專利名稱：基因重組人源化色素上皮衍生因子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組蛋白及其應(yīng)用，特別是涉及一種基因重組人源化色素上皮衍生因子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
新生血管的形成是惡性腫瘤，尤其是肺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中非常重要的過(guò)程，它不僅為肺癌組織提供了大量的生長(zhǎng)所需要的原料，而且為其向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供了通道。正常狀態(tài)下，人體內(nèi)的脈管系統(tǒng)是在血管生長(zhǎng)因子和抑制因子相互作用下處于平衡狀態(tài)的；病理狀態(tài)下，尤其是發(fā)生惡性腫瘤時(shí)，這種平衡向血管生成的方向發(fā)展。PEDF(pigment epithelial derived factor)是目前所知的最重要的內(nèi)源性血管生成抑制因子，我們前期的研究結(jié)果已經(jīng)顯示，PEDF在肺癌細(xì)胞的胞漿中有一定程度的表達(dá)，而且PEDF陽(yáng)性表達(dá)與抑制微血管的形成有關(guān)(張力建，陳晉峰，陸愛(ài)萍，等.胎盤(pán)生長(zhǎng)因子和色素上皮衍生因子在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系.中華醫(yī)學(xué)雜志，2005.853328-3331)，患者的預(yù)后分析中也發(fā)現(xiàn)PEDF的陽(yáng)性表達(dá)是肺癌患者預(yù)后較好的影響因素之一。離體細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)，(Zhang L，Chen J，Ke Y，et al.Down-regulationof PEDF expression by ribozyme transgene in endothelial and lung cancer cellsand its impact on angiogenesis in vitro.Oncol Rep，2005，141615-9)也提示，當(dāng)腫瘤細(xì)胞中PEDF基因被抑制時(shí)，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)呈現(xiàn)出明顯的增加趨勢(shì)。類似的研究結(jié)果也在腦膠質(zhì)瘤、黑色素瘤等其他惡性腫瘤中得到證實(shí)(Guan M，Yam HF，Su B，et al.Loss of pigment epithelium derived factor expression in gliomaprogression.J Clin Pathol，2003，56277-282；Abe R，Shimizu T，Yamagishi S，et al.Overexpression of pigment epithelium-derived factor decreasesangiogenesis and inhibits the growth of human melanoma cells in vivo.Am JPathol，2004，1641225-1232)。這些研究結(jié)果均說(shuō)明PEDF是肺癌以及其他惡性腫瘤組織中腫瘤血管生成因子的對(duì)抗因子，具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的治療作用。
有關(guān)抗血管生成藥物的研制在惡性腫瘤的治療中已經(jīng)成為熱點(diǎn)，但這些藥物或者為單克隆抗體，或者為化學(xué)制劑，應(yīng)用于人體時(shí)均會(huì)產(chǎn)生一定程度毒副作用。因此，如何找到一種與人體自身組織相容性良好，高效、低毒的肺癌治療的新藥成為科研工作者需要攻克的難題。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有抗血管生成藥物應(yīng)用于人體時(shí)均會(huì)產(chǎn)生一定程度毒副作用的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種人源化色素上皮衍生因子，并應(yīng)用于腫瘤治療。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供一種重組載體pEF6/V5/His-PEDF，含有SEQ ID No.1所示的基因序列。
本發(fā)明還提供所述重組載體pEF6/V5/His-PEDF的制備方法，包括如下步驟(1).提取正常組織的mRNA；(2).逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA產(chǎn)物；(3).設(shè)計(jì)引物如SEQ ID No.2-7所示f15’Atgcaggccctggtgcta3’(SEQ ID No.2)f25’gacatgcaggccctggt3’(SEQ ID No.3)r15’cctggggtccagaatctt3’(SEQ ID No.4)r25’ggggcccctggggtccagaa3’(SEQ ID No.5)r35’ggggcccctggggtccagaatctt3’(SEQ ID No.6)r45’gcccctggggtccagaat3’(SEQ ID No.7).
(4).擴(kuò)增PEDF基因全長(zhǎng)，如SEQ ID No.1所示；(5).將PEDF全長(zhǎng)基因?qū)雙EF6/V5/His質(zhì)粒載體，獲得重組載體pEF6/V5/His-PEDF。
上述的正常組織是指肺部組織。
擴(kuò)增PEDF的條件如下PCR反應(yīng)體系如下HiFidelity master mix(AbGene公司)25μl，10μmol/L引物各2μl，模板DNA 2μl，加水至總體積 50μl；反應(yīng)條件為95℃ 5min，94℃ 1min，57℃ 60s，72℃ 75s；共30個(gè)循環(huán)。
PEDF全長(zhǎng)基因?qū)雙EF6/V5/His質(zhì)粒載體的步驟如下應(yīng)用TA克隆的方法將PEDF基因全長(zhǎng)導(dǎo)入pEF6/V5/His質(zhì)粒載體(Invitrogen，Paisley，Scotland，UK)本發(fā)明提供一種重組蛋白rhPEDF，是由上述重組載體pEF6/V5/His-PEDF表達(dá)得到的。
本發(fā)明還提供上述重組蛋白rhPEDF的制備方法，包括如下步驟(1).重組載體pEF6/V5/His-PEDF轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)菌E.coli；(2).利用轉(zhuǎn)染重組載體pEF6/V5/His-PEDF的E.coli菌表達(dá)人源化重組蛋白rhPEDF。
表達(dá)人源化重組蛋白rhPEDF的步驟如下(a).將含有重組載體pEF6/V5/His-PEDF的E.coli細(xì)菌在含有氨芐青霉素的SOC液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h；(b).將1.5ml培養(yǎng)液置入eppendorf管中，4℃下12000rpm離心30s；(c).棄去上清，將細(xì)菌沉淀懸浮于120ml STET(Sigma公司)中，混勻；(d).加入10ml溶菌酶溶液(Sigma公司)，旋渦振蕩3s；(e).加同量中和溶液(SIGMA)后，將eppendorf置入4℃條件下12000rpm離心10min，取上清；并將含質(zhì)粒的上清加入提純分離柱(Plasmid purification column，Sigma)；(f).將純化質(zhì)粒在75％酒精中洗滌2次，沉淀后溶于無(wú)菌蒸餾水中，得到純化的滅菌處理的質(zhì)粒；(g).于CHO細(xì)胞(ATCC，Maryland，USA)細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，在無(wú)血清DMEM(GIBCO公司)培養(yǎng)基中，置入電擊槽(electoporation cuvette)在250V 1500A的條件下電擊(Easyject，F(xiàn)lowgen，Oxford，England，UK)；(h).更換新鮮無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3天；(i).4天后更換為含有10％胎牛血清和Blasticidin(5μg/ml)的篩選培養(yǎng)基，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株；(j).倒去培養(yǎng)液后，用無(wú)菌PBS溶液(天為時(shí)代公司)洗滌細(xì)胞，加入無(wú)菌的細(xì)胞裂解液(天為時(shí)代公司)，其中含有大量的人源化PEDF蛋白；(k).將細(xì)胞裂解液經(jīng)HiTrap純化柱(GE Healthcare公司)過(guò)濾后，得到純化的PEDF蛋白。
本發(fā)明提供一種抑制PEDF表達(dá)的錘頭狀核酶，其制備方法包括如下步驟(1)應(yīng)用降落PCR(Touch down PCR)的方法擴(kuò)增出所需要的核酶序列，上游引物PEDFribR5’actagtggcagcggctgtctccaacttttcgtcctcacggact3’(SEQ ID No.8)，下游引物PEDFribF5’ctgcagcacccggtacaggtcatagccctgatgagtccgtgagga 3’(SEQ ID No.9)；反應(yīng)條件94℃預(yù)變性3分鐘，退火起始溫度為68℃，終止于53℃，退火溫度每降低1℃重復(fù)循環(huán)2次，最后在53℃退火溫度繼續(xù)循環(huán)20次，72℃延伸3分鐘，然后在4℃保存；(2)將步驟(1)擴(kuò)增得到的核酶序列用限制性內(nèi)切酶SpeI和PstI雙酶切；(3)pEF6/V5/His質(zhì)粒(Invitrogen公司，內(nèi)含耐氨芐青霉素基因)進(jìn)行限制性內(nèi)切酶SpeI和PstI雙酶切；(4)將步驟(2)和(3)制得的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到核酶基因裝入pEF6/v5-his載體的質(zhì)粒PEDFrib。
本發(fā)明提供的重組蛋白可用于制備腫瘤治療藥物。
本發(fā)明所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)效果如下本發(fā)明所研制的人源化色素上皮衍生因子全身應(yīng)用后，不會(huì)產(chǎn)生免疫原性，耐藥性的可能性相對(duì)較小；生理活性與正常蛋白完全一致，具有高效的優(yōu)點(diǎn)，可以靶向抑制腫瘤新生血管，幾乎可以對(duì)所有的實(shí)體腫瘤發(fā)揮抑制新生血管生成的作用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本發(fā)明提供一種重組載體pEF6/V5/His-PEDF，含有SEQ ID No.1所示的基因序列。
本發(fā)明還提供所述重組載體pEF6/V5/His-PEDF的制備方法，包括如下步驟(1).提取正常組織的mRNA；(2).逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA產(chǎn)物；(3).設(shè)計(jì)引物如SEQ ID No.2-7所示f15’Atgcaggccctggtgcta3’(SEQ ID No.2)f25’gacatgcaggccctggt3’(SEQ ID No.3)
r15’cctggggtccagaatctt3’(SEQ ID No.4)r25’ggggcccctggggtccagaa3’(SEQ ID No.5)r35’ggggcccctggggtccagaatctt3’(SEQ ID No.6)r45’gcccctggggtccagaat3’(SEQ ID No.7).
(4).擴(kuò)增PEDF基因全長(zhǎng)，如SEQ ID No.1所示；(5).將PEDF全長(zhǎng)基因?qū)雙EF6/V5/His質(zhì)粒載體，獲得重組載體pEF6/V5/His-PEDF。
上述的正常組織是指肺部組織。
擴(kuò)增PEDF的條件如下PCR反應(yīng)體系如下HiFidelity master mix(AbGene公司) 25μl，10μmol/L引物 各2μl，模板DNA2μl，加水至總體積 50μl；反應(yīng)條件為95℃ 5min，94℃ 1min，57℃ 60s，72℃ 75s；共30個(gè)循環(huán)。
PEDF全長(zhǎng)基因?qū)雙EF6/V5/His質(zhì)粒載體的步驟如下應(yīng)用TA克隆的方法將PEDF基因全長(zhǎng)導(dǎo)入pEF6/V5/His質(zhì)粒載體(Invitrogen，Paisley，Scotland，UK)本發(fā)明提供一種重組蛋白rhPEDF，是由上述重組載體pEF6/V5/His-PEDF表達(dá)得到的。
本發(fā)明還提供上述重組蛋白rhPEDF的制備方法，包括如下步驟(1).重組載體pEF6/V5/His-PEDF轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)菌E.coli；(2).利用轉(zhuǎn)染重組載體pEF6/V5/His-PEDF的E.coli菌表達(dá)人源化重組蛋白rhPEDF。
表達(dá)人源化重組蛋白rhPEDF的步驟如下(a).將含有重組載體pEF6/V5/His-PEDF的E.coli細(xì)菌在含有氨芐青霉素的SOC液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h；(b).將1.5ml培養(yǎng)液置入eppendorf管中，4℃下12000rpm離心30s；(c).棄去上清，將細(xì)菌沉淀懸浮于120ml STET(Sigma公司)中，混勻；(d).加入10ml溶菌酶溶液(Sigma公司)，旋渦振蕩3s；(e).加同量中和溶液(SIGMA)后，將eppendorf置入4℃條件下12000rpm離心10min，取上清；并將含質(zhì)粒的上清加之質(zhì)提純分離柱(Plasmid purification column，Sigma)；(f).將純化質(zhì)粒在75％酒精中洗滌2次，沉淀后溶于無(wú)菌蒸餾水中，得到純化的滅菌處理的質(zhì)粒；(g).于CHO細(xì)胞(ATCC，Maryland，USA)細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，在無(wú)血清DMEM(GIBCO公司)培養(yǎng)基中，置入電擊槽(electoporation cuvette)在250V 1500A的條件下電擊(Easyject，F(xiàn)lowgen，Oxford，England，UK)；(h).更換新鮮無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3天；(i).4天后更換為含有10％胎牛血清和Blasticidin(5μg/ml)的篩選培養(yǎng)基，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株；(j).倒去培養(yǎng)液后，用無(wú)菌PBS溶液(天為時(shí)代公司)洗滌細(xì)胞，加入無(wú)菌的細(xì)胞裂解液(天為時(shí)代公司)，其中含有大量的人源化PEDF蛋白；(k).將細(xì)胞裂解液經(jīng)HiTra純化柱(GE Healthcare公司)過(guò)濾后，得到純化的PEDF蛋白。
本發(fā)明提供一種抑制PEDF表達(dá)的錘頭狀核酶，其制備方法包括如下步驟(1)應(yīng)用降落PCR(Touch down PCR)的方法擴(kuò)增出所需要的核酶序列，上游引物PEDFribR5’actagtggcagcggctgtctccaacttttcgtcctcacggact3’(SEQ ID No.8)，下游引物PEDFribF5’ctgcagcacccggtacaggtcatagccctgatgagtccgtgagga 3’(SEQ ID No.9)；反應(yīng)條件94℃預(yù)變性3分鐘，退火起始溫度為68℃，終止于53℃，退火溫度每降低1℃重復(fù)循環(huán)2次，最后在53℃退火溫度繼續(xù)循環(huán)20次，72℃延伸3分鐘，然后在4℃保存；(2)將步驟(1)擴(kuò)增得到的核酶序列用限制性內(nèi)切酶SpeI和PstI雙酶切；(3)pEF6/V5/His質(zhì)粒(Invitrogen公司，內(nèi)含耐氨芐青霉素基因)進(jìn)行限制性內(nèi)切酶SpeI和PstI雙酶切；(4)將步驟(2)和(3)制得的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到核酶基因裝入pEF6/v5-his載體的質(zhì)粒PEDFrib。
本實(shí)施例具體步驟如下
1.提取mRNA1)取100mg正常肺組織置于研磨皿中，液氮條件下研磨至粉末狀；2)加入1ml Trizol(AbGene公司)充分勻漿，室溫靜置15分鐘，移至1.5ml離心管中；3)加入0.2ml三氯甲烷，混勻15秒，靜置15分鐘；4)4℃離心，12000轉(zhuǎn)/分×10分鐘，取上清；5)加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10分鐘；6)4℃離心，12000轉(zhuǎn)/分×15分鐘，棄上清；7)加入1ml 75％乙醇，輕輕洗滌沉淀；8)4℃離心，12000轉(zhuǎn)/分×5分鐘，棄上清；9)晾干，加入適量的DEPC(Sigma公司)處理的H2O溶解。
2.RNA定量和電泳鑒定1)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)(計(jì)算OD260/OD280的比值)取比值為1.8-2.0的樣本；2)RNA濃度(μg/μl)＝OD260×40×稀釋倍數(shù)/1000(取OD260＝0.2-0.3之間的樣本)；3)RNA電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量1μl RNA樣本與1μl上樣緩沖液混合后在1％瓊脂糖凝膠，90伏電壓下電泳；4)確定提取的RNA質(zhì)量良好，在-80℃冰箱保存。
3.逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中主要試劑成分

1)3μg總RNA，加入以下反應(yīng)物Oligo(dT)15(10ng/l)1μldNTP Mix(10mM) 1μl
加DEPC-dH2O至10μl，65℃5分鐘，立即置冰上不少于1分鐘。
2)準(zhǔn)備以下反應(yīng)物，按順序加入10×PCR buffer 2μl25mM MgCl24μ0.1mM DTT2μlRNase Out(50u/μl) 1μl在每個(gè)變性后的RNA樣品中加入上述混合物共9μl；3)42℃溫浴2分鐘后加Superscript II；4)42℃1小時(shí)；5)70℃ 15分鐘，置冰不少于1分鐘；6)加入RNase H 1μl，37℃ 20分鐘；7)立即置于冰上，得到cDNA產(chǎn)物。
4.設(shè)計(jì)引物，合成PEDF基因全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物純化過(guò)程需要上海華舜公司膠回收純化試劑盒，內(nèi)含S1液、W1液、T1液、吸附柱。
1)應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Beacon Designers(Version 2.0，Polo Alto，California，USA)設(shè)計(jì)出合成PEDF全長(zhǎng)的引物序列如下f15’Atgcaggccctggtgcta3’(SEQ ID No.2)f25’gacatgcaggccctggt3’(SEQ ID No.3)r15’cctggggtccagaatctt3’(SEQ ID No.4)r25’ggggcccctggggtccagaa3’(SEQ ID No.5)r35’ggggcccctggggtccagaatctt3’(SEQ ID No.6)r45’gcccctggggtccagaat’3(SEQ ID No.7).
2)反應(yīng)體系HiFidelity master mix(AbGene公司) 25μl10μmol/L引物 各2μl模板DNA 2μl加水至總體積 50μl3)反應(yīng)條件為95℃ 5min，94℃ 1min，57℃ 60s，72℃ 75s；共30個(gè)循環(huán)。
4)電泳得到1542bp的單一條帶。切下條帶，放于1.5ml離心管中。
5)按每100mg瓊脂糖加入300μl S1液，置50℃水浴10分鐘使膠完全熔化并混勻。
6)將瓊脂糖液移入吸附柱，離心1分鐘，棄去液體，在吸附柱中加入500μL W1液，離心15秒，棄去液體，再在吸附柱中加入500μL W1液，離心15秒，棄去液體，離心1分鐘。
7)吸附柱中加入30μl T1液體，靜置1分鐘，離心1分鐘，得到純化的目的DNA片段。
8)用純化的100ng的目的DNA片段，10μmol的f1引物，送上海申能博采公司進(jìn)行測(cè)序。
9)測(cè)序結(jié)果與Gene Bank中PEDF基因序列，在NCBI網(wǎng)站的序列比對(duì)界面http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST進(jìn)行序列比對(duì)后，確定所得序列正確，如SEQID No.1所示。
5.PEDF全長(zhǎng)基因?qū)胼d體并轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)菌應(yīng)用TA克隆的方法將PEDF基因全長(zhǎng)導(dǎo)入pEF6/V5/His質(zhì)粒載體(Invitrogen，Paisley，Scotland，UK)連接反應(yīng)在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。
10μl體積反應(yīng)體系如下①取pEF6/V5/His質(zhì)粒載體1μl，加入2μl PCR產(chǎn)物。
②加入含ATP的10×Bufferlμl，T4DNA連接酶(Invitrogen，Paisley，Scotland，UK)10IU，用ddH2O補(bǔ)足至10μl。
稍加離心，4℃水浴過(guò)夜，得到PEDF基因與pEF6/V5/His載體(Invitrogen公司)已經(jīng)相連接的重組載體pEF6/V5/His-PEDF。
1)用冷卻的無(wú)菌吸頭吸取200μl感受態(tài)細(xì)菌E.coli(TOP-10，Invitrogen公司)至離心管中，并加入已經(jīng)連接好的重組載體pEF6/V5/His-PEDF10μl，輕輕旋轉(zhuǎn)，混勻后置于冰中30min。
2)再將離心管置于預(yù)加溫至42℃的循環(huán)水浴中，放置90s。
3)再次將離心管置于冰浴中，冷卻1min。
4)加入800μl SOC培養(yǎng)基(天為時(shí)代公司)，水浴加熱至37℃，轉(zhuǎn)移至搖床上，溫育45分鐘。
5)將含有重組載體pEF6/V5/His-PEDF的E.coli細(xì)菌接種在SOC瓊脂培養(yǎng)基上12～24小時(shí)。
6.提取克隆的細(xì)菌株的DNA小劑量DNA提取試劑盒(上海華舜公司)內(nèi)含DL液、DT液、Rnase A、Proteinase K、W1液、異丙醇、TE液、吸附柱、收集管等。
1)用無(wú)菌牙簽挑取單菌落接種到5ml SOC液體培養(yǎng)基上，37℃振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。
2)在200μl細(xì)菌培養(yǎng)液中加入400μl DL液，振蕩懸浮后，置65℃溫浴使小塊組織消失(15分鐘以上)，期間來(lái)回顛倒離心管數(shù)次。再加入200μl DT液，20μl RnaseA和25μl Proteinase K，迅速溫和地來(lái)回顛倒離心管徹底混勻。置65℃溫浴15-30分鐘，期間來(lái)回顛倒離心管數(shù)次，離心3分鐘，將上清移至另外一個(gè)離心管中。
3)加入200μl異丙醇，劇烈顛倒離心管使溶液混勻后，移取600μl至吸附柱中，離心30秒。棄去收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。將剩余的全部移至吸附柱中，離心30秒。棄去收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。
4)加入500μl W1液，靜置1分鐘后，離心30秒。
5)將吸附柱移入另外一個(gè)干凈的收集管中。加入500μl W1液，離心15秒。
6)棄掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。離心1分鐘。
7)將吸附柱移入一個(gè)干凈的1.5ml離心管中。在吸附膜中央加入100μl TE(pH8.5)液，65℃靜置5分鐘后，離心1分鐘。最后1.5ml離心管(DNA)內(nèi)為模板DNA，-20℃保存。
7.提取的DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，確定序列正確的克隆(1)反應(yīng)體系10×PCR標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(Promega公司) 5μl10mmol/L的dNTPs 1μl10μmol/L引物(上游、下游)2μlpfu高保真DNA聚合酶(Promega公司) 3unit模板DNA 2μl加水至總體積 50μl。
(2)引物序列上游5’Atgcaggccctggtgcta3’；下游5’gcccctggggtccagaat3’。
(3)反應(yīng)條件95℃變性3min，56℃退火15s，72℃延伸1min。
(4)PCR產(chǎn)物純化、回收(上海華舜公司膠回收純化試劑盒，內(nèi)含S1液、W1液、T1液、吸附柱)1)PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切下目的片段條帶，放于1.5ml離心管中。
2)按每100mg瓊脂糖加入300μl S1液，置50℃水浴10分鐘使膠完全熔化并混勻。
3)將瓊脂糖液移入吸附柱，離心1分鐘，棄去液體，在吸附柱中加入500μL W1液，離心15秒，棄去液體，再在吸附柱中加入500μL W1液，離心15秒，棄去液體，離心1分鐘。
4)吸附柱中加入30μl T1液體，靜置1分鐘，離心1分鐘5)PCR產(chǎn)物經(jīng)稀釋適當(dāng)倍數(shù)，測(cè)量OD值，1OD＝50微克DNA，推算PCR產(chǎn)物量。純化的DNA置于-20℃保存(5).PCR純化產(chǎn)物直接測(cè)序(1)用純化的100ng的目的DNA片段，10μmol的上游f1引物，送上海申能博采公司進(jìn)行測(cè)序。
(2)測(cè)序結(jié)果與Gene Bank中PEDF基因序列，在NCBI網(wǎng)站的序列比對(duì)界面http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST進(jìn)行序列比對(duì)后，確定所得序列正確。
8.得到人源化表達(dá)的rhPEDF蛋白(1).將含有能夠正確表達(dá)PEDF基因的pEF6/V5/His-PEDF質(zhì)粒的E.coli細(xì)菌在含有氨芐青霉素的SOC液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24小時(shí)。
(2).將1.5ml培養(yǎng)液置入eppendorf管中，4℃下12000rpm離心30s。
(3).棄去上清，將細(xì)菌沉淀懸浮于120ml STET(Sigma公司)中，混勻。
(4).加入10ml溶菌酶溶液(Sigma公司)，旋渦振蕩3s.
(5).同量中和溶液(SIGMA)后，將eppendorf置入4℃條件下12000rpm離心10min，取上清；并將含質(zhì)粒的上清加入質(zhì)粒提純分離柱(Plasmid purification column，Sigma)；(6).將純化質(zhì)粒在75％酒精中洗滌2次，沉淀后溶于無(wú)菌蒸餾水中，得到純化的滅菌處理的重組載體pEF6/V5/His-PEDF。
(7).于CHO細(xì)胞(ATCC，Maryland，USA)細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，在無(wú)血清DMEM(GIBCO公司)培養(yǎng)基中，置入電擊槽(electoporation cuvette)在250V 1500A的條件下電擊(Easyject，F(xiàn)lowgen，Oxford，England，UK)。
(8).更換新鮮無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3天。
(9).4天后更換為含有10％胎牛血清和Blasticidin(5μg/ml)的篩選培養(yǎng)基，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。
(10).倒去培養(yǎng)液后，用無(wú)菌PBS溶液(天為時(shí)代公司)洗滌細(xì)胞，加入無(wú)菌的細(xì)胞裂解液(天為時(shí)代公司)，其中含有大量的人源化PEDF蛋白。
(11).將細(xì)胞裂解液經(jīng)HiTra純化柱(GE Healthcare公司)過(guò)濾后，得到純化的PEDF蛋白。
本實(shí)施例所制備的rhPEDF生物應(yīng)用性效果驗(yàn)證如下細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)外源性PEDF蛋白可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成過(guò)程，而且證實(shí)PEDF基因表達(dá)被抑制后，肺癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增加。
選用的細(xì)胞株為HECV細(xì)胞(人類細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞系，ICLC HL01001)，肺腺癌A549細(xì)胞(ATCC CCL-185)；，細(xì)胞外基質(zhì)為Matrigel(200μg/mlSigma公司)，DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)；CO2孵箱(Shellab公司)，CO2濃度為5％。
體外實(shí)驗(yàn)直接證明基因重組PEDF蛋白可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成過(guò)程。
(1)96孔板的每個(gè)平板孔中加入100μl Matrigel膠，平鋪于平板底部，在通風(fēng)廚中(56℃)風(fēng)干2小時(shí)，使膠在平板底部形成薄層基質(zhì)膜。加100μl培養(yǎng)基新水化(2)每孔加入的3×103個(gè)HECV細(xì)胞，每孔200μl，各組細(xì)胞分為3孔分別加入，在37℃孵箱中孵育2小時(shí)，使細(xì)胞能夠均勻貼于Matrigel膠上生長(zhǎng)。
(3)將平板小心傾斜，吸去多余的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入100μl第二層Matrigel膠。
(4)加入100μl DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液于第二層Matrigel膠上，分為三組不同的組分，分別為不加入任何生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)液的細(xì)胞組，加入已經(jīng)制好的重組的PEDF蛋白組，加入重組的PEDF蛋白和VEGF因子的混合蛋白組。
(5)各組細(xì)胞在37℃孵箱中孵育24和48小時(shí)后，分別在倒置顯微鏡下測(cè)量小管形成的直徑，取平均值進(jìn)行比較，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
(6)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示外源性VEGF蛋白可以增加HECV細(xì)胞在體外的小管形成作用，基因重組的PEDF蛋白與對(duì)照組相比，可以明顯抑制VEGF對(duì)HECV細(xì)胞的體外小管形成的促進(jìn)作用，具有抑制體外血管內(nèi)皮細(xì)胞小管形成的作用。
體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)肺癌細(xì)胞株中PEDF基因表達(dá)被抑制后，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯增加。
1.抑制PEDF表達(dá)的錘頭狀核酶的合成與克隆(1)利用Zucker’s mFold軟件對(duì)人PEDF mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和最低能量進(jìn)行分析，同時(shí)結(jié)合NCBI Gene Bank進(jìn)行同源性分析設(shè)計(jì)核酶的序列。從中尋找出一個(gè)適合錘頭狀核酶的靶位點(diǎn)(2)應(yīng)用降落PCR(Touch down PCR)的方法擴(kuò)增出所需要的核酶序列。其上游引物PEDFribR5’actagtggcagcggctgtctccaacttttcgtcctcacggact3’；下游引物PEDFribF5’ctgcagcacccggtacaggtcatagccctgatgagtccgtgagga3’。
反應(yīng)條件94℃預(yù)變性3分鐘，退火起始溫度為68℃，終止于53℃，退火溫度每降低1℃重復(fù)循環(huán)2次，最后在53℃退火溫度繼續(xù)循環(huán)20次，72℃延伸3分鐘，然后在4℃保存。
(3)在引物的5’末端的6個(gè)堿基對(duì)中均含有SpeI和PstI的限制性酶切位點(diǎn)。在無(wú)菌的eppendorf管(Promega公司)中用微量槍將1μg所得的DNA和內(nèi)切酶緩沖液2μl，加入雙蒸餾水至總體積19μl，混勻后加入1μl限制性內(nèi)切酶(New England Biolabs公司)。
(4)將eppendorf管在37℃水浴條件下保溫4小時(shí)。
(5)加入0.1mol/L EDTA(pH8.0)(Promega公司)2μl，停止酶切反應(yīng)，得到目的DNA序列的酶解液。
(6)在無(wú)菌的eppendorf管(Promega公司)中用微量槍將1μg pEF6/V5/His質(zhì)粒進(jìn)行如上的酶解過(guò)程，得到質(zhì)粒的酶解液。
(7)在微量離心管中加入下列連接混合液25μg/ml的DNA序列酶解液1μlpEF6/V5/His質(zhì)粒酶解液 20ng(Invitrogen公司，內(nèi)含耐氨芐青霉素基因)10×連接緩沖液 1μl連接酶 3U總體積 10μl(8)14℃孵育4小時(shí)，得到核酶基因裝入pEF6/v5-his載體的質(zhì)粒，命名為PEDFrib。
(9)用冷卻的無(wú)菌吸頭吸取200μl感受態(tài)細(xì)菌E.coli(TOP-10，Invitrogen公司)至離心管中，并加入已經(jīng)連接有核酶基因的質(zhì)粒10μl，輕輕旋轉(zhuǎn)，混勻后置于冰中30分鐘。
(10)再將離心管置于預(yù)加溫至42℃的循環(huán)水浴中，放置90s。
(11)再次將離心管置于冰浴中，冷卻1分鐘。
(12)加入800μl SOC培養(yǎng)基(天為時(shí)代公司)，水浴加熱至37℃，轉(zhuǎn)移至搖床上，溫育45分鐘，得到可以正確表達(dá)PEDFrib質(zhì)粒的E.coli細(xì)菌。
2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的建立(1)將含有能夠正確表達(dá)PEDFrib質(zhì)粒的E.coli細(xì)菌在含有氨芐青霉素的SOC液體培養(yǎng)基(天為時(shí)代公司)中，37℃培養(yǎng)24小時(shí)。
(2)將1.5ml培養(yǎng)液置入eppendorf管中，4℃下12,000離心30s。
(3)棄去上清，將細(xì)菌沉淀懸浮于120ml STET(Sigma公司)中，混勻。
(4)加入10ml溶菌酶溶液(Sigma公司)，旋渦振蕩3s.
(5)加同量中和溶液(SIGMA)后，將eppendorf置入4℃條件下12000rpm離心10min，取上清；并將含質(zhì)粒的上清加之質(zhì)提純分離柱(Plasmid purificationcolumn，Sigma)；。
(6)將純化質(zhì)粒在75％酒精中洗滌2次，沉淀后溶于無(wú)菌蒸餾水中，得到純化的滅菌處理的質(zhì)粒。
(7)于A549細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，在無(wú)血清的DMEM(GIBCO公司)培養(yǎng)基中，將其與含有除菌處理的質(zhì)粒和脂質(zhì)體(Invitrogen公司)的混合物在CO2孵箱(Shellab公司)共同孵育24小時(shí)。
(8)更換新鮮DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3天。
(9)4天后更換為含有10％胎牛血清和Blasticidin(5μg/ml)的篩選培養(yǎng)基，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。
在轉(zhuǎn)染過(guò)程中同時(shí)設(shè)立沒(méi)有裝入目的片段的空載體作為空白對(duì)照。經(jīng)過(guò)PEDFrib轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞命名為A549PEDFrib；轉(zhuǎn)染入pEF6/V5/His空質(zhì)粒的A549細(xì)胞命名為A549control；沒(méi)有經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞命名為A549wt。
3.Western blot檢測(cè)細(xì)胞中PEDF蛋白的表達(dá)(1).各組A549細(xì)胞分別經(jīng)胰蛋白酶(天為時(shí)代公司)消化后呈懸浮狀態(tài)。
(2).離心后加入細(xì)胞裂解液(Applygen Technologies Co.，Ltd.)，所得的蛋白定量為0.4μg/μl。
(3).將蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠(天為時(shí)代公司)中電泳，樣品在濃縮膠中泳動(dòng)時(shí)，電壓為100V，進(jìn)入分離膠后，電壓增至150～200V(約15V/em)。
(4).把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。
1)轉(zhuǎn)移緩沖液(天為時(shí)代公司)洗滌凝膠和硝酸纖維素膜(天為時(shí)代公司)，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來(lái)回滾動(dòng)去除所有的氣泡。
2)在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙(預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕)，將凝膠夾在中間，保持濕潤(rùn)和沒(méi)有氣泡。
3)將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。
4)將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒(méi)凝膠。
5)接通電源開(kāi)始電泳轉(zhuǎn)移。
6)轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。
(5).將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時(shí)取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。
(6).用100ml水洗滌纖維素膜，必要時(shí)可用脫色緩沖液。
(7).膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時(shí)。
(8).室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。
(9).用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。
(10).袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。
(11).混合NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體(10毫升)，加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動(dòng)2小時(shí)(或4℃過(guò)夜)(12).用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤(pán)中洗滌薄膜，每次75ml。
(13).將羊抗人PEDF的多克隆抗體(1∶500)(Santa Cruz公司)加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)。
(14).按步驟9洗滌。
(15).加入兔抗羊IgG(1∶1000)(Santa Cruz公司)，于室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)。
(16).按步驟9洗滌。
(17).加入ECL系統(tǒng)(Applygen Technologies Co.，Ltd.)顯色液體，于室溫下靜置5分鐘。
(18).將薄膜轉(zhuǎn)到暗室中，底片曝光10分鐘。
檢測(cè)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，PEDF蛋白在A549PEDFrib組細(xì)胞中的表達(dá)明顯被抑制。
3.MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線MTT試劑(Sigma公司)濃度配制成0.1mg/ml，分裝儲(chǔ)存。
(1)96孔板中每孔加入的3×103個(gè)細(xì)胞，每孔200μl，各組細(xì)胞分為3孔分別加入。
(2)共需5個(gè)96孔板，分別用于計(jì)數(shù)第0~4天時(shí)細(xì)胞的數(shù)量。
(3)空白對(duì)照孔內(nèi)不加入細(xì)胞，其測(cè)定的吸光光度值作為基線值；(4)第0天為細(xì)胞接種后4小時(shí)的測(cè)定值。
(5)每孔加入100μl MTT，37℃孵育4小時(shí)，仔細(xì)吸去上清液體后每孔加入150μl二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司)充分溶解MTT，15分鐘后于分光光度計(jì)570nm處測(cè)量吸光度值，反映細(xì)胞數(shù)量。
(6)以時(shí)間為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(見(jiàn)附圖
6)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PEDFrib后的A549PEDFrib細(xì)胞與A549control及A549wt相比，PEDF基因表達(dá)被明顯抑制，MTT細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示，A549PEDFrib組細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯高于A549control及A549wt組，說(shuō)明PEDF表達(dá)被抑制后，肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯增加。
臨床試驗(yàn)證實(shí)PEDF蛋白的表達(dá)與肺癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。
為進(jìn)一步了解PEDF蛋白在肺癌組織中的表達(dá)與肺癌患者預(yù)后之間的關(guān)系，收集手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本81例。根據(jù)1997年第八屆國(guó)際肺癌大會(huì)制定的分期標(biāo)準(zhǔn)分類和分級(jí)。男性58例，女性23例，中位年齡62(39～77)歲。術(shù)后分期(pTNM)I-II期55例(67.9％)，III-IV期26例(32.1％)。組織病理學(xué)類型鱗癌45例(55.6％)，腺癌36例(44.4％)。81例患者中位隨訪時(shí)間24.6個(gè)月(2～49個(gè)月)，平均生存時(shí)間為36.5個(gè)月(95％CI32.88-40.14)。應(yīng)用免疫組化的方法在臨床試驗(yàn)研究中證實(shí)PEDF蛋白在肺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)時(shí)，患者的生存時(shí)間明顯高于陰性表達(dá)的患者，說(shuō)明PEDF蛋白可以抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有一定程度的治療肺癌的作用。
1.制備切片1)載玻片用清洗液浸泡24小時(shí)，清水洗凈烘干。
2)酸處理24小時(shí)，清水洗凈，晾干。
3)將清潔的載玻片置入1∶50丙酮稀釋的多聚賴氨酸溶液(中衫公司)中浸泡30秒。
4)置入純丙酮溶液中洗去未結(jié)合的多聚賴氨酸溶液，涼干備用。
5)常規(guī)切片厚4μm。
6)切片置烤箱58~62℃，8~12小時(shí)。
2.免疫組化染色1)二甲苯脫蠟10分鐘，梯度酒精水化15分鐘。
2)PBS(中衫公司)洗，5分鐘×3次。
3)3％過(guò)氧化氫溶液孵育，室溫10分鐘。
4)PBS洗，5分鐘×3次。
5)枸櫞酸緩沖液(0.01M，PH 6.0)(中衫公司)微波熱修復(fù)，650W，10分鐘。
6)室溫冷卻后，PBS洗，5分鐘×3次。
7)滴加羊抗PEDF的多克隆抗體(Santa Cruz公司)，40μl/切片，4℃孵育過(guò)夜。
8)PBS洗，5分鐘×3次。
9)滴加二抗(中杉公司)，30μl/切片，室溫30分鐘。
10)PBS洗，5分鐘×3次。
11)滴加新鮮配制的DAB顯色液(中衫公司)，100μl/切片，室溫3-5分鐘，顯微鏡下觀察顯色滿意即終止反應(yīng)。
12)蘇木素復(fù)染胞核，20-30秒。
13)1％鹽酸酒精分化，5秒。
14)流水沖洗30分鐘。
15)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封固。
16)顯微鏡下觀察，PEDF陽(yáng)性染色均位于細(xì)胞漿，陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的百分率＞5％為表達(dá)陽(yáng)性，≤5％為表達(dá)陰性。
生存分析的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示PEDF蛋白在肺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)時(shí)，患者的生存時(shí)間明顯高于陰性表達(dá)的患者。
本實(shí)施例所制備的重組蛋白經(jīng)全身靜脈注射、局部腫瘤內(nèi)注射、肌肉注射或皮下注射，均會(huì)達(dá)到有效抑制腫瘤內(nèi)新生血管生成的作用，是一種非常前途的抗腫瘤新藥。
序列表<110>張，力建姜，文國(guó)<120>基因重組人源化色素上皮衍生因子及其應(yīng)用<130>Guan M，Yam HF，Su B，et al.Loss of pigment epithelium derivedfactor expression in glioma progression.J Clin Pathol，2003，56277-282<160>9<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1542<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>get from human lung by pcr<400>1ggtcgcttta agaaaggagt agctgtaatc tgaagcctgc tggacgctgg attagaaggc 60agcaaaaaaa gctctgtgct ggctggagcc ccctcagtgt gcaggcttag agggactagg120ctgggtgtgg agctgcagcg tatccacagg ccccaggatg caggccctgg tgctactcct180ctgcattgga gccctcctcg ggcacagcag ctgccagaac cctgccagcc ccccggagga240gggctcccca gaccccgaca gcacaggggc gctggtggag gaggaggatc ctttcttcaa300agtccccgtg aacaagctgg cagcggctgt ctccaacttc ggctatgacc tgtaccgggt360gcgatccagc acgagcccca cgaccaacgt gctcctgtct cctctcagtg tggccacggc420cctctcggcc ctctcgctgg gagcggagca gcgaacagaa tccatcattc accgggctct480ctactatgac ttgatcagca gcccagacat ccatggtacc tataaggagc tccttgacac540ggtcactgcc ccccagaaga acctcaagag tgcctcccgg atcgtctttg agaagaagct600
gcgcataaaa tccagctttg tggcacctct ggaaaagtca tatgggacca ggcccagagt 660cctgacgggc aaccctcgct tggacctgca agagatcaac aactgggtgc aggcgcagat 720gaaagggaag ctcgccaggt ccacaaagga aattcccgat gagatcagca ttctccttct 780cggtgtggcg cacttcaagg ggcagtgggt aacaaagttt gactccagaa agacttccct 840cgaggatttc tacttggatg aagagaggac cgtgagggtc cccatgatgt cggaccctaa 900ggctgtttta cgctatggct tggattcaga tctcagctgc aagattgccc agctgccctt 960gaccggaagc atgagtatca tcttcttcct gcccctgaaa gtgacccaga atttgacctt1020gatagaggag agcctcacct ccgagttcat tcatgacata gaccgagaac tgaagaccgt1080gcaggcggtc ctcactgtcc ccaagctgaa gctgagttat gaaggcgaag tcaccaagtc1140cctgcaggag atgaagctgc aatccttgtt tgattcacca gactttagca agatcacagg1200caaacccatc aagctgactc aggtggaaca ccgggctggc tttgagtgga acgaggatgg1260ggcgggaacc acccccagcc cagggctgca gcctgcccac ctcaccttcc cgctggacta1320tcaccttaac cagcctttca tcttcgtact gagggacaca gacacagggg cccttctctt1380cattggcaag attctggacc ccaggggccc ctaatatccc agtttaatat tccaataccc1440tagaagaaaa cccgagggac agcagattcc acaggacacg aaggctgccc ctgtaaggtt1500tcaatgcata caataaaaga gctttatccc taacttctgt ta 1542<210>2<211>18<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>2Atgcaggccc tggtgcta18
<210>3<211>17<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>3gacatgcagg ccctggt 17<210>4<211>18<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>prumer<400>4cctggggtcc agaatctt18<210>5<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>5ggggcccctg gggtccagaa 20<210>6<211>24<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>6ggggcccctg gggtccagaa tctt 24
<210>7<211>18<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>7gcccctgggg tccagaat18<210>8<211>43<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>8actagtggca gcggctgtct ccaacttttc gtcctcacgg act43<210>9<211>45<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>9ctgcagcacc cggtacaggt catagccctg atgagtccgt gagga 4權(quán)利要求
1.一種重組載體pEF6/V5/His-PEDF，其特征在于，所述重組載體含有SEQ IDNo.1所示的基因序列。
2.權(quán)利要求1所述重組載體pEF6/V5/His-PEDF的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1).提取正常組織的mRNA；(2).逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA產(chǎn)物；(3).設(shè)計(jì)引物如SEQ ID No.2-7所示(4).擴(kuò)增PEDF基因全長(zhǎng)，如SEQ ID No.1所示；(5).將PEDF全長(zhǎng)基因?qū)雙EF6/V5/His質(zhì)粒載體，獲得重組載體pEF6/V5/His-PEDF。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體pEF6/V5/His-PEDF的制備方法，其特征在于，上述的正常組織是指肺部組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體pEF6/V5/His-PEDF的制備方法，其特征在于，擴(kuò)增PEDF基因全長(zhǎng)的條件如下PCR反應(yīng)體系如下HiFidelity master mix 25μl，10μmol/L引物 各2μl，模板DNA 2μl，加水至總體積50μl；反應(yīng)條件為95℃ 5min，94℃ 1min，57℃ 60s，72℃ 75s；共30個(gè)循環(huán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體pEF6/V5/His-PEDF的制備方法，其特征在于，PEDF全長(zhǎng)基因?qū)雙EF6/V5/His質(zhì)粒載體的方法如下應(yīng)用TA克隆的方法將PEDF基因全長(zhǎng)導(dǎo)入pEF6/V5/His質(zhì)粒載體。
6.一種重組蛋白rhPEDF，其特征在于，所述重組蛋白是由權(quán)利要求1所述重組載體pEF6/V5/His-PEDF表達(dá)得到的。
7.權(quán)利要求6所述重組蛋白rhPEDF的制備方法，包括如下步驟(1).重組載體pEF6/V5/His-PEDF轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)菌E.coli；(2).利用轉(zhuǎn)染重組載體pEF6/V5/His-PEDF的E.coli菌表達(dá)人源化重組蛋白rhPEDF。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述重組蛋白rhPEDF的制備方法，表達(dá)人源化重組蛋白rhPEDF的步驟如下(a).將含有重組載體pEF6/V5/His-PEDF的E.coli細(xì)菌在含有氨芐青霉素的SOC液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h；(b).將1.5ml培養(yǎng)液置入eppendorf管中，4℃下12000rpm離心30s；(c).棄去上清，將細(xì)菌沉淀懸浮于120ml STET中，混勻；(d).加入10ml溶菌酶溶液，旋渦振蕩3s；(e).同量中和溶液后，將eppendorf置入4℃條件下12000rpm離心10min，取上清；并將含質(zhì)粒的上清加入提純分離柱；(f).將純化質(zhì)粒在75％酒精中洗滌2次，沉淀后溶于無(wú)菌蒸餾水中，得到純化的滅菌處理的質(zhì)粒；(g).于CHO細(xì)胞細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，在無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，置入電擊槽在250V 1500A的條件下電擊；(h).更換新鮮無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3天；(i).4天后更換為含有10％胎牛血清和Blasticidin的篩選培養(yǎng)基，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株；(j).倒去培養(yǎng)液后，用無(wú)菌PBS溶液洗滌細(xì)胞，加入無(wú)菌的細(xì)胞裂解液，其中含有大量的人源化PEDF蛋白；(k).將細(xì)胞裂解液經(jīng)HiTra純化柱過(guò)濾后，得到純化的PEDF蛋白。
9.權(quán)利要求6所述重組蛋白制備的腫瘤治療藥物。
10.一種用于權(quán)利要求6所述重組蛋白rhPEDF檢測(cè)的錘頭狀核酶，其制備方法包括如下步驟(1)以SEQ ID No.8和SEQ ID No.9為引物，應(yīng)用降落PCR的方法擴(kuò)增出所需要的核酶序列，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3分鐘，退火起始溫度為68℃，終止于53℃，退火溫度每降低1℃重復(fù)循環(huán)2次，最后在53℃退火溫度繼續(xù)循環(huán)20次，72℃延伸3分鐘，然后在4℃保存；(2)將步驟(1)擴(kuò)增得到的核酶序列用限制性內(nèi)切酶SpeI和PstI雙酶切；(3)pEF6/V5/His質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶SpeI和PstI雙酶切；(4)將步驟(2)和(3)制得的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到核酶基因裝入pEF6/v5-his載體的質(zhì)粒PEDFrib。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組蛋白及其應(yīng)用，特別是涉及一種基因重組人源化色素上皮衍生因子及其應(yīng)用。本發(fā)明提供一種重組載體pEF6/V5/His－PEDF，含有SEQ ID No.1所示的基因序列。本發(fā)明還提供所述重組載體pEF6/V5/His－PEDF的制備方法。本發(fā)明所研制的人源化色素上皮衍生因子全身應(yīng)用后，不會(huì)產(chǎn)生免疫原性，耐藥性的可能性相對(duì)較??；生理活性與正常蛋白完全一致，具有高效的優(yōu)點(diǎn)，可以靶向抑制腫瘤新生血管，幾乎可以對(duì)所有的實(shí)體腫瘤發(fā)揮抑制新生血管生成的作用。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1924021SQ20061012779
公開(kāi)日2007年3月7日 申請(qǐng)日期2006年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月8日
發(fā)明者張力建, 姜文國(guó) 申請(qǐng)人:張力建, 姜文國(guó)