專利名稱：促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素在治療彌漫性間質(zhì)型肺炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的新用途，尤其涉及促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素在治療彌漫性間質(zhì)型肺炎藥物中的應(yīng)用，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素可以作為治療彌漫性間質(zhì)型肺炎的治療或輔助治療藥物。
背景技術(shù)：
促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素是從新鮮乳豬肝或未哺乳新生牛肝臟中提取的多組分小分子肽類混合物，分子量在10,000Da以下。其主要藥理作用是能明顯刺激新生肝細(xì)胞的DNA合成，改善肝臟枯否細(xì)胞的吞噬功能，對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷有較好的保護(hù)作用，對(duì)D-氨基半乳糖誘致的肝衰竭有明顯的提高存活力的作用。臨床用于各種重型病毒性肝炎，如急性、亞急性、慢性重癥肝炎等的早期或中期的輔助治療。該品自1992年上市以來，已廣泛使用多年，臨床療效確切。促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素系采用勻漿、變性、離心、分級(jí)超濾等現(xiàn)代生物技術(shù)手段提取純化制備而成。
彌漫性肺間質(zhì)性疾病是一組非特異性的，侵犯肺泡壁及肺泡周圍組織的疾病，主要病理改變?yōu)榉伍g質(zhì)纖維化。180余種致肺間質(zhì)纖維化疾病中，約占64％的病因不清。其典型臨床表現(xiàn)是漸進(jìn)性、勞力性氣促，干咳，呼吸困難，終末期表現(xiàn)為呼吸衰竭。目前對(duì)肺纖維化尚沒有一種令人滿意的治療藥物。臨床常用的藥物有糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑/細(xì)胞毒藥物和抗纖維化藥物。糖皮質(zhì)激素為最主要的治療藥物，但是不良反應(yīng)非常多，可誘發(fā)或加重感染，不適合長(zhǎng)期大劑量使用。
開發(fā)治療或輔助治療肺纖維化的藥物，減少或替代激素，減輕激素不良反應(yīng)對(duì)人體造成的傷害，在當(dāng)前以至今后都具有非常廣泛的社會(huì)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的新用途，既促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素在治療彌漫性間質(zhì)型肺炎藥物中的應(yīng)用，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素可以用于彌漫性間質(zhì)型肺炎的治療或輔助治療。
用于彌漫性間質(zhì)型肺炎的治療劑量為靜脈滴注，本品100mg加入5％葡萄糖液250ml緩慢靜脈點(diǎn)滴，每日1次，療程視病情而定，一般為4-12周。
本發(fā)明促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素在治療彌漫性間質(zhì)型肺炎藥物中的應(yīng)用，它對(duì)油酸誘致急性肺損傷具有較好的保護(hù)作用，對(duì)博萊霉素誘致的肺損傷肺纖維化具有保護(hù)作用。
本發(fā)明是發(fā)明人通過長(zhǎng)期大量關(guān)于促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的治療彌漫性間質(zhì)型肺炎的試驗(yàn)研究驗(yàn)證的，至今未見記載和報(bào)道。本發(fā)明藥效學(xué)試驗(yàn)肺系數(shù)變化、SOD(超氧化物歧化酶)值、MDA(丙二醛)值以及HYP(羥脯氨酸)值變化與對(duì)照組比較差異均具有顯著性。證明促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)多種因素致肺損傷、肺纖維化具有保護(hù)作用。提示促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)臨床彌漫性間質(zhì)型肺炎具有治療作用。
一、彌漫性間質(zhì)型肺炎的發(fā)病機(jī)制肺泡上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、纖維細(xì)胞與膠原及細(xì)胞因子等在彌漫性間質(zhì)型肺炎中均發(fā)揮作用。
①肺泡上皮細(xì)胞受損 肺上皮損傷是引起肺纖維化的重要因素之一，I型上皮細(xì)胞受損，II型上皮細(xì)胞增生。包括血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-α、TGF-β)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、前列腺素F2a(PGF2a)等參與肺損傷過程。
②巨噬細(xì)胞活化 活化的肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophage，AM)釋放的細(xì)胞因子和炎性遞質(zhì)在早期肺損傷中起主要作用。AM活化后TGF-β、PDGF和IGF-1(胰島素樣生長(zhǎng)因子)是致纖維化的生長(zhǎng)因子，在早期分泌增多，同時(shí)啟動(dòng)肺纖維化的過程，形成不可逆性肺損傷。TGF-β是重要的致纖維化生長(zhǎng)因子，能刺激成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成，促進(jìn)膠原蛋白、纖維連接蛋白、透明質(zhì)酸、蛋白聚糖等在細(xì)胞外基質(zhì)中沉積，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解。PDGF和IGF-1也是重要的致纖維化生長(zhǎng)因子，能刺激平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成。
③炎癥細(xì)胞聚集和活化淋巴細(xì)胞在肺間質(zhì)纖維化的患者肺間質(zhì)中經(jīng)常存在，可釋放白介素-4(IL-4)、成纖維母細(xì)胞趨化因子、單核細(xì)胞趨化因子和巨噬細(xì)胞趨化因子等。這些肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞、炎性細(xì)胞之間的相互作用，生成的炎性介質(zhì)以及生長(zhǎng)因子，最后作用于成纖維母細(xì)胞，造成成纖維母細(xì)胞增生和膠原形成。
④纖維細(xì)胞增生和膠原產(chǎn)生PGE-2、干擾素-γ(INF-γ)、成纖維細(xì)胞移動(dòng)抑制因子等均屬于負(fù)調(diào)節(jié)因子。I、III型膠原的異常表達(dá)，主要發(fā)生于肺纖維化的中、后期，而IV型膠原的變化在肺纖維化早期就非常突出。近年來，金屬蛋白酶(MMPs)和組織型金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)比例失調(diào)在肺纖維化膠原代謝紊亂的作用已引起重視。特發(fā)性肺纖維化(IPF)患者纖維化病灶內(nèi)TIMP-2活性增高。
⑤細(xì)胞凋亡已經(jīng)有大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡在肺纖維化中起著重要的作用。Fas、級(jí)聯(lián)酶、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、活性氧自由基(ROS)、NO、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、p53和p21(癌基因蛋白)、白介素-6(IL-6)都可促進(jìn)FAS介導(dǎo)的凋亡。Fas-FasL誘發(fā)的凋亡促進(jìn)IL-1β分泌、中性粒細(xì)胞聚集和上皮細(xì)胞的缺失。在肺部疾病模型中，炎癥和纖維化可以通過干擾Fas-FasL的相互作用或下調(diào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)而控制。
⑥細(xì)胞因子在肺纖維化發(fā)病中的作用及機(jī)制大量細(xì)胞因子之間及其與炎癥細(xì)胞、肺臟組織細(xì)胞之間可以相互作用，發(fā)生一系列復(fù)雜的反應(yīng)，加重肺組織炎癥或免疫損傷，刺激纖維母細(xì)胞分裂增殖，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和沉積。肺纖維化的發(fā)生是以細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失衡導(dǎo)致大量趨化因子釋放從而引起炎性細(xì)胞聚集、活化為基礎(chǔ)。
生長(zhǎng)因子TGF-β對(duì)成纖維細(xì)胞作用主要表現(xiàn)在兩大方面一方面它能刺激成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)成分；另一方面抑制對(duì)新合成的基質(zhì)蛋白產(chǎn)生的酶解作用，還具有抑制肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cell，AECs)增殖的作用。肺內(nèi)的IGF-1是重要的致肺纖維化因子之一，其含量增高與肺纖維化的嚴(yán)重程度成正比。IGF-1與大鼠成纖維細(xì)胞IGF-1R受體結(jié)合后，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)DNA合成而發(fā)揮作用。
腫瘤壞死因子TNF-α是在致炎因子刺激下，機(jī)體組織產(chǎn)生的一種重要的細(xì)胞免疫防御因子。在BLM所致小鼠肺纖維化發(fā)生過程中主要由巨噬細(xì)胞及II型肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生。刺激人肺成纖維細(xì)胞的增生和膠原的合成。
白介素 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IL-1受體拮抗劑(IL-1ra)可明顯減輕博萊霉素(BLM)或二氧化硅誘發(fā)的肺纖維化。IL-4具有使肺表面活性物質(zhì)SP-D表達(dá)增加，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生、膠原基因表達(dá)以及膠原合成功能。IL-8是肺纖維化中重要的前炎癥因子，不僅參與早期的肺損傷和炎癥的維持、發(fā)展，也可能參與纖維化的形成。
γ-干擾素 INF-γ抑制膠原合成。
趨化因子 巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α(MIP-1α)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)是與肺纖維化相關(guān)的趨化因子和免疫調(diào)節(jié)因子，可顯著刺激肺成纖維細(xì)胞合成膠原，并可導(dǎo)致具有成纖維特性的細(xì)胞因子或介質(zhì)產(chǎn)生。
內(nèi)皮素、血管緊張素II、轉(zhuǎn)錄因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-7(MMP-7)、細(xì)胞間黏附分子等均對(duì)肺纖維化的發(fā)生發(fā)揮一定的作用。
下述試驗(yàn)中所用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素可以是市售也可以是按本發(fā)明實(shí)施例1方法制備而成。
二、本發(fā)明藥物的藥理試驗(yàn)彌漫性間質(zhì)型肺炎的病理經(jīng)過各種不明的致病因子——肺泡炎癥——上皮基底膜遭致破壞——肺泡腔內(nèi)纖維化——最終肺泡結(jié)構(gòu)破壞——形成肺纖維化和囊泡蜂窩肺。抑制急性期肺泡炎癥與慢性期纖維化進(jìn)展對(duì)間質(zhì)性肺炎均具有積極意義。我們采用油酸所致小鼠急性肺損傷模型與博萊霉素致大鼠肺損傷纖維化模型研究了促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)急、慢性肺損傷及肺纖維化的保護(hù)作用。
(一)促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)油酸所致急性肺損傷的保護(hù)作用1、基本原理急性肺損傷常可導(dǎo)致肺纖維化。采用靜脈注射油酸的方法，造成急性肺損傷模型是目前研究急性肺損傷(ALI)的一個(gè)常用方法。我們將小鼠預(yù)防性給促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素三日，最后一次給藥后30min，靜脈給油酸造成ALI，通過測(cè)定血清脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)與抗過氧化物質(zhì)超氧化物歧化酶(SOD)的變化及肺組織病理學(xué)變化、肺系數(shù)的變化來判定促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素是否具有對(duì)抗ALI的作用。
2、實(shí)驗(yàn)方法60只小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，雌雄各半。在給油酸制備ALI模型前，各組動(dòng)物預(yù)防性給藥三次，每日1次。C組腹腔內(nèi)注射地塞米松2mg/kg，D組靜脈注射促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素8mg/kg、E組促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素15mg/kg、F組促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素30mg/kg。給藥體積為0.4～0.5ml，A組與B組尾靜脈注射等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)三次。最后一次給藥30min，除A正常對(duì)照組靜脈注射0.15ml/kg生理鹽水外，其它各組均尾靜脈注射0.15ml/kg油酸，造成ALI。給油酸6小時(shí)后各組小鼠摘眼球采血，離心分離血清，-20℃冰箱保存待檢；然后脫頸處死小鼠，取出肺臟，觀察大體形態(tài)，用濾紙吸干，稱肺濕重，計(jì)算肺系數(shù)(肺濕重÷體重×100)，取其右葉置4％甲醛液中固定，72小時(shí)后常規(guī)石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡檢查、SOD活性檢測(cè)(鄰苯三酚自氧化速率法)、MDA含量檢測(cè)[硫代巴比妥酸(TBA)顯色法]，采用南京建成生物工程研究所SOD、MDA試劑盒方法檢測(cè)。
3、試驗(yàn)結(jié)果a肺系數(shù)變化肺系數(shù)＝肺重/體重×100％。各試驗(yàn)組肺系數(shù)均明顯高于正常對(duì)照組，差異均有顯著性(P＜0.01)；促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組各組肺系數(shù)低于油酸模型組，其中E中劑量組肺系數(shù)值最低，差異顯著(P＜0.01)。
表1、肺系數(shù)變化表(X±SD)(單位g)

注▲與油酸模型組比較 P＜0.05▲▲與油酸模型組比較 P＜0.01*與正常對(duì)照組比較 P＜0.05 **與正常對(duì)照組比較P＜0.01b血清MDA、SOD含量的變化與正常對(duì)照組比較，各試驗(yàn)組SOD均低于正常對(duì)照組。油酸模型組SOD為最低；促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組各組SOD值均高于油酸模型組，差異均顯著。其中E促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素中劑量組最高。
與正常對(duì)照組比較，各試驗(yàn)組MDA明顯高于A正常對(duì)照組，差異均有顯著性；促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組MDA低于油酸模型組，其中E中劑量組與F高劑量組差異顯著(P＜0.05)，D低劑量組MDA值也低于B模型組，但差異不具顯著性。
表2、血清丙二醛(MDA)與超氧化物歧化酶(SOD)結(jié)果(X±SD)


注▲與油酸模型組比較 P＜0.05▲▲與油酸模型組比較 P＜0.01*與正常對(duì)照組比較P＜0.05 **與正常對(duì)照組比較 P＜0.01c肺組織病理學(xué)變化肺組織肉眼所見 各試驗(yàn)組肺體積明顯增大，肺表面充血，水腫和出血點(diǎn)；油酸模型組最為嚴(yán)重，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素中劑量組肉眼可見病變明顯輕于油酸模型組，與地塞米松組大致相似，表現(xiàn)為肺體積較小，出血點(diǎn)較少，病變程度較輕。
光鏡檢查 各試驗(yàn)組均可見肺毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血、出血，肺間質(zhì)水腫，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，透明膜形成，肺泡灶性壞死及肺不張。促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素高劑量與中劑量組病變程度明顯輕于B油酸模型組。
4、實(shí)驗(yàn)結(jié)論本實(shí)驗(yàn)采用油酸復(fù)制ALI模型，結(jié)果表明，油酸模型組血清MDA增高，SOD降低，肺系數(shù)升高，病理改變?yōu)榧毙匝装Y表現(xiàn)，肺腫大，充血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。采用地塞米松作為陽性藥物，試驗(yàn)結(jié)果血清MDA降低、SOD升高、肺系數(shù)下降，病理組織學(xué)改變減輕，提示應(yīng)用地塞米松可以抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕肺組織損傷的程度，對(duì)油酸致ALI有保護(hù)作用。同時(shí)也證實(shí)了該動(dòng)物模型復(fù)制成功。
促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素給藥組血清MDA較油酸模型組降低，差異顯著；血清SOD較油酸模型升高，差異顯著，說明促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素抑制了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組肺病理變化較輕，腫脹程度小，肺系數(shù)較模型組低。本試驗(yàn)結(jié)果表明，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)油酸所致急性肺損傷具有保護(hù)作用，與陽性對(duì)照藥物地塞米松組結(jié)果相似。
本試驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素劑量在15mg/kg時(shí)最為顯著，而在8mg/kg作用較差，將這一結(jié)果推論人用藥，成人體重60-70kg計(jì)，臨床使用劑量為100mg/日為宜。
(二)促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)由博萊霉素誘致大鼠肺損傷及纖維化保護(hù)作用研究1、基本原理博萊霉素是一種抗腫瘤藥物，其毒副作用之一是引起肺纖維化，已證明其病理學(xué)和生理學(xué)改變與人肺纖維化近似。采用博萊霉素制作動(dòng)物肺纖維化模型是藥理試驗(yàn)常用的方法。我們采用大鼠氣管內(nèi)一次性注射博萊霉素復(fù)制肺纖維化模型，同時(shí)靜脈注射促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素進(jìn)行預(yù)防性治療，通過測(cè)定血清中丙二醛(MDA)含量與肺組織中羥脯氨酸(HYP)含量，測(cè)量肺系數(shù)及進(jìn)行肺病理學(xué)檢查等指標(biāo)判定促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素是否對(duì)博萊霉素所致肺損傷具有保護(hù)作用及是否具有抗肺纖維化作用。
2、試驗(yàn)方法Wistar大鼠180只，體重200～220g，雌雄各半，隨機(jī)分成6組，每組30只，雌雄各半。用一次性氣管內(nèi)注入博萊霉素復(fù)制肺纖維化模型具體步驟為用1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，取仰臥位固定于平板上，行無菌手術(shù)，剪開頸部皮膚分離出氣管，除正常對(duì)照組外，各組均氣管內(nèi)注入博萊霉素0.2～0.3ml(5mg/kg)。正常對(duì)照組注入等體積的生理鹽水。給藥后立即將大鼠直立并旋轉(zhuǎn)，使藥物在肺內(nèi)均勻分布，縫合皮膚。于氣管手術(shù)后即開始藥物治療地塞米松組每日腹腔內(nèi)注射約0.4ml(3.33mg/kg)；注射用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素使用時(shí)用氯化鈉注射液稀釋，低、中、高三個(gè)劑量組分別按5、10、20mg/kg給藥，給藥體積為1ml/200g，尾靜脈給藥，正常對(duì)照組與博萊霉素組每日靜脈內(nèi)注射生理鹽水1ml/200g，每日給藥一次，至處死日。分別于給藥的第3日、14日、28日，將動(dòng)物分3批處死，每批每組處死10只。給藥后約1小時(shí)，將大鼠用乙醚麻醉，腹主動(dòng)脈采血(第3日、14日)，離心分離血清，-20℃冷凍備用，待測(cè)丙二醛(MDA)含量；摘取肺臟，用濾紙吸干，稱全肺重，計(jì)算肺系數(shù)，即全肺重/體重×100％；取一部分右肺組織固定于甲醛固定液中，作病理切片；其它肺作羥脯氨酸含量測(cè)定用。
3、試驗(yàn)結(jié)果a肺系數(shù)變化肺系數(shù)＝肺重/體重×100％。
試驗(yàn)各組動(dòng)物體重均有所下降，肺充血腫脹，重量增加，致肺系數(shù)增加。促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素各組與博萊霉素組比較，肺系數(shù)均有所降低，中劑量組降低幅度最大，有顯著差異(P＜0.01)。
表3、不同時(shí)間肺系數(shù)變化表(X±SD)(單位％)

注▲與博萊霉素模型組比較 P＜0.05▲▲與博萊霉素模型組比較 P＜0.01*與正常對(duì)照組比較P＜0.05 **與正常對(duì)照組比較P＜0.01b血清丙二醛(MDA)含量的變化在給藥第3日與第14日，各試驗(yàn)組血清MDA均較正常對(duì)照組升高；促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素各組與博萊霉素組比較，MDA均有所降低，中劑量組降低幅度最大。顯著性差異(P＜0.01，第3日；P＜0.05，第14日)。
表4、不同時(shí)間血清丙二醛(MDA)變化表(X±SD)(單位nmol/ml)

注▲與博萊霉素模型組比較 P＜0.05▲▲與博萊霉素模型組比較 P＜0.01*與正常對(duì)照組比較 P＜0.05 **與正常對(duì)照組比較P＜0.01c羥脯氨酸(HYP)含量的變化在第14日與28日，各試驗(yàn)組肺HYP含量較正常對(duì)照組普遍升高，第28日值高于第14日值。以博萊霉素模型組為最高。促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組中、高劑量組與博萊霉素模型組比較均具顯著性差異(P＜0.01)。
表5、不同時(shí)間肺組織羥脯氨酸(HYP)含量HYP變化表(X±SD)(單位mg/g)

注▲與博萊霉素模型組比較 P＜0.05▲▲與博萊霉素模型組比較 P＜0.01*與正常對(duì)照組比較 P＜0.05 **與正常對(duì)照組比較P＜0.01d組織病理學(xué)變化在給藥第3日，試驗(yàn)組肺外觀腫大，有深紅色充血點(diǎn)，表面不光滑，在第14日與28日，實(shí)驗(yàn)組雙肺蒼白，有深紅色充血點(diǎn)和灰白色小結(jié)節(jié)，硬度增加，體積較第14日縮小。各時(shí)間段均以博萊霉素組最為明顯，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素中劑量組情況較輕。
HE染色光鏡下觀察 病理改變呈漸進(jìn)性纖維化形成，早期水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，晚期主要表現(xiàn)為毛細(xì)血管增生，成纖維細(xì)胞增生，膠原增加。促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素各組病理改變也輕于博萊霉素組，其中的中劑量組情況為最好。
4、試驗(yàn)結(jié)論本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素可以顯著地抑制肺脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生，在給藥第3日與第14日，模型組MDA有下降趨勢(shì)。三個(gè)促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組MDA含量均低于博萊霉素組，其中的中劑量組幅度最大。提示促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素可能通過抑制過氧化反應(yīng)，減輕博萊霉素對(duì)肺臟的損傷作用；與此同時(shí)給藥組的羥脯氨酸含量也顯著低于博萊霉素組；病理改變也有所減輕；本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組動(dòng)物肺系數(shù)較博萊霉素組明顯降低，配合病理變化，可以認(rèn)為促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素使肺腫脹、充血等炎癥變化減輕；結(jié)果表明，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素具有抑制由博萊霉素致肺損傷與肺纖維化作用。
在本試驗(yàn)中，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素劑量在10mg/kg時(shí)最為顯著，而在5mg/kg作用結(jié)果較差，將這一結(jié)果推論人用藥，按成人體重60-70kg計(jì)，臨床使用劑量為100mg/日為宜。
上述試驗(yàn)促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)油酸誘致急性肺損傷較好的保護(hù)作用及對(duì)博萊霉素誘致的肺損傷肺纖維化的保護(hù)作用，提示促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)臨床彌漫性間質(zhì)型肺炎具有治療或輔助治療作用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法包括下述步驟①選取健康、非傳染區(qū)的、經(jīng)檢疫合格的乳豬或未哺乳新生牛，取新鮮肝臟(要求表面應(yīng)光潔、細(xì)膩、色澤正常，不得有包囊、結(jié)節(jié)及寄生蟲)，用注射用水洗凈后分裝于滅菌容器內(nèi)，直接使用或-20℃下冷凍保存不超過3個(gè)月使用；②組織處理將新鮮或低溫冷凍肝臟去除外膜，以注射用水洗凈，剪碎或切碎；③勻漿按重量∶體積為1∶1加入滅菌注射用水，于低溫(4℃)條件下的膠體磨中反復(fù)勻漿2分鐘，顯微鏡下檢查細(xì)胞完全破碎，得勻漿液；④凍融將勻漿液反復(fù)凍融三次，采取速凍緩融方法，冷凍溫度-20℃～-35℃，融化溫度低于40℃；
⑤熱變性并去除大分子蛋白將速融液迅速升溫至85℃，恒溫5分鐘，以達(dá)到大分子蛋白熱變性，并去除大分子蛋白；⑥離心熱變性后，4℃，4000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，棄沉淀，取上清；⑦分級(jí)超濾及病毒滅活將離心上清液以超濾器進(jìn)行分級(jí)超濾。一級(jí)超濾——收集分子量30,000Da以下的組分；二級(jí)超濾——收集分子量為10,000Da以下的多肽組分，60℃保溫10小時(shí)，滅活病毒；⑧除菌過濾、分裝以0.45μm、0.22μm微孔濾膜過濾，將檢驗(yàn)合格的過濾液分裝于一次性使用塑料輸液袋中，低溫(-18℃±2℃)貯存，即得促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液。
使用上述方法取得的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液性狀為微黃色澄明液體，其檢測(cè)情況如下鑒別加雙縮脲反應(yīng)溶液顯藍(lán)紫色至紫紅色。
檢查pH值為6.0～7.0。(中國藥典2005年版二部附錄VI H)蛋白質(zhì) 陰性。
高分子量物質(zhì) 小于胰島素峰保留時(shí)間的峰面積之和不得過6.0％。
活力測(cè)定 采用MTT法測(cè)定促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液活性，刺激指數(shù)不小于4.0。
異常毒性 取本品，加氯化鈉注射液制成每1ml中含多肽5.0mg的溶液，依法檢查(中國藥典2005年版二部附錄XI C)，按靜脈注射法給藥，應(yīng)符合規(guī)定。
熱原 取本品，加氯化鈉注射液制成每1ml中含多肽5.0mg的溶液，依法檢查(中國藥典2005年版二部附錄XI D)，劑量按家兔體重每1kg注射1ml，應(yīng)符合規(guī)定。
過敏性試驗(yàn) 取本品適量，加氯化鈉注射液制成每1ml中含多肽5.0mg的溶液，作為供試品液。取體重250～350g健康豚鼠6只，間日腹腔注射供試品0.5ml，連續(xù)3次，在第三次注射后的14天，自靜脈注射本品1.0ml，注射后15分鐘內(nèi)觀察動(dòng)物，均不得出現(xiàn)連續(xù)干咳、連續(xù)前爪抓鼻、明顯聳毛、四肢發(fā)軟、躺臥、呼吸困難、痙攣、虛脫及死亡現(xiàn)象。連續(xù)觀察3天，動(dòng)物應(yīng)健存。
無菌 依法檢查(中國藥典2005年版二部附錄XI H)，應(yīng)符合規(guī)定。
含量測(cè)定照福林酚測(cè)定法測(cè)定，每1ml中含多肽不得少于10mg。
上述促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素在治療彌漫性間質(zhì)型肺炎藥物中的應(yīng)用，它對(duì)油酸誘致急性肺損傷具有較好的保護(hù)作用，對(duì)博萊霉素誘致的肺損傷肺纖維化具有保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素在治療彌漫性間質(zhì)型肺炎藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了注射用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的新用途，即促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素在治療彌漫性間質(zhì)型肺炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過藥理試驗(yàn)證明促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)多種因素致肺損傷、肺纖維化具有保護(hù)作用。提示促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)臨床彌漫性間質(zhì)型肺炎具有治療或輔助治療作用。
文檔編號(hào)A61P11/00GK1907491SQ200610047370
公開日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2006年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月2日
發(fā)明者王光, 李莉, 曲娜 申請(qǐng)人:沈陽斯佳科技發(fā)展有限公司