專利名稱：：來自人類脂肪組織的多能干細胞和包含該多能干細胞的細胞治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及來自人類脂肪組織的多能成體干細胞，具體涉及來自人類乳房脂肪組織的多能成體干細胞，其可通過形成球體而長時間保持未分化狀態(tài)，并具有較高的增殖率。此外，本發(fā)明還涉及用于分離和保持成體干細胞的方法，用于將成體干細胞分化成神經(jīng)細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞和胰島素釋放胰腺I3細胞的方法，用于治療骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥和糖尿病的細胞治療劑，以及用于形成乳房組織的細胞治療劑。
背景技術(shù)：
：21世紀生物技術(shù)以提高人類繁榮為最終目標提供了食物、環(huán)境和健康問題上新解決辦法的可能性。近年來，使用干細胞的技術(shù)已經(jīng)被認為是治療不可治愈的疾病的新途徑。以前，器官移植、基因治療等被提出用于治療不可治愈的人類疾病，但是由于免疫排斥、器官源短缺、載體發(fā)展的不足以及缺乏對疾病基因知識，不能將它們高效地使用。由于這種原因，隨著對干細胞研究興趣的增加，人們己經(jīng)認識到通過增殖和分化具有形成所有器官的能力的全能干細胞不僅能夠治療絕大多數(shù)疾病，而且基本治愈器官損傷。而且，許多科學家已經(jīng)提出干細胞用于再生所有器官和治療不可治愈疾病的適用性，包括帕金森癥、各種癌癥、糖尿病和脊柱損傷。干細胞指的是不僅具有自我復制能力而且具有分化成至少兩種細胞的能力的細胞，其可被分成全能干細胞、亞全能干細胞和多能干細胞。全能干細胞是具有能夠形成一個完整個體的全能性的細胞，卵母細胞和精子受精后到8細胞期的細胞具有這些性質(zhì)。當這些細胞被分離并移植到子宮中時，它們可發(fā)育成一個完整個體。亞全能干細胞是能夠形成來源于外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的各種細胞和組織的細胞，亞全能干細胞來自定位在受精4-5天后產(chǎn)生的胚泡內(nèi)的內(nèi)部球團。這些細胞被稱為"胚胎干細胞"，并可分化成各種其它組織細胞，但不能形成新的活體組織。多能干細胞是僅能分化成對含有這些細胞的組織和器官具有特異性的細胞，多能干細胞不僅在胎兒、新生兒和成人階段的各種組織和器官的生長和發(fā)育中涉及，而且還在保持成人組織的內(nèi)環(huán)境平衡和當組織損傷時誘導再生的功能中涉及。組織特異性多能細胞統(tǒng)稱為"成體干細胞"。成體干細胞通過從各種人類器官中收集細胞并使細胞發(fā)育成干細胞而獲得，其特征在于它們僅僅分化成特定組織。但是，近年來，用于將成體干細胞分化成各種組織包括肝細胞的實驗也明顯獲得成功。多能干細胞首先從成人骨髓細胞中分離(Jiang等人，Nature,418:41，2002)，然后在其它各種成人組織中均被發(fā)現(xiàn)(Verfaillie，TrendsCellBiol.，12:502，2002)。換言之，雖然骨髓是最廣為人知的干細胞源，但多能干細胞在皮膚、血管、肌肉和腦中也被發(fā)現(xiàn)(Tomas等人，Nat.CellBiol.，3:778，2001;Sampaolesi等人，Science,301:487，2003;Jiang等人，Exp.Hematol.，30:896，2002)。但是，成人組織諸如骨髓中的干細胞存在非常少，這些細胞在不誘導分化的情況下難以培養(yǎng)，在不存在特定篩選培養(yǎng)基的情況下同樣也難以培養(yǎng)。也就是說，在體外保持這些分離的干細胞非常困難。近年來，發(fā)現(xiàn)脂肪組織是一種新的多能干細胞源(Cousin等人，BBRC.，301:1016，2003;Miranville等人，Circulation,110:349，2004;Gronthos等人，J.CellPhysiol.，189:54，2001;Seo等人，BBRC.，328:258，2005)。也就是說，據(jù)報道通過吸脂術(shù)得到的人類脂肪組織中含有一組未分化細胞。其具有分化成脂肪細胞、成骨細胞、成肌細胞、成軟骨細胞的能力(Zuk等人，TissueEng.,7:211，2001;Rodriguez等人，BBRC.，315:255，2004)。這種脂肪組織具有的優(yōu)點是可以被大量提取，因此，作為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點的新干細胞源而引起注意。而且，使用動物模型實驗所進行的新近研究表明，脂肪組織源細胞具有再生肌肉并刺激神經(jīng)血管分化的能力。因此，這些脂肪組織源細胞作為新的干細胞源而引起注意。到目前為止已知的脂肪組織源干細胞包括可分化成上皮細胞的人脂肪源成體干細胞(Brzoska等人，BBRC，330:142，2005)，可分化成成骨細胞和脂肪細胞的人脂肪源成體干細胞(Cao等人，BBRC，332:370，2005)，可分化成神經(jīng)細胞的人脂肪源成體干細胞(Safford等人，BBRC，294:371，2002)，可分化成脂肪細胞的鼠脂肪源干細胞(Ogawa等人，BBRC，319:511，2004)，可分化成成骨細胞和成軟骨細胞的鼠脂肪源干細胞(Ogawa等人，BBRC，313:871，2004)，可分化成軟骨細胞的人脂肪源干細胞(Biomaterials，25:3211，2004)，可分化成神經(jīng)細胞的鼠脂肪源干細胞(Fujimura等人，BBRC，333:116，2005)，可分化成骨細胞、軟骨細胞、神經(jīng)細胞或者肌肉細胞的脂肪源干細胞(美國專利US6777231)。但是，到目前為止絕大多數(shù)已知的脂肪源干細胞是來源于除人類以外的其它動物的脂肪組織的干細胞。即便它們是來源于人類脂肪組織的干細胞，它們也被限制在通過腹部脂肪吸脂術(shù)獲得的組織來源，并且由這些干細胞分化而成的細胞的種類也是有限的。特別地，分離的干細胞具有低增殖率，并且難以長期保持在未分化狀態(tài)，因此，在應用方面受到限制。因此，本發(fā)明的發(fā)明人付出了極大的努力來開發(fā)具有高增殖率的成人多能干細胞，它們可通過形成球體而長期保持在未分化狀態(tài)，并可分化成更多種細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從人類脂肪組織中分離的多能干細胞可分化成各種細胞，包括成骨細胞、成軟骨細胞、神經(jīng)細胞、星形細胞、脂肪細胞和胰島素釋放胰腺卩細胞，具有非常高的增殖率，并可通過形成球體長期保持在未分化狀態(tài)，由此完成本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的在于，提供脂肪組織源多能成體干細胞，其具有高增殖率并可通過形成球體長時間保持在未分化狀態(tài)，本發(fā)明還提供了這種多能干細胞的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的另一個目的在于，提供將所述多能干細胞分化成神經(jīng)細胞、星形細胞、軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞以及胰島素釋放胰腺(3細胞的方法，以及含有所述分化細胞或者成體干細胞的治療劑。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)成體干細胞的方法，包括在含有N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人脂肪組織源球團，然后收集培養(yǎng)的細胞，所述成體干細胞的特征在于(a)對所有CD73、CD90、CD29、CD44和CD105產(chǎn)生陽性免疫應答，并對所有CD33、CD34、CD45、CD4、CD31、CD62p、CD14和HLA-DR產(chǎn)生陰性免疫應答；(b)附著于塑料生長，顯示梭狀形態(tài)學特征，并在含有CORM-2的培養(yǎng)基中形成球體，從而能夠長時間保持為在分化狀態(tài)；和(c)具有分化成中胚層源細胞的能力。在本發(fā)明中，含NAC的培養(yǎng)基另外包括抗壞血酸、鈣、rEGF、BPE、胰島素和皮質(zhì)醇。另一方面，本發(fā)明提供了一種將成體干細胞細胞保持在未分化狀態(tài)的方法，該方法包括在含有CORM-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)由所述方法制備的成體干細胞使其形成球體。在本發(fā)明中，含有CROM-2的培養(yǎng)基優(yōu)選為無血清培養(yǎng)基，其另外包含抗真菌抗生素溶液、皮質(zhì)醇、胰島素、rEGF、FGF、B27和p-巰基乙醇。在又一方面，本發(fā)明提供了由所述方法生產(chǎn)的成體干細胞，其特征在于(a)對所有CD73、CD卯、CD29、CD44和CD105產(chǎn)生陽性免疫應答，并對所有CD33、CD34、CD45、CD4、CD31、CD62p、CD14和HLA-DR產(chǎn)生陰性免疫應答；(b)附著于塑料生長，顯示梭狀形態(tài)學特征，并在含有CORM-2的培養(yǎng)基中形成球體，從而能夠長時間保持在未分化狀態(tài)；和(c)具有分化成中胚層源細胞的能力。在本發(fā)明中，成體干細胞優(yōu)選以未分化狀態(tài)培養(yǎng)到至少16代，中胚層源細胞優(yōu)選為軟骨細胞、成骨細胞、神經(jīng)細胞、星形細胞、脂肪細胞、以及胰島素釋放胰腺P細胞。在再一方面，本發(fā)明提供了將成體干細胞分化成神經(jīng)細胞的方法，所述方法包括下列歩驟(a)在含有BME和FBS的DEME培養(yǎng)基中預培養(yǎng)成體干細胞；和(b)用DMSO和BHA處理預培養(yǎng)的培養(yǎng)液以便誘導分化成神經(jīng)細胞。而且，本發(fā)明提供了用于治療神經(jīng)疾病的細胞治療劑，其含有所述分化的神經(jīng)細胞作為活性成分。在還一方面，本發(fā)明提供了用于將成體干細胞分化成軟骨細胞的方法，所述方法包括在含有TFG-f31、L-抗壞血酸鹽-2-磷酸鹽和胰島素的a-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)成體干細胞。而且，本發(fā)明提供了用于治療骨關(guān)節(jié)炎的細胞治療劑，其含有所述分化的軟骨細胞作為活性成分。在又一方面，本發(fā)明提供了用于將成體干細胞分化成成骨細胞的方法，所述方法包括將成體干細胞與磷酸三鈣(TCP)混合并同基因移植(isotransplanting)該混合物。而且，本發(fā)明提供了用于治療骨缺損的細胞治療劑，其含有所述分化的成骨細胞作為活性成分。在還一方面，本發(fā)明提供了用于將成體干細胞分化成脂肪細胞的方法，所述方法包括在含有地塞米松、抗炎吲哚酸、胰島素和IBMX的a-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)成體干細胞。而且，本發(fā)明提供了用于形成乳房組織的細胞治療劑，其含有所述分化的脂肪細胞作為活性成分。在再一方面，本發(fā)明提供了將成體干細胞分化成胰島素釋放胰腺卩細胞的方法，所述方法包括下列步驟(a)將成體干細胞在含有尼克酰胺、(3-巰基乙醇和FBS的低葡萄糖DEME培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-72小時；和(b)將培養(yǎng)的細胞在含有尼克酰胺、(3-巰基乙醇和FBS的高葡萄糖DEME培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-7天。而且，本發(fā)明提供了用于治療糖尿病的細胞治療劑，其含有所述胰島素釋放胰腺p細胞作為活性成分。在又一方面，本發(fā)明提供了用于治療神經(jīng)疾病的細胞治療劑，其含有具有分化成神經(jīng)細胞能力的成體干細胞作為活性成分。在又一方面，本發(fā)明提供了用于治療糖尿病的細胞治療劑，其含有具有分化成胰島素釋放胰腺(3細胞能力的成體干細胞作為活性成分。在又一方面，本發(fā)明提供了用于治療骨關(guān)節(jié)炎的細胞治療劑，其含有具有分化成軟骨細胞能力的成體干細胞作為活性成分。在又一方面，本發(fā)明提供了用于治療骨缺損的細胞治療劑，其含有具有分化成成骨細胞能力的成體干細胞作為活性成分。在又一方面，本發(fā)明提供了用于形成乳房組織的細胞治療劑，其含有具有分化成脂肪細胞能力的成體干細胞作為活性成分。通過下列詳細描述和所附的權(quán)利要求書，本發(fā)明的上述和其它目的、特征和實施方式將會更顯而易見地被理解。圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細胞的放大100倍拍攝的照片。圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細胞的累計倍增數(shù)目水平(CPDL)。A-l和A-2:根據(jù)本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細胞；B和C:根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的脂肪源干細胞。圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的人乳房脂肪組織源多能干細胞培養(yǎng)7天后形成的球體的放大200倍拍攝的照片。圖4顯示了通過干細胞在瓊脂中增殖形成的球體形狀的放大200倍拍攝的照片。圖5示出了放大100倍拍攝的照片，其顯示了巢蛋白，Oct4，SH2，SH3/4在本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細胞中的表達，該人脂肪組織源多能干細胞在含有MEBM的CORM-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)成球體然后免疫染色。圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細胞分化成神經(jīng)細胞和星形細胞。圖7顯示了由根據(jù)本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細胞分化而成的脂肪細胞的放大200倍拍攝的照片。A:分化階段對比；B:通過油紅O染色法染色。圖8顯示了由根據(jù)本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細胞分化而成的軟骨細胞的放大100倍拍攝的照片。A:分化階段對比；B:愛爾新藍染色結(jié)果，顯示分化成軟骨細胞。圖9顯示了由根據(jù)本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細胞分化而成的成骨細胞。A:TCP單獨處理組；B:TCP和骨髓干細胞處理組；和C:TCP和脂肪源干細胞處理組D圖10顯示了由根據(jù)本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細胞分化而成的胰島素釋放胰腺P細胞的免疫染色結(jié)果。具體實施例方式本發(fā)明涉及從人乳房脂肪組織分離的多能干細胞。在本發(fā)明中，多能干細胞首先以下列方式從人乳房脂肪組織中分離并純化。分離的人脂肪組織用PBS清洗，并精細地切割然后在添加了1型膠原酶(lmg/ml)的DMEM培養(yǎng)基中在37r消化2小時。用PBS清洗后，將組織以1000rpm離心5分鐘。吸去上清，用PBS清洗保留在底部的球團，然后以1000rpm離心5分鐘。得到的球團通過100/^i篩過濾除去殘渣，接著用PBS清洗。然后，球團在DMEM培養(yǎng)基(10。/aFBS，2mMNAC，0.2mM抗壞血酸)中培養(yǎng)。過一夜后，用PBS將未附著的細胞洗去，剩余細胞在K-NAC培養(yǎng)基(角質(zhì)化細胞-SFM培養(yǎng)基+2mMNAC+0.2mM抗壞血酸+0.09mM1丐+5ng/mlrEGF+50〃g/mlBPE+5港/1111胰島素+74ng/ml皮質(zhì)醇)中培養(yǎng)，同時每隔兩天更換一次培養(yǎng)基，從而得到人乳房脂肪組織源多能干細胞溶液。檢查分離的人乳房脂肪組織源多能干細胞的增殖率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPDL逐漸增加到16代數(shù)，表明干細胞具有高增殖率。同時，對于干細胞的球體培養(yǎng)物，將5xlO、lxl()S細胞/ml分離的人乳房脂肪組織源多能干細胞接種到含有MEBM培養(yǎng)基(10|iMC0RM-2(三羰基二氯代釕(n)二聚體)、B27、5ml抗真菌抗生素溶液(IOOX)，1颼/ml皮質(zhì)醇、5〃g/ml胰島素，20ng/mlEGF,40ng/mlFGF和p-巰基乙醇)的6孔板的每個孔中，結(jié)果，它們從接種3天后就開始形成球體。這顯示干細胞具有高增殖率并保持在未分化狀態(tài)。從上述得到的人脂肪組織源干細胞培養(yǎng)液中獲得表達所需表面抗原的多能干細胞的方法包括，使用具有分選功能的流式細胞儀的FACS方法(Int.Immunol.,10(3):275，1998)，使用磁珠的方法和使用抗體特異地識別多能干細胞的淘選方法(J.Immunol.,141(8):2797，1998)。而且，用于從大量培養(yǎng)液中獲得多能干細胞的方法包括其中在細胞表面上表達的抗體特異地識別分子(此后稱為"表面抗原")被單獨使用或者結(jié)合成列(ascolumn)使用的方法。流式細胞儀可包括水滴電荷法和細胞捕獲法。在這些方法的任何一種中，特異地識別細胞表面上的抗原的抗體被熒光標記，將與細胞表面上表達的分子結(jié)合的抗體發(fā)出的熒光強度轉(zhuǎn)化成電信號，從而對抗原的表達量進行定量。還能夠通過結(jié)合使用的熒光類型來分離表達多個表面抗原的細胞。在這種情況下可使用的熒光的例子包括FITC(熒光異硫氰酸酯)、PE(藻紅蛋白)、APC(別藻藍蛋白)、TR(TexasRed)、Cy3、CyCh腿e、Red613、Red670、TRI-Color、QuantumRed等。使用流式細胞儀的FACS方法包括其中從分離的細胞中通過例如離心并直接用抗體染色來收集上述干細胞培養(yǎng)液的方法；和其中細胞在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并生長然后用抗體染色的方法。細胞的染色通過將識別表面抗原的初級抗體與耙細胞樣品混合并在冰上將混合物培養(yǎng)30分鐘到1小時。當初級抗體被標記上熒光后，清洗后用流式細胞儀分離細胞。當初級抗體沒有被標記上熒光時，清洗后混合與初級抗體反應的細胞和熒光標記的對初級抗體具有結(jié)合活性的第二抗體，并在冰上培養(yǎng)30分鐘到1小時。清洗后，由初級抗體和第二抗體染色的細胞用流式細胞儀分離。各種表面抗原可包括造血相關(guān)抗原、間葉細胞的表面抗原和對神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元特異的抗原。造血相關(guān)抗原包括CD34、CD35等，間葉細胞的表面抗原包括SH-2、SH-3等，對神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元特異的抗原包括NSE、GFAP等。識別上述表面抗原的抗體單獨或結(jié)合使用允許獲得所需細胞。根據(jù)本發(fā)明的分離的多能成年干細胞使用流式細胞術(shù)分析，結(jié)果，對CD73、CD卯、CD29、CD44和CD105顯示陽性應答。而且，多能干細胞對所有的CD33、CD34、CD45、CD4，CD31、CD62p、CD14和HLA-DR顯示陰性免疫應答。另外發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的分離多能干細胞是可分化成神經(jīng)細胞、星形細胞、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞以及胰島素釋放胰腺P細胞的多能干細胞。實施例隨后將通過實施例詳細描述本發(fā)明。但是應當理解，這些實施例僅用于說明的目的，而不構(gòu)成對本發(fā)明的范圍的限制。實施例l:從脂肪組織中分離多能干細胞脂肪組織由首爾國立大學乳腺癌中心提供的婦女乳房組織中分離，用PBS清洗然后精細切割。切割的組織在添加了1型膠原酶(lmg/ml)的DMEM培養(yǎng)基中在37"C下消化2小時。消化的組織用PBS清洗然后以1000rpm離心5分鐘，吸去上清，并用PBS清洗保留在底部的球團，然后以1000rpm離心5分鐘。得到的球團經(jīng)100，篩過濾除去殘渣，然后用PBS清洗。得到的細胞在DMEM培養(yǎng)基(10%FBS，2mMNAC，0.2mM抗壞血酸)中培養(yǎng)。過一夜后，用PBS洗去未附著的細胞，并在角質(zhì)形成細胞-SFM培養(yǎng)基(含有2mMNAC,0.2mM抗壞血酸，0.09mM鈣，5ng/mlrEGF,50〃g/mlBPE,5〃g/ml胰島素和74ng/ml皮質(zhì)醇)中培養(yǎng)，同時以兩天為間隔更換培養(yǎng)基，由此分離多能干細胞。圖1顯示了上述分離的人脂肪組織源多能干細胞放大IOO倍拍攝的照片。實施例2:脂肪組織源干細胞的增殖率檢査脂肪組織根據(jù)上述實施例1中描述的分離方法從每種不同人乳房組織樣品獲得。為了檢査來自分離的人乳房脂肪組織的多能干細胞的增殖率，將2xl05個細胞接種到T-75燒瓶中并測定CPDL(累計倍增數(shù)目水平)并表示為代數(shù)的函數(shù)。CPDL是細胞增殖率的指數(shù)表示并表示為下列方程。CPDL=ln(Nf/Ni)/ln2，其中Ni:初始接種細胞數(shù);和Nf:最終細胞數(shù)。結(jié)果，如圖2的"A-l"和"A-2"中所示，根據(jù)本發(fā)明的成體干細胞(hMAD-MCSl和hMAD-MCS2)在傳代16代數(shù)時顯示了大約50的CPDL值。同時，圖2的"B"和"C"顯示了作為代數(shù)的函數(shù)的現(xiàn)有技術(shù)的人脂肪組織源干細胞的CPDL值(Lin等人，StemCellsandDevelopment,14:92,2005;Zuk等人，TissueEng.,7:211，2001)。如圖2所示，在代數(shù)為7和13時細胞的CPDL值分別為30-35和21。這些結(jié)果顯示根據(jù)本發(fā)明的成體干細胞具有非常高的增殖率。實施例3:脂肪源多能干細胞的免疫學特性在實施例1中得到的脂肪組織源多能干細胞用PBS清洗并用胰蛋白酶處理。收集處理的細胞并以lOOOrpm離心5分鐘。除去上清然后用2%FBS和PBS的混合物清洗，然后以lOOOrpm離心5分鐘。除去上清，將細胞懸浮于PBS中，對每種樣品將lx105個細胞分散到孔板中，將抗體(R-藻紅蛋白結(jié)合的鼠抗人單克隆抗體)放置到每個孔中并在冰上培養(yǎng)40分鐘。培養(yǎng)后，將培養(yǎng)基以lOOOrpm離心5分鐘。除去上清并用PBS清洗細胞并以lOOOrpm離心5分鐘。再次除去上清，用PBS清洗細胞并以lOOOrpm離心5分鐘。除去上清后，將細胞與1%的多聚甲醛混合并使用流式細胞儀分析。表l:脂肪源干細胞的表面抗原的FACS分析<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>結(jié)果，如表1所示，根據(jù)本發(fā)明的脂肪組織源成體干細胞顯示了對CD73為91%，對CD90為97%,對CD29為96%，對CD44為83%，以及對CD105為80%的陽性應答。而且，本發(fā)明的干細胞對所有CD33、CD34、CD45、CD4、CD31,CD62p、CD14和HLA-DR顯示陰性免疫應答。實施例4:脂肪組織源多能干細胞的球體形成將實施例1中得到的5><104-1><105/1111人乳房脂肪組織源多能干細胞接種到含有10pMCORM-2，5ml抗生素溶液(100X)，1巡/ml皮質(zhì)醇，5〃g/ml胰島素，20ng/mlEGF，40ng/mlFGF,B27和p-巰基乙醇的無血清MEBM培養(yǎng)基的6孔板的每個孔中。結(jié)果，接種后3-7天細胞開始形成球體，如圖3和圖4所示，甚至在接種后7-10天細胞增殖形成球體。而且，根據(jù)本發(fā)明的干細胞在瓊脂中培養(yǎng)。結(jié)果，如圖4所示，細胞形成球體。同時，將實施例1中得到的5><104個干細胞接種到24孔板的每個孔中并在每個代數(shù)測定球體的數(shù)目(見表2)。結(jié)果，如表2所示，細胞保持球體，表明細胞可增殖并長期保持。而且，如圖5所示，Oct4陽性表達，表明細胞具有高增殖率并保持在未分化狀態(tài)。表2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>22603271實施例5:脂肪組織源干細胞的免疫染色分析將實施例4中得到的脂肪組織源干細胞球用PBS清洗3次并與含PBS的4%多聚甲醛混合30分鐘。用PBS清洗3次后，將球體用含有0.1%Triton-XlOO的PBS滲透10分鐘。用PBS清洗3次后，允許球體與10%NGS反應1小時，然后與含有初級抗體的PBS反應過夜。用PBS清洗3次后，允許球體與第二抗體在暗室中反應1小時。用PBS清洗3次后，對球體進行測定(mount)。結(jié)果，如圖5所示，根據(jù)本發(fā)明的多能干細胞球?qū)λ锌杀徽J為是神經(jīng)祖細胞的標記物的巢蛋白、可被認為是未分化細胞的標記物的Oct4和間葉細胞的標記物SH2(CD105)及SH3/4(CD73)都顯示陽性應答。實施例6:脂肪源多能干細胞分化成神經(jīng)細胞和星形細胞實施例1中得到的脂肪組織源多能干細胞在添加了1mMBME和10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中預培養(yǎng)24小時。預培養(yǎng)后，為了誘導神經(jīng)細胞分化，將干細胞在含有P/。DMSO和100pMBHA(丁基羥基茴香醚)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)90分鐘以便誘導分化成神經(jīng)細胞，接著進行免疫染色(圖6)。結(jié)果，如圖6所示，根據(jù)本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細胞對神經(jīng)系統(tǒng)中的星形細胞特異的抗原GFAP(神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白)和神經(jīng)細胞特異性物質(zhì)MAP2(微管相關(guān)蛋白2)都顯示陽性應答。圖6中第一行的照片顯示陰性對照組的結(jié)果，表示分化的細胞本身沒有顯示FITC和TRITC的熒光。第二行左側(cè)的MAP2照片顯示TRITC紅色熒光，表明MAP2表達。通過這些階段對比照片和融合照片發(fā)現(xiàn)，紅色熒光是由其中表達MAP2的細胞發(fā)出的熒光。而且，第三行左側(cè)的GFAP照片顯示FITC綠色熒光，從階段對比照片和融合照片可以看出，綠色熒光是由表達GFAP的細胞發(fā)出的熒光。這些結(jié)果表明，根據(jù)本發(fā)明的人脂肪源多能干細胞分化成神經(jīng)細胞和星形細胞。實施例7:脂肪源多能干細胞分化成神經(jīng)細胞實施例1中得到的脂肪組織源多能干細胞在含有5%FBS，lpM地塞米松，200pM抗炎叼l哚酸、]0巡/ml胰島素和0.5mMIBMX(3-異丁基-l-甲基黃嘌呤)的a-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周以便誘導分化成脂肪細胞然后使用油紅O染色法進行分析。結(jié)果，如圖7所示，觀察到人脂肪組織源多能干細胞分化成脂肪細胞。實施例8:脂肪源多能干細胞分化成軟骨細胞將實施例1中得到的107個干細胞以1(HU的量接種到24孔板的每個中心。然后，將細胞在含有5。/。FBS，10ng/mlTFG-J31，50)iML-抗壞血酸鹽-2-磷酸鹽和6.25巡/ml胰島素的a-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周，以便誘導分化成軟骨細胞。然后，多能干細胞是否分化成軟骨細胞使用愛爾新藍染色法進行分析。結(jié)果，如圖8所示，人脂肪組織源多能干細胞分化成軟骨細胞。實施例9:脂肪源多能干細胞分化成成骨細胞將實施例1中得到的107個干細胞與TCP(磷酸三鈣)混合并皮下同基因移植到狗的身體中。14天后，使用H&E染色法處理并分析。結(jié)果，如圖9所示，用TCP單獨處理的組(A)顯示炎性細胞滲透到部分周圍的TCP中，用TCP和骨髓干細胞的混合物處理的組(B)顯示炎性響應保持與周圍TCP未接觸。但是，在用TCP和脂肪源干細胞的混合物處理的組(C)中，絕大多數(shù)TCP被吸收，并觀察到典型的初始骨生成，還觀察到成骨細胞狀細胞、多核破骨細胞狀細胞和骨基質(zhì)。這些結(jié)果表明，人脂肪組織源多能干細胞分化成成骨細胞。實施例10:脂肪源多能干細胞分化成胰島素釋放胰腺!3細胞實施例1中得到的脂肪組織源多能干細胞在含有1Ommol/L尼克酰胺、1mmol/LP-巰基乙醇和10°/。FBS的低葡萄糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，然后在含有10mmol/L尼克酰胺、1mmol/L卩-巰基乙醇和5%FBS的高葡萄糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天，以便誘導分化成胰島素釋放胰腺P細胞。誘導分化后，通過免疫染色法分析細胞，結(jié)果在圖10中顯示。如圖10所示，細胞中存在C-肽和胰島素。如同本領(lǐng)域已知的那樣，被分成胰島素和C-肽的胰島素原在胰島素釋放胰腺(3細胞中產(chǎn)生。因此，上述結(jié)果表明，根據(jù)本發(fā)明的脂肪組織源干細胞分化成了胰島素釋放胰腺(3細胞。雖然已經(jīng)參照特定特征對本發(fā)明進行了詳細描述，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，該描述僅僅是優(yōu)選實施方式，而不是對本發(fā)明的范圍的限制。因此，本發(fā)明的實際范圍將由所附的權(quán)利要求書及其等同物限定。工業(yè)實用性如上面詳細描述的那樣，雖然根據(jù)本發(fā)明的多能干細胞是成體干細胞，它們可分化成比現(xiàn)有脂肪源成體干細胞分化的那些細胞更多種類的細胞。特別地，本發(fā)明的成人多能干細胞具有分化成神經(jīng)細胞、星形細胞、脂肪細胞、成軟骨細胞、成骨細胞或者胰島素釋放胰腺P細胞的能力，并有效地治療骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)疾病、糖尿病等，還用于形成乳房組織。而且，本發(fā)明的成體干細胞在無血清培養(yǎng)基中形成球體，使它們可被高純度地分離，長時間保持未分化狀態(tài)并具有高增殖率。因此，本發(fā)明的成體干細胞作為細胞治療劑是有用的。權(quán)利要求1、一種生產(chǎn)成體干細胞的方法，包括在含有N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人脂肪組織源球團，然后收集培養(yǎng)的細胞，所述成體干細胞，其特征在于(a)對所有CD73、CD90、CD29、CD44和CD105產(chǎn)生陽性免疫應答，并對所有CD33、CD34、CD45、CD4、CD31、CD62p、CD14和HLA-DR產(chǎn)生陰性免疫應答；(b)附著于塑料生長，顯示梭狀形態(tài)學特征，并在含有CORM-2的培養(yǎng)基中形成球體，從而能夠長時間保持在未分化狀態(tài)；和(c)具有分化成中胚層源細胞的能力。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的產(chǎn)生成體干細胞的方法，其特征在于，含有NAC的培養(yǎng)基另外含有抗壞血酸、鈣、rEGF、BPE、胰島素和皮質(zhì)醇。3、一種將成體干細胞保持在未分化狀態(tài)的方法，所述方法包括在含有CORM-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法制備的成體干細胞以便形成球體。4、一種將成體干細胞保持在未分化狀態(tài)的方法，其特征在于，含有CROM-2的培養(yǎng)基優(yōu)選為無血清的培養(yǎng)基，其另外包含抗真菌抗生素溶液、皮質(zhì)醇、胰島素、rEGF、B27和p-巰基乙醇。5、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法產(chǎn)生的成體干細胞，其特征在于(a)對所有CD73、CD90、CD29、CD44和CD105產(chǎn)生陽性免疫應答，并對所有CD33、CD34、CD45、CD4、CD31、CD62p、CD14和HLA-DR產(chǎn)生陰性免疫應答；(b)附著于塑料生長，顯示梭狀形態(tài)學特征，并在含有CORM-2的培養(yǎng)基中形成球體，從而能夠長時間保持在未分化狀態(tài)；和(C)具有分化成中胚層源細胞的能力。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的成體干細胞，其特征在于，成體干細胞以未分化狀態(tài)培養(yǎng)至少16代。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的成體干細胞，其特征在于，中胚層源細胞選自下組包括軟骨細胞、成骨細胞、神經(jīng)細胞、星形細胞、脂肪細胞以及胰島素釋放胰腺{3細胞。8、一種將成體干細胞分化成神經(jīng)細胞的方法，所述方法包括下列步驟(a)在含有BME和FBS的DEME培養(yǎng)基中預培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項所述的成體干細胞；和(b)用DMSO和BHA處理預培養(yǎng)的培養(yǎng)液以便誘導分化成神經(jīng)細胞。9、一種用于治療神經(jīng)疾病的細胞治療劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法分化的神經(jīng)細胞作為活性成分。10、一種將成體干細胞分化成軟骨細胞的方法，所述方法包括在含有TFG-pi、L-抗壞血酸鹽-2-磷酸鹽和胰島素的a-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項所述的成體干細胞。11、一種用于治療骨關(guān)節(jié)炎的細胞治療劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求io所述的方法分化的軟骨細胞作為活性成分。12、一種將成體干細胞分化成成骨細胞的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項所述的成體干細胞與磷酸三鈣(TCP)混合并同基因移植該混合物。13、一種用于治療骨缺損的細胞治療劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法分化的成骨細胞作為活性成分。14、一種將成體干細胞分化成脂肪細胞的方法，所述方法包括在含有地塞米松、抗炎吲哚酸、胰島素和IBMX的a-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項所述的成體干細胞。15、一種用于治療骨關(guān)節(jié)炎的細胞治療劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法分化的脂肪細胞作為活性成分。16、一種將成體干細胞分化成胰島素釋放胰腺(3細胞的方法，所述方法包括下列步驟將根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項所述的成體干細胞在含有尼克酰胺、J3-巰基乙醇和FBS的低葡萄糖DEME培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-72小時；和(b)將培養(yǎng)的細胞在含有尼克酰胺、p-巰基乙醇和FBS的高葡萄糖DEME培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-7天。17、一種用于治療糖尿病的細胞治療劑，其含有通過權(quán)利要求16的方法分化的胰島素釋放胰腺(3細胞作為活性成分。18、一種用于治療神經(jīng)疾病的細胞治療劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項所述的成體干細胞作為活性成分，所述成體干細胞具有能分化成神經(jīng)細胞的能力。19、一種用于治療糖尿病的細胞治療劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項所述的成體千細胞作為活性成分，所述成體干細胞具有能分化成胰島素釋放胰腺P細胞的能力。20、一種用于治療骨關(guān)節(jié)炎的細胞治療劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項所述的成體干細胞作為活性成分，所述成體干細胞具有能分化成軟骨細胞的能力。21—種用于治療骨缺損的細胞治療劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項所述的成體干細胞作為活性成分，所述成體干細胞具有能分化成成骨細胞的能力。22、一種用于形成乳房組織的細胞治療劑，其含有其含有權(quán)利要求5至7中任一項所述的成體干細胞作為活性成分，所述成體干細胞具有能分化成脂肪細胞的能力。全文摘要本發(fā)明涉及來自人類脂肪組織的多能成體干細胞，具體涉及來自人類乳房脂肪組織的多能成體干細胞，其可通過形成球體以未分化狀態(tài)保持很長一段時間，并具有較高的增殖率，本發(fā)明還涉及用于分離和保持成體干細胞的方法，用于將成體干細胞分化成神經(jīng)細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞和胰島素釋放胰腺β細胞的方法。而且，本發(fā)明涉及用于治療骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥和糖尿病的細胞治療劑，以及用于形成乳房組織的細胞治療劑，其含有分化的細胞或者成體干細胞。雖然多能干細胞是成體干細胞，但它們具有分化成成骨細胞、神經(jīng)細胞、星形細胞、脂肪細胞、軟骨細胞以及胰島素釋放胰腺β細胞的能力，并有效地治療骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、神經(jīng)疾病、糖尿病等疾病的細胞治療劑。而且干細胞在含有CORM-2的培養(yǎng)基中形成球體，由此可長時間保持在未分化狀態(tài)。而且，干細胞具有非常高的增殖率。因此，干細胞作為細胞治療劑是有用的。文檔編號A61K35/12GK101300343SQ200580051945公開日2008年11月5日申請日期2005年12月20日優(yōu)先權(quán)日2005年11月16日發(fā)明者姜慶順,樸貞蘭,羅正燦申請人:Rnl生物技術(shù)株式會社