專利名稱：：桑枝生物堿有效部位在制備降血糖藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及桑枝生物堿有效部位提取物在制備降血糖藥物中的應用。背景介紹據有關資料報道，國內40歲以上人群糖尿病發(fā)病率高達4%，60歲以上人群超過11%。根據世界衛(wèi)生組織的最新數據，在未來15年中，中國的糖尿病患者人數將達到目前的四倍。糖尿病已成為嚴重危害人民生活和健康的重大疾病?；疾∪巳褐?，90%以上為2型糖尿病(非胰島素依賴型，NIDDM)，需長期服用口服降糖藥。20世紀50年代，用于治療NIDDM的口服藥物磺酰脲類和雙胍類等藥物上市，使2型糖尿病人的血糖得到了控制，壽命延長，生活質量有所提高。但磺酰脲類易引起低血糖危險，雙胍類存在嚴重的胃腸道刺激。經過40多年的努力，科學家又發(fā)現了一類新型的抗糖尿病藥物，即a-葡萄糖苷酶抑制劑。該種藥物作用于小腸粘膜刷狀緣的a-葡萄糖苷酶，抑制其對多糖和葡萄糖的分解，延緩葡萄糖的吸收，使餐后血糖峰值降低并后移，"血糖波動"幅度縮小，從而起到降低血糖、防止和延緩某些糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。a-葡萄糖苷酶抑制劑的應用己被國內外公認為是抗糖尿病的新途徑。20世紀90年代初，德國拜爾公司推出了該類型藥物拜糖蘋(Acarbose)，并在世界50多個國家上市，獲得了良好的治療效果。1994年，該藥進入我國市場，經10年的臨床驗證，表明本品用于2型糖尿病治療，有效性好，安全性高，獲得了很好的社會效益和顯著的經濟效益。我國藥用植物資源豐富，用于降血糖的粗制劑品種繁多，但均無明確作用機制，且質量不可控。桑枝為?？浦参锷５母赡壑ΓＶχ泻猩习俜N化合物，包括多糖、單糖、植物蛋白、酚類、黃酮類及皂苷、有機酸、氨基酸、多羥基生物堿等。中國醫(yī)學科學院藥物研究所在20世紀90年代即發(fā)現桑枝水和/或醇提取物具有很強的a-葡萄糖苷酶抑制活性。并申請了專利"桑枝的醇和/或水浸膏在制備降血糖藥物中的的應用"，申請?zhí)枮?7112359，該篇專利己于2002年4月10日獲得國家專利局授權。由于醇和/或水浸膏粗制劑劑量過大(每次用量在3g以上)、且質量可控性不好，為此，中國醫(yī)學科學院藥物研究所又對桑枝有效部位進行了研究。對桑枝不同的提取部位進行a-葡萄糖苷酶的抑制活性考察，結果表明，水溶性生物堿部分活性最強，即降糖活性的有效部位存在于水溶性生物堿部分。桑枝粗提物對a-葡萄糖苷酶的抑制活性IG(產60ug/ml，而水溶性生物堿提取部位的IC5。<0.1ug/ml。本發(fā)明是在97112359基礎上進行的進一步技術創(chuàng)新。除本所申請的97112359專利外，尚檢索到以下3篇與桑枝及具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的中藥提取物的研究報道專利01113191:"具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的中藥提取物及其制備方法和用途"，其中中藥提取物是由桑白皮、桑葉和桑葚制備而得的總生物堿，未涉及桑枝，同時對生物堿的組成未進行描述。專利02113004:"桑提取物及其提取方法和新用途"，內容涉及的成分為總黃酮，未涉及生物堿，用途為預防高尿酸血癥和痛風，未涉及糖尿病。專利200410018677.4:"具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的藥物組合物及其用途"，藥物組合物是由生物堿和黃酮類成分組成，生物堿系由蠶沙或桑枝或桑白皮或桑葉中提取的總生物堿(含量未進行明確說明)。加入的黃酮類提取物為兒茶素、槲皮素、茶多酚中的至少一種。組合物中，生物堿提取物重量比為5-95%、黃酮類提取物重量比為10-95%。從200410018677.4專利描述的實驗結果和附圖分析，在設定的實驗條件下，生物堿提取物與黃酮類提取物合并用藥，僅表現出劑量相加作用，而不具備協同作用。這與該專利的目標和結論不一致。?？浦参锇ㄉ０灼ぁ⑸Ｖ蜕Ｈ~。桑白皮來源困難，且破壞植物再生，因此，不宜作為提取藥材；桑葉和桑枝需每年進行修剪，其中桑葉用于養(yǎng)蠶，不易收購，而大量的桑枝則被桑農作為燒火用的柴料。因此，以桑枝為藥材，來源廣泛，方便易得，價格便宜。對桑枝中生物堿有效部位的降糖作用進行研究具有重大現實意義。
發(fā)明內容以桑枝為藥材，粉碎后經提取、分離、精制和濃縮，制備總生物堿含量在50%以上的有效部位，加入藥劑學上允許的賦形劑，制成各種口服制劑，用于糖尿病患者餐后血糖的控制。桑枝總生物物有效部位提取物對a-葡萄糖苷酶抑制活性與拜糖蘋相當，明顯強于桑枝水和/或醇提取的粗制劑。1、有效部位制備桑枝中生物堿有效部位的制備方法，系將桑枝粉碎，用水和/或醇溶液或酸水加熱回流提取，溶劑量為原藥材的5-12倍，重復提取1-3次，合并提取液，濃縮至一定體積，加入50-80%的乙醇，沉淀去除雜質，離心，清液上陽離子交換樹脂，以蒸餾水洗盡不吸附的雜質，用0.2-1N的氨水洗脫，洗脫液濃縮后上陰離子交換樹脂，收集不吸附部分，經減壓濃縮或噴霧千燥或冷凍干燥，得淺黃色有效部位提取物千粉，收率約為1-2%。。2、有效部位含量測定有效部位中的生物堿為多羥基生物堿及其苷類，無紫外吸收，為此，發(fā)明人選擇合適的衍生化試劑，對提取物進行衍生化處理，采用HPLC方法對處理后的樣品進行測定。經考察，所建立的方法專性強、靈敏度高、重復性好。研究發(fā)現，有效部位的一組生物堿中，1-deoxynojirimycin含量最高，且活性最強。為此，發(fā)明人制備了1-deoxynojirimycin精制品以期用于含量測定的對照品。通過核磁、質譜、紅外、紫外及熱分析檢測，對其進行了結構確證。經HPLC測定，1-deoxynojirimycin精制品含量大于98%，符合對照品質量要求。按上述制備方法制備桑枝有效部位提取物，經柱前衍生化-HPLC方法測定，總生物堿占有效部位提取物的含量均在50%以上，化合物(l)即1-deoxynojirimycin占提取物的含量在27%以上。3、有效部位提取物穩(wěn)定性對中試放大提取物密封室溫保存，于不同時間取樣，HPLC法測定含量，結果表明，貯存24個月，質量穩(wěn)定，見表l.表l:中試產品初步穩(wěn)定性考察<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>4、有效部位提取物藥效學研究(1)離體試驗以拜糖蘋(Arcarbose)為陽性對照藥，觀察實施例1提取物在不同濃度下對a-葡萄糖苷酶的抑制百分率，并求出IC5。。結果表明，在離體條件下，有效部位提取物對蔗糖酶的抑制作用強于拜糖蘋，對麥芽糖酶的抑制作用與拜糖蘋相當，而對淀粉酶的抑制作用明顯低于拜糖蘋，提示桑枝有效部位降糖活性與拜糖蘋相當，但胃腸道漲氣的副作用可能小于拜糖蘋。結果見表2。表2.SZ-A對a葡萄糖苷酶活性的抑制作用(invitro)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(2)整體動物試驗以拜糖蘋為對照，考察了桑枝有效部位對正常小鼠蔗糖負荷后血糖曲線的影響和對四氧嘧啶糖尿病小鼠蔗糖負荷后血糖變化的影響。有效部位對正常小鼠蔗糖負荷后血糖升高的影響有效部位試驗組設三個劑量，即10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg;p.o.;另設陰性對照組(不用藥)和陽性對照組(陽性對照藥選用拜糖蘋，10mg/kg;p.o.)。結果表明，桑枝有效部位在10mg/kg~40mg/kg劑量范圍內，能使正常小鼠蔗糖負荷后血糖升高明顯減少，血糖曲線下面積也明顯小于對照組，試驗組和陽性對照組結果無明顯差異(圖1)。有效部位對四氧嘧啶高血糖小鼠蔗糖負荷后血糖升高的影響五組四氧嘧啶糖尿病小鼠，分別設陰性對照組、陽性對照藥拜糖蘋組(10mg/kg)以及不同劑量給藥組(10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg)。結果表明，桑枝有效部位使四氧嘧啶糖尿病小鼠蔗糖負荷后血糖峰值降低并后移，血糖曲線下面積減少，20mg/kg與40mg/kg給藥組效果優(yōu)于陽性對照組(圖2)。圖1:桑枝有效部位對正常小鼠蔗糖負荷后血糖曲線的影響圖2:桑枝有效部位對四氧嘧啶糖尿病小鼠蔗糖負荷后血糖變化的影響圖3:有效部位口嚼片對健康志愿受試者饅頭實驗血糖變化的影響(n=8)具體實施方式以下將通過實施例進一步描述本發(fā)明，但這些實施例僅是說明本發(fā)明，而不應理解為對本發(fā)明范圍的任何限制。實施例l:總生物堿有效部位制備及測定鮮嫩桑枝,粉碎，晾干，取350kg，加去離子水2000L，加熱回流2小時，重復提取2次，合并提取液，濃縮至250L，加入700L乙醇，沉淀24小時，過濾，取上清液，上732#陽離子樹脂，以蒸餾水洗至中性，用0.5N的氨水洗脫，收集洗脫液，上DowexlX2(0H-)陰離子交換樹脂，收集不吸附部分，收集液經減壓濃縮干燥，得淡黃色粉末530g，收率為1.51%0。取上述干燥物，加水溶解，照柱前衍生化-HPLC法測定，以化合物(1)作對照，按外標法計算，生物堿總含量為55%，其中化合物(1)即l-deoxynojirimycin為29%?；衔?1)在一組生物堿中所占重量百分比為29%+55%=52.7%。實施例2:桑枝降糖有效部位片劑制備取實施例1制備的有效部位10g，加入磷酸二氫鈣5g，乳糖15g，硬脂酸鎂0.3g，分別過80目篩，混勻，用70%乙醇制軟材，20目篩制粒，千燥，14目篩整粒，壓片，片重約300mg，每片含有效部位提取物100mg，總生物堿50mg。實施例3:桑枝降糖有效部位膠囊制備取實施例1制備的有效部位10g，加入磷酸二氫鈣5g,乳糖5g，硬脂酸鎂0.3g，分別過80目篩，混勻，用70%乙醇制軟材，20目篩制粒，干燥，40目篩整粒，裝入2號硬膠囊，內容物約200mg，每片含有效部位提取物100mg，總生物堿50mg。實施例4:桑枝降糖有效部位口服液制備取實施例1制備的有效部位10g，加蒸餾水溶解并稀釋至500ml,加入0.05%苯甲酸，亦可加入適量調味劑，分裝于5ml或10ml的小瓶中，壓蓋，即得。每瓶含有效部位提取物100-200mg,總生物堿50-lOOmg。實施例5:桑枝降糖有效部位滴丸制備取聚乙二醇6000(PEG6000)50g，加熱到IOO'C熔融，加入實施例1制備的有效部位10g，攪拌制備均勻的熔融液，恒溫條件下將熔融液傾至滴丸機貯液缸中，滴液至液體石蠟中，冷卻成形，洗去液體石蠟，千燥，即得。每粒滴丸重約30mg，含有效部位5mg，總生物堿2.5mg。實施例6:桑枝降糖有效部位分散片制備取實施例1制備的有效部位10g，加入磷酸二氫鈣20g，乳糖5g，甘露醇15g，交聯聚乙吡咯烷酮10g，硬脂酸鎂0.3g，分別過80目篩,混勻，用70%乙醇制軟材，20目篩制粒，干燥，14目篩整粒，壓片，片重約600mg，每片含有效部位提取物100mg,總生物堿50mg。實施例7:桑枝降糖有效部位口嚼片制備及降血糖作用取實施例1制備的有效部位10g，加入磷酸二氫鈣5g，乳糖5g，甘露醇15g，硬脂酸鎂0.3g，分別過80目篩，混勻，用70%乙醇制軟材，20目篩制粒，干燥，14目篩整粒，壓片，片重約300mg，每片含有效部位提取物100mg，總生物堿50mg。本研究組8名工作人員作為健康志愿受試者，先后進行3次饅頭實驗，--次僅食饅頭U00g)作為對照，另兩次分別食饅頭與不同劑量(50mg/人、100mg/人)的有效部位口嚼片。實驗前空腹過夜，食饅頭前(作為"0"時)及后1小時及2小時測血糖水平。結果表明，口嚼片在每人50mg和100mg劑量下，能使健康志愿受試者饅頭餐后血糖峰值明顯降低，曲線下面積減少(圖3)。權利要求1、一種具有降血糖活性的生物堿有效部位，其特征在于，該有效部位是從桑枝中提取、分離和精制后得到的淡黃色或淺棕色粉末，有效部位中的活性成分為一組多羥基生物堿組合物，總生物堿含量占提取物的重量百分比在50％以上。2、根據權利要求1的生物堿有效部位，其特征在于，所述的多羥基生物堿組合物由1—deoxynojirimycin(1)禾口N~methly—1—deoxynojirimycin(2)、fagomine(3)、3-epi-fagomine(4)、1，4-dideoxy-1，4-imino-EKarabinitol(5)、1，4-dideoxy-1，4-imino-D~ribitol(6)、calysteginB2(7)、calysteginCi(8)、2~0~(aHD~gaIactopyranosyI)-1-deoxynojirimycin(9)、(P~D~gIucopyranosyI)—1-deoxynojirimycin(17)、1，4-dideoxy-1，4-imino-(2~0~e~0-glucopyranosyl)~D-arabinitol(18)中的至少一種組成，其中，1-deoxynojirimycin的重量百分比不得低于總生物堿的30%。3、根據權利要求2的生物堿有效部位，其特征在于，所述的多羥基生物堿組合物中1-deoxynojirimycin的重量百分比不得低于總生物堿的40%。4、根據權利要求3的生物堿有效部位，其特征在于，所述的多羥基生物堿組合物中1-deoxynojirimycin的重量百分比不得低于總生物堿的50%。5、一種具有降血糖活性的藥物組合物，其特征在于，含有有效劑量的權利要求l一4的生物堿有效部位和藥劑學上允許的賦形劑。6、根據權利要求5的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括普通片、分散片、口嚼片、膠囊、顆粒劑、沖劑、滴丸或口服液。7、根據權利要求6的藥物組合物，其特征在于，含有的生物堿有效部位按有效部位提取物計為25-400mg/片。8、根據權利要求7的藥物組合物，其特征在于，含有的生物堿有效部位按有效部位提取物計為50-200mg/片。9、根據權利要求8的藥物組合物，其特征在于，含有的生物堿有效部位按有效部位提取物計為100-200mg/片。10、制備權利要求l一4的生物堿有效部位的方法，其特征在于，制備方法系將桑枝藥材粉碎，加入水和/或醇提取，經酒沉或絮凝除雜，再經離子交換權脂分離和精制，收集液采用減壓濃縮或噴霧干燥，也可采用冷凍干燥方法去除溶劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種具有降血糖活性的有效部位，系由桑枝粉碎后用水和/或醇提取，或用酸水提取，經酒沉或絮凝去除雜質，濃縮，經樹脂色譜法分離精制而得的淡黃色粉末。本發(fā)明所述的有效部位，降糖活性成分為一組多羥基生物堿，采用HPLC法測定，總生物堿占有效部位重量百分比在50％以上。降糖劑量為每人每次12.5-200mg(按總生物堿計)。文檔編號A61K9/16GK101129476SQ20061011164公開日2008年2月27日申請日期2006年8月21日優(yōu)先權日2006年8月21日發(fā)明者泉劉,劉玉玲,夏學軍,孫素娟,汪仁蕓,申竹芳,金篤嘉申請人:中國醫(yī)學科學院藥物研究所