的載體可以在體外或者細(xì)胞培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)錄，或者可以導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或者患者用于原位表達(dá)。合適的載體描述如下。用于重組表達(dá)的啟動(dòng)子和任選的其他調(diào)控序列的選擇可以決定表達(dá)的組織特異性。例如，PDGF，朊病毒，神經(jīng)烯醇酶，或者thy-l啟動(dòng)子適合于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)。還能夠通過(guò)有機(jī)化學(xué)合成和體外退火，合成siRNAs的鏈。如果是化學(xué)合成或者通過(guò)體外酶促合成，RNA在導(dǎo)入細(xì)胞前可以純化。例如，通過(guò)用溶劑或者樹(shù)脂沉淀、電泳、層析、或者其組合來(lái)提取，可以從混合物中純化RNA。RNA可以被干燥用于儲(chǔ)存，或者溶于水溶液。溶液可包含促進(jìn)退火和/或雙鏈穩(wěn)定的緩沖液或者鹽。通過(guò)各種方法，能夠?qū)iRNAs以RNA或者編碼RNA的DNA形式導(dǎo)入細(xì)胞或者生物體，如下面所述。(b)反義多核苷酸通過(guò)結(jié)合并干擾有義mRNA的翻譯，干擾轉(zhuǎn)錄，干擾RNA前體的加工或者定位，抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄或者通過(guò)一些其它機(jī)理起作用，反義多核苷酸能夠造成抑制。反義分子通過(guò)何種特定機(jī)理減少表達(dá)不是最關(guān)鍵的。通常反義多核苷酸包括至少7至10到通常20或者更多個(gè)核苷酸的單鏈反義序列，所述序列與來(lái)自基因mRNA的序列特異雜交。一些反義多核苷酸來(lái)自長(zhǎng)度約IO到大約50個(gè)的核苷酸，或者長(zhǎng)度大約14到大約35個(gè)的核苷酸。一些反義多核苷酸是小于大約100個(gè)核苷酸或者小于大約200個(gè)核苷酸的多核苷酸。通常，如果需要，反義多核苷酸應(yīng)該足夠長(zhǎng)以形成穩(wěn)定的雙鏈，但是還需足夠短以便體內(nèi)給藥，這取決于給藥方式。與靶序列特異雜交所需的多核苷酸最小長(zhǎng)度取決于幾個(gè)因素，尤其是，例如G/C含量，錯(cuò)配堿基(如果有的話)的位置，與靶多核苷酸群相比該序列的獨(dú)特程度，和多核苷酸的化學(xué)性質(zhì)(例如，甲基膦酸酯骨架，肽核酸，硫代磷酸酯)。為確保特異雜交，反義序列至少與編碼它們的靶mRNA或者基因的片段基本上互補(bǔ)。一些反義序列與它們的目標(biāo)靶序列完全互補(bǔ)。但是反義多核苷酸還能包括，核苷酸取代，添加，缺失，轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)座，或者修飾，或者其他核酸序列或者非核酸部分，只要將與對(duì)應(yīng)于RNA或者其基因的有關(guān)靶的序列特異結(jié)合保留作為該多核苷酸的功能性質(zhì)。用于抑制NS1或者PDZ蛋白表達(dá)的反義多核苷酸被設(shè)計(jì)成顯示出與特定NS1或者PDZ基因或者轉(zhuǎn)錄體的完全的或者相當(dāng)程度的序列一致性，和與不同PDZ基因的不完全的和較低程度的序列一致性。一些反義序列與mRNA相對(duì)易接近的序列(例如，相對(duì)缺少二級(jí)結(jié)構(gòu))互補(bǔ)。這可以通過(guò)分析預(yù)測(cè)的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)確定，利用例如MFOLD程序(GeneticsComputerGroup,MadisonWI)和本領(lǐng)域己知的體外或者體內(nèi)檢驗(yàn)。用于鑒定有效反義組合物的另一個(gè)有用的方法利用寡聚核苷酸的組合陣列(參見(jiàn)，例如，Milner等，1997,NatureBiotechnology15:537)。可以利用任何合適的生產(chǎn)核酸的方法制備反義核酸(PNA，RNA，修飾的，類似物，等等)，例如此處公開(kāi)的化學(xué)合成和重組方法。反義RNA可以就這樣投放或者以編碼反義RNA的DNA形式投放。編碼反義RNA的DNA可以作為載體的成分或者非復(fù)制形式投放，例如下面所述。(c)鋅指蛋白鋅指蛋白還可以用于抑制NSl或者PDZ蛋白或者核酸或者特定NSl亞型的表達(dá)。鋅指蛋白可以工程化或者選擇結(jié)合靶基因內(nèi)的任意需要的耙位點(diǎn)。在一些方法中，靶位點(diǎn)在啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子內(nèi)。在其他方法中，耙位點(diǎn)在結(jié)構(gòu)基因內(nèi)。在一些方法中，鋅指蛋白與翻譯阻遏劑連接，例如來(lái)自人類KOX-l蛋白的KRAB抑制結(jié)構(gòu)域(Thiesen等人，NewBiologist2，363-374(1990);Margolin等人，Proc.Natl.Acad.ScLUSA91，4509-4513(1994);Pengue等人，Nucl.AcidsRes.22:2908-2914(1994);Witzgall等人，Proc.NatlAcad.SciUSA91,4514-4518(1994)。WO00/00388描述了選擇適合被鋅指蛋白靶定的靶位點(diǎn)的方法，和設(shè)計(jì)鋅指蛋白結(jié)合選定的靶位點(diǎn)的方法。EP.95908614.1描述了利用噬菌體展示選擇與靶結(jié)合的鋅指蛋白的方法。用于設(shè)計(jì)鋅指蛋白的靶位點(diǎn)通常是大約9-19個(gè)核苷酸。為了抑制NSl或者PDZ蛋白或者多核苷酸，在NSl或者PDZ蛋白或者多核苷酸內(nèi)選擇靶位點(diǎn)，所述位點(diǎn)顯示與上面討論的不同PDZ基因或者轉(zhuǎn)錄體是不完全的或者缺乏顯著的序列一致性。WO00/00409描述了利用鋅指蛋白調(diào)控內(nèi)源基因的方法。鋅指蛋白可以作為蛋白或者以編碼鋅指的核酸形式給藥。在后一種情況下，核酸可以利用載體或者如下所述的不可復(fù)制形式投放。(d)核糖酶核糖酶是充當(dāng)酶的RNA分子，并且能夠被工程化在特定位點(diǎn)切割其他RNA分子。該過(guò)程中核糖酶自身不消耗，并且能夠催化作用于切害UmRNA耙分子的多個(gè)拷貝。Haseloff&Gerlach，(1988)Nature334:585-591和Uhlenbeck,(1987)Nature328:596-603和US5,496,698描述了設(shè)計(jì)反向切割靶RNA的核糖酶的一般規(guī)則。核糖酶通常包括兩個(gè)側(cè)翼片段和側(cè)翼片段之間的催化區(qū)，所述側(cè)翼片段顯示與轉(zhuǎn)錄體(靶亞位點(diǎn))上的兩個(gè)位點(diǎn)互補(bǔ)并與其結(jié)合。側(cè)翼片段通常長(zhǎng)5-9個(gè)核苷酸，最佳長(zhǎng)6-8個(gè)核苷酸。核糖酶催化區(qū)的長(zhǎng)度通常是大約22個(gè)核苷酸。mRNA耙在靶亞位點(diǎn)之間包含一致的(consensus)切割位點(diǎn)，具有通式NUN，優(yōu)選GUC(Kashani-Sabet和Scanlon,(1995)CancerGeneTherapy2:213-223;Perriman,等人，(1992)Gene(Amst.)113:157-163;Ruffher,等人，(19%)Biochemistry29:10695-10702);Birikh,等人，(1997)Eur.J.Biochem.245:1-16;Perrealt，等人，(1991)Biochemistry30:4020-4025)。通過(guò)選擇靶亞位點(diǎn)，并從而選擇與該亞位點(diǎn)互補(bǔ)的核糖酶?jìng)?cè)翼片段，可以控制核糖酶的特異性。對(duì)于NS1或者PDZ蛋白的抑制劑，優(yōu)先選擇耙亞位點(diǎn)，使在其他PDZ蛋白中不存在準(zhǔn)確的相應(yīng)亞位點(diǎn)，并優(yōu)選沒(méi)有具有顯著序列一致性的相應(yīng)亞位點(diǎn)。核糖酶可以作為RNA分子，或者以編碼核糖酶的DNA作為可復(fù)制載體組分的形式，或者采用如下所述的不可復(fù)制的形式，進(jìn)行投放。(e).抗體化合物包括抗體，完整的和其結(jié)合片段二者都是，例如Fabs，F(xiàn)vs，它們與本發(fā)明基因編碼的蛋白特異結(jié)合。通常抗體是單克隆抗體，盡管多克隆抗體也能重組表達(dá)(參見(jiàn)，例如，US6,555,310)。能夠表達(dá)的抗體實(shí)例包括小鼠抗體，嵌合抗體，人源化抗體，鑲嵌(veneered)抗體和人類抗體。嵌合抗體是輕和重鏈基因已經(jīng)構(gòu)建的抗體，通常通過(guò)遺傳工程對(duì)屬于不同種類的免疫球蛋白基因片段進(jìn)行構(gòu)建(參見(jiàn)，例如，Boyce等人，AnnalsofOncology14:520-535(2003))。例如，小鼠單克隆抗體基因的可變(V)片段可以與人的恒定(C)片段連接。典型的嵌合抗體因此是一種雜合蛋白，由小鼠抗體的V或者抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人抗體的C或者效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域組成。人源化抗體具有基本上來(lái)自人抗體的可變區(qū)骨架殘基(稱為受體抗體)和基本上來(lái)自小鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)，(稱為供體免疫球蛋白)。參見(jiàn)Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)和WO90/07861,US5,693,762,US5,693,761,US5，585，089,US5,530,101禾BWinter,US5,225,539。恒定區(qū)(constantregion),如果存在，也基本上或者全部來(lái)自人免疫球蛋白。特別是，通過(guò)常規(guī)雜交瘤方法，噬菌體展示(參見(jiàn)，例如，Dower等人，WO91/17271和McCafferty等人，WO92/01047)，利用具有人免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠(Lonberg等人，W093/12227(1993))，可以獲得抗體。編碼免疫球蛋白鏈的核酸可以從產(chǎn)生抗體的雜交瘤或者細(xì)胞系獲得，或者基于已出版文獻(xiàn)中的免疫球蛋白核酸或者氨基酸序列。(f).模擬化合物在特定實(shí)施方式中，本篩選法化合物中鑒定的該候選抗病毒化合物是所述PDZ結(jié)構(gòu)域多肽或者PL的模擬肽，即，與所述PDZ結(jié)構(gòu)域或者PL具有基本上相同的結(jié)構(gòu)和/或功能特點(diǎn)的合成化合物。所述模擬物可以完全由氨基酸的合成、非天然類似物組成，或者，是部分天然肽氨基酸和部分氨基酸非天然類似物的嵌合分子。模擬物還包括任意量的天然氨基酸保守取代，只要這類取代也是基本上不改變模擬物的結(jié)構(gòu)和/或抑制或者結(jié)合活性。至于是保守變異體的本發(fā)明多肽，常規(guī)實(shí)驗(yàn)法確定模擬物是否在本發(fā)明的范圍內(nèi)，即，其結(jié)構(gòu)和/或功能基本上不改變。因此，如果模擬組合物能夠抑制所述多肽之間的結(jié)合，則該模擬組合物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。模擬物可以包含非天然結(jié)構(gòu)組分的任意組合，它們通常來(lái)自3個(gè)結(jié)構(gòu)組a)除了天然酰胺鍵("肽鍵")連接外的殘基連接組；b)代替天然存在的氨基酸殘基的非天然的殘基；或者c)誘導(dǎo)二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬的殘基，艮卩，誘導(dǎo)或者穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，例如，卩轉(zhuǎn)角，Y轉(zhuǎn)角，/3折疊，a螺旋構(gòu)象，等等。當(dāng)多肽殘基的全部或者一些通過(guò)除了天然肽鍵外的化學(xué)方法連接時(shí)，多肽可以表征為模擬物。個(gè)體模擬肽殘基可以通過(guò)肽鍵、其他化學(xué)鍵或者偶聯(lián)方法連接，例如，戊二醛，N-羥基琥珀酰亞胺酯，雙官能馬來(lái)酰亞胺，N,N--二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或者N,N--二異丙基碳二亞胺(DIC)?？梢蕴娲Ｒ?guī)酰胺鍵("肽鍵")連接的連接基團(tuán)包括，例如，酮亞甲基(例如，對(duì)于-C(0)-NH-的-C(0)-CHr),氨基亞甲基(CH2-NH)，乙烯，烯烴(CH=CH)，醚(CH2-0)，硫醚(CH2-S)，四唑(CN4-)，噻唑，逆酰胺(retroamide)，硫代酰胺，或者酯(參見(jiàn)，例如，Spatola(1983)ChemistryandBiochemistryofAminoAcids,PeptidesandProteins,Vol.7,pp267-357,APeptideBackboneModifications,MarcellDekker,NY)。通過(guò)包含全部或者一些非天然殘基取代天然存在的氨基酸殘基，多肽也可以表征為模擬物。在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中詳盡描述了非天然殘基；下面描述了可用作天然氨基酸殘基模擬物的一些示范性非天然組合物和指導(dǎo)方針。芳香族胺基酸的模擬物能夠通過(guò)用以下物質(zhì)取代而產(chǎn)生，例如，D-或者L-萘基丙氨酸(naphylalanine);D-或者L-苯基甘氨酸；D-或者L-2噻吩丙氨酸；D-或者L-l，2，3，或者4-芘基丙氨酸(pyreneylalanine);D-或者L-3噻吩丙氨酸；D-或者L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D-或者L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或者L-(2-吡嗪基)-丙氨酸；D-或者L-(4-異丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基丙氨酸；D-對(duì)-氟苯丙氨酸；D-或者L-對(duì)-二苯基苯丙氨酸；K-或者L-對(duì)-甲氧基二苯基苯丙氨酸；D-或者L-2-吲哚(垸基)丙氨酸；和，D-或者L-垸基丙氨酸(alkylainines)，其中烷基可以是取代的或者未取代的甲基，乙基，丙基，己基，丁基，戊基，異丙基，異丁基，sec-isotyl，異戊基，或者非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳環(huán)包括，例如，噻唑基，苯硫基，吡唑基，苯并咪唑基，萘基，呋喃基，吡咯基，和吡啶基芳環(huán)。通過(guò)用下列物質(zhì)取代，例如，非羰酸鹽氨基酸同時(shí)維持負(fù)電荷；(膦?；?丙氨酸；硫酸蘇氨酸，能夠產(chǎn)生酸性氨基酸的模擬物。羧基側(cè)基(例如，天冬氨?；蛘吖劝滨；?還可以通過(guò)與碳二亞胺(R-N-C-N-R^反應(yīng)進(jìn)行選擇性修飾，所述碳二亞胺例如，1^-環(huán)己基-3(2-嗎啉基-(4-乙基)碳二亞胺或者L-乙基-3(4-氮鑰-4,4-二甲基苯基(dimetholpentyl))碳二亞胺。通過(guò)與銨離子反應(yīng)，天冬氨酰或者谷氨酰還可以轉(zhuǎn)變?yōu)樘於０孵：凸劝滨０孵埢?。通過(guò)用下列物質(zhì)取代，例如，(除賴氨酸和精氨酸外)氨基酸鳥(niǎo)氨酸，瓜氨酸，或者(胍基)-乙酸，或者(胍基)垸基乙酸，其中烷基按上面所定義，可以產(chǎn)生堿性氨基酸的模擬物。腈衍生物(例如，包含CN-部分取代COOH)可以被天門(mén)冬酰胺或者谷氨酰胺取代。天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰殘基可以脫氨基，成為相應(yīng)的天冬氨?；蛘吖劝滨埢?。通過(guò)精氨酰與下列物質(zhì)反應(yīng)，例如，一種或者多種常規(guī)試劑，包括，例如，苯基乙二醛，2，3-丁二酮，1,2-環(huán)己二酮，或者水合茚三酮，優(yōu)選在堿性條件下反應(yīng)，能夠產(chǎn)生精氨酸殘基模擬物。通過(guò)酪氨酰與例如芳香族重氮化合物或者四硝基甲垸反應(yīng)，能夠產(chǎn)生酪氨酸殘基模擬物。N-乙?；溥?acetylimidizol)和四硝基甲垸可分別用于生成O-乙酰酪氨酰類和3-硝基衍生物。通過(guò)半胱氨酰殘基與下列物質(zhì)反應(yīng)，例如，a-卣代乙酸酯例如2-氯乙酸或者氯乙酰胺和相應(yīng)的胺，得到羧甲基或者羧酰胺，基衍生物，可以產(chǎn)生半胱氨酸殘基模擬物。通過(guò)半胱氨酰殘基與下列物質(zhì)反應(yīng)，例如，溴-三氟丙酮，0!-溴-/3-(5-咪唑酰基丙酸；磷酸氯乙酰，N-烷基馬來(lái)酰亞胺，3-硝基-2-吡啶二硫化物；甲基2-吡啶二硫化物；對(duì)氯汞苯甲酸；2-氯汞基-4硝基苯酚；或者，氯-7-硝基苯并-氧-l,3-二唑，也能夠產(chǎn)生半胱氨酸殘基模擬物。通過(guò)賴氨酰與例如琥珀酸或者其他羧酸酐反應(yīng)，能產(chǎn)生賴氨酸模擬物(和可以改變氨基末端殘基)。通過(guò)與亞氨酯反應(yīng)，例如甲基皮考林亞氨酯(picolinimidate)，磷酸吡眵醛，吡哆醛，氯代硼氫化物，三硝基苯磺酸，O-甲基異脲，2，4-戊二酮，以及與乙醛酸的轉(zhuǎn)酰胺基酶催化反應(yīng)，也可以產(chǎn)生賴氨酸和其他包含a-氨基的殘基模擬物。通過(guò)與例如甲硫氨酸亞砜反應(yīng)，可以產(chǎn)生甲硫氨酸的模擬物。脯氨酸的模擬物包括，例如，哌啶酸，噻唑烷羧酸，3-或者4-羥基脯氨酸，脫氫脯氨酸，3-或者4-甲基脯氨酸，或者3,3，-二甲基脯氨酸。通過(guò)組氨酰與例如二乙基焦碳酸酯或者對(duì)溴苯酰甲基溴反應(yīng)，可以產(chǎn)生組氨酸殘基模擬物。其他模擬物包括，例如，通過(guò)以下作用產(chǎn)生的那些脯氨酸和賴氨酸的羥化作用；絲氨?；蛘咛K氨酰殘基的羥基磷酸化作用；賴氨酸，精氨酸和組氨酸的a-氨基甲基化；N端胺的乙酰化；主鏈酰胺殘基的甲基化或者用N-甲基氨基酸取代；或者C端羧基的酰胺化。所述多肽的氨基酸還可以用相反手性的氨基酸(或者模擬肽殘基)取代。因此，以L-構(gòu)型天然存在的任意氨基酸(還可以稱為R或者S，取決于化學(xué)實(shí)體的結(jié)構(gòu))可以用相同化學(xué)結(jié)構(gòu)類型的氨基酸或者模擬肽取代，但它們具有相反的手性，通常稱為D-氨基酸，但此外還可以稱為R-或者S-形。本發(fā)明的模擬物還可以包括組合物，該組合物包含結(jié)構(gòu)模擬殘基，尤其是誘導(dǎo)或者模擬二級(jí)結(jié)構(gòu)的殘基，例如P轉(zhuǎn)角，^折疊，a螺旋結(jié)構(gòu)，Y轉(zhuǎn)角，等等。例如，在肽內(nèi)用D-氨基酸；N-a-甲基氨基酸；C-ce-甲基氨基酸；或者脫氫氨基酸取代天然氨基酸殘基，可以誘導(dǎo)或者穩(wěn)定0轉(zhuǎn)角，Y轉(zhuǎn)角，/折疊或者a螺旋構(gòu)象。/3轉(zhuǎn)角模擬結(jié)構(gòu)已得以描述，例如，Nagai(1985)Tet.Lett.26:647-650;Feigl(1986)J.Amer.Chem.Soc.108:181-182;Kahn(1988)J.Amer.Chem.Soc.110:1638-1639;Kemp(1988)Tet.Lett.29:5057-5060;Kahn(1988)J,Molec.Recognitionl:75-79。/3折疊模擬結(jié)構(gòu)已得以描述，例如，Smkh(1992)J.Amer.Chem.Soc.114:10672-10674。例如，Beusen(1995)Biopolymers36:181-200，描述了順式酰胺替代物，1，5-二取代四唑，誘導(dǎo)VI型]8轉(zhuǎn)角。Banerjee(1996)Biopolymers39:769-777,描述了摻入非手性(O-氨基酸殘基以產(chǎn)生聚亞甲基單位作為酰胺鍵的取代。通過(guò)例如強(qiáng)場(chǎng)1HNMR或者2DNMR光譜，可以分析多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，參見(jiàn)，例如，Higgins(1997)J.Pept.Res.50:421-435。還可以參見(jiàn)，Hruby(1997)Biopolymers43:219-266，Balaji等人，美國(guó)專利號(hào)5,612,895。D.改進(jìn)抗病毒劑為改進(jìn)抗病毒劑在所選細(xì)胞中的接受和導(dǎo)入，存在許多已知的方法。例如，蛋白的PEG化可使它們更能抵抗免疫系統(tǒng)。或者，可以在蛋白和載體中添加胞內(nèi)信號(hào)或者部分使它們更易進(jìn)入所選細(xì)胞。可以添加使蛋白或者載體易被感染細(xì)胞特異攝取的部分，在這種情況下是對(duì)呼吸細(xì)胞表達(dá)的受體特異的配體。該部分可以對(duì)流感受體或者細(xì)胞類型特異的受體具有特異性。該治療化合物還可以進(jìn)一步修飾，以便該化合物更容易溶解或者促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞。例如，化合物可以在任意位置PEG化，或者化合物可以偶聯(lián)到膜易位(translocating)肽例如tat、觸足蛋白或者信號(hào)序列膜易位肽，如U丄angel所述，"CellPenetratingPeptides",CRCPress,BocaRotan,2002，即，在此完全引入作為參考。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了許多肽序列，它們能夠促進(jìn)與這些序列連接的肽通過(guò)胞質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞(Derossi等人，1998，TrendsinCellBiol.8:84)。為了本發(fā)明的目的，這類肽統(tǒng)稱為"跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白肽"，這與"細(xì)胞穿透肽"互換使用。后者細(xì)胞穿透肽的實(shí)例包括，但不限于下列肽即，源自HIV的tat(Vives等人，1997,J.Biol.Chem.272:16010;Nagahara等人，1998，Nat.Med.4:1449)，來(lái)自果蠅(Drosophila)的觸足蛋白(Derossi等人，1994，J.Biol.Chem.261:10444),來(lái)自單純皰疹病毒的VP22(Elliot和D'Hare,1997,Cell88:223-233)，抗DNA抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)2禾B3(Avrameas等人，1998,Proc.NatlAcad.SciU.S.A.,95:5601-5606)，70KDa熱休克蛋白(Fujihara,1999,EMBOJ.18:411-419)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(transportan)(Pooga等人，1998，F(xiàn)ASEBJ.12:67-77)。在某些實(shí)施方式中，可以使用截短的HIVtat肽。E.干擾素產(chǎn)生干擾素a和/3(IFN-a//3)在抗病毒抵抗的固有細(xì)胞機(jī)制中起著重要作用，例如，抑制病毒序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。IFN-ce/Z受體信號(hào)復(fù)合物的組裝需要給受體復(fù)合物募集因子，包括轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kB，STAT和INF-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子-3;和蛋白激酶。據(jù)認(rèn)為RACK1可以作為支架蛋白，給復(fù)合物募集和/或結(jié)合PKC和STAT;可能結(jié)合網(wǎng)蛋白，艮P，半橋粒(hemidesmasome)組織者(organizer)。最近來(lái)自其他實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)表明腮腺炎和麻疹病毒可能破壞INF-o;/i3信號(hào)復(fù)合物，即，據(jù)報(bào)道腮腺炎V-蛋白結(jié)合RACK1，并誘導(dǎo)STAT從受體復(fù)合物解離；禾口，在麻疹病毒感染細(xì)胞中，據(jù)報(bào)道病毒C和/或V蛋白通過(guò)結(jié)合和"凍結(jié)"INF-o^受體復(fù)合物，來(lái)抑制信號(hào)激酶的磷酸化作用。干擾素-/|3信號(hào)抑制促-細(xì)胞凋亡應(yīng)答，通過(guò)STAT和NFkB14的核轉(zhuǎn)移提高細(xì)胞存活率"。干擾素受體信號(hào)觸發(fā)PKC-S"的活化，其又能下調(diào)半胱天冬酶3'以及，通過(guò)STAT17和，在氣道中，通過(guò)NFKB18，19，下調(diào)促炎癥信號(hào)。據(jù)報(bào)道PKC-S活化還抑制TNFa誘導(dǎo)的凋亡"'21。在這方面，IFN-o/z3信號(hào)的禽流感NSl抑制看來(lái)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞死亡和決定疾病的嚴(yán)重程度。因此，用于藥物研發(fā)的候選藥劑和新的分子靶標(biāo)是干擾和/或阻斷NS1對(duì)IFN-o/j8信號(hào)作用的那些。這些試劑在感染流感A的對(duì)象中促進(jìn)改善一種或者多種癥狀的所需治療效果。流感A的高危(也參見(jiàn)致病性)禽類株在人類中造成爆發(fā)性感染，即，快速越過(guò)粘膜肺組織傳播進(jìn)入循環(huán)和CNS。不受特定理論束縛，很有可能某些后來(lái)的效應(yīng)源自受非結(jié)構(gòu)流感A病毒蛋白介導(dǎo)INB-a//3信號(hào)的抑制。此外，很有可能病毒蛋白例如NS1和NS2抑制胞內(nèi)PDZ結(jié)構(gòu)域-PL的相互作用，而這種相互作用對(duì)于有效的INB-ce/Z3信號(hào)信號(hào)和誘導(dǎo)細(xì)胞抗病毒抵抗機(jī)理是必需的。此處鑒定了INF-o/Z3受體-l中可能的PDZ-配體(PL)序列(檢索號(hào)16166194)，C端序列"QDFV，，(SEQIDN0:31)，即，可能的1-型PL序列。相似的，INF-a/0-受體-l信號(hào)復(fù)合物的其他潛在成員還包括下列推斷的C端PL序列模體即，MAP-1A(檢索號(hào)2119250)包含"KSRV"(SEQIDNO:32);MAP-1B(檢索號(hào)14165456/5174525)包含"KIEL"(SEQIDNO:33);MAP-1A/1B輕鏈-3(檢索號(hào)12383056A8551443)包含C端"KLSV"(SEQIDNO:34);網(wǎng)蛋白-1(檢索號(hào)4505877)包含C端PL序列模體"SAVA"(SEQIDNO:35);PKC-5(檢索號(hào)509050)包含"KVLL"(SEQIDNO:36);INF-可誘導(dǎo)蛋白激酶(檢索號(hào)13637584和4506103-elf2a)包含C端序列模體"RHTC"(SEQIDNO:37);干擾素o;應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子-3(檢索號(hào)5174475)具有C端模體"LSLV"(SEQIDNO:38);禾口，干擾素調(diào)節(jié)因子-2(檢索號(hào)20141499/4504723)包含"VKSC"(SEQIDNO:39)。因此，很有可能PDZ結(jié)構(gòu)域-PL相互作用在病毒發(fā)病機(jī)理中起著重要作用，并從而成為開(kāi)發(fā)藥物化合物的靶標(biāo)。能夠抑制NS1與IFN-o/j8受體復(fù)合物的胞內(nèi)PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用的藥物化合物包括PL肽，和其模擬物，NSlPL/IFN-oZ/3相互作用的肽抑制劑，NS1表達(dá)的抑制劑，細(xì)胞可滲透的非天然PDZ結(jié)構(gòu)域多肽，和其模擬物，和能夠抑制NS1PL與人特異PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合的小分子抑制劑，所述PDZ結(jié)構(gòu)域參與IFN-o/jS反應(yīng)。F.5.4治療方法此處公開(kāi)的藥物組合物用于流感A疾病預(yù)防或治療方法。從上面公開(kāi)的內(nèi)容可知，本發(fā)明具有多種應(yīng)用。例如，NS1蛋白、PDZ蛋白或者NS1和PDZ蛋白之間相互作用的抑制劑，可用于鑒定與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互作用并且能夠進(jìn)入感染細(xì)胞的試劑或者偶聯(lián)物。NS1蛋白、PDZ蛋白或者NS1和PDZ蛋白之間相互作用的抑制劑還能通過(guò)鑒別結(jié)合感染細(xì)胞的偶聯(lián)部分并將偶聯(lián)部分與試劑連接，用于增強(qiáng)試劑結(jié)合感染細(xì)胞的能力。在預(yù)防應(yīng)用中，給對(duì)流感A感染易感、或者處于患流感A感染發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象施用一定量的藥物組合物或者藥物，所述的量足夠預(yù)防、減弱或者阻止流感A感染的發(fā)展。在治療應(yīng)用中，給被懷疑患有、或者已經(jīng)患有流感的患者施用一定量的組合物或者藥物，，述的量足夠逆轉(zhuǎn)、阻止或者至少部分阻止，流感A感染的癥狀。在預(yù)防和治療方案中，作為NS1、PDZ和/或NSl-PDZ相互作用抑制劑形k的本發(fā)明活性劑，通常分幾次劑量給藥，直到實(shí)現(xiàn)充分的應(yīng)答。但是，在預(yù)防和治療方式中，活性劑還可以單次劑量給藥，直到實(shí)現(xiàn)充分的應(yīng)答。通常，對(duì)治療進(jìn)行監(jiān)控，并可以給予重復(fù)劑量。此外，對(duì)于那些治療流感A感染治療或者流感A感染發(fā)展的患者，治療方式可以使用相似的劑量；給藥途徑和給藥頻率。根據(jù)治療的疾病、哺乳動(dòng)物種類和特定給藥方式，可以與載體組合產(chǎn)生單一劑型的NS1蛋白、PDZ蛋白和/或NS1/PDZ相互作用和其他活性劑的抑制劑的量是不同的。對(duì)于任意特定患者，"有效劑量"，"藥理可接受劑量"或者"藥理可接受量"可能取決于各種因素，包括使用的特定化合物的活性，接受治療的患者的物種，年齡，體重，健康狀況、性別和飲食；給藥時(shí)間和途徑；代謝或者排泄速度；同時(shí)或者先前給藥的其他藥物；疾病的類型和嚴(yán)重度；副作用的嚴(yán)重程度，患者是否是動(dòng)物或者人類，等等。通常患者是人類，但還可以治療非人類的哺乳動(dòng)物，包括轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物?？梢允┯糜行┝康娜L(zhǎng)活性劑或者其活性片段。對(duì)于用于本發(fā)明方法的NS1蛋白、PDZ蛋白和/或NS1/PDZ相互作用的任意抑制劑和其他活性劑，用于人類的有效量最初可以從非人類動(dòng)物模型估算。臨床醫(yī)生利用本領(lǐng)域已知的參數(shù)可以確定有效量。通常，開(kāi)始的給藥劑量稍微低于最佳有效量。此后小量增加給藥量直至廿達(dá)至lj有效劑量。(參見(jiàn)TheMerckManualofDiagnosisandTherapy,第16半,§22,1992,Berkow，MerckResearchLaboratories,Rahway，NewJersey,在此引入作為參考)。劑量需要逐步增高以最優(yōu)化安全性和效果。可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)步驟檢測(cè)此處描述的化合物的毒性和治療效果，例如通過(guò)測(cè)定LD5Q(導(dǎo)致50%試驗(yàn)群體死亡的劑量)和ED5。(在50%試驗(yàn)群體中治療有效的劑量)。有毒和治療效果之間的劑量比例是治療指數(shù)，可以表達(dá)為L(zhǎng)D5Q和ED5Q之間的比例。優(yōu)選顯示高治療指數(shù)的化合物。從這些非人類動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于配制對(duì)于人用無(wú)毒的劑量范圍。這類化合物的劑量?jī)?yōu)選處于循環(huán)濃度范圍內(nèi)，該范圍包括幾乎沒(méi)有或者沒(méi)有毒性的ED5()。個(gè)人醫(yī)生根據(jù)患者情況可以選擇正確的劑型、給藥途徑和劑量。(參見(jiàn)，例如，F(xiàn)ingl等人(1975)In:ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,Chapter1,在此弓l入作為參考)。G.給藥方法NS1蛋白、PDZ蛋白和/或NS1/PDZ相互作用的抑制劑和其他活性劑可以被單獨(dú)投放或者施用于哺乳動(dòng)物，例如，人類患者或者對(duì)象，以藥物可接受的鹽或者其可水解前體的形式，或者以藥物組合物形式，其中有效劑量的化合物與合適的載體或者賦形劑混合。有效方案是指藥物或者藥物組合以足夠的量和頻率并且通過(guò)合適途徑給藥，以便至少可檢測(cè)地預(yù)防、延緩、抑制或者逆轉(zhuǎn)流感A感染至少一種癥狀的發(fā)展。"有效劑量"，"藥理可接受劑量"，"藥理可接受量"是指當(dāng)以合適的方式給藥時(shí)，存在足夠量的NS1蛋白或者表達(dá)、PDZ蛋白或者表達(dá)和/或NS1/PDZ蛋白相互作用的抑制劑、活性劑或者NS1、PDZ蛋白和/或NS1/PDZ蛋白相互作用的抑制劑與其他活性劑聯(lián)合，以獲得所需要的結(jié)果，例如，預(yù)防、延緩、抑制或者逆轉(zhuǎn)流感A感染的癥狀或者流感A感染的進(jìn)展。'用于本發(fā)明方法的的流感A的NS1、一種或者多種PDZ蛋白和/或NS1/PDZ蛋白相互作用的抑制劑和其他活性劑可以作為藥物組合物給藥，所述藥物組合物包括NS1、PDZ蛋白和/或NS1/PDZ蛋白相互作用的抑制劑或者活性劑，和各種其他藥學(xué)可接受的組分。藥物組合物可以是以下形式固體(例如粉劑，顆粒，糖衣丸，片劑或者丸劑)，半固體(例如凝膠劑，漿劑，或者膏劑)，液體，或者氣體(例如氣霧劑或者吸入劑)。本發(fā)明使用的合適劑型可以參考Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPublishingCompany1985)Philadelphia,PA，第17版)禾口Langer,Science(1990)249:1527-1533，在此引入作為參考。此處描述的藥物組合物可以釆用常規(guī)方式制備，即，混合，溶解，?；苽涮且峦?，磨粉，乳化，包囊，捕獲或者凍干步驟。NS1/PDZ蛋白和/或NS1/PDZ蛋白相互作用的抑制劑和其他活性劑可以與常見(jiàn)的賦形劑、稀釋劑或者載體一起配制，壓成片劑，或者配制成酏劑或者方便口服給藥的溶液。NS1、PDZ蛋白和/或NSl/PDZ蛋白相互作用的抑制劑和其他活性劑還可以配制緩釋劑型等等?？梢远喾N方式實(shí)現(xiàn)化合物的給藥，包括口服，含服，直腸，胃腸外，腹膜內(nèi)，經(jīng)皮，透皮，氣管內(nèi)，.靜脈內(nèi)，和肌內(nèi)給藥。該化合物可以在長(zhǎng)效或者緩釋的劑型中，局部而不是全身方式給藥。此外，化合物可以在脂質(zhì)體中給藥。此外，化合物可以通過(guò)基因治療方式給藥。為了口腔給藥，組合物可以采用按常規(guī)方式配制的片劑或者錠劑的形式。為了吸入給藥，本發(fā)明應(yīng)用的化合物以氣溶膠噴物制劑形式可以方便地投放，所述制劑來(lái)自增壓包裝、噴霧器(nebulizer)或者注射噴霧器(syringesprayer)，借助于合適的噴射劑，例如，二氯二氟甲垸，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或者其他合適的氣體，或者來(lái)自無(wú)噴射劑的干粉吸入器。就增壓氣霧劑而言，劑量單位可以通過(guò)設(shè)置投放計(jì)定量的閥來(lái)確定。例如在吸入器或者吹入器中使用的明膠的膠囊和藥筒，可以制成包含化合物和合適的粉末基質(zhì)例如乳糖或者淀粉的粉末混合物?；衔锟梢耘渲瞥赏ㄟ^(guò)注射進(jìn)行腸胃外給藥，例如，通過(guò)彈丸注射(bolusinjection)或者連續(xù)輸注。用于注射的劑型可以存在于單位劑型，例如，在安瓿中或者多劑量容器中，含有添加的防腐劑。組合物可以采用以下形式油基或水性介質(zhì)中的懸浮液、溶液、或者乳液，并且可以包含配制劑(formulatoragents)例如懸浮、穩(wěn)定和/或分散劑。組合物配制成無(wú)菌、基本等滲的和完全符合美國(guó)食品和藥物管理局(theU.S.FoodandDragAdministration)的所有藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GoodManufacturingPractice,GMP)。NSl、PDZ蛋白和/或NS1/PDZ蛋白相互作用的抑制劑和其他活性劑還可以配制為直腸組合物，例如栓劑或者保留灌腸劑，.例如，包含常用栓劑基質(zhì)例如可可脂，碳蠟，聚乙二醇或者其他甘辨酯，所有這些在體溫下溶化，而在室溫下凝固。除以上描述的劑型外，化合物還可以配制為長(zhǎng)效制劑(dep6tpreparation)。這類長(zhǎng)效劑型可以通過(guò)植入(例如，皮下或者肌內(nèi))或者通過(guò)肌肉注射給藥。因此，例如，化合物可以用合適的聚合或者疏水性材料(例如，作為可接受的油中的乳劑)或者離子交換樹(shù)脂配制，或者作為微溶的衍生物，例如，微溶的鹽。(參見(jiàn)，例如，Urquhart等人，(1984),AnnRev.Pharmacol.Toxicol.24:199;Lewis,ed.,1981,ControlledReleaseofPesticidesandPharmaceuticals,PlenumPress,NewYork,N.Y.，美國(guó)專利號(hào)3,773,919,和3,270,960,在此引入作為參考)?；蛘?，可以使用用于疏水性藥物化合物的其他運(yùn)送系統(tǒng)。脂質(zhì)體和乳劑是疏水性的藥物運(yùn)送介質(zhì)或者載體的公知實(shí)例。在一些方法中，可以使用循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)，即，隱形脂質(zhì)體。Woodle等人的美國(guó)專利號(hào)5,013,556—般性地描述了這類脂質(zhì)體，其教示在此引入作為參考。本發(fā)明的化合物還可以通過(guò)控釋工具和/或運(yùn)送裝置給藥，所述工具和裝置描述于美國(guó)專利號(hào)3,845,770;3,916,899;3,536,809;3,598,123;和4,008,719;其公開(kāi)內(nèi)容在此引入作為參考。為了通過(guò)基因治療給藥，目標(biāo)遺傳物質(zhì)(例如，DNA或者RNA)被轉(zhuǎn)移到宿主中以治療或者預(yù)防流感A感染。在本發(fā)明中，目標(biāo)遺傳物質(zhì)編碼NS1、PDZ和域NS1/PDZ相互作用的抑制劑、活性劑或者其片段。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，遺傳物質(zhì)應(yīng)該是有療效的。許多這類蛋白、載體、DNA本身是已知的。(參見(jiàn)Culver,K.W.，"GeneTherapy",1994,p.xii,MaryAnnLiebert,Inc.,Publishers,NewYork,N.Y.,在此完整引入作為參考)。只為了示例的目的，載體可以選自莫洛尼小鼠白血病病毒載體，帶有組織特異啟動(dòng)子的腺病毒載體，單純性皰疹載體，牛痘的載體，人工染色體，受體介導(dǎo)的基因運(yùn)送，和上述載體的混合物?；蛑委熭d體是由不同的實(shí)驗(yàn)室商品化供應(yīng)的，例如Chiron,Inc.,Emeryville,Calif.;GeneticTherapy,Inc.,Gaithersburg,Md.;Genzyme，Cambridge,Mass.;Somtax，Alameda,Calif;TargetedGenetics,Seattle,Wash.;Viagene禾卩Vical，SanDiego，Calif。腺病毒是遺傳物質(zhì)的有希望的基因治療載體，所述遺傳物質(zhì)編碼NS1、PDZ和/或NS1/PDZ相互作用的抑制劑、活性劑或者其片段?？梢圆倏v腺病毒使其編碼和表達(dá)所需基因產(chǎn)物(例如，NS1、PDZ和/或NS1/PDZ相互作用的抑制劑或者其片段)，并且同時(shí)其在正常裂解病毒生活周期中的復(fù)制能力被滅活。無(wú)需將病毒DNA整合入宿主細(xì)胞染色體就可以實(shí)現(xiàn)腺病毒表達(dá)，從而緩解了關(guān)于插入突變發(fā)生的擔(dān)心。此外，腺病毒作為活的傷寒疫苗已經(jīng)使用很多年，具有優(yōu)異的安全特征(Schwartz,A.R.等人(1974)Am.Rev.Respir.Dis.109:233-238)。最后，在許多例子中已經(jīng)證明了腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，包括a-l-抗胰蛋白酶和CFTR轉(zhuǎn)移到棉鼠的肺中(Rosenfeld，M.A.等人(1991)Science252:431-434;Rosenfeld等人，(1992)Cell68:143-155)。此外，試圖確認(rèn)腺病毒為人類癌癥致病劑的廣泛研究一律是陰tf的(Green,M.等人(1979)PNASUSA76:6606)。藥物組合物還能包括合適的固體或者膠體相載體或者賦形劑。這類載體或者賦形劑的實(shí)例包括但不限于碳酸鈣，磷酸鈣，各種糖，淀粉，纖維素衍生物，明膠，和多聚體例如聚乙二醇。實(shí)施例實(shí)施例l:流感ANSI蛋白具有PDZ結(jié)構(gòu)域配體(PL)模體NCBI流感資源數(shù)據(jù)庫(kù)的檢查顯示，NSl蛋白序列具有符合結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域能力的特征。這類序列被命名為PDZ結(jié)構(gòu)域配體或者PL。經(jīng)鑒定這些流感NSl蛋白的PL模體是S/T-X-V/I/L，其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸，X是任意氨基酸。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)747個(gè)全長(zhǎng)人NSl序列中，572個(gè)具有該模體。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)345個(gè)全長(zhǎng)雞NS1序列中，237個(gè)具有該模體。該數(shù)據(jù)概述于表3a-3e,和圖1-3。該數(shù)據(jù)提供了特定NS1PL模體在不同的動(dòng)物和人類中出現(xiàn)的統(tǒng)計(jì)表述。統(tǒng)計(jì)分析可用于分析各種動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了何種PL模體，它們?nèi)绾卧谖锓N之間穿梭，以及在一些情況下，通常發(fā)現(xiàn)何種PL具有特定H或者N蛋白。人PL分成5個(gè)序列組(參見(jiàn)表3a):RSKI(SEQIDNO:40),ESEV(SEQIDN0:2)，KSEV(SEQIDNO:41),RSEV(SEQIDNO:7)，和RSKV(SEQIDNO:8)。亞型和特定PL模體間存在著強(qiáng)相關(guān)性；RSKI(SEQIDNO:40)和H3N2(93%),ESEV(SEQIDNO:2)和H5N1(100%)，KSEV(SEQIDNO:41)和H1N1(100%，盡管數(shù)量少)，RSEV(SEQIDNO:7)和H3N2(98%),以及RSKV(SEQIDNO:8)和H3N2(95%)。雞PL分成5個(gè)序列組(參見(jiàn)表3b):ESEI(SEQIDNO:3),ESEV(SEQIDNO:2)，GSEV(SEQIDNO:6),ESKV(SEQIDNO:4)和GSKV(SEQIDNO:10)。亞型或亞型組與特定PL模體間存在著強(qiáng)相關(guān)性；ESEI(SEQIDNO:3)和H7N2(90%)，ESEV(SEQIDNO:2)禾卩H5N1(64%)，ESKV(SEQIDNO:4)和H5N2(84%)以及GSKV(SEQIDNO:10)和H5N2(100%-但數(shù)量稍小)。如果匯總需通報(bào)的禽流感或者H5和H7，ESEI(SEQIDNO:3)與NAI100%相關(guān)，ESEV(SEQIDNO:2)與NAI83%相關(guān)。鴨PL分成3個(gè)序列組(參見(jiàn)表3c)。豬PL分成7個(gè)序列組(參見(jiàn)表3d)。馬PL分成1個(gè)序列組(參見(jiàn)表3e)。NS1PL序列與HN分亞型的非隨機(jī)組合表明了通過(guò)NS1PL分型鑒定HN亞型的方法。PDZ結(jié)合模式可用于區(qū)分不同的PL序列，并作為流感分亞型的基礎(chǔ)。表3a-e表3a:人NSlPL572PL/747分離物<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>表3b:雞NSlPL237PL/345分離物<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>表3c:鴨NS1PL72PL/110分離物<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>表3e:馬NS1PL3PL/21分離物<table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table>檢查3個(gè)代表性的PL序列基團(tuán)，ESEV(SEQIDN0:2)、EPEV(SEQIDNO:27)和RSKV(SEQIDNO:8),揭示了PL可能的起源。ESEV(SEQIDNO:2)首先出現(xiàn)在禽類分離物中，直到2003年才進(jìn)入人類和哺乳動(dòng)物宿主(參見(jiàn)圖1)。EPEV(SEQIDNO:27)首先出現(xiàn)在馬分離物中，在1997年進(jìn)入人類、禽類和其他哺乳動(dòng)物宿主(參見(jiàn)圖2)。RSKV(SEQIDNO:8)首先出現(xiàn)在人類分離物中，直到1997年才進(jìn)入其他物種，具體是豬(參見(jiàn)圖3)。這類分析對(duì)評(píng)價(jià)流行性感冒的物種起源可以是非常重要的。上述分析證明了一種檢測(cè)流感病毒NS1多肽存在的新方法，它利用了對(duì)流感A特異和特定亞型特異的PL模體。特定PL的鑒定是鑒定樣本存在何種流感病毒株的方法。實(shí)施例2:PDZ分析本實(shí)施例描述PDZ蛋白與不同流感APL模體的結(jié)合。利用改良ELISA評(píng)定PDZ蛋白。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，產(chǎn)生GST-PDZ融合，其包含PDZ蛋白的完整PDZ結(jié)構(gòu)域。此外，合成對(duì)應(yīng)于不同流感A株NS1蛋白的C端20個(gè)箅基酸的生物素化的肽，并利用HPLC純化。這些實(shí)體之間的結(jié)合通過(guò)"G"分析檢測(cè)，這是一種比色分析，利用抗生物素蛋白-HRP結(jié)合生物素和過(guò)氧化物酶底物。來(lái)自特定流感株的NS1蛋白的序列如SEQIDNOS:42-47所顯示。檢觀IJNS1PL(或者就H5N1A來(lái)說(shuō)是C末端)與人PDZ蛋白的結(jié)合，利用(i)選擇模擬流感AH5N1、H1N1和H3N2株中某些NS1PL(或者C末端)序列的生物素化的合成20-mer肽；禾B，(ii)重組系統(tǒng)中合成基因編碼的重組NS1蛋白，即，表達(dá)系統(tǒng)中合成NS1DNA并與編碼MBP免疫化學(xué)標(biāo)簽的序列融合(麥芽糖結(jié)合蛋白；NEB;根據(jù)廠商的說(shuō)明書(shū)產(chǎn)生)。在人類基因組中所有不同PDZ結(jié)構(gòu)域的幾乎全套(255)組成的陣列形式中檢測(cè)基質(zhì)graphPeptides和蛋白。每個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域多肽都可以在商品化的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)為重組GST-PDZ多肽。利用鏈霉親和素-HRP和TMB底物，檢測(cè)生物素化的PL肽與PDZ結(jié)構(gòu)域多肽的特異結(jié)合。同樣地，利用生物素化的抗MBP、鏈霉親和素-HRP和TMB底物，可顯示NS1-MBP融合蛋白與PDZ結(jié)構(gòu)域多肽的特異結(jié)合。分析結(jié)合的相對(duì)強(qiáng)度，顯示每個(gè)PL的強(qiáng)和弱結(jié)合劑。當(dāng)用于捕獲或者鑒定PL蛋白時(shí)，優(yōu)選結(jié)合更強(qiáng)的。PDZ蛋白。但是對(duì)于利用PDZ蛋白與不同PL蛋白差異結(jié)合的試驗(yàn)，'弱結(jié)合PDZ蛋白仍然可能是有用的。結(jié)果如下檢測(cè)來(lái)自A/Taiwan/1996AcJAAC14269株的MBP,NS1H1N1(RSEV)PL(SEQIDNO:42)與多種PDZ蛋白的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)下列PDZ蛋白結(jié)合強(qiáng)Rho-Gap10,Syntrophin1a，外膜，Magi2d3，Magild4，Tip43dl，Magildl，Tip1,PSD95dl，2,3,PTPL1d2,PSD95d2，INADLd8,DLGldl,2,Vartuld2，PSD95dl,Magil3dl，DLGld2.Mast2dl，NeDLGdl,2，SNPClla，DLG2d2。發(fā)現(xiàn)下列PDZ蛋白結(jié)合弱:Magi3d2，PTN3dl,DLG2dl.在利用直接結(jié)合夾心分析的滴定研究中，發(fā)現(xiàn)PSD95dl,2,3結(jié)合的EC50為1.29/ig/ml，外膜蛋白結(jié)合的ECso為1.25pg/ml.。其他測(cè)定結(jié)果顯示于4a。表4a:滴定EC50:MBP.NSlH1N1(RSEV-SEQIDNO:7)<table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table>檢測(cè)來(lái)自A/NewYork/31/2004Ac.#AAX56415株的MBP.NS1H3N2(RSKV)PL(SEQIDNO:43)與多種PDZ蛋白的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)下列PDZ蛋白結(jié)合強(qiáng):外膜，PSD95d1,2，3，INADLd8,DLGldl,2,Grip1d4，Shank1,GoRaspldl，SimGoRasp65,Syntenind2,NeDLGd3，F(xiàn)LJ12615,KIAA0967,PTN3dl,DLG2dl，NeDLGl，dl,2，DLG2d2,mastldl，Kiaal719d4,Kiaal415dl，和PicklFL。發(fā)現(xiàn)下列結(jié)合弱Shank2，NumbBPd3，psd95dl,2，3，和Mast2dl。在利用直接結(jié)合夾心分析的滴定研究中，發(fā)現(xiàn)PSD95dl，2,3結(jié)合的ECso為25.3/xg/ml，發(fā)現(xiàn)INADL結(jié)合的ECso為0.869pg/ml。其它測(cè)定結(jié)果顯示于表4b。表4b:滴定EC50:MBP.NSlH3N2(RSKV-SEQIDNO:8)<table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table>檢測(cè)來(lái)自A/HongKong/97/1998Ae.#AAK49317株的MBP.NS1H5N1A(EPEV)PL(SEQIDN0:44)與多種PDZ蛋白的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)下列PDZ蛋白結(jié)合強(qiáng)ALP，PSD95dl,和PICKFL。發(fā)現(xiàn)下列結(jié)合弱INADLd8,NeDLGdl,2，和KIAA1719d4。在利用直接結(jié)合夾心分析的滴定研究中，發(fā)現(xiàn)外膜蛋白結(jié)合的ECso為12.55/tg/ml，發(fā)現(xiàn)PSD95dl，2，3結(jié)合的EQo為15.76/xg/ml。其它測(cè)定結(jié)果顯示于表4c。表4c:滴定EC50:MBP.NS1H5N1A(EPEV-SEQIDNO:27)<table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table>檢測(cè)來(lái)自A/Vietnam/1194/2004Ac.#AAT73394株的MBP,NSlH5N1B(ESEV)PL(SEQIDNO:45)與不同PDZ蛋白的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)下列DZ蛋白結(jié)合強(qiáng):DLG1dl,2,LIMmystiquedl，DLG2d3,Vartuld2,PSD95dl，Magi3dl,DLGld2,PTN-3dl,DLG2dl，NeDLGldl,2，Magi2d5,DLG2d2,禾口PSD95d3CSBound,Magi2dl,DLGldl,RhoGaplO，外膜，Magild4，Tip43，Tipldl，PSD95dl,2,3,Tip33dl，PSD95d2。發(fā)現(xiàn)下列結(jié)合弱:SIP1d2,LimRiL，mint3d2，ALP1,PSD95d3:SEMCAP3dl,LIMK1,Kiaa0613，Syntrophinyl，Magi2d6,Mast2dl，Magild5，INADLd3,Magi3d2,syntrophin1a，magi2d3,par3Ld2，Magildl,Kiaal719d5，Vartuldl,和PTPLldl。在利用直接結(jié)合夾心分析的滴定研究中，發(fā)現(xiàn)PSD95dl,2，3結(jié)合的EC5o為0.29/xg/ml，發(fā)現(xiàn)外膜蛋白結(jié)合的ECso為0.18Mg/ml。其它測(cè)量結(jié)果顯示于表4d(ND表示未進(jìn)行)。表4d:滴定EC50:MBP.NS1H5N1B(ESEV-SEQIDNO:2)<table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table>檢測(cè)來(lái)自A/duck/ST/4003/2003Ac.#AAF02349/6048830株的肽1958H5N1A(EPEV)PL(SEQIDNO:46)與不同PDZ蛋白的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)下列DZ蛋白結(jié)合弱MAST2dl，PSD95dl，2，3'和PSD95d2。在利用直接結(jié)合夾心分析的滴定研究中，發(fā)現(xiàn)PSD95d2結(jié)合的EC50為3.8/ig/ml，發(fā)現(xiàn)PSD95dl,2,3結(jié)合的ECso為4.1jLtg/ml。其它測(cè)定結(jié)果顯示于表4e。表4e滴定EC50:1958H5N1A肽(EPEV-SEQIDNO:27)<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>檢測(cè)來(lái)自A/chicken/HongKong/915/1997Ac.#AAT73457/50296374株的肽1959H5N1B(ESEV)PL(SEQIDNO:47)與不同PDZ蛋白的結(jié)合。符合碰撞分類(hitclassification)特定標(biāo)準(zhǔn)的PDZ匯總于基質(zhì)碰撞列表(MatrixHitsList)的表4a-e，顯示相互作用的相對(duì)強(qiáng)度。為了按碰揸(hit)分類，NS1-PDZ相互作用的OD必須大于T均背景的兩倍，并且它必須在至少兩個(gè)樣本中符合碰撞。分類為"弱"的碰撞具有小于0.5的OD，分類為"強(qiáng)"的碰撞具有大于0.5的OD。利用如上所述的用于基質(zhì)分析的相同檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行肽和融合蛋白滴定?；|(zhì)碰撞列表用于確定何種PDZ與NS1滴定來(lái)測(cè)定相互作用的強(qiáng)度。上面顯示了每種檢測(cè)的特定PL的滴定結(jié)果。列出了滴定NSl-PDZ相互作用計(jì)算出的EC5Qs。下面提供使用的特定分析和方法。A.肽純化代表不同流感ANS1蛋白C端20個(gè)氨基酸的肽，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)FMOC化學(xué)方法合成，如果不用作未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性試劑，則將其生物素化。利用大小為10*25mm，5um的Vydac218TPCI8反相柱，通過(guò)反相高效液相色譜法(HPLC)純化肽。大約40mg的肽溶于2.0mL49.9%乙腈和0.1。/。三氟乙酸(TFA)的水溶液中。然后通過(guò)25微米注射過(guò)濾器(Millipore)將該溶液注入HPLC設(shè)備。用于獲得好的分離的緩沖液是(A)含有0.1。/。TFA的蒸餾水和(B)含有乙腈的0.1%TFA。分離是基于肽的性質(zhì)發(fā)生的?？傮w上疏水性的肽比親水性的肽更晚洗脫。收集包含"純"肽的級(jí)份，利用質(zhì)譜儀(MS)核查。純化的肽進(jìn)行凍干以保持穩(wěn)定和以后使用。B.鑒定肽和融合蛋白試劑和材料之間相互作用的"G"分析NuncPolysorp96孑L酶標(biāo)板(Nunccat#62409-005)(Maxisorp板顯示有較高的背景信號(hào))PBSpH7.4(GibcoBRLcat#l6777-148)或者(AVC磷酸鹽緩沖鹽水，8gNaCI，0.29gKCl，1.44gNa2HP04,0.24gKH2P04，力口H20到1L和pH7.4;0.2阿過(guò)濾2%BSA/PBS(10g牛血清白蛋白，級(jí)份V(ICNBiomedicalscat#IC15142983)溶于500mlPBS山羊抗-GSTmAb儲(chǔ)存液5mg/ml，4°C保存，(AmershamPharmaciacat#27-4577-01),PBS1:1000稀釋，終濃度5jug/mlHRP-鏈霉親和素，2.5mg/2ml儲(chǔ)存液4°C保存(Zymedcat#43-4323)，2%BSA1:2000稀釋，終濃度0.5pg/ml'洗滌緩沖液，0.2%Tween20溶于50mMTrispH8.0即用TMB(Dakocat#S1600)1MH2S0412w多道移液器，50ml試劑庫(kù)，15ml聚丙烯錐形管方案1)用100pi5jug/ml山羊抗GST包被板，在4°CO/N2)倒出包被抗體，輕拍干3)封閉一每孔添加200]ul2%BSA，4°C2小時(shí)4)在2。/。BSA中準(zhǔn)備蛋白(每排或者每?jī)闪?ml)5)用冷的PBS洗滌3次(在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中必須是冷的)(洗滌最后在孔中殘留PBS直到立即添加下一步)6)在冰上每孔添加50pl蛋白(4"Cl-2小時(shí))'7)在2。/。BSA中準(zhǔn)備肽(2ml/排或者/列)8)用冷的PBS洗滌3次9)在冰上每孔添加50/d肽(開(kāi)始時(shí)間/結(jié)束時(shí)間)a.在添加最后一次肽后在冰上放置恰好IO分鐘.b.在室溫放置恰好20分鐘a10)準(zhǔn)備12ml/板的HRP-鏈霉親和素(在2%BSA中1:2000稀釋)11)用冷的PBS洗滌3次12)在冰上每孔添加100plHRP-鏈霉親和素，4'C20分鐘13)打開(kāi)讀板器，準(zhǔn)備文件14)洗滌5次，避免起泡15)用手套，每孔添加100/ilTMB底物。a.在室溫下暗處孵育b.定期檢查板(5，10&20分鐘)c.如果需要，在650nm(藍(lán)色)讀取早期讀數(shù)d.在20分鐘時(shí)，用100/il1MH2S04終止反應(yīng)e.在450nm(黃色)讀取最終讀數(shù)實(shí)施例3:NS1蛋白在人臨床樣本中的表達(dá)檢查人鼻分泌物中流感ANS1的存在和量。收集人鼻抽吸物，-80'C保存于M4病毒轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基(Remel,Inc，Lenexa，KS)中。解凍保存的材料，在10。/。SDS-PAGE上電泳。用NS1，3H3和1A10的單克隆抗體(ArborVitaCorporation,sSunnyvale,Ca)進(jìn)行Western印跡分析。6個(gè)樣本的結(jié)果顯示于圖4。該結(jié)果顯示NSl在鼻分泌物中大量存在。為了研究感染流感A病毒的細(xì)胞產(chǎn)生和分泌NS1的時(shí)間線，MDCK細(xì)胞在0.1的MOI下被人流感A/PR/8感染。收集上清液以及細(xì)胞，在1%TritonX-100中裂解，利用對(duì)NS1泛反應(yīng)性的單克隆抗體3H3進(jìn)行SDS-PAGE和Western分析。感染后24小時(shí)內(nèi)在感染細(xì)胞中檢測(cè)到NS1，48小時(shí)內(nèi)在感染細(xì)胞的上清中檢測(cè)到NS1(參見(jiàn)圖5)。這表明基于NS1的診斷也許能在48小時(shí)內(nèi)和可能24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)流感A造成的感染。實(shí)施例4:細(xì)胞中NS1與PDZ的相互作用為驗(yàn)證細(xì)胞中NS1與PDZ蛋白的相互作用，進(jìn)行一系列PDZ牽出(pull-down)實(shí)驗(yàn)。用包含HA-NS1-H5N1B的質(zhì)?；蛘哂肏A-NS1-H3N2轉(zhuǎn)染293HEK細(xì)胞。按照此處所述制備裂解產(chǎn)物。制備谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠-PDZ珠(10ugDLGld1，2，10ugNeDLGdl，2，和10ugPSD95dl,2，3)，用于牽出(pulldown)來(lái)自轉(zhuǎn)染的293ET細(xì)胞的150ug裂解產(chǎn)物，如圖6和7所示。在4'C過(guò)夜孵育并用HNTG緩沖液多次洗滌后，用牽出物制備膜。該膜用F63-3G1上清(l:5)探測(cè)。全部3個(gè)檢測(cè)的PDZs成功地從表達(dá)HA-H5N1B的細(xì)胞中牽出NS1(參見(jiàn)圖6)。類似地，制備谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠-PDZ珠(40uglNADLd8)，用于牽出轉(zhuǎn)染H3N2的293ET細(xì)胞的150ug裂解產(chǎn)物。在4'C過(guò)夜孵育和用PBS多次洗滌后，準(zhǔn)備Western印跡，用a-HA(1:500)(Roche)檢測(cè)。INADLd8成功地從細(xì)胞裂解產(chǎn)物中牽出HA-H3N2NS1(圖7)。結(jié)論是如基質(zhì)(MATRIX)分析所確定，NS1PL在細(xì)胞內(nèi)是有功能的，它可以與PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用。實(shí)施例5:NS1的單克隆抗體制備與NS1蛋白亞型、NS1PL類特異結(jié)合和具有泛特異性的單克隆抗體。產(chǎn)生NS1單克隆抗體的策略如下，結(jié)果顯示于表5、6和7:1.制備用于表5匯總的亞型的NS1的GST和MBP融合蛋白?？寺≥d體獲自Pharmacia(GST)或者NewEnglandBiolabs(MBP)。通過(guò)DNA2.0(MenloPark，Ca)利用重疊寡核苷酸合成NS1編碼區(qū)。2.用MBP-NS1融合蛋白免疫小鼠，劑量范圍是每劑量10-100ug，開(kāi)始在CFA中，然后是在IFA和PBS中。3.根據(jù)Kohler和Milstein所述(Nature1975),在用相應(yīng)GST-NS1融合蛋白最后一次加強(qiáng)免疫后3天，收集脾細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，并與FOX-NY骨髓瘤細(xì)胞融合。4.首先在ELISA(參見(jiàn)表5-7的直接ELISA)中用MBP-NSl篩選雜交瘤?？寺￡?yáng)性孔，用一組MBP和GSTNSl再篩選，并將其分為泛反應(yīng)性的或者亞型活性的5.利用Western印跡進(jìn)一步篩選，證實(shí)符合NSl的靶蛋白的分子6.利用S2分析形式(參見(jiàn)實(shí)施例4)進(jìn)行另外的篩選，用于與PDZ捕獲的相容性(參見(jiàn)表5-7的S2ELISA)。7.用細(xì)胞裂解產(chǎn)物形式的真核表達(dá)NS1重復(fù)步驟5和6。8.檢查抗體對(duì)實(shí)施例6所述側(cè)向流形式的相容性。9.最后，檢查抗體檢測(cè)臨床樣本中NSl的能力。該工作流程對(duì)獲得識(shí)別人臨床樣本的抗體是關(guān)鍵的。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table>表5(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table>表6<table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table>實(shí)施例6:側(cè)向流圖8,9和11提供用于NS1檢測(cè)的側(cè)向流形式的實(shí)施例。圖8提供一種側(cè)向流，利用PDZ捕獲繼之以單克隆抗體檢測(cè)。對(duì)所有情況，利用提條器(striper)將重組PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白或者抗體沉積在RF120Millipore膜上。對(duì)圖8，PDZ蛋白PSD95Dl-3，和INADLD8沉積濃度為0.5mg/ml。還沉積對(duì)照條帶，其由山羊抗小鼠抗體(GAM)組成，濃度也為0.5mg/ml。NS1蛋白與lOOul體積溶于TBS-T緩沖液的金交聯(lián)單克隆的抗NSl例如4B2結(jié)合。使用的NSl蛋白來(lái)自HlNl，H3N2,H5N197,H5N1，而對(duì)照道(controllane)不包含NS1。在所有情況下，稀釋人鼻抽吸物并保存于鹽水或者M(jìn)4，按指示。樣本與如下所述量的金交聯(lián)抗體直接混合。將PDZ條膜插入NSl/抗NSl蛋白溶液，流動(dòng)起始于毛細(xì)管作用和導(dǎo)濕墊。根據(jù)PDZ反應(yīng)性模式對(duì)NS1進(jìn)行分型；H1N1與PSD95和INADLd8均結(jié)合；H3N2只結(jié)合INADLd8;H5N1只結(jié)合PSD95。利用與PDZ的反應(yīng)性和用金交聯(lián)的泛反應(yīng)性抗NSl單克隆抗體，根據(jù)NSl側(cè)向流的結(jié)果進(jìn)行流感A分型。在圖9中，13種不同的單克隆抗體沉積在側(cè)向流裝置中。這13種使用的抗體是F64-lAO,F64-3H3，F(xiàn)64-6G12,F64-7A8,F64-7D1，F(xiàn)68-1D10，F(xiàn)68-4B2，F(xiàn)68-4H9,F68-6A12,F68-6B7，F(xiàn)68-6D6,F68-7B10。向包含H1N1流感病毒的樣本中添加亞型特異的金交聯(lián)泛NS1抗體。將樣本加入側(cè)向流裝置，結(jié)果顯示于圖9。該結(jié)果顯示，泛特異抗體可以用于鑒定何種抗體與H1N1結(jié)合最好的試驗(yàn)和測(cè)定。利用下列符號(hào)定量結(jié)合強(qiáng)度(-)是指沒(méi)有結(jié)合，(+)是指弱結(jié)合，(+++)是指強(qiáng)結(jié)合和(++)是指中等結(jié)合。在膜上沉積泛特異抗體，產(chǎn)生鑒定患者樣本中致病性流感A的側(cè)向流試驗(yàn)?；颊邩颖九c金標(biāo)記抗體的混合物混合，所述抗體識(shí)別全部NS1PL。樣本加入側(cè)向流測(cè)試條，如果存在流感A的致病株，條上將形成一條線。利用下列方案和材料進(jìn)行條測(cè)試檢驗(yàn)使用的材料包括:之前用山羊抗小鼠/PSD95dl，2，3/INADLd8涂條的測(cè)試條；TBST/2%BSA/0.25%Tween20緩沖液；NS1蛋白MBP-H1N1、MBP-H3N2、MBP-H5N1A、和MBP-H5N1B"舊"(Jon's)快速金交聯(lián)F68-4B2抗體的儲(chǔ)存液；和MaxisorpELISA板。按如下步驟進(jìn)行1.)NS1蛋白儲(chǔ)存液在TBST/2%BSA/0.25%Tween20中稀釋到100ng/uL(利用不少于5uL蛋白進(jìn)行稀釋)2.)通過(guò)向lOuLTBST/2%BSA/0.25%Tween20中添加10uL蛋白，將100ng/uL稀釋液被稀釋到50ng/uL3.)制備溶于TBST/2%BSA/0.25%Tween20緩沖液的金交聯(lián)抗體儲(chǔ)存液。每lOOuL緩沖液中添加4uL抗體，準(zhǔn)備足夠6個(gè)lOOuL反應(yīng)(這提供了額外的死體積)使用的緩沖液。4.)ELISA板各孔中添加98uL抗體/緩沖液混合物5.)向含有緩沖液的孔中添加2uLNSl稀釋液(每孔一種NS1)6.)—個(gè)孔中只有抗體和緩沖液作為陰性"無(wú)NS1"對(duì)照7.)輕敲ELISA板若干次以混合孔的內(nèi)含物8.)在孔中加入預(yù)涂條(pre-striped)的測(cè)試條，在進(jìn)展期間觀察。在大約15分鐘后(當(dāng)全部液體已經(jīng)被吸收，但條還未干燥時(shí))，從孔中取出條，掃描進(jìn)計(jì)算機(jī)。圖10a和10b中提供的試驗(yàn)按如下方式制備GST-PSD95d1，2，3蛋白以3mg/mL涂條在膜上用于禽類試驗(yàn)，或者可以使用兩種單克隆抗體的混合物(l.lmg/mLF64-3H3和0.075mg/mLF68-4H9用于泛流感A試驗(yàn))。lmg/mL多克隆山羊抗小鼠抗體的第二條線用于試驗(yàn)捕獲線。下面闡明試驗(yàn)步驟。1.制備具有樣本膜和接收墊(sinkpad)的卡片。2.用PDZ蛋白和/或抗體對(duì)膜涂條(參見(jiàn)上面對(duì)濃縮的說(shuō)明)3.膜在56度干燥過(guò)夜，然后將卡片切成4.26mm寬的條。4.將玻璃纖維樣本墊與條的底部連接，將完整的條放置于盒內(nèi)用于測(cè)試。5.解凍待測(cè)樣本，添加80m1樣本到20/xl緩沖液中。上下抽吸若干次進(jìn)行混合。6.在樣本/緩沖溶液中摻加8^1金交聯(lián)(Au-)檢測(cè)體混合物。該檢測(cè)體混合物是4/xlAu-F68-4B2和4piAu-F68-3D5。上下抽吸若干次進(jìn)行混合。7.在盒的樣本孔中添加100/d制備的樣本。8.在樣本添加后15分鐘讀取盒上的試驗(yàn)和對(duì)照線。對(duì)于任何讀數(shù)可信的試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)照線都是清晰可見(jiàn)的。流感A陽(yáng)性樣本標(biāo)注為(+)。流感A陰性樣本標(biāo)注為(-)。上箭頭(toparrow)指向?qū)φ?，下箭頭(bottomarrow)指向測(cè)試。在兩種情況下，頂部線是對(duì)照線(山羊抗小鼠mAb)，下面第二條線是測(cè)試線(用于泛流感A試驗(yàn)的F64-3H3和F68-4H9mAbs的混合物以及用于禽類試驗(yàn)的PSD95dl,2，3)。對(duì)禽類試驗(yàn)檢測(cè)2ngH5Nl蛋白。底部環(huán)狀斑點(diǎn)是樣本孔。在圖10a中，兩個(gè)試驗(yàn)都是陽(yáng)性的。圖10c顯示用圖10a和10b所示形式檢測(cè)的20個(gè)人樣本中的3個(gè)。所述樣本顯示各種結(jié)果，例如，樣本1對(duì)流感A是陽(yáng)性的，但對(duì)禽流感A是陰性的，樣本14對(duì)兩者都是陰性的。圖10d顯示對(duì)HlNl,H3N2，和H5N1重組蛋白相同的試驗(yàn)。泛FluA試驗(yàn)對(duì)這三個(gè)都是陽(yáng)性的。禽流感試驗(yàn)只對(duì)H5N1是陽(yáng)性的。在圖10e中，金交聯(lián)PDZ用作檢測(cè)體，而單個(gè)或者多個(gè)mAb用于捕獲。圖10e具有以含有F6S-4B2mAb捕獲劑的Au-PSD95dl,2，3形式添加的液體金(liquidgold)。1.7ngNS1H5N1蛋白檢測(cè)陽(yáng)性。這是禽流感特異性試驗(yàn)。在圖10f中，使用干金(driedgold)方法?？ㄆ闹苽渑c液體金方案相同，除了在進(jìn)行任何涂條前樣本墊被固定到卡片上。當(dāng)捕獲劑被涂下條后，在卡片底部的樣本墊上噴射金交聯(lián)檢測(cè)體混合物(其這時(shí)還包含偶聯(lián)稀釋劑)?？ㄆ桓稍铮懈?，并像液體試驗(yàn)一樣放入盒中。當(dāng)制備人樣本時(shí)，在100/Xl人樣本在盒中進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，它們只用緩沖溶液處理(不添加其他的金交聯(lián)檢測(cè)體混合物)。流感A陽(yáng)性樣本標(biāo)注為(+)，流感A陰性樣本標(biāo)注為(-)。這些盒的設(shè)計(jì)和讀數(shù)與液體金盒一樣。在圖10f中，樣本7和9對(duì)流感A和禽流感都是陽(yáng)性的，樣本12對(duì)流感A和禽流感都是陰性的。實(shí)施例7:PDZ/PDZ配體相互作用的抑制劑在該實(shí)施例中，選擇化合物分析其作為PDZ/PDZ配體相互作用的抑制劑。對(duì)于挑選的PDZ/PL對(duì)，篩選了下列23種藥物(1-17號(hào)是COX抑制劑)。l.氟尼酸，2.布洛芬，3.奈普生鈉，4.雙氯芬酸鈉鹽，5.乙酰水楊酸，6.水楊酸，7.氟吡洛芬，8.舒林酸硫醚，9.舒林酸，10.依托度酸，11.吲哚美辛，12.酮咯酸氨丁三醇鹽，13.酮基布洛芬，14.甲芬那酸，15.卡洛芬，16.巴氯芬，17.菲諾洛芬，18.甲磺酰苯扎托品，19.鹽酸阿米替林，20.色甘酸鈉，21.鹽酸去甲丙咪嗪，22.鹽酸氯丙咪嗪，和23.鹽酸去甲替林。在下面的說(shuō)明中，A部分提供利用COX抑制劑進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，B部分提供利用小分子抑制劑進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，C部分提供利用肽抑制劑進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。表8提供A-C部分中用于鑒定抑制劑的PDZ/PL相互作用。使用的PL序列是SEQIDNOS:54-59。結(jié)果顯示于表1-13。表8:用于藥物篩選的PDZ/PL相互作用<table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table>A.根據(jù)以下兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)選擇COX抑制劑:l.存在好在PDZ的零位發(fā)生相互作用的羰酸基團(tuán)，和2.可以位于PDZ零位的羰酸基團(tuán)附近的疏水性或者芳香族基團(tuán)。疏水性或者芳香族基團(tuán)不是絕對(duì)必需的，但是優(yōu)選的。濃度為250uM藥物濃度的COX分子在基質(zhì)/陣列競(jìng)爭(zhēng)性分析形式中接受篩選，5卩，該分析中在前面描述的小分子競(jìng)爭(zhēng)物存在或者缺失的條件下，測(cè)定配體與融合蛋白中固相PDZ結(jié)構(gòu)域的對(duì)接(docking)。結(jié)果如下。舒林酸硫醚抑制Magildl/AVC1857。菲諾洛芬抑制PSD95dl/AVC1912相互作用。分析中沒(méi)有任何藥物顯著抑制PSD95d2/AVCAA345相互作用。菲諾洛芬抑制PSD95d2/AVCAA348相互作用。菲諾洛芬抑制PSD95d3/AVC1916相互作用。菲諾洛芬抑制SHANK1/AVC1965相互作用。舒林酸硫醚抑制TIP1/AVCAA56相互作用。其他藥物在該分析中未顯示顯著的抑制。兩個(gè)主要小分子碰撞是舒林酸硫醚和苯氧苯丙酸。結(jié)果表明COX抑制劑可以用作PDZ/PDZ配體相互作用的抑制劑，這些抑制劑的衍生物可能是基于PDZ的靶標(biāo)的有效治療劑，那些被測(cè)的舒林酸硫醚和菲諾洛芬顯示出最強(qiáng)的抑制作用。B.根據(jù)分子模型預(yù)測(cè)PDZ/PDZ配體相互作用的小分子抑制劑。禾廿用Accelryssoftware(Accehys，SanDiego，CA)的insilico蹄選構(gòu)建模型，和用4種不同PDZ結(jié)構(gòu)域模擬物對(duì)接(dock)650,000分子文庫(kù)(ChemDiv,SanDiego,CA;BlancaPharmaceuticals,MountainView,CA)。該分子模型基于發(fā)現(xiàn)的化合物具有通過(guò)靜電、氫鍵鍵合和疏水性相互作用與PDZ相互作用的能力。從insilico篩選得到的最佳碰撞用于在基質(zhì)/陣列競(jìng)爭(zhēng)性分析形式中接受篩選，即，該分析中在別處描述的小分子競(jìng)爭(zhēng)物存在或者缺失的條件下，測(cè)定配體與融合蛋白中固相PDZ結(jié)構(gòu)域的對(duì)接(docking)。表9列出了篩選的抑制PDZ/PDZ配體相互作用的小分子。可以參考本領(lǐng)域技術(shù)人員任何已知的小分子公共數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得待測(cè)小分子抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)式。小分子抑制劑的其他實(shí)施例可見(jiàn)于美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)ARBV:002USP1，標(biāo)題為"SmallMoleculeInhibitorsofPDZInteractions",_提交，在此完整引入作為參考。用于篩選的小分子濃度是250uM。這些篩選的結(jié)果顯示于表10。表9250UM小分子濃度下，藥物篩選中用于碰撞的碰撞相對(duì)強(qiáng)度<table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table>表10<table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table>參考總結(jié)結(jié)果的表10和11，根據(jù)分析的OD(450)讀數(shù)，小分子被認(rèn)為是碰撞弱、中或者強(qiáng)弱碰撞OD相對(duì)于對(duì)照降低〉40y。，中碰撞OD相對(duì)于對(duì)照降低40-60%，強(qiáng)碰撞OD降低〉40%。在該后來(lái)分析中最好的碰撞然后進(jìn)行滴定結(jié)合研究，即，在相同競(jìng)爭(zhēng)性分析中滴定小分子進(jìn)行估算，IC5o值和結(jié)果總結(jié)于表10。根據(jù)insilico篩選，鑒定出PDZ/PL相互作用的不同小分子抑制劑。這些分子可用于阻斷治療值的PDZ/PL相互作用，包括流感ANS1/PDZ相互作用。C.鑒定和檢測(cè)肽治療抑制劑(參見(jiàn)表11)。每個(gè)包含PL(H5N1，H3N2和H1N1)的流感ANS1蛋白類型具有與若干種PDZs相互作用的潛力。這些PDZ的每一個(gè)本身可能就是抗有關(guān)流感A株的潛在治療革巴標(biāo)，這樣的話，用肽阻斷PDZ可能具有治療功用。為了鑒定潛在的治療肽，搜索AVC專利數(shù)據(jù)庫(kù)尋找每個(gè)PDZ的PDZ配體。AVC數(shù)據(jù)庫(kù)包含PL/PDZ相互作用，這是基于經(jīng)先前描述的專利ELISA試驗(yàn)(G分析)鑒定的。用于鑒定有希望的PL的標(biāo)準(zhǔn)基于下列3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)1)OD(450nm)>=0.5，2)測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<0.25，3)肽濃度=<20微摩爾。根據(jù)PDZ/PL結(jié)合相互作用、結(jié)構(gòu)和結(jié)合數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定C端序列最可能與根據(jù)PSD95d2結(jié)構(gòu)和結(jié)合數(shù)據(jù)的PSD95d2結(jié)構(gòu)(SEQIDNO:l，例如)結(jié)合。因此，禽流感A(H5N1)優(yōu)選的肽治療抑制劑基于結(jié)合PSD95d2的肽和，與符合共有序列E/D/N/Q-S/T-D/E/Q/N-V/L(SEQIDNO:48)的PSD95d2結(jié)合的最佳和優(yōu)選的肽序列。利用這些共有序列，以下是用作結(jié)合PSD95d2結(jié)構(gòu)域的肽抑制劑優(yōu)選C端序列的實(shí)例1)ESDV(SEQIDNO:49)2)ESEV(SEQIDNO:2)3)ETDV(SEQIDNO:50)4)ETEV(SEQIDNO:51)5)DTDV(SEQIDNO:52)6)DTEV(SEQIDNO:53)7)DSDV(SEQIDNO:996)8)DSEV(SEQIDNO:997)針對(duì)各PDZ的潛在PDZ配體治療肽匯總于表11。表11在第一列顯示PL肽標(biāo)識(shí)符(AVCID)，第二列顯示PL肽名稱(源自作為其來(lái)源的蛋白)，第三列顯示肽序列，最后一列顯示序列識(shí)別號(hào)。表的每個(gè)部分包含一個(gè)題頭，表明PLs將結(jié)合的PDZ蛋白。表11所示的肽或者其保留C端PL的截短型是適于治療流感的試劑。阻斷致病性流感PL與PDZ結(jié)合的PL肽治療劑可用于治療致病性流感。例如，通過(guò)將轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白肽(蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)連接到該肽序列的N端，這些肽(SEQIDNOS:89-987)中每個(gè)肽的C端序列(長(zhǎng)3到20個(gè)氨基酸)可以轉(zhuǎn)變成治療劑。具有C端保守的3個(gè)氨基酸的至少長(zhǎng)5個(gè)氨基酸的這些肽的亞片段被用作表11所列各PDZ的病毒PL/PDZ相互作用的治療抑制劑，優(yōu)選，至少6個(gè)氨基酸長(zhǎng)，7個(gè)氨基酸長(zhǎng)，8個(gè)氨基酸長(zhǎng)，9個(gè)氨基酸長(zhǎng)，和10個(gè)氨基酸長(zhǎng)。優(yōu)選至少C端4個(gè)氨基酸是保守的，更優(yōu)選，C端5個(gè)氨基酸是保守的，C端6個(gè)氨基酸，或者C端7個(gè)氨基酸。肽治療劑還包括包含肽模擬物中氨基酸保守取代的肽。但是，優(yōu)選保守取代位于除了最后3或者4個(gè)氨基酸以外的區(qū)域中。使用若干種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白肽序列，包括Tat和觸足蛋白。利用實(shí)施例2描述的A或者GPDZ分析，鑒定那些抑制PDZ/PL相互作用的肽，對(duì)所述肽進(jìn)行進(jìn)一步分析。對(duì)那些被證明具有抑制作用的肽在體外和流感動(dòng)物模型中進(jìn)行進(jìn)一步研究。實(shí)施例8:與毒性相關(guān)的NS2模體在前面部分，NS1PL模體，ESEV(SEQIDno:2)，與禽亞型H5N1中所見(jiàn)的高度毒性/致死表型有關(guān)。因?yàn)镹S1的PL部分與NS2重疊，分析了禽pl保守性對(duì)重疊區(qū)中NS2序列的影響。NS1和NS2對(duì)重疊區(qū)使用不同的讀碼框，這對(duì)可以使用的密碼子的選擇構(gòu)成了限制。所述分析確認(rèn)，該區(qū)域的序列變化改變了NS1而不是NS2的蛋白序列(參見(jiàn)表12和13—在表12中STYPE是指病毒的亞型)。具體地，在H5N1中，pl序列ESEV(SEQIDNO:2)，EPEV(SEQIDNO:27)和ESKV(SEQIDNO:4)不改變NS2的蛋白序列，在NS2的70位保持絲氨酸(S或者Ser)。相反，良性亞型例如H3N2包含導(dǎo)致70位為甘氨酸的核苷酸序列。這種情況的唯一例外是導(dǎo)致1918年致命大流行病的1918株H1N1，其表達(dá)PL，KSEV(SEQIDNO:41)，這導(dǎo)致與H5N1株一樣的70位絲氨酸。表12所示的NSlPL序列是ESEV(SEQIDNO:2),EPEV(SEQIDNO:27),ESKV(SEQIDNO:4)，RSKV(SEQIDNO:8),KSEV(SEQIDNO:41)，和RSEV(SEQIDNO:7)，在表中鑒別NSlC端編碼區(qū)域的SEQIDNO與NS2區(qū)域的SEQIDNO相同s(參見(jiàn)表12和13)。因此，流感A病毒NS2蛋白中70位的絲氨酸與病毒的毒性相關(guān)。因而，70位絲氨酸可以用作高毒性的標(biāo)記物，而NS2中70位甘氨酸可以用作更良性的臨床病程的標(biāo)記物。下文中NS270位的變化被用作診斷標(biāo)記物和治療靶標(biāo)。絲氨酸取代允許該序列被磷酸化，可能被激酶調(diào)控。表12/S70與高毒性臨床病程相關(guān)<table>tableseeoriginaldocumentpage140</column></row><table>用作診斷標(biāo)記物從表現(xiàn)流感A癥狀的患者中提取粘液樣本。該樣本經(jīng)過(guò)處理使其更具流動(dòng)性以便用于側(cè)向流形式。利用實(shí)施例6中提出的方案產(chǎn)生側(cè)向流形式，除了用一種核酸鑒定捕獲劑來(lái)捕獲樣本中存在的任何包含70位絲氨酸的NS2，所述核酸與包括重疊區(qū)并包含來(lái)自表12的NS2蛋白中的絲氨酸70的序列互補(bǔ)。所述捕獲劑包括與所有已知的毒性流感A株互補(bǔ)的核酸。陽(yáng)性結(jié)果表明患者應(yīng)該接受針對(duì)流感A病毒高毒性形式的治療。<table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table>基于單克隆抗體的試驗(yàn)是相似的，除了一系列特異識(shí)別包括來(lái)自表12絲氨酸70的重疊區(qū)的抗體被用作捕獲劑。用于治療劑設(shè)計(jì)使用阻斷NS2和靶標(biāo)之間相互作用的治療劑。具體地，治療劑阻斷NS2蛋白在70位絲氨酸處的結(jié)合。給已經(jīng)感染流感A的患者或者在感染前施用肽或者小分子治療劑，給藥量足以阻斷NS2和其靶標(biāo)之間的相互作用。通過(guò)吸入給藥，繼續(xù)治療直到患者癥狀消失和/或患者不再有感染疾病的危險(xiǎn)。本說(shuō)明書(shū)引用的全部出版物和專利在此引入作為參考，就如各個(gè)獨(dú)立出版物或者專利是具體和單獨(dú)地表明引入作為參考。通過(guò)GID或者檢索號(hào)引用的Genbank記錄，尤其是任何多肽序列、多核苷酸序列或者其注釋在此引入作為參考。任何出版物的引用是因?yàn)槠涔_(kāi)在提交日期前，不應(yīng)被認(rèn)為是承認(rèn)因?yàn)橄惹暗陌l(fā)明，本發(fā)明不享有居先于這類出版物的權(quán)利。盡管本發(fā)已經(jīng)明參考其特定實(shí)施例進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，可以做出各種改變和等同替換，而不脫離本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍。此外，可以做出許多改進(jìn)以使特定情況、材料、物質(zhì)的組成、方法、工序或者步驟適應(yīng)本發(fā)明的目標(biāo)、精神和范圍。所有這類改進(jìn)認(rèn)為是在此處所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本說(shuō)明書(shū)中提及的全部出版物和專利申請(qǐng)?jiān)诖讼嗤潭纫胱鳛閰⒖?，就如各個(gè)獨(dú)立出版物或者專利申請(qǐng)是具體和單獨(dú)地指出用來(lái)引入作為參考。表11:結(jié)合DLG2dl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage143</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合GORASPdl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合GRIP1d4的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合INADLd8的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage146</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage149</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合KIAA1415dl的PL序列(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合KIAA1719d4的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage151</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合LimMystiquedl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合LimMystiquedl的PL序列(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage153</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合MAGIldl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage154</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合MAGIldl的PL序列(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage155</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合MAGI2d5的PL序列(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage156</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合MAGI2d5的PL序列(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage157</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合MAGI3dl的PL序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage158</formula>3表11續(xù)結(jié)合MAGI3dl的PL序列(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合MAGI3d2的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage160</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage161</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage162</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合NeDLGd2的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage163</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合NeDLGd2的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage164</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合外膜蛋白的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage165</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合外膜蛋白的PL序列AVCID肽序列Seq.IDNo.AA07CD34ATSRNGHSARQHVVADTEL635636AA244—a-2B腎上腺素能受體f丁AXispgg;leppsekhfretev637AA"2iGluR5-2PTPT!LGI;NIiGNDPDRGTSI638AA240多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ELVDRGEV，TIiRHWLKV639AA240多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白iEIiVDRGEVRQFTLRHWLKV640Nedasin(S-型)NIEEVYVGGKQVVPFSSSV641AA181BAI-1(腦特異性血管生成抑制劑1)SGAT工PLVGQDIIDLQTEV642AA095GluR5-2(.大,)FTSIIiTCHQRRTQRKETVA643AA70.1HPVE6#"SGGNRARQERIiQRRRETQV644AA06CD6SPQPDSTDNDDYDDISAA645AA23.3Fas配體SSKSKSSEESGTBTGLYKL646AA228柄蛋白2SPDSSYQGKGFVMSRAMYV647AA223密蛋白lYPTPRPYPKPAPSSGKDYV648A入36神經(jīng)配蛋白TFAAGFNSTGLPHSTTRV649AA200LHER2受體FKGTPTAENPEYLGLDVPV650AA69.1HPVE6針6(修飾的)TGRGMSGGRSSRTRRETQL651AA66.1HPVE6#66(無(wú)半胱氨酸)(^"K:lq'awrht^rqStESTV652AA化ONMDA谷氨酸受體2C(無(wú)半胱氨酸)QGFPGPATWRRISSLESEV653AA22DNAM-1RED工YVNYPTFSRRPKTRV654AA33KV1.3TTNNNPNSAVN工KK工FTDV655AA114_GLUR7(代謝型谷氨酸擎體).|DPNSPAAKKKYVSYNNIjV工656AdenoE4typ9GTIiUjERVIFPSVKIATLV657AA125緊密連合蛋白3(ZO-3)HDAESSDEDGYDWGPATDL658AA77HPV-E6#63HKVRNKFKAKCSiLCRLYII659AA123a-輔肌動(dòng)蛋白2PGALDYAAFSSALYGESDL660AA348TAT國(guó)DA2B9grkkrrqrrrk;lssiesdv6611777Tat-M-蛋白-SARS|GRKKRRQRRRNDNIALLVQ6621776Tat-E-蛋白-SARSGRKKRRQRRRSEGVPDLIjV663166表11續(xù)結(jié)合Pickldl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage167</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合PSD95dl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage168</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合PSD95dl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage169</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage170</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合PSD95dl,2的PL序歹iJ(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage171</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合PSD95d2的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage172</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合PSD95d2的PL序歹!j(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage173</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合PTN-3的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage174</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合SHANKl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage174</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合SHANKl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage175</column></row><table>表ll續(xù)結(jié)合TIP43dl的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage176</column></row><table>表11續(xù)結(jié)合Vartuld2的PL序列<table>tableseeoriginaldocumentpage177</column></row><table>引文1.Fauci,2005，Nature435(7041):423-424.2.Normile，2005，Science308(5726):1234-1235.3.Guan，2002,PNAS99(13):8950-8955.4.Jin,2004,AvianDis.48(4):870-878.5.Webster,2004,Rev.ScLTech.23(2):453-465.6.Noah，2003Virology307(2):386-395.7.Chien，Biochemistry43(7):1950-62.8.Dauber，J.Fzro/.78(4):1865-1872.9.Quinlivan，2005J.Fifro/.79(13):8431-8439.10.Solorzano，2005JVirol,79(12):7535-7543.11.Stasakova,2005,JGe/Virol.86(Pt1):185-195.12.Diebold，2003,Nature424(6946):324陽(yáng)328.13.Theoftlopoulos,2005，Ann.Rev.Immunol.23:307-336.14.Yang,2005J.Biol.Chem.280(36):31530-31536.15.Uddin，2002.J.Biol.Chem.277(17):14408-14416.16.Voss,2005JBiol.Chem.2ni:17371-17379.17.DeVries2004JBiol,Chem.279(44):45603-45612.18.Page2003J.Immunol.170(11):5681-5689.19.Farshori,2003,J.SteroidBiochem.Mol.Biol.85(2-5):337-347.20.Akca,2003，GrowthFactors21(1):31-39.21.Mmami2003，J.Biol.Chem.278(9):6976-6984.22.Greenspan,1988J.Virol.62:3020-3026.23.Compans，1973，Virology51:56-70.24.Krug，1973，Virology56:334-348.25.Seo2004,VirusRes.103(1-2):107-1326.Solorzano,2005,J.Virol.79(12):7535-7543.27.Quinlivan,2005J.Virol.79(13):8431-8439.28.Garcia-Sastre,1998，Virology252:324-330.29.Lipatov,2005，J.Gen.Virol.86(4):1121-1130.30.Usacheva,2001，J.Biol.Chem.276(25):22948-22953.31.Usacheva，2003J,Immunol.171(6):2989-2994.32.Osmanagic-Myers;2004.Plectin-RACKl，J.Biol.Chem.279(8):18701-18710.33.Litjens,2005，J,Biol.Chem.280(23):22270-7.34.Kubota,2002，J,Virology16(24):12676-12682.35.Yokota,2003,Virology306(1):135-146.36.Spackman,2005,J.Vet..Diagn..Invest.17(1):76-80.37.Lee,J.Virol,Methods119(2):151-158.38.Munch,2001,Arch.Virol.146(1):87-97.39.Xu，2005，J.Clin.Microbiol.43(4):1953-1955.40.Tumpey,2005,J.Clin.Microbiol.43(2):676-682.41.Steininger,2002，J.Clin.Microbiol.40(6):2051-2056.42.Cattoli,2004,AvianPathol.33(4):432-437.43.Kaiser,1999"J.Clin.Virol.14(3):191-197.44.Tucker,2001.Philos.Trans.R.Soc丄ondBBiol.Sci.356(1416):1915-1924.45.Sharma，2002,Arch.Pediatr.Adolesc.Med.156(1):41-43.50.B層n，1983,NS1.Virology130(1):134-143.'51.Seo，2000,NatureMedicine8(9):950-954.52.Govorkova,2005J.Virol.19(4):2191-2198.權(quán)利要求1.一種鑒定患者是否感染A型流感病毒的方法，包括確定患者樣本中是否存在A型流感病毒的NS1蛋白，存在表明患者感染A型流感病毒。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其中確定包括將患者樣本與特異結(jié)合A型流感病毒蛋白NS1的試劑接觸；和檢測(cè)該試劑和NS1蛋白之間的特異結(jié)合，特異結(jié)合表明A型流感病毒的存在。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中確定包括確定編碼NS1蛋白PDZ配體模體(PL)的mRNA的存在，并由mRNA的存在推斷出NS1蛋白的存在。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中NS1蛋白PL具有模體S/T-X-V/I/L，其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸，和X是任意氨基酸。5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中試劑是至少一種PDZ多肽。6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中試劑是至少一種抗體。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中抗體對(duì)NS1蛋白的保守區(qū)特異。8.如權(quán)利要求2所述的方法，其中接觸步驟包括，將患者樣本與特異結(jié)合A型流感病毒蛋白NS1不同表位的第一和第二試劑接觸，第一試劑固定在支持物上，并且檢測(cè)步驟檢測(cè)其中第一和第二試劑與NS1蛋白特異結(jié)合的夾心，以表明病毒的存在。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中第一和第二試劑是第一和第二抗體。10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中第一試劑是一種或者多種PDZ多肽，和第二試劑是一種或者多種抗體。11.如權(quán)利要求8所述的方法,其中第一試劑是一種或者多種PDZ多肽和一種或者多種抗體的混合物。12.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述抗體是對(duì)A型流感病毒NS1的所有亞型特異的抗體。13.如權(quán)利要求5所述的方法，其中至少一種PDZ多肽選自外膜，PSD95(PDZ弁2),PSD95(PDZ#1,2,3),DLG1(PDZ#1)，DLG1(PDZ#1,2),DLG1(PDZ#2)，DLG2(PDZ#1)，DLG2(PDZ#2),Magi3(PDZ#1),PTN3(PDZ#1),MAST2(PDZ#1),NeDLG(PDZ#1,2),Shankldl，Shank2dl,Shank3dl,Syntrophinla,Syntrophinyl，Magil(PDZ#1)，Magil(PDZ#4)，Tipl;PTPLl(PDZ#1),Mint3(PDZ#1)，LymMystique(PDZ#1)，DLG2(PDZ#3),MUPPl(PDZ#8)，NeDLG(PDZ#1),DLG5(PDZ#1)，PSD95(PDZ#1)，NumBP(PDZ#3)，LIMK1(PDZ#1)，KIAA0313,DLGl(PDZ弁2),Syntenin(PDZ#2),Pickl，MAST2，PTN3(PDZ#1)，NOSl(PDZ#1,2，3),M證l(PDZ#2)，ZO-1(PDZ#2)，NSP和RIM212。14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述患者樣本選自血液，組織，鼻分泌物，肺滲出液，泄殖腔樣本，糞便樣本，喉拭子和唾液。15.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述患者選自人，鳥(niǎo)，豬，馬，和哺乳動(dòng)物。16.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述PDZ多肽是包括PSD95d2的PL結(jié)合區(qū)SEQIDNO:l(80-100氨基酸區(qū)域)的蛋白。17.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述PDZ多肽是選自下列的蛋白PSD95dl,PSD95d2,PSD95d3,歸DL8dl，Magildl,DLGld2,DLGld3,NeDLGldl，和NeDLGld2。18.—種用于A型流感感染診斷和分型的方法，包括鑒定亞型特異性A型流感病毒蛋白NS1PDZ配體模體(PL)區(qū)的存在。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中PL區(qū)具有模體S/T-X-V/I/L，其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸，和X是任意氨基酸。20.—種檢測(cè)待測(cè)樣本中包含PL區(qū)的A型流感病毒蛋白的存在和量的方法，包括在適于結(jié)合的條件下，將等份待測(cè)樣本和至少一種PDZ肽和至少—種PDZ配體(PL)檢測(cè)劑混合；和測(cè)定PDZ肽和PL檢測(cè)劑之間的結(jié)合，其中結(jié)合降低表明待測(cè)樣本中存在A型流感病毒蛋白。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中A型流感病毒蛋白選自NP，HA，Ml和腦。22.如權(quán)利要求20所述的方法，其中PL檢測(cè)劑包括來(lái)自A型流感病毒蛋白C末端的PL模體，所述A型流感病毒蛋白選自NP，HA，Ml禾卩NS1。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中PL模體是S/T-X-V/I/L，其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸，和X是任意氨基酸。24.—種鑒定患者是否感染A型流感病毒的方法，包括確定患者的鼻分泌物、痰樣本或者喉拭子中是否存在A型流感病毒的NS1蛋白，存在表明患者感染A型流感病毒。25.—種檢測(cè)待測(cè)樣本中包含PL區(qū)的A型流感病毒蛋白的存在和量的方法，包括將等份待測(cè)樣本和至少一種PDZ肽混合；和測(cè)定PDZ肽和PLA型流感病毒蛋白之間的結(jié)合，其中結(jié)合表明待測(cè)樣本中存在A型流感病毒蛋白。26.—種確定患者是否感染流感A致病株的方法，包括確定患者是否感染流感A,'如果患者被感染；和確定患者樣本中帶有PL模體的非結(jié)構(gòu)蛋白的存在，存在表明患者感染A型流感病毒的致病株。27.—種鑒定患者樣本中A型流感病毒的特異性亞型存在的方法，包括將患者樣本與至少一種PDZ多肽或者至少一種捕獲抗體接觸，所述捕獲抗體與對(duì)流感病毒A亞型特異的NS1蛋白的PL模體特異結(jié)合；和檢測(cè)PDZ多肽或者捕獲抗體是否與樣本中的PL模體特異結(jié)合，特異結(jié)合表明亞型的存在。28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中接觸步驟包括將患者樣本與多個(gè)PDZ多肽接觸，所述PDZ多肽特異結(jié)合多個(gè)NS1蛋白中的多個(gè)PL模體，所述PL模體對(duì)流感病毒A的多個(gè)亞型特異；并且檢測(cè)包括確定哪種PDZ多肽特異結(jié)合其PL模體，與一種或者多種PDZ多肽結(jié)合從而表明亞型的存在。29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述捕獲抗體識(shí)別NS1的羧基末端。30.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述捕獲抗體或者PDZ多肽識(shí)別選自下列的一種或者多種PDZ配體模體(PL):ESEV(SEQIDNO:2),ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQID戮4)，TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6)，RSEV(SEQIDNO:7)，RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9),GSKV(SEQIDNO:10)，NICI(SEQIDNO:11),TICI(SEQIDNO:12),RICI(SEQIDNO:13)，DMAL(SEQIDNO:14)'畫(huà)TL(SEQIDNO:15),DIAL(SEQIDNO:16)，DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18),SEV,SEI，SKV和SKI。31.如權(quán)利要求27所述的方法,其中所述PDZ多肽選自外膜，PSD95(PDZ#2)，PSD95(PDZ#1,2,3)，DLGl(PDZ#1),DLGl(PDZ#1,2)，DLGl(PDZ弁2),DLG2(PDZ#1),DLG2(PDZ#2),Magi3(PDZ#1),PTN3(PDZ弁l)，MAST2(PDZ#1),NeDLG(PDZ#1，2)，Shankldl,Shank2dl，Shank3dl，Syntrophinla，Syntrophinyl,Magil(PDZ#1),Magil(PDZ#4),Tipl;PTPLl(PDZ弁l),Mint3(PDZ#1),LymMystique(PDZ#1),DLG2(PDZ#3),MUPP1(PDZ#8),NeDLG(PDZ#1)，DLG5(PDZ#1)，PSD95(PDZ#1)，NumBP(PDZ#3),LIMK1(PDZ#1),KIAA0313,DLGl(PDZ#2)，Syntenin(PDZ#2),Pickl,MAST2,PTN3(PDZ#1)，NOS1(PDZ#1，2，3)，M證l(PDZ#2)，ZO-1(PDZ#2)，NSP和RIM2。32.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述患者樣本選自鼻分泌物，痰樣本，喉拭子，泄殖腔樣本，糞便樣本，肺滲出液和唾液。33.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述亞型是禽流感A，所述PL是PL模體ESEV/I/A(SEQIDNO:19)。34.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述亞型是H3N2，PL是PL模體RSKV。35.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述PL是PL模體ESKV(SEQIDNO:4)。36.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述亞型是H1N1，PL是PL模體RSEV。37.如權(quán)利要求27所述的方法，還包括將樣本與檢測(cè)抗體接觸。38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述檢測(cè)抗體包括信號(hào)發(fā)生化合物。39.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述檢測(cè)抗體不抑制PL與PDZ的結(jié)合或者捕獲抗體與NS1的結(jié)合。40.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述PDZ多肽或者所述抗體固定在固體支持物上。41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述固體支持物是毛細(xì)管流動(dòng)分析裝置，所述接觸步驟包括將小棒浸在所述患者樣本中。42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中毛細(xì)管流動(dòng)分析是免疫分析。43.如權(quán)利要求40所述的方法，其中固體支持物是側(cè)向流分析。44.一種用于患者樣本中流感A病毒的鑒定和分型的試劑盒，包括，與流感A病毒NS1特異結(jié)合的試劑，其中所述試劑固定在固體支持物上。45.如權(quán)利要求44所述的試劑盒，其中所述試劑是抗體，PDZ多肽，寡核苷酸適配體，或者其混合物。46.—種用于患者樣本中流感A病毒鑒定和/或分型的試劑盒，包括與流感A的病毒編碼蛋白特異結(jié)合的試劑；和與NS1蛋白特異結(jié)合的試劑。47.如權(quán)利要求46所述的試劑盒，其中特異結(jié)合NS1蛋白的試劑與蛋白上的PL區(qū)結(jié)合。48.如權(quán)利要求46所述的試劑盒，其中所述試劑是抗體，PDZ多肽，寡核苷酸適配體，或者其混合物。49.如權(quán)利要求46所述的試劑盒，其中所述流感A的病毒編碼蛋白是NS1。50.—種用于患者樣本中流感A病毒鑒定和/或分型的試劑盒，包括與NS1在PL模體以外處特異結(jié)合的試劑；和與NS1在PL模體處特異結(jié)合的試劑。51.—種包括多個(gè)PDZ多肽的試劑盒，所述PDZ多肽對(duì)多個(gè)流感A病毒的多個(gè)NS1蛋白中的多個(gè)PL模體特異。52.—種鑒定能夠特異結(jié)合流感病毒PDZ配體(PL)的PDZ多肽的方法，包括將流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白PL與具有PDZ結(jié)構(gòu)域的候選多肽在適于結(jié)合的條件下接觸；和檢測(cè)PL與候選多肽的特異結(jié)合；和確認(rèn)PL與PDZ結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。53.—種分離的抗體，所述抗體與A型流感病毒NS1蛋白的羧基末端模體特異結(jié)合。54.如權(quán)利要求53所述的分離的抗體，其中所述羧基末端模體包括選自下列的PL模體ESEV(SEQIDNO:2),ESEI(SEQIDNO:3)，ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7)，RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9),GSKV(SEQIDNO:10),NICI(SEQIDNO:11)，TICI(SEQIDNO:12),RICI(SEQIDNO:13)，DMAL(SEQIDNO:14),DMTL(SEQIDNO:15),DIAL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18),SEV,SEI,SKV和SKI。55.如權(quán)利要求53所述的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體或者抗體片段。56.如權(quán)利要求53所述的抗體，其中所述PL模體是ESEV/I/A(SEQIDNO:19)。57.—種用于患有A型流感病毒感染或者處于A型流感病毒感染風(fēng)險(xiǎn)下的患者的治療或者預(yù)防的方法，包括對(duì)患者給藥試劑的有效方案，所述試劑抑制病毒NS1蛋白與細(xì)胞PDZ蛋白的相互作用，從而實(shí)現(xiàn)治療或者預(yù)防感染。58.如權(quán)利要求57所述的方法，其中所述試劑是特導(dǎo)結(jié)合A型流感病毒NS1蛋白PL模體的抗體。59.如權(quán)利要求57所述的方法，其中試劑選自反義寡核苷酸，小分子，siRNA和鋅指蛋白，其中所述試劑抑制流感ANh蛋白或者PDZ蛋白的表達(dá)。'60.如權(quán)利要求58所述的方法，其中NS1的PL模體選自ESEV(SEQIDNO:2)，ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6),RSEV(SEQIDNO:7),RSKV(SEQIDNO:8)，GSEI(SEQIDNO:9)，GSKV(SEQIDNO:10)，NICI(SEQIDNO:11),TICI(SEQIDNO:12),RICI(SEQIDNO:13),DMAL(SEQIDNO:14),DMTL(SEQIDNO:15)，DIAL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18)，SEV，SEI,SKV和SKI。61.如權(quán)利要求58所述的方法，其中試劑是PDZ多肽。62.如權(quán)利要求61所述的方法，其中PDZ多肽至少包括與PL相互作用的結(jié)合區(qū)，SEQIDNO:l。63.如權(quán)利要求61所述的方法，其中所述PDZ多肽選自外膜，PSD95(PDZ#2)，PSD95(PDZ#1,2,3)，DLGl(PDZ#1)，DLGl(PDZ#1,2),DLGl(PDZ#2)，DLG2(PDZ#1)，DLG2(PDZ#2)，Magi3(PDZ#1),PTN3(PDZ弁l),MAST2(PDZ#1),NeDLG(PDZ#1,2)，Shankldl，Shank2dl,Shanl(3dl，Syntr叩hinla，Syntrophinyl,Magil(PDZ#1)，Magil(PDZ#4),Tipl;PTPLl(PDZ#1),Mint3(PDZ#1),LymMystique(PDZ#1)，DLG2(PDZ#3)，MUPPl(PDZ#8),NeDLG(PDZ#1)，DLG5(PDZ#1)，PSD95(PDZ#1),NumBP(PDZ#3),LIMKl(PDZ#1),KIAA0313,DLGl(PDZ#2)，Syntenin(PDZ#2),Pickl,MAST2,PTN3(PDZ#1),NOSl(PDZ#1,2,3)，M窗l(fā)(PDZ#2)，ZO-1(PDZ弁2),NSP和RIM2。64.—種篩選抗病毒劑的方法，包括-在待測(cè)化合物存在或者缺失的條件下，將PDZ多肽和流感病毒PDZ配體(PL)接觸；和將待測(cè)化合物存在時(shí)PDZ/PL結(jié)合的量與待測(cè)化合物缺失時(shí)相比較，其中所述抗病毒劑減少PDZ/PL結(jié)合。65.如權(quán)利要求64所述的方法，還包括在體內(nèi)或者胞內(nèi)檢測(cè)所述試劑以鑒定其是否干擾干擾素產(chǎn)生。66.—種非天然的PDZ配體(PL)肽診斷劑，包括選自流感A蛋白C端氨基酸序列以內(nèi)的氨基酸線性陣列，其中所述PL能夠結(jié)合哺乳動(dòng)物PDZ多肽。67.如權(quán)利要求66所述的非天然PDZ配體(PL)肽試劑，其中PL具有模體S/T-X-V/I/L，其中S是絲氨酸，T是蘇氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，L是亮氨酸，和X是任意氨基酸。'68.如權(quán)利要求66所述的非天然PL肽診斷劑，其中流感ANS1蛋白的氨基酸線性陣列選自ESEV(SEQIDN0:2)，ESEI(SEQIDNO:3),ESKV(SEQIDNO:4)，TSEV(SEQIDNO:5)，GSEV(SEQIDNO:6)，RSEV(SEQIDNO:7),RSKV(SEQIDNO:8),GSEI(SEQIDNO:9),GSKV(SEQIDNO:10)，NICI(SEQIDNO:11),TICI(SEQIDNO:12),RICI(SEQIDNO:13),固AL(SEQIDNO:14)，DMTL(SEQIDNO:15),DIAL(SEQIDNO:16),DLDY(SEQIDNO:17),SICL(SEQIDNO:18)，SEV，SEI,SKV和SKI。69.如權(quán)利要求66所述的非天然PL肽診斷劑，還包括選自下列的診斷劑陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，分析標(biāo)準(zhǔn)品，分析校準(zhǔn)品，競(jìng)爭(zhēng)性分析配體，標(biāo)記的肽檢測(cè)劑或者固相捕獲劑。70.如權(quán)利要求66所述的非天然PL肽診斷劑，還包括合成肽，重組多肽，基本上純化的天然PL多肽，基本上純化的天然PL多肽的片段，模擬PL的肽，寡核苷酸適配體PL和多肽適配體PL。71.如權(quán)利要求70所述的非天然PL肽，其中所述PL肽來(lái)自流感ANSI蛋白。72.—種用于檢測(cè)生物樣本中流感APL的非天然PDZ多肽診斷劑，包括能夠結(jié)合流感ANS1蛋白的非天然PDZ多肽，其中PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白診斷劑選自陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、分析標(biāo)準(zhǔn)品、分析校準(zhǔn)品、競(jìng)爭(zhēng)性配體、標(biāo)記的蛋白檢測(cè)結(jié)合伴侶和捕獲劑的診斷劑。73.如權(quán)利要求72所述的非天然PDZ多肽診斷劑，選自外膜，PSD95(PDZ#2)，PSD95(PDZ#1,2,3),DLGl(PDZ#1)，DLGl(PDZ#1,2)，DLGl(PDZ弁2)，DLG2(PDZ弁l)，DLG2(PDZ弁2),Magi3(PDZ#1)，PTN3(PDZ#1)，MAST2(PDZ#1)，NeDLG(PDZ#1,2)，Shankldl，Shank2dl，Shank3dl，Syntrophinla，Syn加phinyl，Magil(PDZ#1)，Magil(PDZ#4),Tipl;PTPLl(PDZ#1)，Mint3(PDZ#1)，LymMystique(PDZ#1),DLG2(PDZ#3)，MUPPl(PDZ弁8)，NeDLG(PDZ弁l)，DLG5(PDZ#1),PSD95(PDZ#1),NumBP(PDZ#3)，LIMK1(PDZ#1)，KIAA0313,DLGl(PDZ#2),Syntenin(PDZ#2),Pickl,MAST2，PTN3(PDZ#1),NOSl(PDZ#1,2，3),M證l(PDZ#2)，ZO-l(PDZ#2),NSP和RIM2。74.—種用于檢測(cè)待測(cè)樣本中流感A蛋白的信號(hào)發(fā)生結(jié)合劑，包括非天然PL或者非天然PDZ，其中PL或者PDZ任一種包括與信號(hào)發(fā)生化合物共價(jià)連接的肽或者多肽。75.—種鑒定患者是否感染致病流感A的方法，包f舌確定患者樣本中是否存在A型流感病毒的NS2蛋白，所述蛋白包括第70位的絲氨酸，該蛋白的存在表明患者感染流感A的致病株。76.如權(quán)利要求75所述的方法，其中確定包括將患者樣本與特異結(jié)合NS2蛋白的試劑接觸，所述NS2蛋白中第70位被絲氨酸所占據(jù)。77.如權(quán)利要求76所述的方法，其中試劑是抗體。78.如權(quán)利要求75所述的方法，其中確定包括確定編碼NS2蛋白的核酸密碼子70中的一個(gè)或者多個(gè)核苷酸的一致性。79.如權(quán)利要求78所述的方法，其中確定包括將核酸與探針或者引物接觸，所述探針或者引物與包括或者靠近一個(gè)或者多個(gè)核苷酸的核酸序列雜交。80.—種鑒定患者是否感染致病性A型禽流感病毒的方法，包括將患者樣本與PSD-95PDZ蛋白接觸；和檢測(cè)PSD-95PDZ蛋白與樣本之間的特異結(jié)合，特異結(jié)合表明存在A型流感病毒，存在表明患者感染致病性A型禽流感病毒。81.如權(quán)利要求80所述的方法，其中致病性A型流感病毒是H5N1。82.如權(quán)利要求80所述的方法，其中PSD-95PDZ蛋白是PSD-95的結(jié)構(gòu)域2。83.如權(quán)利要求80所述的方法，其中流感NS1蛋白PL具有以下模體ESKV(SEQIDN0:4),ESEI(SEQIDNO:3),或者ESEV(SEQIDNO:2)。84.如權(quán)利要求80所述的方法，其中接觸步驟包括將患者樣本與PSD-95PDZ蛋白和抗體接觸，所述抗體與A型流感病毒蛋白NSl的不同表位而不是PSD-95PDZ蛋白特異結(jié)合，PSD-95固定在支持物上，檢測(cè)步驟檢測(cè)與抗體特異結(jié)合的NS1蛋白。85.如權(quán)利要求80所述的方法，還包括將患者樣本與作為對(duì)照的第二種PDZ蛋白INADLd8接觸，并確定特異結(jié)合，第一種PDZ-95蛋白相對(duì)于第二種PDZ蛋白的特異性結(jié)合更高表明患者感染致病性A型禽流感病毒。86.NS-1蛋白在取自患者的樣本中檢測(cè)流感A的用途。87.如權(quán)利要求l所述的用途，其中樣本是鼻分泌物。88.與流感A致病株的PL模體結(jié)合的抗體在鑒定流感A中的用途。89.PDZ多肽在檢測(cè)流感A致病株中的用途。90.NS-1蛋白在取自患者的樣本中檢測(cè)流感A的用途。91.如權(quán)利要求l所述的用途，其中樣本是鼻分泌物。92.與流感A致病株的PL模體結(jié)合的抗體在鑒定流感A中的用途。93.PDZ多肽在檢測(cè)流感A致病株中的用途。94.來(lái)自流感A致病株的NS-1蛋白和結(jié)合NS-1的PDZ蛋白在篩選具有用于治療流感A致病株活性的化合物中的用途。全文摘要本發(fā)明提供用于檢測(cè)樣品中流感病毒的存在和量的方法和組合物，包括高危流感A株。本發(fā)明還提供檢測(cè)對(duì)象是否感染流感病毒以及檢測(cè)流感病毒類型和株的方法。該方法包括將對(duì)象的樣本與PDZ多肽(PDZ)和/或PDZ配體(PL)接觸，并檢測(cè)PDZ和PL之間是否發(fā)生結(jié)合相互作用。還提供鑒定抗病毒劑的分析，以及利用組合物改變流感感染細(xì)胞中PDZ與PL結(jié)合的方法。文檔編號(hào)A61K39/00GK101287988SQ200680032034公開(kāi)日2008年10月15日申請(qǐng)日期2006年7月3日優(yōu)先權(quán)日2005年7月1日發(fā)明者喬舒亞·D·拉比諾維茨,彼得·S·盧,邁克爾·P·貝爾馬雷什申請(qǐng)人:阿波維塔公司