專利名稱：一種λ－卡拉膠寡糖在制備血管增生的抑制劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種λ-卡拉膠寡糖的應(yīng)用，尤其涉及λ-卡拉膠寡糖在制備血管增生的抑制劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管增生是在原來存在的血管結(jié)構(gòu)上長出新血管的生物學(xué)過程，許多病理?xiàng)l件下可以發(fā)生異常的血管增生，如炎癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，特別是腫瘤的形成與轉(zhuǎn)移更是依賴于新血管的形成。因此抑制過度的新血管增生已經(jīng)成為治療有關(guān)疾病有效的重要策略，并且該策略不會(huì)產(chǎn)生骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)或脫發(fā)等毒副反應(yīng)，也不易產(chǎn)生耐藥性。
體內(nèi)血管增生涉及的細(xì)胞主要是血管內(nèi)皮細(xì)胞，其過程包括小血管基底膜和基質(zhì)的降解，內(nèi)皮細(xì)胞在趨化因子的作用下發(fā)生遷移，內(nèi)皮細(xì)胞增殖，管腔形成并相互連接等。研究顯示，在新血管形成過程中涉及一種硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)，它廣泛分布于內(nèi)皮細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)，作為血管生長因子的輔助受體發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，對維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性、影響細(xì)胞侵襲、遷移和粘附都有重要的作用。因此外源性給予肝素樣硫酸化物質(zhì)可干擾HSPG的調(diào)節(jié)作用，從而影響血管生成；如蘇拉明和多硫酸戊聚糖已用于臨床治療；來源于褐藻的多硫酸化巖藻糖能夠抑制血管生長因子與受體的結(jié)合；國際專利(PCT/AU96/00238)也公開了一類硫酸化寡糖的制備，制備的產(chǎn)物是單糖單位間以1-2，1-3，1-4和/或1-6糖苷鍵連接的聚合物，其目的是對乙酰肝素酶的有效抑制作用，從而可以用來抑制人類的血管形成、腫瘤轉(zhuǎn)移及各類炎癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種λ-卡拉膠寡糖在制備血管增生的抑制劑的應(yīng)用；其在腫瘤、炎癥、糖尿病等疾病的治療和預(yù)防時(shí)用作血管增生的抑制劑。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為本發(fā)明提供一種具有下述結(jié)構(gòu)式的λ-卡拉膠寡糖在制備血管增生的抑制劑的應(yīng)用
其中n＝2-20。
所述的λ-卡拉膠寡糖是來自于紅藻多糖的λ型卡拉膠的降解產(chǎn)物，平均分子量為3351Da。
所述的λ型卡拉膠降解時(shí)所用的介質(zhì)為經(jīng)過酸處理的陽離子交換樹脂。
用該寡糖為活性成分可制備成保健品、藥物或食品用來治療和預(yù)防各種疾病引起的血管增生，由于λ-卡拉膠寡糖是從紅藻多糖中降解得到的低分子量糖，具有重復(fù)的α-(1-4)-D-半乳吡喃糖-β-(1-3)-D-半乳吡喃糖的二糖單元骨架結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)單元內(nèi)含有高硫酸基團(tuán)，可以用作外源性給予肝素樣硫酸化物質(zhì)，干擾體內(nèi)的HSPG的調(diào)節(jié)作用，所以其可以在腫瘤、炎癥、糖尿病等疾病引起的血管增生用作血管增生抑制劑，抑制各種疾病引起的血管增生。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于其原料來源于純天然的海洋藻類，該λ-卡拉膠寡糖具有無毒、低副作用的特點(diǎn)，使用安全性高；該寡糖其結(jié)構(gòu)單元內(nèi)含有高硫酸基團(tuán)，可以用作外源性給予肝素樣硫酸化物質(zhì)，干擾體內(nèi)的HSPG的調(diào)節(jié)作用，所以其可以在腫瘤、炎癥、糖尿病等疾病引起的血管增生用作血管增生抑制劑，抑制各種疾病引起的血管增生；該寡糖具有明確的單糖化合物寡聚體，其作用機(jī)理比較明確，并且抑制活性較好；可用于制藥及保健品、食品等領(lǐng)域中，預(yù)防和治療由于各種疑難雜癥所引起的各種血管增生和形成。


圖1A為對照組的雞胚尿囊膜上血管形成顯微鏡示意圖；圖1B為對照組的雞胚尿囊膜組織切片顯微鏡示意圖；圖2A實(shí)驗(yàn)組的雞胚尿囊膜血管形成的顯微鏡示意圖；圖2B為實(shí)驗(yàn)組的雞胚尿囊膜組織切片顯微鏡示意圖；圖3為實(shí)驗(yàn)組的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成顯微鏡示意圖；圖4為對照組的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成顯微鏡示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。本發(fā)明不僅局限于此。
制備例1將角叉菜屬植物紅藻Chondrus ocellatu 20g于40℃烘干，粉碎成100目，加適量水(藻水比為1∶80)，沸水浴攪拌1小時(shí)后，紗布過濾，濾渣重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，自來水透析24小時(shí)，蒸餾水透析24小時(shí)。在高速離心機(jī)上離心分離后取上清液在冰箱里凍透，95％酒精融化脫水，85％酒精浸洗二次，紅外燈下干燥。將此角叉菜多糖加3000ml水溶解，加入KCl至最終濃度為0.3mol/L，在冰水浴中攪拌1h，5000rpm離心30mins，得上清液，減壓濃縮，冰箱中凍透過夜、95％酒精脫水，烘干、得λ-卡拉膠1.45g。
將λ-卡拉膠配成1.5％的溶液，按體積比1∶4加入介質(zhì)為001×7型陽離子交換樹脂到溶液中，在90℃水浴，攪拌反應(yīng)6h，過濾去除樹脂，濾液減壓濃縮至近干，冷凍干燥得到λ-卡拉膠寡糖0.98g；按端基法測定寡糖平均分子量為3351Da。
制備例2用市售的λ-卡拉膠作為寡糖的作為制備原料，制備λ-卡拉膠寡糖方法同上。
試驗(yàn)例1雞胚尿囊膜(CAM)模型用新鮮海蘭種蛋以消毒水擦干其表面，取胚齡4d的胚蛋，分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組8枚；將蛋剝于杯中，胚蛋在37℃，60％相對濕度的孵箱中孵至CAM展開，培育8天，此時(shí)將剪好的約為1mm3的無菌明膠海綿置于對照組和實(shí)驗(yàn)組的尿囊絨毛膜上，吸取5μl(相當(dāng)于200μg活性成分/egg)卡拉膠寡糖加到無菌明膠海綿上置于實(shí)驗(yàn)組的尿囊絨毛膜上，而對照組以磷酸緩沖液代替寡糖樣品。雞蛋在孵箱中繼續(xù)孵育兩天，待雞胚尿囊膜毛細(xì)血管網(wǎng)徹底形成后，取出雞蛋，以載體為中心剪下雞胚尿囊膜，在10％甲醛中固定12-24h，顯微觀察，分別隨機(jī)各選取4個(gè)視野計(jì)數(shù)血管分支點(diǎn)數(shù)(對照組為57±6.78條；實(shí)驗(yàn)組為23±0.85條)。另外各做組織學(xué)切片，片厚5μm，HE染色，封片將對照組和實(shí)驗(yàn)組的作比較，分別得到圖1、圖2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
本實(shí)驗(yàn)例使用雞胚尿囊膜作為血管新生的模型，在雞胚生長至約第10天，對照組的雞胚尿囊膜內(nèi)形成大量的血管網(wǎng)圖1A，實(shí)驗(yàn)組使用λ-卡拉膠寡糖(200μg/egg)會(huì)使血管新生明顯減少圖2A，實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果圖2A與對照組的結(jié)果圖1A比較，血管密度明顯減少，并且膜內(nèi)的微血管數(shù)也大大減少；從中對比得出使用λ-卡拉膠寡糖(200μg/egg)對血管生成的抑制率達(dá)到54.90％；其組織切片的結(jié)果也顯示，實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果圖2B比對照組的結(jié)果圖1B在尿囊膜內(nèi)的毛細(xì)血管明顯減少。
試驗(yàn)例2臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模型本實(shí)驗(yàn)例以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為模型，取HUVEC 150μl，細(xì)胞密度3×104/cells，加入到預(yù)鋪以無血清MEM培養(yǎng)基(MEM為一種培養(yǎng)基的名稱縮寫)1∶1稀釋的Matrigel(基底膜基質(zhì))的96孔板內(nèi)，37℃下凝固30分鐘的培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)組的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中加入λ-卡拉膠寡糖，體系的最終濃度為125μg/ml(ml是細(xì)胞溶液的量)，37℃孵育48h后，顯微鏡下分別觀察各自的管腔的形成情況，分別得到圖3、圖4的結(jié)果。
在此試驗(yàn)中，對照組的結(jié)果圖3顯示鏡下可見明顯的管腔出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果圖4顯示鏡下可見管腔無法生成，所以對HUVEC施用125μg/ml的λ-卡拉膠寡糖即可以破壞內(nèi)皮細(xì)胞管腔的生成。
權(quán)利要求
1.一種具有下述結(jié)構(gòu)式的λ-卡拉膠寡糖在制備血管增生的抑制劑的應(yīng)用 其中n＝2-20。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的λ-卡拉膠寡糖是來自于紅藻多糖的λ型卡拉膠的降解產(chǎn)物，平均分子量為3351Da。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的λ型卡拉膠降解時(shí)所用的介質(zhì)為經(jīng)過酸處理的陽離子交換樹脂。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種λ－卡拉膠寡糖的應(yīng)用，尤其涉及在制備血管增生的抑制劑的應(yīng)用；其在腫瘤、炎癥、糖尿病等疾病的治療和預(yù)防時(shí)用作血管增生的抑制劑；本發(fā)明的原料來源于純天然的海洋藻類，使用安全性高，具有無毒、低副作用的特點(diǎn)；其作用機(jī)理比較明確，并且抑制活性較好；可廣泛應(yīng)用于制藥及保健品、食品等領(lǐng)域中，防止和治療由于各種疑難雜癥所引起的各種血管增生和形成。
文檔編號A61P35/00GK1899293SQ20061005258
公開日2007年1月24日 申請日期2006年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月21日
發(fā)明者陳海敏, 嚴(yán)小軍, 徐繼林 申請人:寧波大學(xué)