專利名稱：小干擾rna與單壁碳納米管復(fù)合物及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單壁碳納米管(SWNTs)作為生物材料的應(yīng)用，特別是一種小干擾RNA與單壁碳納米管復(fù)合物及制備方法和應(yīng)用。小干擾RNA(siRNA)與單壁碳納米管復(fù)合物(siRNA:SWNTs+)可導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞如樹突細(xì)胞，用于檢測其對腫瘤細(xì)胞生長的影響以及免疫調(diào)節(jié)的功能，此發(fā)明具有潛在的臨床治療應(yīng)用價值。
背景技術(shù)：
RNA干涉(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA(dsRNA)特異性地抑制其互補(bǔ)基因表達(dá)的一種現(xiàn)象。小干擾RNA(small interfering dsRNA，siRNA)可以介導(dǎo)基因沉默，可以用于哺乳動物細(xì)胞干涉RNA的表達(dá)，從而影響靶基因的功能。RNA干涉治療是最近幾年發(fā)展的能使靶基因滅活的最具潛力的遺傳治療方法。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶是保持染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞增殖過程中起關(guān)鍵作用。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶能在有增殖能力的細(xì)胞內(nèi)檢測到，尤其是各種腫瘤細(xì)胞。在正常的體細(xì)胞很難發(fā)現(xiàn)。因此端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的小分子抑制劑或端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)的降低為靶向性腫瘤細(xì)胞治療提供了可能。早在1995年，F(xiàn)eng et al.(1995，Science，269(5228)，1236-1241)用抗端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶mRNA導(dǎo)致了Hela細(xì)胞的死亡。
盡管有一些脂質(zhì)體類轉(zhuǎn)染試劑和電穿孔方法可以轉(zhuǎn)染siRNA，但這些試劑一般轉(zhuǎn)染效率低而且不穩(wěn)定。為了取得安全有效的siRNA干擾治療，急切需要一個能使siRNA保持穩(wěn)定，進(jìn)入細(xì)胞，并且能夠體內(nèi)應(yīng)用的siRNA載體轉(zhuǎn)染方法。有效的siRNA載體導(dǎo)入細(xì)胞方法能夠潛在的發(fā)揮治療效果。但到目前為止還沒有一種有效的能夠體內(nèi)應(yīng)用的siRNA載體，這就嚴(yán)格限制了siRNA作為藥物治療的應(yīng)用。
單壁碳納米管(SWNTs)的各項(xiàng)優(yōu)異的性能不僅使其在電子、航空、航天、機(jī)械、能源等領(lǐng)域擁有廣泛的應(yīng)用潛力，最近其在生物領(lǐng)域的一些應(yīng)用也顯示了它們潛在的功能，氧化的SWNTs可以在它們的羥基或羧基部分連接蛋白質(zhì)，多肽，DNA，寡核苷酸，糖基等生物大分子。由于功能化的SWNTs可以進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞并且沒有明顯毒性，所以SWNTs可以用作一些分子進(jìn)入細(xì)胞的載體，如可作為各種藥物傳遞的載體，尤其可以用作具有疫苗傳遞等有臨床治療作用的載體。最近研究發(fā)現(xiàn)功能化的SWNTs可以連接siRNA因分子。Dai Hongjie等人(J.Am.Chem.Soc.2005，127，6021-6026.PNAS，2005，102，11600-11605.J.Am.Chem.Soc.2005，127，12492-12493.)利用一種帶有氨基的聚乙烯醇2000磷脂分子先對SWNTs進(jìn)行包裹，得到分散性能很好的SWNTs，再用一種雙官能團(tuán)偶合劑連接siRNA，這種復(fù)合物能夠進(jìn)入細(xì)胞降低腫瘤細(xì)胞中特定基因的表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種小干擾RNA與單壁碳納米管復(fù)合物及制備方法和應(yīng)用，可以克服現(xiàn)有siRNA的載體毒性高，轉(zhuǎn)染效率低且不穩(wěn)定，不具備臨床應(yīng)用價值等方面的不足。本發(fā)明小干擾RNA與單壁碳納米管的復(fù)合物采用正電荷功能化的單壁碳納米管作為siRNA的載體，提供一種低毒高效的siRNA轉(zhuǎn)染劑，將siRNA傳遞入細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長和免疫調(diào)節(jié)的目的。其特點(diǎn)是利用碳納米管的納米級尺寸、可進(jìn)行多種功能化使其可被吞噬細(xì)胞吞噬或穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的特點(diǎn)。通過兩方面的功能加以證明其一端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物降低端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的mRNA(信使RNA)水平，降低它們的活性與表達(dá)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。其二利用免疫分子基因siRNA與SWNTs結(jié)合導(dǎo)入免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞如樹突細(xì)胞，以沉默樹突細(xì)胞中的靶基因，調(diào)節(jié)其免疫功能。本發(fā)明能有效的將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞沉默基因。因此，SWNTs可作為一種高效的siRNA轉(zhuǎn)染劑和載體，顯示了其在基因治療或基因干涉等方面的應(yīng)用前景。
本發(fā)明提供的一種小干擾RNA與單壁碳納米管復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表示為siRNA:SWNTs+，它是用Boc-保護(hù)的二元胺通過共價鍵連接到SWNTs，使其成鹽帶有正電荷，再與帶有負(fù)電性的siRNA通過靜電相互作用構(gòu)成的復(fù)合物。
所述的單壁碳納米管是直徑為1.0～2.0nm，長度為10nm～100μm的單壁碳納米管。
所述的二元胺是C2～C20的二元胺中的至少一種。優(yōu)選丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺和十二二胺。
所述的siRNA是端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA或免疫刺激分子CD80siRNA。
端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的siRNA的(根據(jù)Ambion提供的設(shè)計(jì)程序進(jìn)行)特殊靶序列是AACAGATCAAGAGCAGTAGTC和AATATGTCAGACTCCTCAGGT；CD80siRNA特殊的靶序列是AACTGTCCAAGTCAGTGAAAG和AAGTGTGGCCCGAGTATAAGA。
本發(fā)明小干擾RNA與單壁碳納米管復(fù)合物的制備方法包括如下步驟1)SWNTs的純化、切割和氧化采用在硝酸或鹽酸中超聲并回流的方法純化，然后用表面活性劑Triton-X洗滌，SWNTs進(jìn)一步用混酸切割氧化，在(硝酸∶硫酸＝1∶3)中超聲一定時間。
2)將二元胺用Boc-保護(hù)(或不進(jìn)行保護(hù))，然后與酰氯化的SWNTs進(jìn)行反應(yīng)，再脫掉Boc-保護(hù)并成鹽(或不用脫保護(hù)，加酸成鹽)，得到胺鹽功能化的SWNTs，再將siRNA與功能化的單壁碳納米管相互作用。
本發(fā)明小干擾RNA與單壁碳納米管復(fù)合物的制備方法包括如下具體步驟1)將SWNTs(采用電弧法制備)在2.6M硝酸或濃鹽酸中超聲分散1h，并回流24h，離心洗去酸液，再分別用1.1％和0.2％的Triton X-100洗滌，過膜收集固體，最后用蒸餾水洗去Triton X-100。純化后的SWNTs在混酸(濃硝酸∶濃硫酸＝1∶3)中超聲5h，水洗去酸液。
2)在氬氣保護(hù)下將(Boc)2O加入至二胺溶液中反應(yīng)8h，室溫攪拌3天，得Boc-CnH2nNH2。(Boc)2O與二胺的摩爾比是1∶7.5。
3)步驟2)得到的SWNTs加入到混合溶劑二氯亞砜和DMF(體積比20∶1)中，SWNTs濃度約為5mg/mL，超聲分散1h，然后70℃加熱回流攪拌24h，冷卻，旋蒸除去二氯亞砜，再加四氫呋喃超聲洗滌四～五次，抽濾干燥，得到酰氯化的SWNTs-COCl。
4)Boc-CnH2nNH2與SWNTs-COCl(重量比是100∶1)，在DMF溶劑中，氬氣保護(hù)下90℃反應(yīng)96h，反應(yīng)完成后用0.1μm尼龍膜過濾收集產(chǎn)品，并用二噁烷洗兩次，然后室溫下真空干燥，得到SWNTs-CO-NHCnH2n-Boc。
5)冰水浴和Ar保護(hù)條件下，二噁烷為溶劑，濃HCl與SWNTs-CO-NHCnH2n-Boc反應(yīng)，濃HCl與SWNTs-CO-NHCnH2n-Boc的重量比約為16∶1，撤去冰水浴，室溫反應(yīng)1h，離心除去反應(yīng)液，將SWNTs用二噁烷洗滌2次，室溫下干燥產(chǎn)品，得到SWNTs+。
6)SWNTs+在水溶液中超聲分散，室溫下與siRNA孵育1小時，然后水洗兩次，得到siRNA:SWNTs+復(fù)合物，通過電子能譜、分光光度計(jì)或電鏡分析表征。
本發(fā)明提供的小干擾RNA與單壁碳納米管復(fù)合物的應(yīng)用是1)以siRNA為靶向端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的基因序列，siRNA:SWNTs+復(fù)合物對腫瘤細(xì)胞生長抑制功能的檢測。
2)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶RNA水平的降低，降低端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的活性和抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)。
3)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞的生長與繁殖。
4)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物直接注入腫瘤組織導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。
5)以siRNA靶向免疫刺激分子CD80，進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的檢測。
6)將CD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物與成熟和未成熟的樹突細(xì)胞孵育，抑制細(xì)胞內(nèi)CD80的表達(dá)，降低CD80mRNA的水平。
7)將CD80siRNA:SWNTs+注入小鼠體內(nèi)，抑制免疫調(diào)節(jié)Gr-1+CD11b+細(xì)胞CD80的表達(dá)。
本發(fā)明小干擾RNA與單壁碳納米管的復(fù)合物采用正電荷功能化的單壁碳納米管作為siRNA的載體，提供一種低毒高效的siRNA轉(zhuǎn)染劑，將siRNA傳遞入細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長和免疫調(diào)節(jié)的目的。其特點(diǎn)是利用單壁碳納米管的納米級尺寸、可進(jìn)行多種功能化使其可被吞噬細(xì)胞吞噬或穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的特點(diǎn)。通過兩方面的功能加以證明其一端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物降低端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的mRNA(信使RNA)水平，降低它們的活性與表達(dá)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。其二利用免疫分子基因siRNA與SWNTs結(jié)合導(dǎo)入免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞如樹突細(xì)胞，以沉默樹突細(xì)胞中的靶基因，調(diào)節(jié)其免疫功能。本發(fā)明能有效的將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞沉默基因。因此，SWNTs可作為一種高效的siRNA轉(zhuǎn)染劑和載體，顯示了其在基因治療或基因干涉等方面的應(yīng)用前景。
總之，所述的小干擾RNA與單壁碳納米管復(fù)合物的應(yīng)用，它用作檢測和治療腫瘤細(xì)胞生長或其它細(xì)胞系的試劑，以及用作調(diào)節(jié)免疫功能或治療免疫相關(guān)疾病試劑。
本發(fā)明的具體特點(diǎn)是1)單壁碳納米管是一種優(yōu)良的納米級材料，可以進(jìn)行多種功能化，通過Boc-保護(hù)的二元胺功能化再成鹽后能得到分散性能較好的SWNTs。
2)siRNA等不易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)可通過與碳納米管結(jié)合的方法有效進(jìn)入細(xì)胞。
3)siRNA等不穩(wěn)定易降解的物質(zhì)與單壁碳納米管結(jié)合后有較好的穩(wěn)定性不易被降解，可提高導(dǎo)入細(xì)胞的效率和導(dǎo)入細(xì)胞后的功效。
4)本發(fā)明的方法可將端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞以抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，有潛在的臨床應(yīng)用價值。
5)本發(fā)明的方法可將免疫調(diào)節(jié)分子siRNA導(dǎo)入樹突細(xì)胞，以沉默樹突細(xì)胞中的靶基因，調(diào)節(jié)免疫功能，這對與免疫功能有關(guān)的疾病如腫瘤，移植排斥反應(yīng)，自身免疫性疾病等有廣泛的臨床應(yīng)用價值。


圖1端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的表征。
圖2端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物引導(dǎo)基因沉默。
圖3端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物在體外抑制腫瘤細(xì)胞的生長與增殖。
圖4端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物抑制腫瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。
圖5 CD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物導(dǎo)致成熟樹突細(xì)胞和未成熟樹突細(xì)胞CD80基因的沉默。
圖6 CD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物進(jìn)入腫瘤相關(guān)性Gr-1+CD11b+細(xì)胞引導(dǎo)CD80基因沉默。
圖7體內(nèi)注射CD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物導(dǎo)致小鼠細(xì)胞內(nèi)CD11b+細(xì)胞的CD80表達(dá)降低。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是本實(shí)施例只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容做出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。
本發(fā)明使用的透射電鏡配備電子能譜(FEI，TECNAI-20)，分光光度計(jì)(Eppendorf，AG biophotometer)，原子力顯微鏡(Veeco，Nanoscope IV)，流式細(xì)胞儀(BD FACScalibur)。
各種試劑的純度均為分析純。SWNTs的氧化使用的混酸是濃酸。
實(shí)施例11.siRNA:SWNTs+復(fù)合物的制備(1)SWNTs的純化、切割和氧化0.5g SWNTs在70mL 2.6M HNO3中超聲分散1h，再回流24h，然后離心洗去酸液，再分別用1.1％和0.2％的Triton X-100洗滌，過膜收集固體，最后用蒸餾水洗去Triton X-100。純化的SWNTs進(jìn)一步用混酸切割氧化(硝酸∶硫酸＝1∶3)，100mg純化的SWNTs在400mL混酸中超聲5h，然后用蒸餾水洗去酸液。
(2)正電荷負(fù)載的SWNTs(SWNTs+)的制備a.己二胺的單氨基保護(hù)7.09g(32.5mmol)(Boc)2O溶于80ml新蒸二噁烷，28.3g(244mmol)1，6-己二胺溶于250ml二噁烷。在氬氣保護(hù)下將(Boc)2O滴加至二胺溶液中在8h內(nèi)滴完，然后室溫攪拌3天。處理后得到產(chǎn)品4.30g，產(chǎn)率61.0％。
b.SWNTs的酰氯化100mg SWNTs加入到20mL二氯亞砜中，再加1mL DMF，超聲分散1h，然后70℃加熱回流攪拌24h，產(chǎn)品冷卻，旋蒸除去二氯亞砜，再加四氫呋喃超聲洗滌四～五次，抽濾干燥。
c.Boc保護(hù)過的己二胺與酰氯化的SWNTs反應(yīng)4.3g Boc-C6H12NH2，30ml DMF，0.0430g SWNT-COCl加入反應(yīng)瓶，氬氣保護(hù)下90℃反應(yīng)96h。反應(yīng)完成后用0.1μm尼龍膜過濾收集產(chǎn)品，并用二噁烷洗兩次，然后室溫下真空干燥。
d.去Boc保護(hù)，生成鹽酸鹽9.6ml二噁烷，0.4ml濃HCl置于冰水浴攪拌，Ar保護(hù)下加入30mg SWNT-CO-NHC6H12-Boc并撤去冰水浴，室溫反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束離心除去反應(yīng)液，將SWNTs用二噁烷洗滌2次然后室溫干燥產(chǎn)品。
(3)siRNA:SWNT+復(fù)合物的制備和表征將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。siRNA:SWNTs+復(fù)合物通過電子能譜，分光光度計(jì)，透射電鏡和原子力顯微鏡分析表征。
2.siRNA:SWNTs+復(fù)合物對腫瘤細(xì)胞生長抑制功能的檢測。
(1)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的制備。將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA序列1#正義鏈CAGAUCAAGAGCAGUAGUCtt和反義鏈GACUACUGCUCUUGAUCUGtt；2#正義鏈UAUGUCAGACUCCUCAGGUtt和反義鏈ACCUGAGGAGUCUGACAUAtt。
(2)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的表征。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA納米碳管復(fù)合物通過透射電鏡、電子能譜、原子力顯微鏡、分光光度計(jì)檢測(圖1)。圖1端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的表征。
A端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的電子能譜A1SWNTs；A2未帶正電荷負(fù)載的SWNTs與端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA結(jié)合的復(fù)合物；A3帶有正電荷的SWNTs與端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA的復(fù)合物。
B通過分光光度計(jì)對端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物連接的分析。IRF相對熒光強(qiáng)度。(相對熒光強(qiáng)度＝樣本熒光強(qiáng)度/對照熒光強(qiáng)度)。
C端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的電鏡表征C1透射電鏡。
C2原子力顯微鏡(箭頭指示siRNA與帶有正電荷的SWNTs聯(lián)結(jié))。
(3)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物引導(dǎo)基因沉默。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物導(dǎo)致端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的mRNA水平降低，降低端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)，抑制端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的活性(圖2)。圖2端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物引導(dǎo)基因沉默。
A端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物導(dǎo)致端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的mRNA水平降低。GAPDH陽性對照；siRNA:SWNTs+實(shí)驗(yàn)組；MocksiRNA:SWNTs對照組。
A1鼠肺癌細(xì)胞LLC。
A2鼠宮頸癌細(xì)胞TC-1。
A3鼠卵巢癌細(xì)胞IH8。
B端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物降低端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)。Actin陽性對照。
B1鼠肺癌細(xì)胞LLC。
B2鼠宮頸癌細(xì)胞TC-1。
B3鼠卵巢癌細(xì)胞IH8。
C端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物抑制端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的活性。siRNA:SWNTs+實(shí)驗(yàn)組；MocksiRNA:SWNTs對照組。
將端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNT+復(fù)合物分別加入到培養(yǎng)的鼠肺癌細(xì)胞，鼠宮頸癌細(xì)胞，鼠卵巢癌細(xì)胞，siRNA終濃度為2nM。14小時后，消化收集這些siRNA:SWNTs+復(fù)合物轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞，用Trizol提取RNA。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的mRNA通過半定量RT-PCR進(jìn)行評估。引物包括鼠端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶5’ATGACCCGCGCTCCTCGTTGC和3’GACAGCAGAGATGTGGAGCTG；陽性對照GAPDH引物5’ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC和3’CATCGAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTGCTGT端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物轉(zhuǎn)染的鼠肺癌細(xì)胞，鼠宮頸癌細(xì)胞，鼠卵巢癌細(xì)胞的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶蛋白水平也通過Western Blotting方法檢測。100ug的核提取液由7.5％SDS-PAGE膠分離，然后轉(zhuǎn)移到nitrocellulose膜上，蛋白抗體復(fù)合物用辣根過氧化酶標(biāo)記的第二抗體檢測。
端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶活性通過德國Boehringrt Mannheim公司生產(chǎn)的PCR ELISA Kit測定。
(4)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物抑制腫瘤細(xì)胞生長。
將端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物分別加入到在24孔板中培養(yǎng)好的鼠肺癌細(xì)胞，鼠宮頸癌細(xì)胞，鼠卵巢癌細(xì)胞中。在24小時內(nèi)對照組細(xì)胞，siRNA單獨(dú)處理的細(xì)胞，其它對照siRNA:SWNTs+復(fù)合物處理過的細(xì)胞都生長良好。而加入端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA納米碳管復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞的生長明顯受到抑制(圖3)。圖3端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物在體外抑制腫瘤細(xì)胞的生長與增殖。
A肺癌細(xì)胞B鼠宮頸癌細(xì)胞C鼠卵巢癌細(xì)胞A1，B1，C1細(xì)胞對照。
A2，B2，C2端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物處理過的細(xì)胞。
A3，B3，C3siRNA單獨(dú)處理的細(xì)胞。
A4，B4，C4其它對照siRNA:SWNTs+復(fù)合物處理過的細(xì)胞。
A5，B5，C5不同實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞的數(shù)量。siRNA:SWNTs+實(shí)驗(yàn)組；MocksiRNA:SWNTs對照組。
D端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物處理的鼠肺癌細(xì)胞的變化。D1轉(zhuǎn)染前的鼠肺癌細(xì)胞，D2轉(zhuǎn)染后24小時后的細(xì)胞，D3轉(zhuǎn)染4天的細(xì)胞，D4轉(zhuǎn)染6天后的細(xì)胞。
(5)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物對腫瘤部位的直接注射導(dǎo)致腫瘤生長的抑制。
a.單一點(diǎn)注射。
將2×106的肺癌細(xì)胞注射到小鼠右腿下方。當(dāng)腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，A1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；A2一點(diǎn)注射100uL端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物組(10nM siRNA)；A3只注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA(10nM siRNA)；A4注射其它對照siRNA:SWNTs+結(jié)合的復(fù)合物(10nM siRNA)。
注射后，每隔2天測量腫瘤大小。7天后A1，A3和A4三組腫瘤大小無顯著差異。A2組腫瘤在注射位點(diǎn)，有明顯的凹陷，說明此區(qū)域的腫瘤細(xì)胞生長和增殖都受到了抑制(圖4，A)。
b.多點(diǎn)注射。
將2×106的肺癌細(xì)胞注射到小鼠右腿下方。當(dāng)腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，B1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；B2向腫瘤中多點(diǎn)注射100uL注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物組(siRNA 10nM)；B3多點(diǎn)注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA(siRNA 10nM)；B4多點(diǎn)注射其它對照siRNA:SWNTs+結(jié)合的復(fù)合物(siRNA 10nM)。
注射后每隔2天測量腫瘤大小。8天后B1，B3和B4三組腫瘤大小無顯著差異。B2組腫瘤與其它組腫瘤大小有明顯差異，比其它組腫瘤都明顯減小(圖4，B)。說明注射了端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞生長和增殖都受到了抑制。
圖4腫瘤組織內(nèi)注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物抑制鼠肺癌細(xì)胞的生長和增殖。
A端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物在一點(diǎn)注射導(dǎo)致的對腫瘤生長和增殖的抑制。
A1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；A2注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物組；A3只注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA；A4注射其它對照siRNA:SWNTs+結(jié)合的復(fù)合物。
B多點(diǎn)注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物導(dǎo)致的對腫瘤生長和增殖的抑制。
B1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；B2注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物組；B3只注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA；B4注射其它對照siRNA:SWNTs+結(jié)合的復(fù)合物。
C腫瘤的平均重量。M.T.W.(g)鼠肺癌在不同處理與對照組的平均重量。
3.siRNA:SWNTs+復(fù)合物進(jìn)入免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，降低靶基因的水平，抑制靶基因的表達(dá)。
(1)制備CD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物。
將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM CD80siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。
兩組CD80siRNA序列被用于我們的研究中1#正義鏈CUGUCCAAGUCAGUGAAAGtt和反義鏈CUUUCACUGACUUGGACAGtt 2#正義鏈GUGUGGCCCGAGUAUAAGAtt和反義鏈UCUUAUACUCGGGCCACACtt(2)siRNA:SWNTs+復(fù)合物進(jìn)入免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的檢測。
A、將復(fù)合物分別加入到未成熟的樹突細(xì)胞、成熟的樹突細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞系的培養(yǎng)瓶中，復(fù)合物siRNA終濃度為2nM。48小時后進(jìn)行細(xì)胞表面分子染色，進(jìn)行流失細(xì)胞儀檢測。
同時轉(zhuǎn)染siRNA:SWNTs復(fù)合物的不成熟樹突細(xì)胞，成熟樹突細(xì)胞，單核細(xì)胞以及Raw264.7細(xì)胞系總RNA用Trizol提取。CD80mRNA的水平通過半定量RT-PCR進(jìn)行評估。
鼠CD80的引物5’ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGG和3’CTAAAGGAAGACGGTCTG陽性對照基因GAPDH引物與上述相同(圖5)。圖5 CD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物導(dǎo)致CD80基因的沉默。
ACD80siRNA:SWNTs+在未成熟的樹突細(xì)胞中導(dǎo)致CD80基因沉默。
BCD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物在成熟的樹突細(xì)胞中引導(dǎo)CD80基因沉默。
CCD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物在單核細(xì)胞細(xì)胞系RAW264.7中引導(dǎo)的基因沉默A1，B1，C1加入CD80siRNAA2，B2，C2加入其它對照siRNA與SWNTs+結(jié)合的復(fù)合物A3，B3，C3加入實(shí)驗(yàn)CD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物a抗體亞型對照；b實(shí)驗(yàn)組CD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物(A3，B3，C3)與對照單獨(dú)CD80siRNA(A1，B1，C1)或未帶正電荷SWNTs與CD80siRNA復(fù)合物(A2，B2，C2)。
cCD80在未處理細(xì)胞的表達(dá)組中的表達(dá)。
DCD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物在未成熟樹突細(xì)胞，成熟的樹突細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞系RNA水平。GAPDH陽性對照；siRNA:SWNTs+實(shí)驗(yàn)組；MocksiRNA:SWNTs對照組。
B、將復(fù)合物分別加入到培養(yǎng)Gr-1+CD11b+細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，復(fù)合物siRNA終濃度為2nM。48小時后將細(xì)胞表面分子染色，進(jìn)行流失細(xì)胞儀檢測(圖6)。圖6CD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物在腫瘤相關(guān)性Gr-1+CD11b+細(xì)胞引導(dǎo)CD80基因沉默。
A光鏡下來自于腹腔植入卵巢癌細(xì)胞的小鼠脾細(xì)胞形態(tài)。(40x)Ba抗體亞型對照；bCD80在CD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物處理的Gr-1+CD11b+細(xì)胞中的表達(dá)；cCD80在未經(jīng)處理的Gr-1+CD11b+細(xì)胞中的表達(dá)。
C、將CD80siRNA:SWNTs+經(jīng)鼠尾靜脈注入植入卵巢癌小鼠體內(nèi)，此復(fù)合物可被脾臟內(nèi)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞Gr-1+CD11+細(xì)胞吸收，抑制這些細(xì)胞的CD80的表達(dá)(圖7)。圖7體內(nèi)注射CD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物導(dǎo)致小鼠脾細(xì)胞內(nèi)CD11b+細(xì)胞的CD80表達(dá)降低。
A1卵巢癌鼠脾細(xì)胞；A2卵巢癌鼠脾細(xì)胞大細(xì)胞表達(dá)Gr1和CD11b分子；A3CD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物對CD80表達(dá)的影響。
A3.1注射CD80siRNA；A3.2注射CD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物；A3.3注射對照siRNA:SWNTs+結(jié)合的復(fù)合物；A3.4不同處理組CD80的表達(dá)。a抗體亞型對照；b注射CD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物組CD80的表達(dá)；c和d對照組CD80的表達(dá)。
A4不同處理組mRNA的水平。GAPDH陽性對照siRNA:SWNTs+實(shí)驗(yàn)組；MocksiRNA:SWNTs對照組。
實(shí)施例2
1.siRNA:SWNTs+復(fù)合物的制備(1)SWNTs的純化、切割和氧化。
0.5g SWNTs在70mL 2.6M HNO3中超聲分散1h，再回流24h，然后離心洗去酸液，再分別用1.1％和0.2％的Triton X-100洗滌，過膜收集固體，最后用蒸餾水洗去Triton X-100。純化的SWNTs進(jìn)一步用混酸切割氧化(硝酸∶硫酸＝1∶3)，100mg純化的SWNTs在400mL混酸中超聲5h，然后用蒸餾水洗去酸液。
(2)正電荷負(fù)載的SWNTs(SWNTs+)的制備。
a.辛二胺的單氨基保護(hù)7.09g(32.5mmol)(Boc)2O溶于80ml新蒸二噁烷，35.1g(244mmol)1，8-辛二胺溶于250ml二噁烷。在氬氣保護(hù)下將(Boc)2O滴加至二胺溶液中在8h內(nèi)滴完。然后室溫攪拌3天。處理后得到產(chǎn)品4.68g，產(chǎn)率59.0％。
b.SWNTs的酰氯化100mg SWNTs加入到20mL二氯亞砜中，再加1mL DMF，超聲分散1h，然后70℃加熱回流攪拌24h，產(chǎn)品冷卻，旋蒸除去二氯亞砜，再加四氫呋喃超聲洗滌四～五次，抽濾干燥。
c.Boc保護(hù)過的辛二胺與酰氯化的SWNTs反應(yīng)4.68g Boc-C8H16NH2，30ml DMF，0.0468g SWNT-COCl加入反應(yīng)瓶，氬氣保護(hù)下90℃反應(yīng)96h。反應(yīng)完成后用0.1μm尼龍膜過濾收集產(chǎn)品，并用二噁烷洗兩次，然后室溫下真空干燥。
d.去Boc保護(hù)，生成鹽酸鹽9.6ml二噁烷，0.4ml濃HCl置于冰水浴攪拌，Ar保護(hù)下加入30mg SWNT-CO-NHC8H16-Boc并撤去冰水浴，室溫反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束離心除去反應(yīng)液，將SWNTs用二噁烷洗滌2次然后室溫干燥產(chǎn)品。
(3)siRNA:SWNT+復(fù)合物的制備和表征將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。siRNA:SWNTs+復(fù)合物通過電子能譜，分光光度計(jì)，透射電鏡和原子力顯微鏡分析表征。
2.siRNA:SWNTs+復(fù)合物對腫瘤細(xì)胞生長抑制功能的檢測。
(1)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的制備。將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA序列1#正義鏈CAGAUCAAGAGCAGUAGUCtt和反義鏈GACUACUGCUCUUGAUCUGtt；2#正義鏈UAUGUCAGACUCCUCAGGUtt和反義鏈ACCUGAGGAGUCUGACAUAtt。
(2)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的表征。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA納米碳管復(fù)合物通過透射電鏡、電子能譜、原子力顯微鏡、分光光度計(jì)檢測(與實(shí)例一的圖1類似)。
(3)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物引導(dǎo)基因沉默。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物導(dǎo)致端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的mRNA水平降低，降低端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)，抑制端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的活性(與實(shí)例一的圖2類似)。
將端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNT+復(fù)合物分別加入到培養(yǎng)的鼠肺癌細(xì)胞，鼠宮頸癌細(xì)胞，鼠卵巢癌細(xì)胞，siRNA終濃度為2nM。14小時后，消化收集這些siRNA:SWNTs+復(fù)合物轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞，用Trizol提取RNA。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的mRNA通過半定量RT-PCR進(jìn)行評估。引物包括鼠端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶5’ATGACCCGCGCTCCTCGTTGC和3’GACAGCAGAGATGTGGAGCTG；陽性對照GAPDH引物5’ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC和3’CATCGAAGGTGGAAGAGTGGAGTTGCTGT端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物轉(zhuǎn)染的鼠肺癌細(xì)胞，鼠宮頸癌細(xì)胞，鼠卵巢癌細(xì)胞的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶蛋白水平也通過Western Blotting方法檢測。100ug的核提取液由7.5％SDS-PAGE膠分離，然后轉(zhuǎn)移到nitrocellulose膜上，蛋白抗體復(fù)合物用辣根過氧化酶標(biāo)記的第二抗體檢測。
端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶活性通過德國Boehringrt Mannheim公司生產(chǎn)的PCR ELISA Kit測定。
(4)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物抑制腫瘤細(xì)胞生長(與實(shí)例一的圖3類似)。
將端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物分別加入到在24孔板中培養(yǎng)好的鼠肺癌細(xì)胞，鼠宮頸癌細(xì)胞，鼠卵巢癌細(xì)胞中。在24小時內(nèi)對照組細(xì)胞，siRNA單獨(dú)處理的細(xì)胞，其它對照siRNA:SWNTs+復(fù)合物處理過的細(xì)胞都生長良好。而加入端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA納米碳管復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞的生長明顯受到抑制。
(5)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物對腫瘤部位的直接注射導(dǎo)致腫瘤生長的抑制。
a.單一點(diǎn)注射。
將2×106的肺癌細(xì)胞注射到小鼠右腿下方。當(dāng)腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，A1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；A2一點(diǎn)注射100uL端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物組(10nM siRNA)；A3只注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA(10nM siRNA)；A4注射其它對照siRNA:SWNTs+結(jié)合的復(fù)合物(10nM siRNA)。
注射后，每隔2天測量腫瘤大小。7天后A1，A3和A4三組腫瘤大小無顯著差異。A2組腫瘤在注射位點(diǎn)，有明顯的凹陷，說明此區(qū)域的腫瘤細(xì)胞生長和增殖都受到了抑制(與實(shí)例一的圖4，A類似)。
b.多點(diǎn)注射。
將2×106的肺癌細(xì)胞注射到小鼠右腿下方。當(dāng)腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，B1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；B2向腫瘤中多點(diǎn)注射100uL注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物組(siRNA 10nM)；B3多點(diǎn)注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA(siRNA 10nM)；B4多點(diǎn)注射其它對照siRNA:SWNTs+結(jié)合的復(fù)合物(siRNA 10nM)。
注射后每隔2天測量腫瘤大小。8天后B1，B3和B4三組腫瘤大小無顯著差異。B2組腫瘤與其它組腫瘤大小有明顯差異，比其它組腫瘤都明顯減小(與實(shí)例一的圖4，B類似)。說明注射了端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞生長和增殖都受到了抑制。
3.siRNA:SWNTs+復(fù)合物進(jìn)入免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，降低靶基因的水平，抑制靶基因的表達(dá)。
(1)制備CD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物。
將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM CD80siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。
兩組CD80siRNA序列被用于我們的研究中1#正義鏈CUGUCCAAGUCAGUGAAAGtt和反義鏈CUUUCACUGACUUGGACAGtt；2#正義鏈GUGUGGCCCGAGUAUAAGAtt和反義鏈UCUUAUACUCGGGCCACACtt(2)siRNA:SWNTs+復(fù)合物進(jìn)入免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的檢測。
A、將復(fù)合物分別加入到未成熟的樹突細(xì)胞、成熟的樹突細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞系的培養(yǎng)瓶中，復(fù)合物siRNA終濃度為2nM。48小時后進(jìn)行細(xì)胞表面分子染色，進(jìn)行流失細(xì)胞儀檢測。
同時轉(zhuǎn)染siRNA:SWNTs復(fù)合物的不成熟樹突細(xì)胞，成熟樹突細(xì)胞，單核細(xì)胞以及Raw264.7細(xì)胞系總RNA用Trizol提取。CD80mRNA的水平通過半定量RT-PCR進(jìn)行評估。
鼠CD80的引物5’ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGG和3’CTAAAGGAAGACGGTCTG陽性對照基因GAPDH引物與上述相同(與實(shí)例一的圖5類似)。
B、將復(fù)合物分別加入到培養(yǎng)Gr-1+CD11b+細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，復(fù)合物siRNA終濃度為2nM。48小時后將細(xì)胞表面分子染色，進(jìn)行流失細(xì)胞儀檢測(與實(shí)例一的圖6類似)。
C、將CD80siRNA:SWNTs+經(jīng)鼠尾靜脈注入植入卵巢癌小鼠體內(nèi)，此復(fù)合物可被脾臟內(nèi)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞Gr-1+CD11+細(xì)胞吸收，抑制這些細(xì)胞的CD80的表達(dá)(與實(shí)例一的圖7類似)。
實(shí)施例31.siRNA:SWNTs+復(fù)合物的制備(1)SWNTs的純化、切割和氧化。
0.5g SWNTs在70mL 2.6M HNO3中超聲分散1h，再回流24h，然后離心洗去酸液，再分別用1.1％和0.2％的Triton X-100洗滌，過膜收集固體，最后用蒸餾水洗去Triton X-100。純化的SWNTs進(jìn)一步用混酸切割氧化(硝酸∶硫酸＝1∶3)，100mg純化的SWNTs在400mL混酸中超聲5h，然后用蒸餾水洗去酸液。
(2)正電荷負(fù)載的SWNTs(SWNTs+)的制備。
a.癸二胺的單氨基保護(hù)7.09g(32.5mmol)(Boc)2O溶于80ml新蒸二噁烷，42.0g(244mmol)1，10-癸二胺溶于250ml二噁烷。在氬氣保護(hù)下將(Boc)2O滴加至二胺溶液中在8h內(nèi)滴完。然后室溫攪拌3天。處理后得到產(chǎn)品4.95g，產(chǎn)率56.0％。
b.SWNTs的酰氯化100mg SWNTs加入到20mL二氯亞砜中，再加1mL DMF，超聲分散1h，然后70℃加熱回流攪拌24h，產(chǎn)品冷卻，旋蒸除去二氯亞砜，再加四氫呋喃超聲洗滌四～五次，抽濾干燥。
c.Boc保護(hù)過的癸二胺與酰氯化的SWNTs反應(yīng)4.95g Boc-C10H20NH2，30ml DMF，0.0495g SWNT-COCl加入反應(yīng)瓶，氬氣保護(hù)下90℃反應(yīng)96h。反應(yīng)完成后用0.1μm尼龍膜過濾收集產(chǎn)品，并用二噁烷洗兩次，然后室溫下真空干燥。
d.去Boc保護(hù)，生成鹽酸鹽9.6ml二噁烷，0.4ml濃HCl置于冰水浴攪拌，Ar保護(hù)下加入30mg SWNT-CO-NHC10H20-Boc并撤去冰水浴，室溫反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束離心除去反應(yīng)液，將SWNTs用二噁烷洗滌2次然后室溫干燥產(chǎn)品。
(3)siRNA:SWNT+復(fù)合物的制備和表征將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。siRNA:SWNTs+復(fù)合物通過電子能譜，分光光度計(jì)，透射電鏡和原子力顯微鏡分析表征。
2.siRNA:SWNTs+復(fù)合物對腫瘤細(xì)胞生長抑制功能的檢測。
(1)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的制備。將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA序列1#正義鏈CAGAUCAAGAGCAGUAGUCtt和反義鏈GACUACUGCUCUUGAUCUGtt；2#正義鏈UAUGUCAGACUCCUCAGGUtt和反義鏈ACCUGAGGAGUCUGACAUAtt。
(2)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的表征。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA納米碳管復(fù)合物通過透射電鏡、電子能譜、原子力顯微鏡、分光光度計(jì)檢測(與實(shí)例一的圖1類似)。
(3)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物引導(dǎo)基因沉默。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物導(dǎo)致端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的mRNA水平降低，降低端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)，抑制端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的活性(與實(shí)例一的圖2類似)。
將端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNT+復(fù)合物分別加入到培養(yǎng)的鼠肺癌細(xì)胞，鼠宮頸癌細(xì)胞，鼠卵巢癌細(xì)胞，siRNA終濃度為2nM。14小時后，消化收集這些siRNA:SWNTs+復(fù)合物轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞，用Trizol提取RNA。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的mRNA通過半定量RT-PCR進(jìn)行評估。引物包括鼠端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶5’ATGACCCGCGCTCCTCGTTGC和3’GACAGCAGAGATGTGGAGCTG；陽性對照GAPDH引物5’ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC和3’CATCGAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTGCTGT端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物轉(zhuǎn)染的鼠肺癌細(xì)胞，鼠宮頸癌細(xì)胞，鼠卵巢癌細(xì)胞的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶蛋白水平也通過Western Blotting方法檢測。100ug的核提取液由7.5％SDS-PAGE膠分離，然后轉(zhuǎn)移到nitrocellulose膜上，蛋白抗體復(fù)合物用辣根過氧化酶標(biāo)記的第二抗體檢測。
端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶活性通過德國Boehringrt Mannheim公司生產(chǎn)的PCR ELISA Kit測定。
(4)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物抑制腫瘤細(xì)胞生長(與實(shí)例一的圖3類似)。
將端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物分別加入到在24孔板中培養(yǎng)好的鼠肺癌細(xì)胞，鼠宮頸癌細(xì)胞，鼠卵巢癌細(xì)胞中。在24小時內(nèi)對照組細(xì)胞，siRNA單獨(dú)處理的細(xì)胞，其它對照siRNA:SWNTs+復(fù)合物處理過的細(xì)胞都生長良好。而加入端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA納米碳管復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞的生長明顯受到抑制。
(5)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物對腫瘤部位的直接注射導(dǎo)致腫瘤生長的抑制。
a.單一點(diǎn)注射。
將2×106的肺癌細(xì)胞注射到小鼠右腿下方。當(dāng)腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，A1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；A2一點(diǎn)注射100uL端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物組(10nM siRNA)；A3只注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA(10nM siRNA)；A4注射其它對照siRNA:SWNTs+結(jié)合的復(fù)合物(10nM siRNA)。
注射后，每隔2天測量腫瘤大小。7天后A1，A3和A4三組腫瘤大小無顯著差異。A2組腫瘤在注射位點(diǎn)，有明顯的凹陷，說明此區(qū)域的腫瘤細(xì)胞生長和增殖都受到了抑制(與實(shí)例一的圖4，A類似)。
b.多點(diǎn)注射。
將2×106的肺癌細(xì)胞注射到小鼠右腿下方。當(dāng)腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，B1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；B2向腫瘤中多點(diǎn)注射100uL注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物組(siRNA 10nM)；B3多點(diǎn)注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA(siRNA 10nM)；B4多點(diǎn)注射其它對照siRNA:SWNTs+結(jié)合的復(fù)合物(siRNA 10nM)。
注射后每隔2天測量腫瘤大小。8天后B1，B3和B4三組腫瘤大小無顯著差異。B2組腫瘤與其它組腫瘤大小有明顯差異，比其它組腫瘤都明顯減小(與實(shí)例一的圖4，B類似)。說明注射了端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞生長和增殖都受到了抑制。
3.siRNA:SWNTs+復(fù)合物進(jìn)入免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，降低靶基因的水平，抑制靶基因的表達(dá)。
(1)制備CD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物。
將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM CD80siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。
兩組CD80siRNA序列被用于我們的研究中1#正義鏈CUGUCCAAGUCAGUGAAAGtt和反義鏈CUUUCACUGACUUGGACAGtt；2#正義鏈GUGUGGCCCGAGUAUAAGAtt和反義鏈UCUUAUACUCGGGCCACACtt(2)siRNA:SWNTs+復(fù)合物進(jìn)入免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的檢測。
A、將復(fù)合物分別加入到未成熟的樹突細(xì)胞、成熟的樹突細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞系的培養(yǎng)瓶中，復(fù)合物siRNA終濃度為2nM。48小時后進(jìn)行細(xì)胞表面分子染色，進(jìn)行流失細(xì)胞儀檢測。
同時轉(zhuǎn)染siRNA:SWNTs復(fù)合物的不成熟樹突細(xì)胞，成熟樹突細(xì)胞，單核細(xì)胞以及Raw264.7細(xì)胞系總RNA用Trizol提取。CD80mRNA的水平通過半定量RT-PCR進(jìn)行評估。
鼠CD80的引物5’ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGG和3’CTAAAGGAAGACGGTCTG陽性對照基因GAPDH引物與上述相同(圖5)。
B、將復(fù)合物分別加入到培養(yǎng)Gr-1+CD11b+細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，復(fù)合物siRNA終濃度為2nM。48小時后將細(xì)胞表面分子染色，進(jìn)行流失細(xì)胞儀檢測(與實(shí)例一的圖6類似)。
C、將CD80siRNA:SWNTs+經(jīng)鼠尾靜脈注入植入卵巢癌小鼠體內(nèi)，此復(fù)合物可被脾臟內(nèi)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞Gr-1+CD11+細(xì)胞吸收，抑制這些細(xì)胞的CD80的表達(dá)(與實(shí)例一的圖7類似)。
實(shí)施例41.siRNA:SWNTs+復(fù)合物的制備(1)SWNTs的純化、切割和氧化。
0.5g SWNTs在70mL 2.6M HNO3中超聲分散1h，再回流24h，然后離心洗去酸液，再分別用1.1％和0.2％的Triton X-100洗滌，過膜收集固體，最后用蒸餾水洗去Triton X-100。純化的SWNTs進(jìn)一步用混酸切割氧化(硝酸∶硫酸＝1∶3)，100mg純化的SWNTs在400mL混酸中超聲5h，然后用蒸餾水洗去酸液。
(2)正電荷負(fù)載的SWNTs(SWNTs+)的制備。
a.十二二胺的單氨基保護(hù)7.09g(32.5mmol)(Boc)2O溶于80ml新蒸二噁烷，48.8g(244mmol)1，12-十二二胺溶于250ml二噁烷。在氬氣保護(hù)下將(Boc)2O滴加至二胺溶液中在8h內(nèi)滴完。然后室溫攪拌3天。處理后得到產(chǎn)品4.53g，產(chǎn)率46.5％。
b.SWNTs的酰氯化100mg SWNTs加入到20mL二氯亞砜中，再加1mL DMF，超聲分散1h，然后70℃加熱回流攪拌24h，產(chǎn)品冷卻，旋蒸除去二氯亞砜，再加四氫呋喃超聲洗滌四～五次，抽濾干燥。
c.Boc保護(hù)過的十二二胺與酰氯化的SWNTs反應(yīng)4.53g Boc-C12H24NH2，30ml DMF，0.0453g SWNT-COCl加入反應(yīng)瓶，氬氣保護(hù)下90℃反應(yīng)96h。反應(yīng)完成后用0.1μm尼龍膜過濾收集產(chǎn)品，并用二噁烷洗兩次，然后室溫下真空干燥。
d.去Boc保護(hù)，生成鹽酸鹽9.6ml二噁烷，0.4ml濃HCl置于冰水浴攪拌，Ar保護(hù)下加入30mg SWNT-CO-NHC12H24-Boc并撤去冰水浴，室溫反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束離心除去反應(yīng)液，將SWNTs用二噁烷洗滌2次然后室溫干燥產(chǎn)品。
(3)siRNA:SWNT+復(fù)合物的制備和表征將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。siRNA:SWNTs+復(fù)合物通過電子能譜，分光光度計(jì)，透射電鏡和原子力顯微鏡分析表征。
2.siRNA:SWNTs+復(fù)合物對腫瘤細(xì)胞生長抑制功能的檢測。
(1)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的制備。將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA序列1#正義鏈CAGAUCAAGAGCAGUAGUCtt和反義鏈GACUACUGCUCUUGAUCUGtt；2#正義鏈UAUGUCAGACUCCUCAGGUtt和反義鏈ACCUGAGGAGUCUGACAUAtt。
(2)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的表征。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA納米碳管復(fù)合物通過透射電鏡、電子能譜、原子力顯微鏡、分光光度計(jì)檢測(與實(shí)例一的圖1類似)。
(3)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物引導(dǎo)基因沉默。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物導(dǎo)致端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的mRNA水平降低，降低端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)，抑制端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的活性(與實(shí)例一的圖2類似)。
將端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNT+復(fù)合物分別加入到培養(yǎng)的鼠肺癌細(xì)胞，鼠宮頸癌細(xì)胞，鼠卵巢癌細(xì)胞，siRNA終濃度為2nM。14小時后，消化收集這些siRNA:SWNTs+復(fù)合物轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞，用Trizol提取RNA。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的mRNA通過半定量RT-PCR進(jìn)行評估。引物包括鼠端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶5’ATGACCCGCGCTCCTCGTTGC和3’GACAGCAGAGATGTGGAGCTG；陽性對照GAPDH引物5’ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC和3’CATCGAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTGCTGT端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物轉(zhuǎn)染的鼠肺癌細(xì)胞，鼠宮頸癌細(xì)胞，鼠卵巢癌細(xì)胞的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶蛋白水平也通過Western Blotting方法檢測。100ug的核提取液由7.5％SDS-PAGE膠分離，然后轉(zhuǎn)移到nitrocellulose膜上，蛋白抗體復(fù)合物用辣根過氧化酶標(biāo)記的第二抗體檢測。
端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶活性通過德國Boehringrt Mannheim公司生產(chǎn)的PCR ELISA Kit測定。
(4)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物抑制腫瘤細(xì)胞生長(與實(shí)例一的圖3類似)。
將端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物分別加入到在24孔板中培養(yǎng)好的鼠肺癌細(xì)胞，鼠宮頸癌細(xì)胞，鼠卵巢癌細(xì)胞中。在24小時內(nèi)對照組細(xì)胞，siRNA單獨(dú)處理的細(xì)胞，其它對照siRNA:SWNTs+復(fù)合物處理過的細(xì)胞都生長良好。而加入端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA納米碳管復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞的生長明顯受到抑制。
(5)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物對腫瘤部位的直接注射導(dǎo)致腫瘤生長的抑制。
a.單一點(diǎn)注射。
將2×106的肺癌細(xì)胞注射到小鼠右腿下方。當(dāng)腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，A1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；A2一點(diǎn)注射100uL端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物組(10nM siRNA)；A3只注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA(10nM siRNA)；A4注射其它對照siRNA:SWNTs+結(jié)合的復(fù)合物(10nM siRNA)。
注射后，每隔2天測量腫瘤大小。7天后A1，A3和A4三組腫瘤大小無顯著差異。A2組腫瘤在注射位點(diǎn)，有明顯的凹陷，說明此區(qū)域的腫瘤細(xì)胞生長和增殖都受到了抑制(與實(shí)例一的圖4，A類似)。
b.多點(diǎn)注射。
將2×106的肺癌細(xì)胞注射到小鼠右腿下方。當(dāng)腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，B1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；B2向腫瘤中多點(diǎn)注射100uL注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物組(siRNA 10nM)；B3多點(diǎn)注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA(siRNA 10nM)；B4多點(diǎn)注射其它對照siRNA:SWNTs+結(jié)合的復(fù)合物(siRNA 10nM)。
注射后每隔2天測量腫瘤大小。8天后B1，B3和B4三組腫瘤大小無顯著差異。B2組腫瘤與其它組腫瘤大小有明顯差異，比其它組腫瘤都明顯減小(與實(shí)例一的圖4，B類似)。說明注射了端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞生長和增殖都受到了抑制。
3.siRNA:SWNTs+復(fù)合物進(jìn)入免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，降低靶基因的水平，抑制靶基因的表達(dá)。
(1)制備CD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物。
將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM CD80siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。
兩組CD80siRNA序列被用于我們的研究中1#正義鏈CUGUCCAAGUCAGUGAAAGtt和反義鏈CUUUCACUGACUUGGACAGtt；2#正義鏈GUGUGGCCCGAGUAUAAGAtt和反義鏈UCUUAUACUCGGGCCACACtt(2)siRNA:SWNTs+復(fù)合物進(jìn)入免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的檢測。
A、將復(fù)合物分別加入到未成熟的樹突細(xì)胞、成熟的樹突細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞系的培養(yǎng)瓶中，復(fù)合物siRNA終濃度為2nM。48小時后進(jìn)行細(xì)胞表面分子染色，進(jìn)行流失細(xì)胞儀檢測。
同時轉(zhuǎn)染siRNA:SWNTs復(fù)合物的不成熟樹突細(xì)胞，成熟樹突細(xì)胞，單核細(xì)胞以及Raw264.7細(xì)胞系總RNA用Trizol提取。CD80mRNA的水平通過半定量RT-PCR進(jìn)行評估。
鼠CD80的引物5’ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGG和3’CTAAAGGAAGACGGTCTG陽性對照基因GAPDH引物與上述相同(與實(shí)例一的圖5類似)。
B、將復(fù)合物分別加入到培養(yǎng)Gr-1+CD11b+細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，復(fù)合物siRNA終濃度為2nM。48小時后將細(xì)胞表面分子染色，進(jìn)行流失細(xì)胞儀檢測(與實(shí)例一的圖6類似)。
C、將CD80siRNA:SWNTs+經(jīng)鼠尾靜脈注入植入卵巢癌小鼠體內(nèi)，此復(fù)合物可被脾臟內(nèi)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞Gr-1+CD11+細(xì)胞吸收，抑制這些細(xì)胞的CD80的表達(dá)(與實(shí)例一的圖7類似)。
實(shí)施例51.siRNA:SWNTs+復(fù)合物的制備(1)SWNTs的純化、切割和氧化。
0.5g SWNTs在70mL 2.6M HNO3中超聲分散1h，再回流24h，然后離心洗去酸液，再分別用1.1％和0.2％的Triton X-100洗滌，過膜收集固體，最后用蒸餾水洗去Triton X-100。純化的SWNTs進(jìn)一步用混酸切割氧化(硝酸∶硫酸＝1∶3)，100mg純化的SWNTs在400mL混酸中超聲5h，然后用蒸餾水洗去酸液。
(2)正電荷負(fù)載的SWNTs(SWNTs+)的制備。
a.丁二胺的單氨基保護(hù)7.09g(32.5mmol)(Boc)2O溶于80ml新蒸二噁烷，21.5g(244mmol)1，4-丁二胺溶于250ml二噁烷。在氬氣保護(hù)下將(Boc)2O滴加至二胺溶液中在8h內(nèi)滴完。然后室溫攪拌3天。處理后得到產(chǎn)品3.4g，產(chǎn)率55.7％。
b.SWNTs的酰氯化100mg SWNTs加入到20mL二氯亞砜中，再加1mL DMF，超聲分散1h，然后70℃加熱回流攪拌24h，產(chǎn)品冷卻，旋蒸除去二氯亞砜，再加四氫呋喃超聲洗滌四～五次，抽濾干燥。
c.Boc保護(hù)過的丁二胺與酰氯化的SWNTs反應(yīng)3.4g Boc-C4H8NH2，30ml DMF，0.0340g SWNT-COCl加入反應(yīng)瓶，氬氣保護(hù)下90℃反應(yīng)96h。反應(yīng)完成后用0.1μm尼龍膜過濾收集產(chǎn)品，并用二噁烷洗兩次，然后室溫下真空干燥。
d.去Boc保護(hù)，生成鹽酸鹽9.6ml二噁烷，0.4ml濃HCl置于冰水浴攪拌，Ar保護(hù)下加入30mg SWNT-CO-NHC4H8-Boc并撤去冰水浴，室溫反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束離心除去反應(yīng)液，將SWNTs用二噁烷洗滌2次然后室溫干燥產(chǎn)品。
(3)siRNA:SWNT+復(fù)合物的制備和表征將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。siRNA:SWNTs+復(fù)合物通過電子能譜，分光光度計(jì)，透射電鏡和原子力顯微鏡分析表征。
2.siRNA:SWNTs+復(fù)合物對腫瘤細(xì)胞生長抑制功能的檢測。
(1)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的制備。將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA序列1#正義鏈CAGAUCAAGAGCAGUAGUCtt和反義鏈GACUACUGCUCUUGAUCUGtt；2#正義鏈UAUGUCAGACUCCUCAGGUtt和反義鏈ACCUGAGGAGUCUGACAUAtt。
(2)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的表征。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA納米碳管復(fù)合物通過透射電鏡、電子能譜、原子力顯微鏡、分光光度計(jì)檢測(與實(shí)例一的圖1類似)。
(3)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物引導(dǎo)基因沉默。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物導(dǎo)致端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的mRNA水平降低，降低端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)，抑制端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的活性(與實(shí)例一的圖2類似)。
將端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNT+復(fù)合物分別加入到培養(yǎng)的鼠肺癌細(xì)胞，鼠宮頸癌細(xì)胞，鼠卵巢癌細(xì)胞，siRNA終濃度為2nM。14小時后，消化收集這些siRNA:SWNTs+復(fù)合物轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞，用Trizol提取RNA。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的mRNA通過半定量RT-PCR進(jìn)行評估。引物包括鼠端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶5’ATGACCCGCGCTCCTCGTTGC和3’GACAGCAGAGATGTGGAGCTG；陽性對照GAPDH引物5’ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC和3’CATCGAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTGCTGT端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物轉(zhuǎn)染的鼠肺癌細(xì)胞，鼠宮頸癌細(xì)胞，鼠卵巢癌細(xì)胞的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶蛋白水平也通過Western Blotting方法檢測。100ug的核提取液由7.5％SDS-PAGE膠分離，然后轉(zhuǎn)移到nitrocellulose膜上，蛋白抗體復(fù)合物用辣根過氧化酶標(biāo)記的第二抗體檢測。
端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶活性通過德國Boehringrt Mannheim公司生產(chǎn)的PCR ELISA Kit測定。
(4)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物抑制腫瘤細(xì)胞生長(與實(shí)例一的圖3類似)。
將端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物分別加入到在24孔板中培養(yǎng)好的鼠肺癌細(xì)胞，鼠宮頸癌細(xì)胞，鼠卵巢癌細(xì)胞中。在24小時內(nèi)對照組細(xì)胞，siRNA單獨(dú)處理的細(xì)胞，其它對照siRNA:SWNTs+復(fù)合物處理過的細(xì)胞都生長良好。而加入端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA納米碳管復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞的生長明顯受到抑制。
(5)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物對腫瘤部位的直接注射導(dǎo)致腫瘤生長的抑制。
a.單一點(diǎn)注射。
將2×106的肺癌細(xì)胞注射到小鼠右腿下方。當(dāng)腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，A1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；A2一點(diǎn)注射100uL端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物組(10nM siRNA)；A3只注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA(10nM siRNA)；A4注射其它對照siRNA:SWNTs+結(jié)合的復(fù)合物(10nM siRNA)。
注射后，每隔2天測量腫瘤大小。7天后A1，A3和A4三組腫瘤大小無顯著差異。A2組腫瘤在注射位點(diǎn)，有明顯的凹陷，說明此區(qū)域的腫瘤細(xì)胞生長和增殖都受到了抑制(與實(shí)例一的圖4，A類似)。
b.多點(diǎn)注射。
將2×106的肺癌細(xì)胞注射到小鼠右腿下方。當(dāng)腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，B1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；B2向腫瘤中多點(diǎn)注射100uL注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物組(siRNA 10nM)；B3多點(diǎn)注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA(siRNA 10nM)；B4多點(diǎn)注射其它對照siRNA:SWNTs+結(jié)合的復(fù)合物(siRNA 10nM)。
注射后每隔2天測量腫瘤大小。8天后B1，B3和B4三組腫瘤大小無顯著差異。B2組腫瘤與其它組腫瘤大小有明顯差異，比其它組腫瘤都明顯減小(與實(shí)例一的圖4，B類似)。說明注射了端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞生長和增殖都受到了抑制。
3.siRNA:SWNTs+復(fù)合物進(jìn)入免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，降低靶基因的水平，抑制靶基因的表達(dá)。
(1)制備CD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物。
將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM CD80siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。
兩組CD80siRNA序列被用于我們的研究中1#正義鏈CUGUCCAAGUCAGUGAAAGtt和反義鏈CUUUCACUGACUUGGACAGtt；2#正義鏈GUGUGGCCCGAGUAUAAGAtt和反義鏈UCUUAUACUCGGGCCACACtt(2)siRNA:SWNTs+復(fù)合物進(jìn)入免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的檢測。
A、將復(fù)合物分別加入到未成熟的樹突細(xì)胞、成熟的樹突細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞系的培養(yǎng)瓶中，復(fù)合物siRNA終濃度為2nM。48小時后進(jìn)行細(xì)胞表面分子染色，進(jìn)行流失細(xì)胞儀檢測。
同時轉(zhuǎn)染siRNA:SWNTs復(fù)合物的不成熟樹突細(xì)胞，成熟樹突細(xì)胞，單核細(xì)胞以及Raw264.7細(xì)胞系總RNA用Trizol提取。CD80mRNA的水平通過半定量RT-PCR進(jìn)行評估。
鼠CD80的引物5’ATGGCTTGCAATTGTGAGTTGATGCAGG和3’CTAAAGGAAGACGGTCTG陽性對照基因GAPDH引物與上述相同(與實(shí)例一的圖5類似)。
B、將復(fù)合物分別加入到培養(yǎng)Gr-1+CD11b+細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，復(fù)合物siRNA終濃度為2nM。48小時后將細(xì)胞表面分子染色，進(jìn)行流失細(xì)胞儀檢測(與實(shí)例一的圖6類似)。
C、將CD80siRNA:SWNTs+經(jīng)鼠尾靜脈注入植入卵巢癌小鼠體內(nèi)，此復(fù)合物可被脾臟內(nèi)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞Gr-1+CD11+細(xì)胞吸收，抑制這些細(xì)胞的CD80的表達(dá)(與實(shí)例一的圖7類似)。
實(shí)施例61.siRNA:SWNTs+復(fù)合物的制備(1)SWNTs的純化、切割和氧化。
0.5g SWNTs在70mL 2.6M HNO3中超聲分散1h，再回流24h，然后離心洗去酸液，再分別用1.1％和0.2％的Triton X-100洗滌，過膜收集固體，最后用蒸餾水洗去Triton X-100。純化的SWNTs進(jìn)一步用混酸切割氧化(硝酸∶硫酸＝1∶3)，100mg純化的SWNTs在400mL混酸中超聲5h，然后用蒸餾水洗去酸液。
(2)正電荷負(fù)載的SWNTs(SWNTs+)的制備。
a.SWNTs的酰氯化100mg SWNTs加入到20mL二氯亞砜中，再加1mL DMF，超聲分散1h，然后70℃加熱回流攪拌24h，產(chǎn)品冷卻，旋蒸除去二氯亞砜，再加四氫呋喃超聲洗滌四～五次，抽濾干燥。
b.己二胺與酰氯化的SWNTs反應(yīng)6.1g NH2-C6H12-NH2，0.0605g SWNT-COCl加入反應(yīng)瓶，超聲分散，90℃反應(yīng)96h。反應(yīng)完成后用0.1μm尼龍膜過濾收集產(chǎn)品，用乙醇洗滌數(shù)次，然后室溫下真空干燥。
c.成鹽SWNT-CO-C6H12NH2水溶液加入少許6M鹽酸，攪拌1h，再離心水洗兩次，收集固體產(chǎn)品。
(3)siRNA:SWNT+復(fù)合物的制備和表征將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。siRNA:SWNTs+復(fù)合物通過電子能譜，分光光度計(jì)，透射電鏡和原子力顯微鏡分析表征。
2.siRNA:SWNTs+復(fù)合物對腫瘤細(xì)胞生長抑制功能的檢測。
(1)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的制備。將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA序列1#正義鏈CAGAUCAAGAGCAGUAGUCtt和反義鏈GACUACUGCUCUUGAUCUGtt；2#正義鏈UAUGUCAGACUCCUCAGGUtt和反義鏈ACCUGAGGAGUCUGACAUAtt。
(2)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的表征。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA納米碳管復(fù)合物通過透射電鏡、電子能譜、原子力顯微鏡、分光光度計(jì)檢測(與實(shí)例一的圖1類似)。
(3)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物引導(dǎo)基因沉默。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物導(dǎo)致端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的mRNA水平降低，降低端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)，抑制端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的活性(與實(shí)例一的圖2類似)。
將端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNT+復(fù)合物分別加入到培養(yǎng)的鼠肺癌細(xì)胞，鼠宮頸癌細(xì)胞，鼠卵巢癌細(xì)胞，siRNA終濃度為2nM。14小時后，消化收集這些siRNA:SWNTs+復(fù)合物轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞，用Trizol提取RNA。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的mRNA通過半定量RT-PCR進(jìn)行評估。引物包括鼠端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶5’ATGACCCGCGCTCCTCGTTGC和3’GACAGCAGAGATGTGGAGCTG；陽性對照GAPDH引物5’ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC和3’CATCGAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTGCTGT端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物轉(zhuǎn)染的鼠肺癌細(xì)胞，鼠宮頸癌細(xì)胞，鼠卵巢癌細(xì)胞的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶蛋白水平也通過Western Blotting方法檢測。100ug的核提取液由7.5％SDS-PAGE膠分離，然后轉(zhuǎn)移到nitrocellulose膜上，蛋白抗體復(fù)合物用辣根過氧化酶標(biāo)記的第二抗體檢測。
端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶活性通過德國Boehringrt Mannheim公司生產(chǎn)的PCR ELISA Kit測定。
(4)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物抑制腫瘤細(xì)胞生長(與實(shí)例一的圖3類似)。
將端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物分別加入到在24孔板中培養(yǎng)好的鼠肺癌細(xì)胞，鼠宮頸癌細(xì)胞，鼠卵巢癌細(xì)胞中。在24小時內(nèi)對照組細(xì)胞，siRNA單獨(dú)處理的細(xì)胞，其它對照siRNA:SWNTs+復(fù)合物處理過的細(xì)胞都生長良好。而加入端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA納米碳管復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞的生長明顯受到抑制。
(5)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物對腫瘤部位的直接注射導(dǎo)致腫瘤生長的抑制。
a.單一點(diǎn)注射。
將2×106的肺癌細(xì)胞注射到小鼠右腿下方。當(dāng)腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，A1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；A2一點(diǎn)注射100uL端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物組(10nM siRNA)；A3只注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA(10nM siRNA)；A4注射其它對照siRNA:SWNTs+結(jié)合的復(fù)合物(10nM siRNA)。
注射后，每隔2天測量腫瘤大小。7天后A1，A3和A4三組腫瘤大小無顯著差異。A2組腫瘤在注射位點(diǎn)，有明顯的凹陷，說明此區(qū)域的腫瘤細(xì)胞生長和增殖都受到了抑制(與實(shí)例一的圖4，A類似)。
b.多點(diǎn)注射。
將2×106的肺癌細(xì)胞注射到小鼠右腿下方。當(dāng)腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，B1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；B2向腫瘤中多點(diǎn)注射100uL注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物組(siRNA 10nM)；B3多點(diǎn)注射端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA(siRNA 10nM)；B4多點(diǎn)注射其它對照siRNA:SWNTs+結(jié)合的復(fù)合物(siRNA 10nM)。
注射后每隔2天測量腫瘤大小。8天后B1，B3和B4三組腫瘤大小無顯著差異。B2組腫瘤與其它組腫瘤大小有明顯差異，比其它組腫瘤都明顯減小(與實(shí)例一的圖4，B類似)。說明注射了端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA:SWNTs+復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞生長和增殖都受到了抑制。
3.siRNA:SWNTs+復(fù)合物進(jìn)入免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，降低靶基因的水平，抑制靶基因的表達(dá)。
(1)制備CD80siRNA:SWNTs+復(fù)合物。
將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM CD80siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。
兩組CD80siRNA序列被用于我們的研究中1#正義鏈CUGUCCAAGUCAGUGAAAGtt和反義鏈CUUUCACUGACUUGGACAGtt；2#正義鏈GUGUGGCCCGAGUAUAAGAtt和反義鏈UCUUAUACUCGGGCCACACtt(2)siRNA:SWNTs+復(fù)合物進(jìn)入免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的檢測。
A、將復(fù)合物分別加入到未成熟的樹突細(xì)胞、成熟的樹突細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞系的培養(yǎng)瓶中，復(fù)合物siRNA終濃度為2nM。48小時后進(jìn)行細(xì)胞表面分子染色，進(jìn)行流失細(xì)胞儀檢測。
同時轉(zhuǎn)染siRNA:SWNTs復(fù)合物的不成熟樹突細(xì)胞，成熟樹突細(xì)胞，單核細(xì)胞以及Raw264.7細(xì)胞系總RNA用Trizol提取。CD80mRNA的水平通過半定量RT-PCR進(jìn)行評估。
鼠CD80的引物5’ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGG和3’CTAAAGGAAGACGGTCTG陽性對照基因GAPDH引物與上述相同(與實(shí)例一的圖5類似)。
B、將復(fù)合物分別加入到培養(yǎng)Gr-1+CD11b+細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，復(fù)合物siRNA終濃度為2nM。48小時后將細(xì)胞表面分子染色，進(jìn)行流失細(xì)胞儀檢測(與實(shí)例一的圖6類似)。
C、將CD80siRNA:SWNTs+經(jīng)鼠尾靜脈注入植入卵巢癌小鼠體內(nèi)，此復(fù)合物可被脾臟內(nèi)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞Gr-1+CD11+細(xì)胞吸收，抑制這些細(xì)胞的CD80的表達(dá)(與實(shí)例一的圖7類似)。
權(quán)利要求
1.一種小干擾RNA與單壁碳納米管復(fù)合物，其特征在于它的結(jié)構(gòu)表示為siRNA:SWNTs+，它是用Boc-保護(hù)的二元胺通過共價鍵連接到SWNTs，使其成鹽帶有正電荷，再與帶有負(fù)電性的siRNA通過靜電相互作用構(gòu)成的復(fù)合物。
2.按照權(quán)利要求1所述的小干擾RNA與單壁碳納米管復(fù)合物，其特征在于所述的單壁碳納米管是直徑為1.0～2.0nm，長度為10nm～100μm的單壁碳納米管。
3.按照權(quán)利要求1所述的小干擾RNA與單壁碳納米管復(fù)合物，其特征在于所述的二元胺是C2～C20的二元胺中的至少一種，優(yōu)選丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺或十二二胺。
4.按照權(quán)利要求1所述的小干擾RNA與單壁碳納米管復(fù)合物，其特征在于所述的siRNA是端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA或免疫刺激分子CD80siRNA；端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的siRNA的特殊靶序列是AACAGATCAAGAGCAGTAGTC和AATATGTCAGACTCCTCAGGT；CD80siRNA特殊的靶序列是AACTGTCCAAGTCAGTGAAAG和AAGTGTGGCCCGAGTATAAGA。
5.一種小干擾RNA與單壁碳納米管復(fù)合物的制備方法，其特征在于包括如下步驟1)SWNTs的純化、切割和氧化采用在硝酸或鹽酸中超聲并回流的方法純化，然后用表面活性劑Triton-X洗滌，SWNTs進(jìn)一步用混酸切割氧化，在體積比混酸為硝酸∶硫酸＝1∶3中超聲反應(yīng)；2)將二元胺用Boc-保護(hù)或不進(jìn)行保護(hù)，然后與酰氯化的SWNTs進(jìn)行反應(yīng)，再脫掉Boc-保護(hù)并成鹽，或不用脫保護(hù)，加酸成鹽，得到胺鹽功能化的SWNTs，再將siRNA與功能化的單壁碳納米管相互作用。
6.一種小干擾RNA與單壁碳納米管復(fù)合物的制備方法，其特征在于包括如下具體步驟1)將SWNTs(采用電弧法制備)在2.6M硝酸或濃鹽酸中超聲分散1h，并回流24h，離心洗去酸液，再分別用1.1％和0.2％的Triton X-100洗滌，過膜收集固體，最后用蒸餾水洗去TritonX-100；純化后的SWNTs在混酸(濃硝酸∶濃硫酸＝1∶3)中超聲5h，水洗去酸液。2)在氬氣保護(hù)下將(Boc)2O加入至二胺溶液中反應(yīng)8h，室溫攪拌3天，得Boc-CnH2nNH2；(Boc)2O與二胺的摩爾比是1∶7.5；3)步驟2)得到的SWNTs加入到混合溶劑二氯亞砜和DMF(體積比20∶1)中，SWNTs濃度約為5mg/mL，超聲分散1h，然后70℃加熱回流攪拌24h，冷卻，旋蒸除去二氯亞砜，再加四氫呋喃超聲洗滌四～五次，抽濾干燥，得到酰氯化的SWNTs-COCl；4)Boc-CnH2nNH2與SWNTs-COCl(重量比是100∶1)，在DMF溶劑中，氬氣保護(hù)下90℃反應(yīng)96h，反應(yīng)完成后用0.1μm尼龍膜過濾收集產(chǎn)品，并用二噁烷洗兩次，然后室溫下真空干燥，得到SWNTs-CO-NHCnH2n-Boc；5)冰水浴和Ar保護(hù)條件下，二噁烷為溶劑，濃HCl與SWNTs-CO-NHCnH2n-Boc反應(yīng)，濃HCl與SWNTs-CO-NHCnH2n-Boc的為量比約為16∶1，撤去冰水浴，室溫反應(yīng)1h，離心除去反應(yīng)液，將SWNTs用二噁烷洗滌2次，室溫下干燥產(chǎn)品，得到SWNTs+；6)SWNTs+在水溶液中超聲分散，室溫下與siRNA孵育1小時，然后水洗兩次，得到siRNA:SWNTs+復(fù)合物。
7.權(quán)利要求1所述的小干擾RNA與單壁碳納米管復(fù)合物的應(yīng)用，其特征在于它用作檢測和治療腫瘤細(xì)胞生長或其它細(xì)胞系的試劑，以及用作調(diào)節(jié)免疫功能或治療免疫相關(guān)疾病試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及小干擾RNA與單壁碳納米管復(fù)合物及制備方法和應(yīng)用。它的結(jié)構(gòu)表示為siRNA:SWNTs
文檔編號A61P37/00GK1840706SQ20061001305
公開日2006年10月4日 申請日期2006年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月16日
發(fā)明者楊榮存, 陳永勝, 楊曉英, 張灼寒, 張園, 王淑靜, 馬延風(fēng) 申請人:南開大學(xué)