專利名稱：用于治療變態(tài)反應(yīng)和腫瘤細(xì)胞增殖的反義寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對(duì)特異性細(xì)胞受體的、單獨(dú)或組合的反義寡核苷酸的用途，以便抑制全身性炎癥(包括與哮喘和變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的炎癥)和嗜酸性粒細(xì)胞增多癥。本發(fā)明還涉及反義寡核苷酸抑制腫瘤細(xì)胞增殖如癌癥的用途。
背景技術(shù)：
反義寡核苷酸是一類新的藥物。一般來說，反義指小的合成寡核苷酸的用途，所述寡核苷酸與存在于人DNA或RNA中的寡核苷酸具有相同組成。反義寡核苷酸設(shè)計(jì)為它們所靶向基因的一部分的互補(bǔ)序列，以便能夠附著于該序列并抑制基因表達(dá)。通過反義寡核苷酸與特異性信使RNA(mRNA)有義靶按照Watson-Crick堿基配對(duì)的雜交使基因表達(dá)受到抑制，在Watson-Crick堿基配對(duì)中，腺嘌呤和胸腺嘧啶(在mRNA中為尿嘧啶)或鳥嘌呤和胞嘧啶通過氫鍵鍵合相互作用。兩種機(jī)制可解釋這些作用，第一種機(jī)制是損害被靶向mRNA翻譯的雜交，第二種機(jī)制是誘導(dǎo)降解mRNA的RNA酶H或類似酶。該策略的主要優(yōu)勢在于作用的特異性以及較少的副作用和毒性，尤其是在施用于作用位點(diǎn)時(shí)(局部治療)。該治療策略可潛在地應(yīng)用于一般認(rèn)為一種或幾種基因的過表達(dá)引起疾病發(fā)生或遷延的任何疾病。因此，已有眾多反義寡核苷酸用作癌癥和病毒性疾病治療劑的研究。
反義寡核苷酸可用于抑制白介素(IL)-6受體表達(dá)，由此抑制急性炎癥介導(dǎo)物白介素-6對(duì)細(xì)胞的作用。已進(jìn)行了幾個(gè)研究來評(píng)價(jià)反義寡核苷酸是否可用于抑制涉及炎癥(包括但不限于與哮喘相關(guān)的炎癥和與特應(yīng)性疾病和變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的炎癥)的細(xì)胞或癌細(xì)胞上的其它受體。
哮喘是一種侵襲5-10％人群的疾病，在最近的25年中發(fā)病率已加倍。尤其在病毒感染氣管(細(xì)支氣管炎)后的嬰兒、兒童和職業(yè)誘發(fā)性哮喘中注意到這種增加。變應(yīng)原經(jīng)常引發(fā)與哮喘相關(guān)的復(fù)發(fā)性呼吸問題，但哮喘的確切病因尚不知曉。然而，一般認(rèn)為病毒之類的因子涉及存在于哮喘患者氣管中的異常炎癥的永續(xù)性，因此涉及病情的遷延。
為此，現(xiàn)時(shí)推薦的哮喘一線治療是有效的抗炎藥物，例如含皮質(zhì)類固醇和抗白細(xì)胞三烯的藥物。盡管該治療在許多患者中有效，但一些患者對(duì)皮質(zhì)類固醇有抗性。該藥物還是具有長期副作用的有效免疫抑制劑，未表明其有效預(yù)防變態(tài)反應(yīng)或哮喘?？拱准?xì)胞三烯在變態(tài)反應(yīng)和哮喘中有一些作用，但不如皮質(zhì)類固醇有效。
幾種炎癥介導(dǎo)物在哮喘患者氣管中的炎癥出現(xiàn)和永續(xù)性方面起作用。一些介導(dǎo)物或者通過嗜酸性粒細(xì)胞的趨化性(趨化因子RANTES、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子1、2、3、MCP-3、4，它們主要通過稱為CCR3的受體在哮喘性炎癥中起作用)或者通過內(nèi)皮細(xì)胞作用(IL-4、-13)吸引炎性細(xì)胞進(jìn)入氣管。其它介導(dǎo)物引起氣管中炎性細(xì)胞的致敏和存活增加(IL-3、-4、-5、GM-CSF)。這些介導(dǎo)物因此或者由嗜酸性粒細(xì)胞的特異性趨化因子構(gòu)成，或者由T輔助淋巴細(xì)胞2型表型的細(xì)胞因子(Th2IL-3、-4、-5、-6、-9、-10、-13和GM-CSF)構(gòu)成(John AE.和Lukacs NW.，2003 Sarcoidosis Vase Diffuse Lung Dis.，20180-189；Blease等，2003，Expert Opin Emerg Drugs.871-81)。業(yè)已表明，當(dāng)氣管中的這些炎癥介導(dǎo)物減少時(shí)，哮喘和全身性呼吸道炎癥改善。
變態(tài)反應(yīng)是一種對(duì)引起不需要的免疫應(yīng)答的變應(yīng)原的超敏反應(yīng)。變態(tài)反應(yīng)是一種極為普遍的疾病，例如侵襲約30％人群的特應(yīng)性鼻炎和結(jié)膜炎。變態(tài)反應(yīng)的特征在于異常的IgE產(chǎn)生和對(duì)變應(yīng)原的炎癥。在IgE和變應(yīng)原存在的情況下，效應(yīng)細(xì)胞如肥大細(xì)胞脫粒并釋放炎性介導(dǎo)物，導(dǎo)致哮喘中可見的相同炎性細(xì)胞的募集。在變應(yīng)性鼻炎(即枯草熱)、變應(yīng)性結(jié)膜炎、鼻息肉病、慢性竇炎和濕疹如特應(yīng)性皮炎中，人們發(fā)現(xiàn)炎性介導(dǎo)物如同哮喘中存在的炎性介導(dǎo)物一樣過量。IL-4和IL-13是生產(chǎn)IgE和誘導(dǎo)Th2表型細(xì)胞所必需的(BarnesPJ.，2003，Cytokine Growth Factor Rev.14511-522；Schuh等，2003，Cytokine Growth Factor Rev.2003，14503-510)。特應(yīng)性疾病是通過接觸變應(yīng)原發(fā)生的變應(yīng)疾病的總稱，尤其是在具有易于對(duì)變應(yīng)原敏化的遺傳傾向性的個(gè)體中。具有這些誘病因素的個(gè)體容易對(duì)食源性抗原和吸入物出現(xiàn)異常免疫應(yīng)答。變應(yīng)疾病的一些具體實(shí)例為支氣管哮喘、特應(yīng)性皮炎、風(fēng)疹、變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性結(jié)膜炎和變應(yīng)性胃腸炎。
腫瘤是一種不可控和進(jìn)行性的異常組織生長。惡性腫瘤經(jīng)常以癌癥為特征。癌癥在人類中是第二致死病因，是以永生化細(xì)胞的異常增殖為特征的100多種疾病的總稱。涉及這些細(xì)胞的持久性和增加的機(jī)制之一是釋放通過受體起作用并導(dǎo)致細(xì)胞增殖的生長因子。在這些生長因子中，已表明GM-CSF是幾種腫瘤細(xì)胞的重要生長因子。最近，趨化因子受體CCR3被表征為由慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)和毛細(xì)胞白血病(HCL)患者回收的惡性B淋巴細(xì)胞，(Trentin等，2004，Blood，104，502-508)。實(shí)際上，已發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體(EGFR)通過CCR-3趨化因子受體的反式激活作用是引起支氣管上皮細(xì)胞中MAP激酶活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生的關(guān)鍵途徑(Adachi等，2004，Biochem.Biophys.Res.Commun.320，292-396)。通過阻斷生長因子和/或趨化因子的受體來抑制癌細(xì)胞增殖可能在某些癌癥的治療中很重要。
嗜酸性粒細(xì)胞是一類白細(xì)胞。它們是具有核和胞質(zhì)的粒性白細(xì)胞，所述核通常具有兩個(gè)通過染色質(zhì)細(xì)線連接的葉，所述胞質(zhì)包含尺寸均一并可由曙紅染色的成層(course)圓粒。嗜酸性粒細(xì)胞增多癥的特征在于嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量增加，經(jīng)常與變態(tài)反應(yīng)、哮喘和感染相關(guān)。
針對(duì)編碼受體的特異性核酸序列的寡核苷酸用于抑制炎性反應(yīng)的某些用途是已知的。Renzi的PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 99/66037描述了用于治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥的反義寡核苷酸。具體地說，Renzi的寡核苷酸針對(duì)的核酸序列編碼CCR3受體、IL-4和IL-3受體的共同亞基或IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同亞基。其中還公開了一種鑒別為107A(5′-GGGTCTGCAGCGGGATGGT-3′)的反義寡核苷酸，其針對(duì)IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β亞基。
對(duì)于潛在的臨床用途，反義寡核苷酸應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)出抗血清和細(xì)胞核酸酶降解的穩(wěn)定性，顯示出與血清和細(xì)胞蛋白的低非特異性結(jié)合，具有增強(qiáng)的靶mRNA序列識(shí)別，表現(xiàn)出細(xì)胞膜透過性，并在與互補(bǔ)mRNA復(fù)合時(shí)激發(fā)細(xì)胞核酸酶。文件已充分證明，含天然糖(D-核糖和D-2-脫氧核糖)和磷酸二酯(PO)鍵的寡核苷酸被血清和胞內(nèi)核酸酶快速降解，這限制了其作為有效治療劑的用途。業(yè)已描述了對(duì)寡核苷酸的化學(xué)策略性修飾，以便提升其作為治療劑的穩(wěn)定性和效力。主要的化學(xué)改變包括糖部分、堿基部分的修飾和/或核苷酸間磷酸二酯鍵的修飾或替代。迄今為止，最廣泛研究的類似物是磷酸二酯主鏈中的其中一個(gè)非橋接氧原子被硫取代的硫代磷酸酯(PS)寡脫氧核苷酸(Eckstein F.，1985，Ann.Rev.Biochem.，54367-402)。已開發(fā)出幾種反義寡核苷酸生產(chǎn)方法，并用于體外和體內(nèi)研究(Goodchild J.，2004，Curr.Opin.Mol.Ther.，2004，6120-128；Urban E.和R.Noe CR.，2003，F(xiàn)armaco.58243-258)。
最近，Renzi等描述了2′，6′-二氨基嘌呤(DAP)及其類似物在抗炎組合物核分子中的用途(PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 03/004511 A2)。在該文獻(xiàn)中還描述了相比于無DAP的寡核苷酸體內(nèi)生理效力增加和毒性降低的核分子的制備。Renzi等進(jìn)一步教導(dǎo)DAP置換具體用于制備針對(duì)肺部/呼吸系統(tǒng)疾病的寡核苷酸，所述疾病例如為囊性纖維化、哮喘、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺病、嗜酸性粒細(xì)胞性支氣管炎、變態(tài)反應(yīng)、變應(yīng)性鼻炎、肺纖維化、成人呼吸窘迫綜合癥、竇炎、呼吸道合胞體病毒或其它病毒性呼吸道感染以及癌癥。
應(yīng)當(dāng)需要具有另外的反義寡核苷酸，其針對(duì)Th2細(xì)胞因子的至少一種特異性共同受體或介導(dǎo)物(其吸引響應(yīng)Th2細(xì)胞因子的細(xì)胞)的受體，以便抑制在哮喘或變態(tài)反應(yīng)中存在的炎性反應(yīng)，以及抑制腫瘤細(xì)胞增殖。
還應(yīng)當(dāng)高度需要具有另外的反義寡核苷酸，其針對(duì)受體編碼核酸序列，以便通過抑制這些受體使這些寡核苷酸可用于治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥。
發(fā)明概述本發(fā)明提供反義寡核苷酸的用途，所述反義寡核苷酸針對(duì)細(xì)胞受體的至少一種共同亞基(例如IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β亞基)或趨化因子受體CCR3，以便治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種。
在另一方面，本發(fā)明提供針對(duì)IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β亞基的編碼核酸序列的反義寡核苷酸，以便通過抑制這些受體使所述反義寡核苷酸可用于治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種。
本發(fā)明還提供針對(duì)趨化因子CCR3受體的編碼核酸序列的反義寡核苷酸，以便通過抑制該受體使所述反義寡核苷酸可用于治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種。
本發(fā)明還提供治療有效量的組合物，其包含至少一種針對(duì)IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β亞基或CCR3受體的編碼核酸序列的反義寡核苷酸，用于治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種。
本發(fā)明還提供治療有效量的組合物，其包含兩種各自針對(duì)IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β亞基或CCR3受體的編碼核酸序列的反義寡核苷酸，用于改善在治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種中的作用。
按照另一方面，本發(fā)明提供一種方法，用于治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、全身性炎癥和癌癥中的至少一種，所述方法包括給予一種或多種針對(duì)細(xì)胞受體的至少一種共同亞基(例如IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β亞基)或CCR3受體的反義寡核苷酸。
本發(fā)明試圖提供任何前述的反義寡核苷酸以及以已知方式修飾的化學(xué)修飾反義寡核苷酸，其在機(jī)體內(nèi)具有改進(jìn)的穩(wěn)定性，同時(shí)表現(xiàn)出提升的有效性和降低的毒性。
按照本發(fā)明的另一方面，提供用于治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的反義寡核苷酸。所述寡核苷酸針對(duì)編碼受體的核酸序列，所述受體選自CCR3趨化因子受體以及IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β亞基，具有選自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的序列。
按照本發(fā)明的另一方面，提供至少一種寡核苷酸用于治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的用途。優(yōu)選地，使用含SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14兩個(gè)序列的寡核苷酸。
按照本發(fā)明的另一方面，提供用于治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的藥物組合物，其包含至少一種寡核苷酸連同藥物可接受的載體。優(yōu)選地，所述至少一種寡核苷酸含SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14兩者。
按照本發(fā)明的另一方面，提供所述藥物組合物用于治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的用途。
按照本發(fā)明的另一方面，提供一種治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的方法，所述方法包括以下步驟給予有效量的(i)至少一種寡核苷酸或(ii)含至少一種寡核苷酸連同藥物可接受的載體的藥物組合物。
本發(fā)明在此還涉及對(duì)反義寡核苷酸的修飾，所述修飾不顯著地不利影響反義寡核苷酸降低靶蛋白活性或抑制靶蛋白表達(dá)的能力，但其可增強(qiáng)該能力。
附圖簡述本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的這些特征和其它特征在以下的詳述中將變得更明顯，在詳述中參考附圖，其中

圖1A顯示了由獼猴IL-3、IL-5和GM-CSF受體基因共同β鏈的PCR擴(kuò)增獲得的3個(gè)克隆與人TOP004補(bǔ)體序列周圍的對(duì)應(yīng)人、黑猩猩、豬、大鼠和小鼠直系同源物的序列比對(duì)。
圖1B顯示了在克隆的獼猴、人、黑猩猩、豬、大鼠和小鼠共同β鏈DNA序列中TOP004補(bǔ)體節(jié)段周圍的翻譯區(qū)的預(yù)測氨基酸序列。
圖2A顯示了與未處理的細(xì)胞相比，通過改變獼猴PBMC中的TOP004濃度降低β鏈(βc)mRNA表達(dá)的情況。
圖2B顯示了與未處理的細(xì)胞相比，通過改變獼猴PBMC中的TOP005濃度降低CCR3 mRNA表達(dá)的情況。
圖3A顯示了與未處理的細(xì)胞相比，獼猴PBMC中的不同TOP004濃度降低β鏈(βc)細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的情況。
圖3B顯示了與未處理的細(xì)胞相比，獼猴PBMC中的不同TOP005濃度降低CCR3細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的情況。
圖4A顯示了與未處理的細(xì)胞相比，通過改變獼猴PBMC中的ASM8濃度降低β鏈(βc)mRNA表達(dá)的情況。
圖4B顯示了與未處理的細(xì)胞相比，通過改變獼猴PBMC中的ASM8濃度降低CCR3 mRNA表達(dá)的情況。
圖5顯示了寡核苷酸對(duì)HL60分化細(xì)胞中的CCR3 mRNA表達(dá)的作用。與對(duì)G3PDH表達(dá)無作用的對(duì)照和有義寡核苷酸相比時(shí)，針對(duì)CCR3的反義寡核苷酸A86顯示出降低CCR3 mRNA表達(dá)。
圖6顯示了在寡核苷酸處理的HL-60 c1-15細(xì)胞中的鈣動(dòng)員測定。與對(duì)照和有義寡核苷酸處理的細(xì)胞相比，在A86處理細(xì)胞中響應(yīng)于嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的動(dòng)員下降。
圖7顯示了寡核苷酸作用于純化人嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的趨化反應(yīng)的情況。將A86處理的嗜酸性粒細(xì)胞的相對(duì)趨化反應(yīng)與對(duì)照和有義寡核苷酸處理的細(xì)胞對(duì)比。
圖8顯示了響應(yīng)于嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的寡核苷酸處理嗜酸性粒細(xì)胞中的鈣動(dòng)員測定。對(duì)比A86處理的嗜酸性粒細(xì)胞和對(duì)照或有義寡核苷酸處理的細(xì)胞中的鈣動(dòng)員。
圖9顯示了TOP005對(duì)CCR3的細(xì)胞表面表達(dá)的作用，以Eol-1和U937細(xì)胞中相對(duì)于對(duì)照的表達(dá)百分率來表示。
圖10顯示了TOP005對(duì)人PBMC中的mRNA表達(dá)的作用。顯示G3PDH和CCR3表達(dá)的凝膠示于條圖上。CCR3 mRNA表達(dá)對(duì)G3PDH的比率相對(duì)于對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化，示于底部。
圖11A顯示了調(diào)節(jié)107A處理的TF-1細(xì)胞中的β鏈(βc)mRNA表達(dá)，使用RT-PCR以檢測β鏈(βc)mRNA表達(dá)或?qū)φ誈3PDH mRNA表達(dá)。
圖11B和11C顯示了有義寡核苷酸和107A處理對(duì)TF-1細(xì)胞的細(xì)胞表面上β鏈表達(dá)的作用，其通過FACS分析測定。
圖11D顯示了TOP004在mRNA和蛋白水平上對(duì)U937細(xì)胞中的共同β鏈表達(dá)的作用。
圖12顯示了在GM-CSF、IL-3或IL-5存在下107A處理的TF-1細(xì)胞的增殖。
圖13A顯示了107A對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞存活率的調(diào)節(jié)，其使用錐蟲藍(lán)染色排除測定來評(píng)價(jià)。
圖13B顯示了107A對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞存活率的調(diào)節(jié)，其通過使用Annexin-V-FITC和碘化丙啶方案的流式細(xì)胞術(shù)分析來評(píng)價(jià)。
圖14顯示了使用DEAE陰離子交換層析的ASM8單個(gè)產(chǎn)物(TOP004和TOP005)的洗脫譜。
圖15顯示了用CH3COOH處理3小時(shí)并進(jìn)行堿裂解后，通過DEAE陰離子交換層析分級(jí)分離后的ASM8洗脫譜。
圖16顯示了用CH3COOH處理6小時(shí)并進(jìn)行堿裂解后，通過DEAE陰離子交換層析分級(jí)分離后的ASM8洗脫譜。
圖17A1、17A2、17B1和17B2顯示了在不同溫度下儲(chǔ)存并隨后使用DEAE陰離子交換層析洗脫后，ASM8的化學(xué)穩(wěn)定性。
圖18顯示了在1×PBS中TOP004和TOP005的解鏈曲線。
圖19顯示了基于1×PBS中TOP004和TOP005的解鏈曲線擬合結(jié)果的熱力學(xué)總結(jié)。
圖20A和20B顯示了在用高劑量ASM8處理后1天，在猴血漿中的TOP004和TOP005及其代謝物的濃度。
圖21A和21B顯示了在用高劑量ASM8處理后14天，在猴血漿中的TOP004和TOP005及其代謝物的濃度。
發(fā)明詳述幾種炎癥介導(dǎo)物在哮喘患者氣管中的炎癥出現(xiàn)和永續(xù)性方面起作用。一些介導(dǎo)物通過嗜酸性粒細(xì)胞的趨化作用吸引炎性細(xì)胞進(jìn)入氣管。這些趨化因子中有許多主要通過CCR3受體在哮喘或變應(yīng)性炎癥中起作用。其它介導(dǎo)物在氣管或皮膚中引起炎性細(xì)胞致敏和存活率增加，例如IL-3、IL-5和GM-CSF。業(yè)已表明，當(dāng)氣管中的這些炎癥介導(dǎo)物減少時(shí)哮喘改善。
此外，釋放通過受體起作用并導(dǎo)致細(xì)胞增殖的炎癥介導(dǎo)物和/或生長因子，可引起特征為永生化細(xì)胞異常增殖的癌癥。其中，已表明GM-CSF是幾種腫瘤細(xì)胞的重要生長因子。趨化因子受體CCR3表征為由慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)和毛細(xì)胞白血病(HCL)患者回收的惡性B淋巴細(xì)胞，(Trentin等，2004，Blood，104，502-508)。實(shí)際上，已發(fā)現(xiàn)EGFR通過CCR-3的反式激活作用是引起支氣管上皮細(xì)胞中MAP激酶活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生的關(guān)鍵途徑(Adachi等，2004，Biochem.Biophys.Res.Commun.320，292-396)。通過阻斷生長因子受體或趨化因子受體CCR3來抑制癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移可能在某些癌癥的治療中很重要。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種鑒別為828(5′-GTTACTACTTCCACCTGCCTG-3′，(SEQ ID NO.1))并針對(duì)CCR3趨化因子受體的新反義寡核苷酸。本文公開的實(shí)例表明，828有效降低或阻斷人細(xì)胞系中的CCR3 mRNA表達(dá)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供基于先前公開的107A和上述828的新反義寡核苷酸TOP004和TOP005。同107A一樣，TOP004(5′-GGGTCTGCXGCGGGXTGGT-3′(SEQ ID NO.13)，其中X代表腺苷殘基的DAP修飾)是19聚體，針對(duì)IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β鏈的 mRNA。同828一樣，TOP005(5′-GTTXCTXCTTCCXCCTGCCTG-3′(SEQ ID NO.14)，其中X代表腺苷殘基的DAP修飾)是21聚體，針對(duì)趨化因子受體CCR3的mRNA。含TOP004和TOP005這二者的組合物被鑒別為ASM8的一部分。
如本文所公開的，TOP004和TOP005在非人靈長類動(dòng)物系統(tǒng)中具有活性，因此驗(yàn)證獼猴對(duì)安全性評(píng)價(jià)的用途。圖1顯示了獼猴共同β鏈基因的測序。與TOP 004互補(bǔ)的獼猴β鏈序列顯示出顯著同源性。獼猴和人β鏈序列之間非常高度的同一性提示，TOP004在獼猴中可能有功能活性。TOP 004和TOP 005在猴外周血單核細(xì)胞中阻斷或降低共同β鏈和CCR3表達(dá)的有效性示于圖2、3和4。結(jié)果表明，針對(duì)人基因靶的TOP004和TOP005在獼猴外周血單核細(xì)胞(PBMC)中均有效降低其對(duì)應(yīng)靶的表達(dá)。含TOP004和TOP005這二者的ASM8顯著抑制共同β鏈表達(dá)和CCR3受體，在較低濃度時(shí)程度較高或者程度相同。因此，TOP004和TOP005一起在阻斷β鏈和CCR3 mRNA表達(dá)方面表現(xiàn)出協(xié)同作用。而且，在表7和8中，分析取自ASM8處理猴的氣管樣品的mRNA表達(dá)水平。靶基因的表達(dá)對(duì)炎性細(xì)胞因子(IL-4和TNF-α)的mRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化。在ASM8處理的動(dòng)物中，即便在給予ASM8后約24小時(shí)，βc-亞基和CCR3 mRNA對(duì)IL-4 mRNA的相對(duì)表達(dá)分別下降達(dá)29％和24％，相對(duì)于TNF-α的表達(dá)分別下降達(dá)30％和24％。
在圖5-10中，測試針對(duì)CCR3 mRNA的反義寡核苷酸(包括A86和TOP005)在人細(xì)胞和細(xì)胞系中的效力。當(dāng)通過半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(“RT-PCR”)評(píng)價(jià)時(shí)，反義寡核苷酸引起CCR3 mRNA表達(dá)抑制。此外，使用FACS分析表明，CCR3蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)同樣受到反義寡核苷酸處理的抑制。而且，通過用嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子刺激后抑制純化的嗜酸性粒細(xì)胞中的鈣(Ca++)動(dòng)員，證實(shí)CCR3的功能性抑制。另外，在趨化性測定中，所述寡核苷酸抑制嗜酸性粒細(xì)胞趨化性達(dá)55％。
在圖11-13中，107A和TOP004反義寡核苷酸用于處理各種細(xì)胞。與107A溫育的TF-1細(xì)胞顯示降低的β鏈mRNA表達(dá)。107A還在IL-3、IL-5或GM-CSF存在下抑制TF-1細(xì)胞增殖。而且，107A以劑量依賴性方式降低IL-5對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞的抗凋亡作用。與TOP004溫育的U937細(xì)胞在mRNA和蛋白水平上顯示降低的共同β鏈表達(dá)。因此，反義107A和TOP004在阻斷β鏈mRNA、蛋白表達(dá)方面高度有效，在阻斷人細(xì)胞培養(yǎng)物中相關(guān)的細(xì)胞反應(yīng)方面有功能。
在圖14-17B2中，通過在改變的條件下洗脫組合物顯示了ASM8的穩(wěn)定性。使用基于DEAE陰離子交換高效液相層析(HPLC)的分級(jí)分離系統(tǒng)洗脫ASM8，以評(píng)價(jià)ASM8及其降解產(chǎn)物在不同溫度儲(chǔ)存后的完整性。ASM8組分在-20℃、4℃、30℃或40℃儲(chǔ)存達(dá)2個(gè)月時(shí)不經(jīng)歷任何可檢測的降解。
在圖18-19中，所提供的ASM8的解鏈曲線和熱力學(xué)總結(jié)表明，兩條寡核苷酸鏈在溶液中不顯著相互作用。
在圖20-21中，檢測ASM8寡核苷酸組分及其初級(jí)代謝物(n-1)在猴血漿樣品中的濃度。在非臨床毒性實(shí)驗(yàn)中收集樣品，其中動(dòng)物通過吸入處理連續(xù)14天。
因此提供針對(duì)IL-3、IL-5和GM-CSF的共同β亞基和CCR3受體并因此針對(duì)其編碼核酸的反義寡核苷酸。還提供包含所述寡核苷酸和藥物可接受載體的藥物組合物。描述了所述寡核苷酸的用途和包含給予所述寡核苷酸的方法，用于治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種。
術(shù)語“核酸”和“核酸分子”在本文可互換使用，指由核苷酸(即核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或這兩者)組成的分子。該術(shù)語包括核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的單體和多聚物，其中在多聚物情況下核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸經(jīng)5′-3′鍵而連接在一起。但是，鍵可以包括核酸合成領(lǐng)域已知的任何鍵，包括例如含5′-2′鍵的核酸。用于核酸分子的核苷酸可以是天然的，或者可以是能與天然堿基對(duì)形成堿基配對(duì)關(guān)系的合成產(chǎn)生的類似物。能形成堿基配對(duì)關(guān)系的非天然堿基的實(shí)例包括但不限于氮雜和脫氮嘧啶類似物、氮雜和脫氮嘌呤類似物以及其它雜環(huán)堿基類似物，其中嘌呤和嘧啶環(huán)的一個(gè)或多個(gè)碳原子和氮原子已經(jīng)被雜原子如氧、硫、硒、磷等取代。
本文所用術(shù)語“核酸主鏈”指連接分子中核苷酸的化學(xué)部分的結(jié)構(gòu)。這可以包括由任何方式的化學(xué)連接核苷酸形成的結(jié)構(gòu)。本文所用的修飾主鏈包括對(duì)核苷酸間化學(xué)鍵的修飾，以及可用于增強(qiáng)穩(wěn)定性和親合性的其它修飾，如對(duì)糖結(jié)構(gòu)的修飾。例如可以使用脫氧核糖的[α]-異頭物，其中堿基相對(duì)于天然[β]-異頭物是反向的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，糖基的2′-OH可以改變成2′-O-烷基或2′-O-烷基-n(O-烷基)，其提供了對(duì)降解的抗性而不影響親合性。
本文使用的術(shù)語“寡核苷酸”指含約1到約100個(gè)核苷酸、更優(yōu)選1到80個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選約4到約35個(gè)核苷酸的核酸分子。
本發(fā)明的反義寡核苷酸化合物還包括siRNA(小干擾RNA)和由于RNAi(RNA干擾)方法而含有它們的RISC(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)。RNA干擾(RNAi)方法最近已有描述，被認(rèn)為是抑制靶基因表達(dá)的新工具。幾年前就已經(jīng)知曉，RNAi基于低等真核生物中的古老抗病毒防御機(jī)制。它由雙鏈RNA誘導(dǎo)，雙鏈RNA被加工成21-23 nt的小干擾RNA(siRNA)，其在RISC復(fù)合物幫助下與單鏈形式靶mRNA雜交后引起同源的內(nèi)源mRNA降解。RNAi的工作方式仍未完全闡明，但其已在廣泛的真核生物物種如線蟲、蠅、植物、真菌和哺乳動(dòng)物中用作產(chǎn)生功能喪失表型的首選方法。
本發(fā)明的反義寡核苷酸化合物還包括核酶以及單鏈或雙鏈的RNA或DNA的短核苷酸序列，其可以摻入如上所述的化學(xué)修飾，能體外和/或體內(nèi)抑制基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
術(shù)語“修飾的寡核苷酸”和“修飾的核酸分子”包括例如已通過插入或缺失1個(gè)或多個(gè)堿基而被修飾但對(duì)其活性沒有顯著不利作用的反義寡核苷酸化合物。具體地說，一般可在與它們針對(duì)的基因具有100％互補(bǔ)性的寡核苷酸末端實(shí)施堿基的加入或缺失，而不顯著喪失抑制活性?？蓪?shí)施這樣的修飾，以便增加寡核苷酸活性或提供增強(qiáng)的寡核苷酸穩(wěn)定性。另外，還可在本發(fā)明的反義寡核苷酸化合物中實(shí)施1個(gè)或多個(gè)堿基的置換，而對(duì)活性沒有不利作用，例如用另一個(gè)嘌呤(腺嘌呤、鳥嘌呤)置換嘌呤，以及用嘧啶(胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)置換嘧啶。本文使用的修飾的寡核苷酸和修飾的核酸分子還包括含寡核苷酸在內(nèi)的核酸，其在所有或任意的核酸堿基、糖部分、核苷間磷酸鍵的天然分子結(jié)構(gòu)的分子水平上具有一個(gè)或多個(gè)化學(xué)修飾，以及包括具有附加取代基(如二胺、膽甾基或其它親脂性基團(tuán))的分子，或在這些位點(diǎn)的修飾的組合。核苷間磷酸酯鍵可以是磷酸二酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲酯、乙酰胺酯、氨基甲酸酯、硫醚、橋聯(lián)氨基磷酸酯(phosphoranidate)、橋聯(lián)亞甲基磷酸酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、二硫代磷酸酯、橋聯(lián)硫代磷酸酯和/或砜核苷間鍵，或3′-3′、2′-5′或5′-5′鍵，以及這些相似鍵的組合(產(chǎn)生混合的主鏈修飾的寡核苷酸)。修飾可以在寡核苷酸分子的內(nèi)部(單個(gè)的或重復(fù)的)或在末端，并且可以包括加到核苷間磷酸酯鍵的分子上，如膽甾基、在氨基之間具有不同數(shù)目碳?xì)埢亩坊衔镆约澳┒撕颂?、脫氧核糖和磷酸酯修飾，所述修飾切割或交?lián)到相對(duì)鏈或締合的酶或其它蛋白。親電基團(tuán)如核糖二醛可以與這種蛋白的賴氨酰殘基的ε-氨基共價(jià)連接。親核基團(tuán)如束縛至寡聚物的n-乙基馬來酰亞胺可共價(jià)連接到mRNA的5′端或另一個(gè)親電位點(diǎn)。術(shù)語修飾的寡核苷酸還包括含有糖部分修飾的寡核苷酸，例如2′-取代的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸單體，任何它們通過5′-3′鍵連接在一起。修飾的寡核苷酸還可以由PNA或嗎啉代修飾的主鏈組成，其中序列的靶特異性得以保持。術(shù)語修飾的寡核苷酸還包括如本文定義的寡核苷酸化合物，其形式不顯著地不利影響反義寡核苷酸降低靶蛋白活性或抑制靶蛋白表達(dá)的能力，但其可增強(qiáng)該活性。
修飾的寡核苷酸還包括基于阿糖核苷酸或修飾的阿糖核苷酸殘基或由其構(gòu)建的寡核苷酸，包括但不限于基于β-阿拉伯呋喃糖及其類似物的反義寡核苷酸構(gòu)建物。阿糖核苷酸是核糖核苷酸的立體異構(gòu)體，差別僅在于糖環(huán)2′-位的構(gòu)型。Damha等(1)的PCT申請(qǐng)?zhí)朩O99/67378公開了阿糖核酸(ANA)寡聚物及其類似物，它們通過結(jié)合互補(bǔ)信使RNA提升了對(duì)基因表達(dá)的序列特異性抑制，該文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。Dahma等進(jìn)一步教導(dǎo)了糖被修飾的寡核苷酸，其與其靶RNA序列形成雙鏈體，產(chǎn)生RNA酶H的底物。具體地說，公開了包括β-D-阿糖核苷酸和2′-脫氧-2′-氟代-β-D-阿糖核苷的寡聚物。也是Dahma等(2)的PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 02/20773公開了用于以序列特異性方式抑制基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的寡核苷酸嵌合體，該文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。具體地說，Dahma等(2)教導(dǎo)了由阿糖核苷酸構(gòu)建的反義寡核苷酸，其位于一系列長度可變的脫氧核糖核苷酸殘基的側(cè)翼。如此構(gòu)建的反義寡核苷酸用于雜交和誘導(dǎo)切割互補(bǔ)RNA。也是Dahma等(3)的PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 03/037909公開了具有內(nèi)部無環(huán)連接殘基的寡核苷酸，該文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。用無環(huán)連接基團(tuán)制備的反義寡核苷酸用于阻止或削弱目標(biāo)靶核酸如RNA的功能。也是Dahma等(4)的PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 03/064441公開了具有糖被修飾的核苷和2′-脫氧核苷的交替節(jié)段、并還具有糖被修飾的核苷酸和2′-脫氧核苷酸的交替節(jié)段的寡核苷酸，該文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。公開了具有這些交替節(jié)段的反義寡核苷酸，用于阻止或削弱目標(biāo)靶核酸如RNA的功能。
術(shù)語“基本抗核酸酶的”指與天然或未修飾的核酸相比抗核酸酶降解的核酸。本發(fā)明的修飾核酸的核酸酶降解抗性是其未修飾對(duì)應(yīng)物的至少1.25倍，更優(yōu)選是其未修飾對(duì)應(yīng)物抗性的至少2倍，甚至更優(yōu)選是其未修飾對(duì)應(yīng)物抗性的至少5倍，最優(yōu)選是其未修飾對(duì)應(yīng)物抗性的至少10倍。這種基本抗核酸酶的核酸包括但不限于具有修飾主鏈的核酸，所述修飾主鏈如硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、乙基磷酸三酯、2′-O-甲基硫代磷酸酯、2′-O-甲基-對(duì)-乙氧基核糖核苷酸、2′-O-烷基、2′-O-烷基-n(O-烷基)、3′-O-烷基、3′-O-烷基-n(O-烷基)、2′-氟、2′-脫氧-赤戊呋喃糖基、2′-O-甲基核糖核苷、氨基甲酸甲酯、碳酸甲酯、反向堿基(如反向T)或這些主鏈的嵌合形式。
本文使用的術(shù)語“CCR3受體和IL-3/IL-5/GM-CSF受體的共同β鏈的反義寡核苷酸”各自指分別靶向序列的寡核苷酸，所述序列影響CCR3趨化因子受體和IL-3/IL-5/GM-CSF受體的共同β鏈的表達(dá)和/或活性。這些寡核苷酸包括但不限于CCR3趨化因子受體和IL-3/IL-5/GM-CSF受體的共同β鏈、DNA編碼序列、DNA啟動(dòng)子序列、DNA增強(qiáng)子序列、mRNA編碼序列等。
如上所述，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供靶向序列的反義寡核苷酸，該序列影響CCR3趨化因子受體和IL-3/IL-5/GM-CSF受體的共同β鏈的表達(dá)和/或活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸可包含這些序列的片段或變體，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，所述片段或變體可改變寡核苷酸組成和/或長度，但保持或增加寡核苷酸下調(diào)基因表達(dá)的活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供至少兩個(gè)反義寡核苷酸的組合，所述兩個(gè)反義寡核苷酸來自鑒別為SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14的序列。
本文所用術(shù)語“處理”、“治療”、“療法”等一般表示獲得期望的藥理和/或生理作用。這種作用可以是預(yù)防性的，即完全或部分預(yù)防疾病或其癥狀，和/或可以是治療性的，即部分或完全治愈疾病和/或減輕疾病引起的不利作用。本文所用“處理”涵蓋對(duì)如先前定義的對(duì)象中疾病的任何處理，所述對(duì)象尤其是人，包括(a)預(yù)防對(duì)象發(fā)生疾病，所述對(duì)象可能容易發(fā)生該疾病但仍未診斷為具有該疾??；(b)抑制疾病，即停止其發(fā)展；或(c)緩解疾病，即引起疾病消退。
術(shù)語“藥物可接受的”在本文中用于載體、表面活性劑和組合物時(shí)表示可接受用于治療患者對(duì)象的物質(zhì)，所述物質(zhì)無毒或?qū)τ谕ㄟ^本文所述任何途徑給予來說不是不可接受的。
本發(fā)明一般涉及通過給予治療有效量的本發(fā)明反義寡核苷酸化合物而治療對(duì)象，所述化合物包括siRNA、核酶、單鏈或雙鏈的短核苷酸序列，包括可與靶核酸互補(bǔ)或可任選地如上所述修飾的RNA和/或DNA；具有所述RNA寡核苷酸的至少一部分的RNA寡核苷酸，所述RNA寡核苷酸能與RNA雜交形成寡核苷酸-RNA雙鏈體；或嵌合寡核苷酸，它們將下調(diào)或抑制內(nèi)源性基因體內(nèi)表達(dá)。
所述“治療有效”量指無毒性但足以提供期望治療效果的反義寡核苷酸化合物的量。在此情況下，該劑量的反義寡核苷酸化合物有效緩解、改善、或預(yù)防待治療病癥或疾病(如與變態(tài)反應(yīng)、哮喘、炎性疾病如炎性呼吸道疾病相關(guān)的疾病)的癥狀。
本文使用的術(shù)語“變態(tài)反應(yīng)”描述了機(jī)體對(duì)物質(zhì)的任何不期望的免疫應(yīng)答，機(jī)體對(duì)所述物質(zhì)已變成超敏性的。
本發(fā)明的制劑優(yōu)選直接給予作用部位，因此優(yōu)選是局部制劑，包括但不限于口服、頰內(nèi)、肺內(nèi)、直腸、子宮內(nèi)、腫瘤內(nèi)、經(jīng)鼻、鞘內(nèi)、可吸入、透皮、皮內(nèi)、腔內(nèi)、離子導(dǎo)入、經(jīng)眼、陰道、關(guān)節(jié)內(nèi)、經(jīng)耳、經(jīng)粘膜、直腸、緩釋或腸溶包衣制劑。不限于任何前述制劑，本發(fā)明的制劑還可為顱內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、血管內(nèi)、腺體內(nèi)、器官內(nèi)、淋巴內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)和可植入制劑。用于制劑的載體可以是例如固體和/或液體載體。
對(duì)于應(yīng)適于與本發(fā)明的寡核苷酸化合物組合，以使組合物/制劑適于給予來治療呼吸系統(tǒng)疾病的其它載體，可以參考“Remington′sPharmaceutical Sciences”，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1985。
任選地，當(dāng)前描述的寡核苷酸可與各種生理載體分子配制。當(dāng)前描述的寡核苷酸還可與增強(qiáng)其進(jìn)入靶細(xì)胞的能力的分子復(fù)合。這種分子的實(shí)例包括但不限于糖、聚胺、氨基酸、肽、脂質(zhì)和對(duì)細(xì)胞生長不可或缺的分子。例如，寡核苷酸可與脂質(zhì)組合，產(chǎn)生的寡核苷酸/脂質(zhì)乳濁液或脂質(zhì)體懸浮液尤其可有效增加寡核苷酸的體內(nèi)半壽期。
本文提供的藥物組合物可包含上述反義寡核苷酸化合物和一種或多種藥物可接受的表面活性劑。增強(qiáng)本發(fā)明的反義寡核苷酸吸收的適宜表面活性劑或表面活性劑成分先前已描述于美國申請(qǐng)公開第2003/0087845號(hào)，該申請(qǐng)中關(guān)于表面活性劑的內(nèi)容結(jié)合到本文中。該申請(qǐng)?zhí)岢?，合適的表面活性劑“...包括合成和天然以及全長和截短形式的表面活性蛋白A、表面活性蛋白B、表面活性蛋白C、表面活性蛋白D、表面活性蛋白E、二飽和磷脂酰膽堿(除了二棕櫚酰以外)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、泛醌、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰膽堿、棕櫚酰溶血磷脂酰膽堿、脫氫表雄酮、多萜醇、硫苷脂酸(sulfatidic acid)、甘油-3-磷酸、磷酸二羥基丙酮、甘油、甘油-3-磷酸膽堿、二羥基丙酮、棕櫚酸、胞嘧啶二磷酸(CDP)二?；视?、CDP膽堿、膽堿、磷酸膽堿；以及天然和人工片狀體，它們是以下表面活性劑成分的天然載體溶媒ω-3脂肪酸、多烯酸(polyenicacid)、多烯酸(polyenoic acid)、卵磷脂、棕櫚酸、環(huán)氧乙烷或環(huán)氧丙烷的非離子性嵌段共聚物、單體和多聚體形式的聚氧丙烯、單體和多聚體形式的聚氧乙烯、具有右旋糖酐和/或烷?；鶄?cè)鏈的聚(乙烯胺)、Brij35TM、Triton X-100TM和合成表面活性劑ALECTM、ExosurfTM、SurvanTM和AtovaquoneTM等。這些表面活性劑可作為制劑中的單一表面活性劑或多組分表面活性劑的一部分使用，或作為對(duì)反義寡核苷酸的5′和/或3′末端的共價(jià)結(jié)合添加物使用?！北景l(fā)明組合物的反義組分可包含在脂質(zhì)顆?；蚰遗?如脂質(zhì)體或微晶)中的藥用制劑中。如美國專利6,025,339所述，脂質(zhì)顆?？梢允侨魏魏线m的結(jié)構(gòu)，如單層或多層，只要所述反義寡核苷酸包含于其中。帶正電的脂質(zhì)如乙基硫酸N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基銨或“DOTAP”，對(duì)于這樣的顆粒和囊泡是特別優(yōu)選的。這種脂質(zhì)顆粒的制備是公知的。參見例如Janoff等的美國專利第4,880,635號(hào)、Kurono等的4,906,477號(hào)、Wallach的4,911,928號(hào)、Wallach的4,917,951號(hào)、Allen等的4,920,016號(hào)、Wheatley等的4,921,757號(hào)；等等。
本發(fā)明的組合物可以用運(yùn)輸反義寡核苷酸化合物到期望部位如肺的任意方式給予。本文公開的反義化合物可通過任何合適的方式給予患者的肺，但優(yōu)選通過氣溶膠吸入給予，所述氣溶膠由包含反義化合物的可呼吸顆粒組成。
本發(fā)明的組合物可以作為包含可呼吸大小的顆粒的制劑給予呼吸系統(tǒng)，例如顆粒大小小到足以在吸入時(shí)通過鼻、口和咽喉并穿過肺的支氣管和肺泡。一般來說，可呼吸顆粒大小范圍在約0.5到10微米之間。包含在氣溶膠中的不可呼吸大小的顆粒傾向于沉積在咽喉并被吞咽，因此氣溶膠中不可呼吸顆粒的量優(yōu)選最少化。對(duì)于經(jīng)鼻給予，優(yōu)選10-500微米(μM)范圍的顆粒大小，以確保保留在鼻腔中。
可以通過將反義化合物與合適的溶媒如無菌無熱源水或磷酸緩沖鹽水混合，制備用于產(chǎn)生氣溶膠的活性化合物(反義寡核苷酸化合物)的液體藥物組合物。
含反義化合物的固體顆粒組合物可以任選含有用于輔助形成氣溶膠的分散劑以及其它治療性化合物。合適的分散劑是乳糖，它可以與反義化合物以任意合適的比例混合，如1∶1的重量比。
反義組合物可以抗支氣管收縮、抗變態(tài)反應(yīng)和/或抗炎有效量給予，該量取決于待治療疾病的程度、患者對(duì)象的身體狀況、具體制劑、給藥途徑、向?qū)ο蠼o藥的時(shí)間安排等。一般來說，期望寡核苷酸細(xì)胞內(nèi)濃度是0.05-50μM，或更具體的0.2-5μM。對(duì)于向哺乳動(dòng)物患者如人給藥，一般使用約0.001、0.01、0.1或1mg/Kg直至約50或100mg/Kg或更多的劑量。但是，也考慮了其它劑量。根據(jù)活性化合物在任何具體制劑中的溶解性，每日劑量可以分成一個(gè)或幾個(gè)單位劑量給予。
含反義化合物的液體顆粒的氣溶膠可通過任意合適的手段產(chǎn)生，如用噴霧器。噴霧器是通過使壓縮氣體(通常是空氣或氧氣)加速通過狹窄的文丘里噴嘴或者經(jīng)超聲攪動(dòng)的方式，將活性成分的溶液或懸液轉(zhuǎn)化成治療性氣溶膠霧的商品裝置。用于噴霧器的合適制劑包含在液體載體中的活性反義寡核苷酸成分，其量可達(dá)制劑的40％(重量/重量)，優(yōu)選少于制劑的20％(重量/重量)。載體一般是水或稀的醇水溶液，優(yōu)選通過加入例如氯化鈉而與體液等滲。任選的添加劑包括防腐劑如羥基苯甲酸甲酯(如果制劑不是無菌制備的話)、抗氧化劑、抗細(xì)菌劑、調(diào)味劑、揮發(fā)性油、緩沖劑和乳化劑以及其它的制劑表面活性劑。
包含活性寡核苷酸化合物和藥物可接受表面活性劑的固體顆粒氣溶膠同樣可用任何固體顆粒藥物氣溶膠發(fā)生器產(chǎn)生。用于向?qū)ο蠼o予固體顆粒藥物的氣溶膠發(fā)生器產(chǎn)生可呼吸的顆粒(如上所釋)，并以適于人給藥的速率產(chǎn)生一定體積的氣溶膠，其中含預(yù)定計(jì)量的藥物劑量。活性寡核苷酸成分一般占制劑的0.1-100重量/重量。第二類示例性氣溶膠發(fā)生器包括計(jì)量劑量吸入器。計(jì)量劑量吸入器是加壓氣溶膠分散器，一般含有活性成分在液化推進(jìn)劑中的懸液或溶液制劑。使用時(shí)這些裝置通過適用于遞送計(jì)量體積(一般為10-150μL)的閥門釋放制劑，以產(chǎn)生含活性成分的細(xì)顆粒噴霧。合適的推進(jìn)劑包括某些氯氟碳化合物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或氫氟烷及其混合物。制劑還可以含有一種或多種助溶劑(如乙醇)、乳化劑和其它制劑表面活性劑(如油酸或失水山梨醇三油酸酯)、抗氧化劑和合適的調(diào)味劑。
無論是由固體還是液體顆粒形成的氣溶膠，都可通過氣溶膠發(fā)生器以約1-150升/分鐘的速率產(chǎn)生。
在本發(fā)明的再一方面，提供一種制品，它包括包裝材料，包裝材料內(nèi)含有藥物可接受的反義寡核苷酸組合物，該組合物治療學(xué)有效地治療與變態(tài)反應(yīng)、哮喘、鼻炎和炎癥疾病相關(guān)的病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含可有效抑制CCR3趨化因子受體基因或IL-3/IL-5/GM-CSF受體的共同β鏈基因的反義寡核苷酸化合物，所述寡核苷酸化合物與該基因至少50％互補(bǔ)。在另一方面，組合物包含至少兩種反義寡核苷酸化合物，反義寡核苷酸化合物各自能下調(diào)CCR3趨化因子受體和IL-3/IL-5/GM-CSF受體基因的共同β鏈，每種反義寡核苷酸化合物的存在濃度使得反義寡核苷酸化合物單獨(dú)使用時(shí)實(shí)際上不能有效下調(diào)所針對(duì)基因，而反義寡核苷酸化合物的組合有效下調(diào)反義寡核苷酸所針對(duì)基因中的至少一種。
在一個(gè)實(shí)施方案中，制品的包裝材料包含標(biāo)簽，它指示組合物可用于治療炎癥呼吸系統(tǒng)疾病，并可另外包括所述疾病是變態(tài)反應(yīng)、鼻炎和哮喘之一的說明。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，制品的包裝材料包含標(biāo)簽，它指示組合物可用于治療炎性呼吸系統(tǒng)疾病，并可另外包括所述疾病是變態(tài)反應(yīng)、哮喘、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、支氣管炎、鼻炎或竇炎之一的說明。
對(duì)于本發(fā)明目的，包裝材料可以是包裝本發(fā)明的含核苷酸組合物的任何適宜材料，包括瓶或其它容器(塑料或玻璃)、紙盒、管或其它保護(hù)性包裝材料。人們將會(huì)意識(shí)到，包裝可以根據(jù)寡核苷酸組合物的性質(zhì)而變化，例如液體制劑可以不同于氣溶膠制劑的形式包裝。
參考實(shí)施例將更容易理解本發(fā)明，給出這些實(shí)施例是為了闡述以下的本發(fā)明，而不是限制其范圍。就這些實(shí)施例而言，使用以下的方法和材料。
實(shí)施例材料和方法材料實(shí)驗(yàn)使用以下的材料和試劑RPMI 1640(Wisent，目錄號(hào)10040CV)；FBS(胎牛血清，Wisent，目錄號(hào)80150)；青霉素-鏈霉素(GIBCO，目錄號(hào)15140-122)；HEPES(Wisent，目錄號(hào)26060CI)；L-谷氨酰胺(Gibco，目錄號(hào)25030-081)；丙酮酸鈉(Wisent，目錄號(hào)25000-Ci)；無菌PBS(GIBCO，目錄號(hào)25030-081)；Hanks平衡鹽溶液(HBSS，cellgro，目錄號(hào)20021-cv)；RT-PCR試劑盒的Superscript首鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen，目錄號(hào)11904-018)；dNTP(Invitrogen，目錄號(hào)10297-018；oligo(dT)12-18(Invitrogen，目錄號(hào)11904-018)；Qiagen RNAeasy Mini Kit(Qiagen，目錄號(hào)74106)；Qiagen凝膠提取試劑盒(Qiagen，目錄號(hào)28704)；Qiagen PCR提取試劑盒(Qiagen，目錄號(hào)28104)；β-巰基乙醇(Sigma，目錄號(hào)M-6250)；99％乙醇(Commercial alcohols Inc.，Brampton，Ontario，Canada)；QiaVac 24 Manifold(Qiagen，目錄號(hào)19403)；一次性Vacconnectors(Qiagen，目錄號(hào)19407)；DNase I試劑盒(Fermentas；目錄號(hào)ENO521)；RiboGreen定量試劑(Invitrogen-IMolecular probes，目錄號(hào)R-11490)；Taq PCR核心試劑盒(Qiagen，目錄號(hào)201223)；Hema-3染色套裝(Fisher scientific Co.目錄號(hào)122-911，批號(hào)999901)；Alamar Blue(Biosource，目錄號(hào)DAL1100)；人CCR3引物對(duì)(R&D systems，目錄號(hào)RDP-209-025)；人GAPE5H引物對(duì)(R&Dsystems，目錄號(hào)RDP-39-025)；Ficoll(Amersham Biosciences；目錄號(hào)17-1440-03)；抗-CD16(嗜酸性粒細(xì)胞純化試劑盒，Miltenyi Biotec，Auburn，CA，目錄號(hào)130-045-701)；rhEotaxin(Biosource，目錄號(hào)PMC1434)；趨化室和膜(NeuroProbe，Nucleopore-Neuroprobe，CabinJohn，MD)；人血清白蛋白(SIGMA；目錄號(hào))；抗人IL-3/IL-5/GM-CSF受體β鏈(小鼠單克隆IgG2b；Santa Cruz Biotechnology，目錄號(hào)sc-457)；抗小鼠IgG2b(山羊單克隆，Alexa Fluor 488，Molecular Probes，目錄號(hào)A-21141)；抗人CCR3抗體(大鼠單克隆，IgG2a，R&D，目錄號(hào)MAB 155)；抗大鼠IgG(山羊單克隆，Alexa Fluor 633，Molecular Probes，目錄號(hào)A-21094)；rhGM-CSF(R&D systems，目錄號(hào)215-GM-005)；rhIL-3(R&D systems，目錄號(hào)203-IL-010)；rhIL-5(R&D systems，目錄號(hào)205-IL-005)；rhIL-2(R&D systems，目錄號(hào)202-IL-010)；TOP004-(n-1)(Biosource，在3′末端少一個(gè)核苷酸的寡核苷酸)；TOP005-(n-1)(Biosource，在3′末端少一個(gè)核苷酸的寡核苷酸)；TOP004-TP(Biosource，模板探針)；TOP004-(n-1-TP-T)(BiosourceBiosource，模板探針)；LP(Biosource，連接探針)；TOP005-TP(Biosource)；TOP004-(n-1-LP-A，Biosource)；Reacti-Bind中性抗生物素蛋白包被的高結(jié)合量平板(Pierce，目錄號(hào)15508)；T4 DNA連接酶5 U/mL(Roche，目錄號(hào)799 009)；抗DIG-AP抗體(Roche，目錄號(hào)1093274)；SuperBlock Blocking Buffer in PBS(Pierce，目錄號(hào)37515)；磷酸甲基傘形酯(methylumbellyferyl phosphate)堿性磷酸酶底物(Molecular Probes，目錄號(hào)M-6491)；含ASM8的猴血漿樣品；MW96板清洗器(Beckman Coulter)；96-孔大容量聚丙烯板(Nunc)；EppendorfResearch Brand的微量移液器；黑色不透明96-孔板(Costar，目錄號(hào)3915)。
反義寡核苷酸合成和序列鑒別用Gene Assembler-PlusTM(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ，USA)合成寡核苷酸，硫代磷酸酯化，并通過HPLC純化。TOP005用于圖5-7中闡述的實(shí)驗(yàn)，所述實(shí)驗(yàn)用cGMP寡核苷酸實(shí)施。反義序列和鑒別描述于表1。
表1
細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)使用以下的細(xì)胞系TF-1(人紅白血病細(xì)胞系，ATCC#CRL-2003)；EOL-1(人急性骨髓“嗜酸性”白血病細(xì)胞系；DSMZ#ACC386)和U937(人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系；ATCC#CRL-1593.2)。EOL-1和U937在具有2mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氫鈉、4.5g/L葡萄糖、10mM Hepes、1mM丙酮酸鈉、10％FBS、青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL的RPMI 1640中培養(yǎng)。TF-1培養(yǎng)使用相同培養(yǎng)基，只是以2ng/mL加入rhGM-CSF。
HL-60克隆15細(xì)胞培養(yǎng)和分化如Tiffany等，1998，J.Immunol 1601385-1392所述，將HL-60克隆15分化為嗜酸性粒細(xì)胞。簡單地講，早幼粒細(xì)胞細(xì)胞系HL-60于37℃和5％CO2中保持在具有L-谷氨酰胺、補(bǔ)加10％熱失活FBS和25mM N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[2-羥基丙磺酸](Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的RPMI 1640，pH 7.6中。通過用0.5μM丁酸(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)處理細(xì)胞至少5天，誘導(dǎo)細(xì)胞分化為嗜酸性粒細(xì)胞樣表型。在細(xì)胞分化后使用FACS分析評(píng)價(jià)IL-3/IL-5/GM-CSF受體的共同β鏈的存在情況。
細(xì)胞生存和反義處理使用Alamar Blue測試按照生產(chǎn)商的方法系統(tǒng)地測定細(xì)胞生存。通過離心(5分鐘、1500RPM，室溫)收集EOL-1、TF-1、HL-60或U937細(xì)胞，用3×HBSS清洗，以1×106細(xì)胞/mL重懸浮在無血清的RPMI培養(yǎng)基中。一式三份將1×106細(xì)胞與精確濃度的反義物(0-20μM)在無菌細(xì)管中溫育5分鐘。然后將各個(gè)反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到12孔平板中，于37℃、5％CO2中溫育5小時(shí)，用于mRNA定量，或溫育12小時(shí)，用于蛋白分析。加入RPMI/FBS 20％至10％FBS的終濃度，細(xì)胞于37℃、5％CO2中溫育過夜。離心(5分鐘、1500RPM，室溫)收集細(xì)胞，用1×HBSS清洗。納入對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其由沒有反義寡核苷酸或存在錯(cuò)配寡核苷酸的細(xì)胞處理組成。
人嗜酸性粒細(xì)胞的純化通過Ficoll-Hypaque梯度(1.077g/mL，350g，30分鐘)離心全血，獲得棕黃層，由此獲得粒細(xì)胞分離級(jí)分。用抗CD16包被的免疫磁性微珠于4℃使用磁性細(xì)胞分揀系統(tǒng)Miltenyi Biotec(Auburn，CA)通過負(fù)選擇進(jìn)一步純化人嗜酸性粒細(xì)胞。通過Giemsa染色估計(jì)嗜酸性粒細(xì)胞群的純度一般為92％-100％。
人和獼猴PBMC的純化獼猴的新鮮血得自ITR Laboratories Canada Inc。通過對(duì)正常供體的EDTA K3血液進(jìn)行Ficoll-Hypaque密度梯度離心，分離PBMC。將PBMC以2×106細(xì)胞/mL/孔接種在12孔平板中的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基補(bǔ)加10％熱失活FBS、青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL。細(xì)胞生存使用Alamar Blue評(píng)價(jià)，一般為85％-95％。
人PBMC和嗜酸性粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染通過離心(5分鐘、1500RPM，室溫)收集人PBMC，用3×HBSS清洗，以2×106細(xì)胞/mL重懸浮在含10μg/mL PHA的RPMI培養(yǎng)基5％血清中。以一式三份將2×106細(xì)胞與精確濃度的反義物(0-20μM)在無菌細(xì)管中溫育5分鐘。然后將各個(gè)反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到12孔平板中，于37℃、5％CO2中溫育過夜，用于mRNA定量，或溫育48小時(shí)或48小時(shí)以下(在指明時(shí))，用于蛋白分析。通過離心(5分鐘、1500RPM，室溫)收集細(xì)胞，用1×HBSS清洗。納入對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其由在沒有反義寡核苷酸或存在錯(cuò)配寡核苷酸的細(xì)胞處理組成。
通過離心(5分鐘、1500RPM，室溫)收集純化的人嗜酸性粒細(xì)胞，用3×HBSS清洗，以2.5×106細(xì)胞/mL重懸浮在2ng/mL rhGM-CSF或rhIL-5的RPMI培養(yǎng)基10％血清中過夜。第二天，用HBSS清洗細(xì)胞兩次，以2.5×106細(xì)胞/mL重懸浮在RPMI培養(yǎng)基5％血清中，一式三份與精確濃度的反義物(0-20μM)在無菌細(xì)管中溫育5分鐘。然后將各個(gè)反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到12孔平板中，于37℃、5％CO2中溫育過夜，用于mRNA定量，或溫育48小時(shí)或48小時(shí)以下(在指明時(shí))，用于蛋白分析。通過離心(5分鐘、1500RPM，室溫)收集細(xì)胞，用1×HBSS清洗。納入對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其由在沒有反義寡核苷酸或存在錯(cuò)配寡核苷酸的細(xì)胞處理組成。
猴PBMC轉(zhuǎn)染通過離心(5分鐘、1500RPM，室溫)收集獼猴PBMC，用3×HBSS清洗，以2×106細(xì)胞/mL重懸浮在RPMI培養(yǎng)基5％血清和10μg/mLPHA(或10ng/mL rhIL-2，在指明時(shí))中。以一式三份將2×106細(xì)胞與精確濃度的反義物(0-20μM)在無菌細(xì)管中溫育5分鐘。然后將各個(gè)反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到12孔平板中，于37℃、5％CO2中溫育過夜，用于mRNA定量，或溫育48小時(shí)或48小時(shí)以下(在指明時(shí))，用于蛋白分析。通過離心(5分鐘、1500RPM，室溫)收集細(xì)胞，用1×HBSS清洗。納入對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其由在沒有反義寡核苷酸或存在錯(cuò)配寡核苷酸的細(xì)胞處理組成。
流式細(xì)胞術(shù)分析計(jì)數(shù)細(xì)胞，并以1×106細(xì)胞/mL重懸浮。于20-25℃以400×g離心細(xì)胞3分鐘，廢棄上清液。此后，將細(xì)胞沉淀重懸浮在50μL FACS緩沖液(1×PBS，pH7.2-7.4；0.5％人白蛋白；2.5％人血清)中，37℃溫育30分鐘。不廢棄上清液，將一抗直接加入管中并混合。于4℃避光溫育1小時(shí)，(抗人CCR-3抗體以1μg/0.5×106細(xì)胞使用?？谷斯餐骆溡?μg/0.5×106細(xì)胞使用)。用2mL FACS緩沖液清洗，以400×g離心3分鐘，廢棄上清液。對(duì)于同種型對(duì)照，用300μL FACSFix(1×PBS，pH 7.2-7.4；4％多聚甲醛)重懸浮細(xì)胞沉淀，于4℃避光保持。
為標(biāo)記CCR3和共同β鏈，用50μL FACS緩沖液重懸浮細(xì)胞沉淀，并加入二抗，(抗大鼠IgG2a Alexa Fluor 633以1μg/0.5×106細(xì)胞使用?？剐∈驣gG2b Alexa Fluor 488以2μg/0.5×106細(xì)胞使用)。4℃避光溫育1小時(shí)。用2mL FACS緩沖液清洗，以400×g離心3分鐘，并廢棄上清液。用300μL FACSFix固定標(biāo)記細(xì)胞，于4℃避光保持。數(shù)據(jù)在BD biosciences FACS calibur中分析，用Cell Quest程序處理。
鈣動(dòng)員測定嗜酸性粒細(xì)胞以1×107細(xì)胞/mL重懸浮在含10％FBS的RPMI1640中，通過與5M Fura-2AM(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)于室溫在黑暗中溫育30分鐘而負(fù)載。細(xì)胞(1×106細(xì)胞/mL)清洗3次，重懸浮在鹽水緩沖液(138mM NaCl、6mM KCl、1mM CaCl2、10mMHepes、5mM葡萄糖和1％BSA，pH 7.4)中。然后將各2mL的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至石英比色皿，將石英比色皿置于發(fā)光分光光度計(jì)LS50B(Perkin-Elmer，Beaconsfield，UK)中。通過記錄在趨化因子作用下于340和380nm順序激發(fā)后于510nm發(fā)射的熒光比率，檢測細(xì)胞的Ca2+動(dòng)員。
趨化性測定使用具有5mm孔的無聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜(Nucleopore-Neuroprobe)，在48孔(NeuroProbe，Cabin John，MD)室中評(píng)價(jià)體外趨化性。對(duì)照或反義物處理的嗜酸性粒細(xì)胞以1×106細(xì)胞/mL懸浮在含0.25％BSA的RPMI 1640培養(yǎng)基中。上層孔和下層孔分別含50μL和31μL細(xì)胞懸浮液，后一懸浮液補(bǔ)加優(yōu)化濃度的嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(80ng/mL)。在于37℃、5％CO2中溫育1小時(shí)后，記數(shù)存在于下層孔中的遷移細(xì)胞。在沒有嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的情況下測定自發(fā)遷移，并計(jì)算入結(jié)果中。
猴反義物處理和毒性研究該方法由ITR Laboratories Canada Inc.的動(dòng)物關(guān)懷委員會(huì)(ACC)回顧和評(píng)價(jià)。所有動(dòng)物都按照Canadian Council on Animal Care出版的現(xiàn)行“Guide to the Care and Use of Experimental Animals”和NIH出版物“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”概述的原則照料。
在連續(xù)14天內(nèi)通過每日一次吸入接觸，給予由兩種寡核苷酸(TOP 004和TOP 005)的1∶1混合物組成的ASM8，在此期間研究所述ASM8的毒性，以表征其單個(gè)寡核苷酸組分的毒代動(dòng)力學(xué)模式。還評(píng)價(jià)14天恢復(fù)期后ASM8的任何作用的可逆性。還評(píng)價(jià)14天吸入接觸ASM8后的任何系統(tǒng)性超敏狀況(可通過皮內(nèi)注射(ID)檢測)。
溶媒對(duì)照制品是USP注射級(jí)0.9％氯化鈉溶液，按原樣使用。通過混合TOP 004和TOP 005與USP注射級(jí)0.9％氯化鈉溶液，以獲得1∶1混合物，制備用于氣溶膠化的測試制品(ASM8)的液體制劑。目標(biāo)劑量的溶液濃度基于純寡核苷酸。因此，將根據(jù)純度調(diào)整的校正系數(shù)應(yīng)用于測試制品組分的稱重和分配。對(duì)于TOP 004，校正系數(shù)是1.15，對(duì)于TOP 005，校正系數(shù)是1.24。在14天接觸期開始前，稱出每個(gè)每日接觸所需要的各相應(yīng)寡核苷酸的量，混合(以粉末形式)在設(shè)計(jì)用于每日接觸的小瓶中，于-80℃冷凍儲(chǔ)存。在每日接觸時(shí)，由冷凍儲(chǔ)存中取出正確的小瓶，將內(nèi)容物溶解在鹽水溶媒中，通過無菌0.2μm濾器過濾，制劑僅用于當(dāng)天的接觸。
每組的動(dòng)物數(shù)目和處理陳述于以下的表2和3
表2
體重范圍在第1天處理時(shí)為2-4kg年齡范圍在第1天處理時(shí)為青年表3ASM8接觸濃度和劑量水平(4)
(1)基于估計(jì)的2.5kg體重。
(2)溶媒對(duì)照動(dòng)物接觸由溶媒溶液產(chǎn)生的氣溶膠，其氣溶膠濃度就質(zhì)量而言一般被認(rèn)為等于高劑量組產(chǎn)生的氣溶膠濃度。
(3)目標(biāo)劑量和氣溶膠濃度基于測試制品的絕對(duì)純度，該絕對(duì)純度通過在劑量溶液配制過程中使用純度的合適校正系數(shù)獲得。
(4)使用下式DL＝Ec×RMV×T/BW估測接觸期當(dāng)中獲得的劑量水平，其中DL＝獲得的劑量水平(mg/kg/天)Ec＝傳遞給動(dòng)物的實(shí)際濃度(mg/L空氣)
RMV＝按照Bide等，2000，J.App.Toxicol.，20，273-290的公式估測的分鐘體積(mL/min)，該公式詳細(xì)為RMV(L)＝0.499×W(kg)0.809T＝時(shí)間，每日接觸的持續(xù)時(shí)間(分鐘)BW＝接觸期當(dāng)中的平均體重(kg)假定此估測的所獲劑量100％沉積在呼吸道中。
對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行生命觀測，包括死亡率、臨床檢查、體重、食物消耗、心電圖、檢眼鏡檢查、臨床病理、血漿水平測定、超敏檢驗(yàn)。
在處理期結(jié)束時(shí)，麻醉動(dòng)物，并進(jìn)行解剖病理學(xué)檢驗(yàn)、驗(yàn)尸、器官重量檢驗(yàn)、組織病理學(xué)檢驗(yàn)。
在給予ASM8后24小時(shí)，使用半定量RT-PCR檢測對(duì)高劑量處理獼猴氣管樣品的共同β鏈和CCR3 mRNA表達(dá)是否存在任何的ASM8抑制作用。
用于猴血漿中的寡核苷酸檢測的HL-ELISA在給藥前的第1天和第14天、給藥后的0.5、1、3、6和24小時(shí)由各只動(dòng)物收集猴血樣(各約1mL)。血樣于4℃離心，以產(chǎn)生血漿，分離血漿，在干冰上冷凍，直至使用雜交/連接ELISA定量測定對(duì)TOP004和TOP005(以及近似的n-1-代謝物)濃度進(jìn)行測定分析。
通過連續(xù)稀釋猴血漿樣品制備寡核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。通常標(biāo)準(zhǔn)曲線的工作范圍是125nM至0.007629nM。適當(dāng)稀釋血漿樣品，用于檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，制備一個(gè)以上稀釋度用于精確檢測。
將各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或血漿樣品等份(200μL)分在96孔聚丙烯板中，其中將200μL適宜的模板探針溶液加至200μL血漿樣品中，37℃溫育60分鐘。以一式兩份將150μL轉(zhuǎn)移至NeutrAvidin包被的板，于37℃溫育30分鐘。使用板清洗器用清洗緩沖液清洗該板4次(每次200μL)。加入150μL連接探針溶液，之后于室溫溫育120分鐘。在溫育后，使用板清洗器用清洗緩沖液度清洗樣品2次(每次200μL)，之后使用板清洗器用ddH2O清洗3次(200μL)。加入150μL 1∶2000抗DIG-AP稀釋液(在Super block，Peirce中)，之后于室溫溫育30分鐘。使用板清洗器用清洗緩沖液清洗樣品4次(200μL)。然后加入150μL10μM MUP試劑，接著室溫溫育60分鐘。讀取355ex/485em的熒光。
用于HL-ELISA的溶液模板探針溶液(0.05μM模板探針、60mM Na2HPO4pH 7.4、0.9MNaCl、0.24％Tween-20)；10×連接緩沖液(0.8248M Tris-Cl pH 7.5，0.0828 M MgCl2、1.93％DTT)；ATP 100mM溶液(在水中制備，用NaOH調(diào)節(jié)至pH 7±0.5)；連接探針溶液(在1×連接緩沖液中的0.067μM寡核苷酸、0.025單位/mL T4 DNA連接酶、0.05mM ATP)；清洗緩沖液(25mM Tris-Cl pH 7.2、0.15M NaCl、0.1％Tween)。
猴氣管勻漿和RNA提取使用Polytron PT 1200(Brinkmann Instruments)勻漿猴氣管，使用Qiagen RNAeasy小型試劑盒(Qiagen，Mississauga ON，Canada)提取總RNA，接著進(jìn)行DNA酶I消化。使用Ribogreen熒光測定(InvitrogenCorporation，Burlington ON，Canada)定量總RNA。使用SuperscriptTMIIRT試劑盒(Invitrogen Corporation，Burlington ON，Canada)，使用首鏈cDNA合成由1-2μg RNA制備cDNA。
RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)按照Qiagen RNAeasy小型試劑盒方法，使用Qiagen的QiaVac 24歧管由細(xì)胞沉淀提取RNA，按照Fermentas方法用DNA酶I處理RNA。使用RiboGreen試劑按照生產(chǎn)商的方法定量RNA?；蛘?，使用分光光度計(jì)定量RNA。使用Invitrogen的RT-PCR試劑盒的Superscript首鏈合成系統(tǒng)以20μL總反應(yīng)體積進(jìn)行首鏈cDNA制備。簡單地講，首先于65℃使1-2.5μgRNA和0.5mM的每種dNTP、0.5μg oligo(dT)12-18變性5分鐘，于冰上冷凍至少1分鐘?；旌衔?2℃溫育2分鐘，加入第二種預(yù)混合物，其含有1×首鏈緩沖液、10mMDTT、40單位RNaseOUT和40單位Superscript II RT。反應(yīng)物于42℃溫育10分鐘，于50℃溫育1小時(shí)，通過于70℃加熱15分鐘失活。用在1×PCR緩沖液(10×Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、15mM MgCl2；pH 8.7)中的優(yōu)化量cDNA(對(duì)于CCR3為100-250ng，對(duì)于G3PDH為1-10ng)、0.2mM每種dNTP、8.5pmol每種PCR引物和2.5單位Taq DNA聚合酶以總反應(yīng)體積50μL進(jìn)行PCR。將混合物于94℃加熱5分鐘，接著進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃溫育1分鐘、60℃溫育45秒以及72℃溫育45秒。補(bǔ)充延伸于72℃進(jìn)行10分鐘。在溴化乙錠存在下通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。使用Total Lab軟件(背景扣除采用滾球法；Ultra Lum Inc.，Model UC4800)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的定量。PCR引物是人CCR3引物對(duì)(R&D systems，目錄號(hào)RDP-209-025)；人GAPDH引物對(duì)(R&D systems，目錄號(hào)RDP-39-025)和示于表4的引物。系統(tǒng)性地納入對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其由對(duì)非RT-RNA進(jìn)行的PCR組成。
表4.
寡核苷酸化學(xué)降解為在分析前誘導(dǎo)TOP 004和TOP 005降解(以便確保分辨完整分子和降解產(chǎn)物)，進(jìn)行以下處理*脫嘌呤將ASM8以0.5mg/mL終濃度重懸浮在30％CH3COOH中，于室溫溫育3、4或6小時(shí)。通過加入5體積水終止反應(yīng)，將混合物置于-20℃，然后在Speed-Vac中凍干，以去除乙酸。
*切割將脫嘌呤的寡核苷酸重懸浮在0.2M NaOH(0.5mg/mL)中，于50℃溫育1小時(shí)，儲(chǔ)存在-20℃或通過HPLC分析。
TOP004和TOP005的HPLC分級(jí)分離稱重ASM8，以0.5mg/mL的濃度(0.25mg/mL TOP004和0.25mg/mL TOP005)溶解在PBS中，HPLC梯度參數(shù)示于下表5。
表5.HPLC梯度參數(shù)
用聯(lián)結(jié)Waters 2487 Dualλ吸光度檢測器并配有在線脫氣器、烘箱和1500系列手動(dòng)注射器Reodyne 7725i的Waters 1500系列二元HPLC泵進(jìn)行HPLC分離。寡核苷酸混合物在Waters Protein Pak DEAE5PW陰離子交換柱(0.5cm×75cm)上分級(jí)分離，保持在60℃，通過260nm的UV吸收檢測。寡核苷酸混合物(體積＝25μL)在水中上柱(緩沖液A水(MilliQ級(jí)))，通過逐漸增加緩沖液B(1M LiClO4，(0.22μm過濾))的比例使液相的離子強(qiáng)度增加，由固相(柱)洗脫寡核苷酸，由此進(jìn)行洗脫。
在測定條件下，62.5μg的TOP 004或TOP 005中的任一個(gè)于260nm產(chǎn)生的可檢測變化都＞0.15吸光度單位(AU)。
寡核苷酸儲(chǔ)存將等份的ASM8(0.5mg/mL)的PBS溶液于-20℃、4℃、30℃和40℃溫育2個(gè)月。在第4周和第8周時(shí)建立ASM8的HPLC譜。對(duì)照條件定義為任意儲(chǔ)存時(shí)間前(即時(shí)間0)的ASM8 HPLC譜。HPLC系統(tǒng)由Waters的BreezeTM(V 3.30)軟件驅(qū)動(dòng)。
寡核苷酸解鏈曲線和熱力學(xué)總結(jié)表TOP 004和TOP 005以在1×PBS(以及其它緩沖系統(tǒng))中的等摩爾濃度混合?？偣押塑账釢舛仍诩s1.2-8.7mM的范圍內(nèi)。使用帶有Tm附件的Beckman DU640分光光度計(jì)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)UV熱變性法。在10-90℃的每個(gè)溫度檢測260nm的吸光度變化。使用MELTWINTM3.5軟件擬合解鏈曲線，以測定熱力學(xué)參數(shù)。產(chǎn)生解鏈曲線和熱力學(xué)總表的屏幕圖像。
實(shí)施例1針對(duì)CCR3受體的反義寡核苷酸的效力分析幾種針對(duì)CCR3趨化因子受體的反義寡核苷酸抑制受體mRNA表達(dá)和抑制受體功能的能力。在Eol-1和U937細(xì)胞系中進(jìn)行CCR3反義初級(jí)篩選。這些細(xì)胞在上述正常細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)CCR3mRNA。表6顯示了針對(duì)人CCR3趨化因子受體的反義寡核苷酸。
參看表6，針對(duì)CCR3受體的反義寡核苷酸828(8285′-GTTACTACTTCCACCTGCCTG-3′SEQ ID NO.1)有效抑制受體的mRNA表達(dá)，如表6中所示。
寡核苷酸828針對(duì)CCR3基因，在外顯子1末端后的48個(gè)堿基處開始，21個(gè)堿基長。對(duì)828進(jìn)行BLAST檢索，除了針對(duì)CCR3受體以外，下一個(gè)最接近的同源性報(bào)告為低于72％的同源性。對(duì)獲得兩個(gè)互補(bǔ)序列的完全結(jié)合來說，這被看作是無意義的同源性。使用錯(cuò)配寡核苷酸(SEQ ID NO.32)評(píng)價(jià)828的特異性。錯(cuò)配對(duì)CCR3mRNA或在這些實(shí)驗(yàn)中用作內(nèi)標(biāo)的看家基因G3PDH沒有作用。因此，反義寡核苷酸828是特異性的。
表6
實(shí)施例2兩個(gè)DAP取代的寡核苷酸在猴外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的效力如上所述，通過用DAP置換腺苷修飾反義寡核苷酸107A和828，以分別產(chǎn)生反義寡核苷酸TOP004和TOP005。同107A一樣，TOP004(5′-GGGTCTGCXGCGGGXTGGT-3′(SEQ ID NO.13)，其中X代表腺苷殘基的DAP修飾)是19聚體，針對(duì)IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β鏈。同828一樣，TOP005(5′-GTTXCTXCTTCCXCCTGCCTG-3′(SEQ ID NO.14))是21聚體，針對(duì)趨化因子受體CCR3。
測試TOP004和TOP005這二者單獨(dú)的和組合的效力。ASM8是部分含TOP004和TOP005這二者的組合物。在猴外周血單核細(xì)胞(PBMC)中進(jìn)行效力研究，以驗(yàn)證該物種研究由ASM8藥理學(xué)活性產(chǎn)生的毒性作用潛力的用途。
為使ASM8在獼猴中有效，其與其靶序列必須存在足夠的同源性。獼猴β鏈序列不能由公開的數(shù)據(jù)庫獲得，因此克隆并測序包含TOP004序列區(qū)的節(jié)段。但是，可在相關(guān)的體外系統(tǒng)中直接評(píng)價(jià)靈長類物種間的TOP004活性。具體地說，外周血單核細(xì)胞(PBMC)制備物是測試TOP004功能性的合適系統(tǒng)，因?yàn)樵诖蟛糠謫魏税准?xì)胞亞群(T和B細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上發(fā)現(xiàn)了共同β鏈。
僅可獲得獼猴CCR3受體編碼區(qū)的序列信息；在公開的數(shù)據(jù)庫中不能獲得TOP005結(jié)合區(qū)的序列信息。TOP005靶序列在人基因外顯子1末端后的48個(gè)堿基處開始；此內(nèi)含子跨越超過20kbp，使其克隆和測序變得很冗長。文獻(xiàn)中的報(bào)告已表明，內(nèi)含子序列中的某些節(jié)段在人和猴之間是保守的(Rahman等，2004.Genomics.8376-84)。進(jìn)化研究也表明，在分類群(人、鯨和海豹)間存在同源內(nèi)含子序列的節(jié)段，發(fā)現(xiàn)這些節(jié)段更經(jīng)常地鄰近內(nèi)含子-外顯子接合處(HareMP和Palumbi SR.，2003 Mol Biol Evol.20，969-978.)。在PBMC制備物中測試TOP005在猴中的功能性，其中在T和B細(xì)胞亞群上存在CCR3受體表達(dá)。
獼猴共同β鏈的測序人、黑猩猩、豬、小鼠和大鼠的IL3/IL-5/GM-CSF受體基因的共同β鏈的分析揭示，在脊椎動(dòng)物間有高度的基因序列相似性。設(shè)計(jì)用于克隆PCR的引物序列。引物序列來源于在人、黑猩猩、豬、小鼠和大鼠中高度保守的核苷酸序列，它們在共同β鏈基因的TOP004寡核苷酸區(qū)周圍。表2顯示了不同的引物。這些引物用于擴(kuò)增獼猴PBMC cDNA的特異性產(chǎn)物。獲得幾種PCR產(chǎn)物，這取決于使用的引物組。使用嵌套PCR循環(huán)評(píng)價(jià)獲得產(chǎn)物的特異性?？寺〔y序陽性擴(kuò)增子。
圖1A顯示了得自獼猴TOP004區(qū)的PCR擴(kuò)增的3個(gè)克隆(分別為SEQ ID NO.25、26和27)的序列，其與人序列(SEQ ID NO.28)和黑猩猩(SEQ ID NO.33)、豬(SEQ ID NO.34)、大鼠(SEQ ID NO.35)和小鼠(SEQ ID NO.36)核苷酸序列中的相應(yīng)區(qū)比對(duì)。非同源核苷酸用小寫字母顯示，而保守區(qū)用大寫字母表示。TOP004區(qū)標(biāo)下劃線。與TOP004區(qū)互補(bǔ)的獼猴β鏈序列在全部3個(gè)測序克隆中都顯示出顯著同源性(19個(gè)堿基中有18個(gè)相同)。在第6位發(fā)現(xiàn)差異(由TOP 004的5′末端開始)，其中“A”和“G”同時(shí)存在(“A”是預(yù)期堿基)。圖1B顯示了由克隆的獼猴(SEQ ID NO.37)和人(SEQ ID NO.38)、黑猩猩(emb.AADA01213660)(SEQ ID NO.39)、豬(U94688.1)(SEQ IDNO.40)、小鼠(NM_007780.1)(SEQ ID NO.41)和大鼠(NM_133555.1)(SEQ ID NO.42)的已知核苷酸序列預(yù)測的蛋白序列的比對(duì)。在第6位(由TOP 004的5′末端開始，其中“A”和“G”同時(shí)存在)存在的核苷酸差異對(duì)應(yīng)于公開數(shù)據(jù)庫中可獲得的蛋白序列的共同β鏈中的谷氨酰胺(Q)或賴氨酸(K)密碼子的第二個(gè)堿基。圖1B中提供的數(shù)據(jù)表明，高度進(jìn)化物種在TOP004互補(bǔ)區(qū)中含有谷氨酰胺殘基(在人、黑猩猩、豬中的箭頭)。谷氨酰胺由兩個(gè)密碼子CAA或CAG編碼。在低等物種(小鼠和大鼠)中，谷氨酰胺被賴氨酸殘基取代。賴氨酸由兩個(gè)密碼子AAA或AAG編碼。在任一種情況下，第2位的腺苷都是保守的。因此，腺苷殘基是有功能的猴序列的可能候選物，因?yàn)槠浯嬖谟谄渌叩燃棺祫?dòng)物中。但是，不能排除GM-CSFβ鏈多態(tài)性。Freeburn等公開了β鏈?zhǔn)荏w的胞質(zhì)內(nèi)區(qū)中的幾個(gè)突變，其可能是易感白血病的原因，(Freeburn等，1997，Exp.Hematol.，25306-311)。圖1A中給出的測序數(shù)據(jù)表明，鳥苷殘基可存在于第6位，第6位由標(biāo)下劃線的TOP004序列的5′末端開始。在此情況下，密碼子將為CGG，蛋白序列將在該位置包含精氨酸(R)殘基。該位置的堿性堿基(H、K或R)使人聯(lián)想到低等脊椎動(dòng)物，不可能是靈長類動(dòng)物的情況。
盡管有這種差異，但猴和人β鏈序列之間非常高度的同一性提示，TOP004在獼猴中有功能。
TOP004和TOP005在獼猴PBMC中的效力在獼猴PBMC中分別單獨(dú)地測試TOP004和TOP005選擇性降低β鏈和CCR3表達(dá)的能力。將純化的猴PBMC與不同濃度的TOP004和TOP005溫育。
參看圖2A和2B，條圖A和條圖B中給出了對(duì)由猴獲得的10個(gè)以上血樣進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。條圖顯示用TOP004(A)和TOP005(B)降低猴PBMC中的β鏈和CCR3 mRNA表達(dá)。抑制是TOP004和TOP005特異性的，不是因?yàn)镽NA降解或細(xì)胞存活喪失，以內(nèi)標(biāo)為證(對(duì)應(yīng)于G3PDH mRNA的451-bp產(chǎn)物和細(xì)胞存活檢驗(yàn))。根據(jù)RT-PCR檢測，TOP004特異性地降低初級(jí)猴PBMC中的共同β鏈表達(dá)(圖2A)。10-15μM濃度獲得最大效力，其中大部分觀察到＞50％的抑制。TOP004對(duì)猴β鏈的抑制證實(shí)了在人和猴β鏈mRNA序列之間顯示出非常高度的同一性的測序數(shù)據(jù)(圖1A)。同樣，根據(jù)RT-PCR檢測，TOP005轉(zhuǎn)染入猴PBMC中降低了CCR3 mRNA的表達(dá)(圖2B)。TOP005對(duì)CCR3 mRNA表達(dá)的最大抑制在低于β鏈所用濃度(10-15μM)的反義寡核苷酸濃度(0.05-2.5μM)獲得。
據(jù)RT-PCR檢測，mRNA表達(dá)抑制還在蛋白水平上得到流式細(xì)胞術(shù)(FACS)的確證。在不同濃度的TOP004或TOP005存在下，猴PBMC在生長培養(yǎng)基中溫育36小時(shí)。如上所述進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量。參看圖3A和3B，條圖顯示了分別在TOP004和TOP005存在下獼猴PBMC中的β鏈和CCR3細(xì)胞表面表達(dá)。所述圖表明，在用TOP004或TOP005處理后，觀察到在7.5μM和0.5μM時(shí)表達(dá)β鏈和CCR3的細(xì)胞百分率分別獲得30％以上的下降。
還測試了以1∶1比率組合(ASM8)的TOP004和TOP005在獼猴PBMC中分別選擇性降低β鏈和CCR3表達(dá)的能力。猴PBMC在不同濃度的ASM8存在下溫育過夜，然后通過RT-PCR評(píng)價(jià)β鏈和CCR3的表達(dá)。參看圖4A和4B，顯示了5個(gè)以上得自猴的血液的條圖，代表在ASM8存在下獼猴PBMC中的β鏈和CCR3表達(dá)。在2.5-5μM的ASM8濃度范圍觀察到顯著的β鏈抑制(圖4A)，這低于單獨(dú)的TOP004獲得最大抑制的最佳濃度范圍(10-15μM(圖2A))。這些結(jié)果表明，相比于單獨(dú)的TOP004，TOP004和TOP005反義寡核苷酸的組合在阻斷β鏈表達(dá)方面提供了增強(qiáng)效力和ASM8的協(xié)同作用。同樣，根據(jù)RT-PCR的檢測，將ASM8轉(zhuǎn)染入猴PBMC中降低了CCR3 mRNA表達(dá)(圖4B)。TOP005對(duì)CCR3 mRNA表達(dá)的最大抑制在低于β鏈所用濃度(2.5-5μM)的反義寡核苷酸濃度(0.05-5μM)獲得。ASM8對(duì)CCR3抑制的作用明顯不是濃度依賴性的，該結(jié)果可能反映出對(duì)CCR3來說獲得最大抑制(穩(wěn)定值)的濃度低于β鏈所用濃度。
總之，獼猴共同β鏈測序表明了非常高度的同一性(含TOP004序列的19個(gè)堿基中的至少18個(gè)堿基相同)。預(yù)期與人基因的此高度同源性足以使TOP004與猴β鏈mRNA雜交，以誘導(dǎo)反義活性，由此降低其表達(dá)。
將TOP004轉(zhuǎn)染入純化的獼猴PBMC中，以評(píng)價(jià)其下調(diào)猴β鏈表達(dá)的能力。TOP004有效降低β鏈mRNA表達(dá)，據(jù)RT-PCR檢測達(dá)30-70％。
同樣，將TOP005轉(zhuǎn)染入獼猴PBMC中，通過半定量RT-PCR測定CCR3表達(dá)水平。結(jié)果表明，TOP005以30％-85％的范圍內(nèi)下調(diào)獼猴CCR3表達(dá)。
同樣，根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測，在猴PMBC中TOP004或TOP005的轉(zhuǎn)染于0.5μM(＞30％)時(shí)誘導(dǎo)β鏈或CCR3陽性的細(xì)胞數(shù)特異性降低。
還將ASM8轉(zhuǎn)染入純化的猴PBMC中，以評(píng)價(jià)組合處理(TOP004和TOP005)下調(diào)猴β鏈和CCR3 mRNA表達(dá)的效力。在這些條件下，根據(jù)RT-PCR檢測，在低至0.1-0.5μM的ASM8濃度時(shí)，ASM8顯著降低β鏈和CCR3的表達(dá)。這也提示，獼猴是在其中檢驗(yàn)由于ASM8藥理學(xué)活性引起的潛在毒性作用的適宜物種。
實(shí)施例3針對(duì)CCR3的反義寡核苷酸在人細(xì)胞和細(xì)胞系中的作用實(shí)施進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，以評(píng)價(jià)A86和TOP005在HL-60分化的嗜酸性粒細(xì)胞樣細(xì)胞(Lee Tiffany等，J.Immunol 1998，1601385-92)、U937和Eol-1細(xì)胞以及外周血單核細(xì)胞(PBMC)中抑制CCR3 mRNA表達(dá)的能力。還研究了A86和TOP005在HL-60細(xì)胞和純化的人外周血嗜酸性粒細(xì)胞這二者中抑制嗜酸性粒細(xì)胞遷移和鈣動(dòng)員的能力。A86是反義寡核苷酸(5′CTG GGC CAT CAG TGC TCT G3′(SEQID NO.29)，對(duì)應(yīng)于CCR3編碼區(qū)(外顯子7)的87-105核苷酸序列。如早前所論述，TOP005是828，但全部3個(gè)腺苷都被2，6-二氨基嘌呤取代(5′GTT XCT XCT TCC XCC TGC CTG 3′(SEQ ID NO.14))。828互補(bǔ)序列在外顯子1末端后的48個(gè)堿基處開始，21個(gè)堿基長?；パa(bǔ)有義寡核苷酸(5′CAG AGC ACT GAT GGC CCA G3′(SEQ IDNO.30))和錯(cuò)配寡核苷酸(5′CGT GGC ACT CAG TGT CCT G3′(SEQID NO.31))用作A86的對(duì)照。錯(cuò)配寡核苷酸(5′CCT TTG ACC TGCCAA TGC TCT 3′(SEQ ID NO.32))用作828/TOP005的對(duì)照。
A86反義寡核苷酸在HL-60克隆15來源的嗜酸性粒細(xì)胞中對(duì)CCR3mRNA表達(dá)的作用已知丁酸處理可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的克隆15變體分化為具有外周血嗜酸性粒細(xì)胞的多種特征的細(xì)胞(Lee Tiffany等，J.Immunol 1998，1601385-92)。使用相同的分化方法，我們證實(shí)CCR3 mRNA在分化的HL-60細(xì)胞中的表達(dá)。然后進(jìn)行RT-PCR，以檢驗(yàn)合成寡核苷酸在分化為嗜酸性粒細(xì)胞的HL-60細(xì)胞中調(diào)節(jié)CCR3受體編碼mRNA表達(dá)的能力。在用10μM A86處理細(xì)胞后，使用內(nèi)標(biāo)G3PDH通過半定量PCR評(píng)價(jià)CCR3 mRNA?？俁NA分離自如上所述新鮮收集的細(xì)胞。參看圖5，顯示了針對(duì)CCR3的反義寡核苷酸在HL60分化細(xì)胞中對(duì)CCR3 mRNA表達(dá)的作用。與有義寡核苷酸和錯(cuò)配寡核苷酸相反，反義寡核苷酸顯著抑制CCR3 mRNA表達(dá)。在有義寡核苷酸和錯(cuò)配寡核苷酸處理的細(xì)胞中CCR3 mRNA表達(dá)明顯不同于在未處理細(xì)胞中獲得的CCR3 mRNA表達(dá)。而且，所有寡核苷酸在所使用的濃度都不影響G3PDH mRNA表達(dá)。因此，在此實(shí)驗(yàn)中使用的反義寡核苷酸A86能夠特異性地抑制CCR3 mRNA的表達(dá)。
A86對(duì)CCR3蛋白細(xì)胞表面表達(dá)的作用進(jìn)一步研究了CCR3 mRNA降低是否能反映出CCR3細(xì)胞表面蛋白密度的降低。就此而言，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析來評(píng)價(jià)用寡核苷酸處理后HL-60衍生的嗜酸性粒細(xì)胞上的CCR3受體表達(dá)。在丁酸處理后，表達(dá)CCR3受體的HL-60衍生的嗜酸性粒細(xì)胞的百分率為40％。當(dāng)用有義和錯(cuò)配寡核苷酸(10μM)處理時(shí)，陽性細(xì)胞的百分率稍微且不顯著地下降；陽性細(xì)胞的百分率分別為35％和38％。但是，在A86處理細(xì)胞上的CCR3受體密度顯著降低(陽性細(xì)胞為26％，相比之下在未處理細(xì)胞中為40％)。10μM的A86能夠降低CCR3細(xì)胞表面表達(dá)達(dá)65％。較高濃度的A86的作用更顯著。具體地說，使用20和30μM的A86，結(jié)果表明CCR3細(xì)胞表面表達(dá)分別降低達(dá)75％和85％。CCR3的反義寡核苷酸A86能夠以劑量依賴性方式抑制CCR3細(xì)胞表面表達(dá)。
A86對(duì)HL-60細(xì)胞中嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子誘導(dǎo)的鈣動(dòng)員的作用當(dāng)趨化因子刺激表達(dá)其特異性受體的白細(xì)胞時(shí)，通常觀察到快速的瞬時(shí)鈣流動(dòng)。這種鈣動(dòng)員可通過Fura-2AM載荷細(xì)胞實(shí)時(shí)跟蹤，是受體活化的便利檢測方法。趨化因子嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子是CCR3受體的特異性配體，在連接至受體時(shí)誘導(dǎo)快速鈣流動(dòng)和白細(xì)胞趨化性。參看圖6，顯示了A86對(duì)CCR3活化的作用。與對(duì)照和有義寡核苷酸相比，A86處理細(xì)胞中響應(yīng)于嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的鈣動(dòng)員下降。以10μM濃度的A86寡核苷酸處理細(xì)胞。用有義寡核苷酸處理的細(xì)胞能夠響應(yīng)于嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子，未處理的細(xì)胞也是如此。在這些情況下，嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子誘導(dǎo)胞內(nèi)Ca++濃度增加。但是，在A86處理的細(xì)胞中，嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子誘導(dǎo)少得多的Ca++動(dòng)員。本文給出的結(jié)果表明，A86在HL-60細(xì)胞系中有效干擾CCR3受體活化。
用反義寡核苷酸處理純化的人嗜酸性粒細(xì)胞抑制純化的人嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的響應(yīng)參看圖7，顯示了反義寡核苷酸對(duì)純化的人嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的趨化反應(yīng)的作用。將純化的人嗜酸性粒細(xì)胞與10μM濃度的反義寡核苷酸(方塊)或有義寡核苷酸(圓形)在補(bǔ)加5％FCS和IL-5(1.5ng/mL)的RPMI 1640中溫育過夜。對(duì)照細(xì)胞(三角形)在無ODNS的相同條件下溫育。數(shù)據(jù)來自代表3個(gè)樣本的單個(gè)實(shí)驗(yàn)，以每5個(gè)高倍視野中三份平行遷移細(xì)胞測定的遷移細(xì)胞平均數(shù)±SD給出。針對(duì)CCR3的反義寡核苷酸抑制嗜酸性粒細(xì)胞遷移，當(dāng)嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子濃度增加時(shí)這種抑制更顯著。在80ng/mL嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子時(shí)，嗜酸性粒細(xì)胞遷移降低達(dá)55.6％。
圖8顯示了反義寡核苷酸處理的嗜酸性粒細(xì)胞中的鈣動(dòng)員。當(dāng)用A86(10μM)處理嗜酸性粒細(xì)胞時(shí)，與對(duì)照和有義寡核苷酸相比，嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子誘導(dǎo)的Ca++動(dòng)員也被抑制。
本文給出的結(jié)果表明，A86通過下調(diào)CCR3受體有效干擾嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的趨化性。
TOP005的效力使用TOP005進(jìn)行相似的實(shí)驗(yàn)。選擇TOP005是因?yàn)?28的效力、表明828與已知基因沒有同源性的該序列BLAST評(píng)價(jià)結(jié)果、828與TOP004沒有雜交(以DNA軟件進(jìn)行的實(shí)驗(yàn))及其長度(當(dāng)混合在一起并通過陰離子交換HPLC分離時(shí)允許由TOP004分化)。
圖9表明了TOP005對(duì)CCR3的細(xì)胞表面表達(dá)的作用。在Eol-1和U937細(xì)胞中評(píng)價(jià)TOP005的效力。在用TOP005處理后36小時(shí)通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)CCR3表達(dá)。結(jié)果以Eol-1和U937細(xì)胞中相對(duì)于對(duì)照的表達(dá)百分率表示。圖9中的條圖表明，TOP005抑制U937和Eol-1細(xì)胞表面上的CCR3蛋白表達(dá)。
圖10A和10B顯示了TOP005對(duì)人外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的CCR3 mRNA表達(dá)的作用。人PBMC或者是新鮮分離的，或者在人IL-2中培養(yǎng)(10ng/mL，24小時(shí))。然后使它們接觸TOP005，培養(yǎng)18小時(shí)。在圖10A中，顯示G3PDH和CCR3表達(dá)的凝膠示于頂部。CCR3mRNA表達(dá)對(duì)G3PDHL的比率相對(duì)于對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化，示于底部。參看圖10B，條圖表明，TOP005在低至1μM濃度的劑量有效降低PBMCCCR3 mRNA表達(dá)。
因此，反義寡核苷酸A86和TOP005可在Eol-1細(xì)胞(人嗜酸性粒細(xì)胞細(xì)胞系)、分化為嗜酸性粒細(xì)胞的HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞中抑制CCR3 mRNA表達(dá)。用這些寡核苷酸抑制CCR3還降低HL-60分化細(xì)胞和人嗜酸性粒細(xì)胞這二者中的鈣動(dòng)員，以及降低嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的趨化性。對(duì)應(yīng)的有義寡核苷酸和錯(cuò)配寡核苷酸均不能影響對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的響應(yīng)。
實(shí)施例4TOP004降低IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β鏈亞基表達(dá)以及人細(xì)胞系中的相關(guān)細(xì)胞應(yīng)答的效力進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，以檢驗(yàn)107A和TOP004對(duì)IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β鏈亞基表達(dá)的作用。
TF-1和U937細(xì)胞中的β鏈mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)參看圖11A、11B和11C，顯示了TF-1細(xì)胞中的β鏈mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)。TF-1細(xì)胞用107A反義寡核苷酸處理12小時(shí)。參看圖11A，進(jìn)行RT-PCR來檢測TF-1細(xì)胞中的β鏈mRNA和G3PDH mRNA表達(dá)。細(xì)胞如下處理泳道1對(duì)照未處理的；泳道2有義寡核苷酸(10μM)；泳道3107A(10μM)；泳道4，錯(cuò)配寡核苷酸(10μM)。在非飽和條件下使用半定量RT-PCR評(píng)價(jià)β鏈和G3PDH(用作對(duì)照)mRNA的表達(dá)。用107A(10μM)處理幾乎完全抑制TF-1(圖11A)和U937處理細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)中的β鏈表達(dá)。107A的抑制是特異性的，不是由于RNA降解或細(xì)胞存活喪失，以內(nèi)標(biāo)為證(對(duì)應(yīng)于G3PDH mRNA的450-bp產(chǎn)物)(圖11A)。相反，在未處理的對(duì)照細(xì)胞或有義或錯(cuò)配寡核苷酸處理的細(xì)胞中，β鏈mRNA表達(dá)不受抑制(圖11A)。因此，107A活性對(duì)于抑制β鏈mRNA的表達(dá)是特異性和有效的。
參看圖11B和11C，顯示了有義寡核苷酸和107A處理對(duì)TF-1細(xì)胞的細(xì)胞表面上的β鏈表達(dá)的作用，如FACS分析測定。圖11B顯示了未處理對(duì)照(PC)對(duì)有義寡核苷酸處理的(S-ODN)，在這里NC代表陰性對(duì)照。圖11C顯示了107A(以5、10和20μM的變化濃度)處理36小時(shí)的細(xì)胞中的細(xì)胞表面表達(dá)。反義寡核苷酸抑制細(xì)胞β鏈蛋白表達(dá)的能力在107A處理細(xì)胞表面上產(chǎn)生對(duì)應(yīng)較低密度的β鏈亞基。使用針對(duì)GM-CSF/IL-3/IL-5受體的共同β鏈蛋白的單克隆抗體(MAb)，與FACS分析一起檢測TF-1細(xì)胞上的β鏈蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)。未處理的TF-1細(xì)胞的β鏈表達(dá)水平非常高，不受有義寡核苷酸處理影響。但是，增加107A濃度(5、10和20μM)以劑量依賴性方式顯著降低β鏈表達(dá)水平(在FACS分析中測試陽性的細(xì)胞百分率由69.9％降低至27.8％)。
圖11D顯示了TOP004處理后在U937細(xì)胞中共同β鏈表達(dá)的抑制。U937細(xì)胞在漸增濃度的TOP004(0.01、0.1、1和10μM)存在下在無血清培養(yǎng)基中溫育12小時(shí)(之后進(jìn)行RT-PCR)和48小時(shí)(之后進(jìn)行FACS分析)。共同β鏈mRNA或蛋白抑制的百分率通過與獲自未處理細(xì)胞的值進(jìn)行對(duì)比來確定。實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次，數(shù)據(jù)表示為平均值±SE。圖11D中給出的結(jié)果表明，TOP004反義寡核苷酸含DAP殘基并與107A反義寡核苷酸同源，在mRNA和蛋白水平上有效抑制共同β鏈。而且，發(fā)現(xiàn)少量的TOP004(例如1μM)足以敲減β鏈mRNA以及對(duì)應(yīng)的蛋白。因此，該數(shù)據(jù)有利于DAP化學(xué)物質(zhì)的效力及其在如上所述的藥理學(xué)組合物中的用途。
細(xì)胞存活和功能研究參看圖12，顯示了在GM-CSF、IL-3或IL-5存在下用107A反義寡核苷酸處理的TF-1細(xì)胞的增殖情況。細(xì)胞與107A(10μM)在含1ng/mL GM-CSF或3ng/mL IL-3或3ng/mL IL-5的無血清培養(yǎng)基中溫育5小時(shí)。2天后終止溫育，通過Alamar Blue測定(n＝3)檢測細(xì)胞增殖。結(jié)果表示為吸光度(570-595)的平均值±SD。
TF-1細(xì)胞需要細(xì)胞因子GM-CSF、IL-3或IL-5來增殖，對(duì)這些細(xì)胞因子的生物反應(yīng)涉及β鏈信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。預(yù)期抑制β鏈蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)抑制TF-1細(xì)胞增殖，即便在這些細(xì)胞因子存在的情況下。107A(10μM)在IL-3、IL-5或GM-CSF存在下引起TF-1細(xì)胞的生長抑制。這些結(jié)果表明，107A對(duì)β鏈細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的抑制有效抑制對(duì)全部3種細(xì)胞因子的細(xì)胞生物反應(yīng)。
嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)GM-CSF、IL-3和IL-5受體，在炎癥和變態(tài)反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。嗜酸性粒細(xì)胞需要GM-CSF、IL-3以及尤其是IL-5用于其分化、活化和存活(Oddera等，1998，Lung.176237-247；Ohnishi等，1993，J.Allergy Clin.Immunol.，92607-615)。研究了靶向β鏈mRNA的反義寡核苷酸抑制響應(yīng)IL-5的嗜酸性粒細(xì)胞存活的能力。參看圖13A和13B，顯示了107A對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞存活的調(diào)節(jié)。
參看圖13A，將純化的人嗜酸性粒細(xì)胞在補(bǔ)加5％FBS和1.5ng/mL IL-5的RPMI培養(yǎng)基中與指定濃度(10、15和20μM)的107A溫育過夜。使用錐蟲藍(lán)染色排除測定評(píng)價(jià)嗜酸性粒細(xì)胞存活。結(jié)果是3個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均結(jié)果。用指定濃度的107A處理以劑量依賴性方式顯著降低嗜酸性粒細(xì)胞存活達(dá)對(duì)照水平的35％±12％(10μM)、43％±2％(15μM)和54％±7％(20μM)(p＜0.01)。嗜酸性粒細(xì)胞存活未受到作為對(duì)照的20μM濃度有義寡核苷酸處理的影響。因此，即便在含特異性細(xì)胞因子IL-5的培養(yǎng)基存在下，靶向β鏈的107A也抑制嗜酸性粒細(xì)胞存活。
參看圖13B，在有或沒有107A(15μM)的情況下，將純化的人嗜酸性粒細(xì)胞在補(bǔ)加5％FBS和2ng/mL IL-5的RPMI培養(yǎng)基中溫育48小時(shí)。如材料和方法中所述，使用Annexin-V-FITC和碘化丙錠方法通過流式細(xì)胞術(shù)分析評(píng)價(jià)嗜酸性粒細(xì)胞存活。
當(dāng)用107A處理嗜酸性粒細(xì)胞時(shí)，其存活降低達(dá)64％，41％歸因于凋亡。相反，在未處理細(xì)胞和用有義寡核苷酸處理的細(xì)胞中，死亡細(xì)胞的百分率較低。
因此，根據(jù)RT-PCR和FACS的檢測，107A反義寡核苷酸在mRNA和蛋白水平上特異性抑制TF-1細(xì)胞和初級(jí)嗜酸性粒細(xì)胞中的共同β鏈表達(dá)。在使用的實(shí)驗(yàn)條件下，在20μM濃度觀察到對(duì)測試的細(xì)胞系統(tǒng)獲得最大效力。在107A存在時(shí)，TF-1細(xì)胞的增殖下降，無論是IL-3、IL-5還是GM-CSF用作營養(yǎng)因子。此結(jié)果表明了107A反義寡核苷酸對(duì)β鏈的特異性和效力。
在IL-5存在下嗜酸性粒細(xì)胞存活受到107A抑制，似乎凋亡是這種抑制作用的結(jié)果。嗜酸性粒細(xì)胞在變應(yīng)性炎癥中起關(guān)鍵作用，需要GM-CSF、IL-3和IL-5用于其分化、活化和存活(Adachi等，1995，Am.J.Respir.Grit.Care Med.151618-623和Oddera等，1998，Lung.176237-247)。在哮喘中，嗜酸性粒細(xì)胞累積和存活被認(rèn)為是炎癥和上皮組織損傷的重要引發(fā)因素，因?yàn)樗鼈冡尫哦拘援a(chǎn)物，包括嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(Walsh等，1997，Clin.Exp.Allergy 27482-487)。
實(shí)施例5
氣管樣品中的ASM8靶基因的mRNA分析進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來分析獼猴氣管樣品中ASM8針對(duì)的靶基因(β鏈亞基和CCR3)的mRNA水平。在第15天(最后1劑后1天)，在處死第1組(對(duì)照)和第4組(高劑量組；目標(biāo)劑量水平2.5mg/kg/天)的全部極期動(dòng)物后，立即收集氣管樣品，并在液氮中快速冷凍。通過RT-PCR分析冷凍的氣管樣品的靶mRNA水平。
使用經(jīng)驗(yàn)證的半定量RT-PCR法測定猴氣管樣品的目標(biāo)基因表達(dá)水平(βc-亞基和CCR3)。對(duì)對(duì)照和高劑量ASM8處理動(dòng)物的氣管提取物進(jìn)行βc-亞基和CCR3-特異性PCR擴(kuò)增(表7)。
表7.RT-PCR樣品分析結(jié)果
備注陰影值代表未納入平均值計(jì)算的逸出值。
盡管甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)通常在RT-PCR反應(yīng)分析中用作內(nèi)標(biāo)，但觀測肺和氣管的溫和細(xì)胞浸潤物(其通常與其它反義寡核苷酸一起在沉積部位被觀測到)。因此，由于細(xì)胞浸潤物有助于βc-亞基和CCR3的檢測水平(即表達(dá)βc-亞基和CCR3的免疫細(xì)胞)，所以G3PDH不被認(rèn)為是在此情況下用作內(nèi)標(biāo)的最合適基因。代之以將靶基因的表達(dá)對(duì)炎性細(xì)胞因子即IL-4和TNF-α的mRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果表明，在ASM8處理的動(dòng)物中(表8)，即便在給予ASM8后約24小時(shí)，βc-亞基和CCR3 mRNA對(duì)IL-4 mRNA的相對(duì)表達(dá)分別降低達(dá)29％和24％，相對(duì)于TNF-α的表達(dá)分別降低達(dá)30％和24％。
因此，盡管猴氣管組織復(fù)雜以及ASM8給藥至獲得組織樣品過去了24小時(shí)，但相對(duì)于炎性細(xì)胞因子IL-4和TNF-α，ASM8處理顯著抑制βc-亞基和CCR3 mRNA的表達(dá)。
實(shí)施例6ASM8的儲(chǔ)存穩(wěn)定性進(jìn)行穩(wěn)定性測試，以評(píng)價(jià)在不同儲(chǔ)存溫度下ASM8(TOP004和TOP005)的寡核苷酸組分的完整性。該信息對(duì)確定ASM8的最優(yōu)儲(chǔ)存、復(fù)測和儲(chǔ)存期條件很重要。
毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)和高效(壓)液相層析(HPLC)已廣泛用于反義寡核苷酸的化學(xué)分析。由于ASM8有兩種寡核苷酸組成，所以測試系統(tǒng)必須提供足夠分開的兩種單獨(dú)的反義分子。因此，將描述以下內(nèi)容1)基于陰離子交換層析的方法以分離ASM8組分(TOP004和TOP005)及其降解產(chǎn)物，和2)儲(chǔ)存溫度對(duì)ASM8組分穩(wěn)定性的作用(圖14-16)。
對(duì)ASM8稱重，并以0.5mg/mL濃度溶解在PBS中(0.25mg/mLTOP004和0.25mg/mL TOP005)。[TOP004的純度因子是1.15(即1.15g粉末含1g活性分子)；TOP005的純度因子是1.24即1.24g粉末含1g活性分子)。]為在分析前誘導(dǎo)TOP004和TOP005降解(以便確保分辨出完整分子的降解產(chǎn)物)，進(jìn)行以下處理·脫嘌呤將ASM8以0.5mg/mL終濃度重懸浮在30％CH3COOH中，于室溫溫育3、4或6小時(shí)。通過加入5體積水終止反應(yīng)，將混合物置于-20℃，然后在Speed-Vac中凍干，以去除乙酸。
·切割將脫嘌呤的寡核苷酸重懸浮在0.2M NaOH(0.5mg/mL)中，于50℃溫育1小時(shí)，儲(chǔ)存在-20℃或通過HPLC分析。
將等份的ASM8(0.5mg/mL)的PBS溶液于-20℃、4℃、30℃和40℃溫育2個(gè)月。在第4周和第8周時(shí)建立ASM8的HPLC譜。對(duì)照條件定義為任意儲(chǔ)存時(shí)間前(即時(shí)間0)的ASM8 HPLC譜。HPLC系統(tǒng)由Waters的Breeze(V 3.30)軟件驅(qū)動(dòng)(圖17A1、17A2、17B1和17B2)。
用聯(lián)結(jié)Waters 2487 Dualλ吸光度檢測器并配有在線脫氣器、烘箱和1500系列手動(dòng)注射器Reodyne 7725i的Waters 1500系列二元HPLC泵進(jìn)行HPLC分離。
寡核苷酸混合物在Waters Protein Pak DEAE 5PW陰離子交換柱(0.5cm×75cm)上分級(jí)分離，保持在60℃，通過260nm的UV吸收檢測。寡核苷酸混合物(體積＝25μL)在水(緩沖液A)中上柱，通過逐漸增加緩沖液B(1M LiClO4)的比例使液相(表9)的離子強(qiáng)度增加，由固相(柱)洗脫寡核苷酸，由此進(jìn)行洗脫。
在測定條件下，62.5μg的TOP004或TOP005中的任一個(gè)于260nm產(chǎn)生的可檢測變化都＞0.15吸光度單位(AU)。
圖14中的層析圖顯示了在DEAE陰離子交換層析中ASM8(TOP004和TOP005)的單個(gè)產(chǎn)物的洗脫譜。25μL體積的新鮮制備的ASM8(0.5mg/mL)在DEAE陰離子交換柱上分級(jí)分離。在上述梯度條件下，TOP004洗脫早于TOP005；這與TOP004比TOP005少兩個(gè)核苷酸并具有較少的帶負(fù)電殘基相一致。TOP004寡核苷酸在81.3分鐘洗脫下來，占260nm吸收的總材料的48.0％。TOP005在86.8分鐘洗脫下來，占260nm吸收的總材料的49.3％。
為了證實(shí)TOP004、TOP005和ASM8降解產(chǎn)物之間足夠分離，進(jìn)行ASM8的兩步化學(xué)降解。切割步驟保持不變，但脫嘌呤步驟的溫育期進(jìn)行3-6小時(shí)。參看圖15，ASM8(0.5mg/mL)用CH3COOH處理3小時(shí)，進(jìn)行堿裂解(如上所述)，然后通過DEAE陰離子交換層析分級(jí)分離。TOP004寡核苷酸在81.5分鐘洗脫下來，占260nm吸收的總材料的32.4％。TOP005產(chǎn)物在86.9分鐘洗脫下來，占總材料的28.0％。較小峰代表ASM8的降解產(chǎn)物。參看圖16，ASM8(0.5mg/mL)用CH3COOH處理6小時(shí)，如上所述進(jìn)行堿裂解，然后通過DEAE陰離子交換層析分級(jí)分離。在260nm檢測下，TOP004寡核苷酸在82.2分鐘洗脫下來，TOP005在86.7分鐘洗脫下來。通過增加脫嘌呤時(shí)間，TOP004的比例降低至20.6％，TOP005的比例降低至14.5％。在這些實(shí)驗(yàn)條件下TOP005的降解程度似乎稍高。如圖15和16中的層析圖可見，增加脫嘌呤時(shí)間增加了ASM8的降解。
參看圖17A1、17A2、17B1和17B2，評(píng)價(jià)不同儲(chǔ)存溫度下ASM8的化學(xué)穩(wěn)定性。ASM8(0.5mg/mL的PBS溶液)于-20℃、4℃、30℃或40℃溫育4周(圖17A1和17A2)和8周(圖17B1和17B2)，并通過DEAE陰離子交換層析分析。在該實(shí)驗(yàn)中測試的各種儲(chǔ)存溫度不影響ASM8組分的洗脫譜。在ASM8儲(chǔ)存長達(dá)2個(gè)月的任一個(gè)溫度都未觀察到ASM8的顯著降解。
上文業(yè)已描述了ASM8的基于DEAE陰離子交換HPLC的分離方法。因?yàn)樵摦a(chǎn)物的性質(zhì)，優(yōu)選ASM8組分(TOP004和TOP005寡核苷酸)的足夠分離。在所述梯度條件下，TOP004的保留時(shí)間比TOP005的保留時(shí)間早5分鐘，兩個(gè)峰幾乎沒有重疊。
該方法還能夠檢測ASM8的降解產(chǎn)物。可通過此HPLC法評(píng)價(jià)在不同溫度、濕度和光照條件下的ASM8的化學(xué)穩(wěn)定性。
ASM8在PBS中的制劑是化學(xué)穩(wěn)定的，在一系列溫度下儲(chǔ)存達(dá)2個(gè)月后通過HPLC法未檢測到顯著的降解產(chǎn)物。
實(shí)施例7ASM8的熱力學(xué)評(píng)價(jià)進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，以確保在使用熱力學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)兩條寡核苷酸鏈TOP004和TOP005在溶液中不相互作用。
TOP 004和TOP 005以在1×PBS(以及其它緩沖系統(tǒng))中以等摩爾濃度混合。總寡核苷酸濃度在約1.2-8.7μM的范圍內(nèi)。使用帶有Tm附件的Beckman DU640分光光度計(jì)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)UV熱變性法。在10-90℃的每個(gè)溫度檢測260 nm的吸光度變化。使用MELTWINTM3.5軟件擬合解鏈曲線，以測定熱力學(xué)參數(shù)。產(chǎn)生解鏈曲線和熱力學(xué)總結(jié)表的屏幕圖像。
參看圖18，顯示了在1×PBS中的TOP004和TOP005的解鏈曲線。圖19是基于TOP004和TOP005在1×PBS中的解鏈曲線擬合結(jié)果的熱力學(xué)總結(jié)。結(jié)果表明，在溫度增加時(shí)，寡核苷酸組合/條件沒有一個(gè)在解鏈譜中產(chǎn)生顯著躍遷(吸光度的突升)。這表明，測試的寡核苷酸混合物在測試緩沖條件下不形成顯著的二級(jí)結(jié)構(gòu)相互作用。
實(shí)施例8ASM8在獼猴中的毒性該實(shí)施例顯示了由TOP004和TOP005的1∶1混合物組成的ASM8的毒性。還顯示了在連續(xù)14天內(nèi)通過每日一次吸入接觸給予獼猴時(shí)，其各個(gè)寡核苷酸組分的毒代動(dòng)力學(xué)模式。此外，14天吸入接觸ASM8未激發(fā)可通過皮內(nèi)注射(ID)檢測的系統(tǒng)性超敏狀況。
表10.估計(jì)達(dá)到的劑量
表11.總體接觸的氣溶膠濃度
進(jìn)行死亡率、臨床征兆、體重、食物消耗、心電圖、檢眼鏡檢查和臨床病理學(xué)的全面評(píng)價(jià)。在接觸的第1天和最后1天以及恢復(fù)期結(jié)束時(shí)得到系列血樣，在完結(jié)時(shí)收集組織，用于測定個(gè)體寡核苷酸含量。另外，在第25天時(shí)，對(duì)設(shè)計(jì)用于恢復(fù)期的動(dòng)物皮內(nèi)注射(ID)給予ASM8，以評(píng)價(jià)潛在的系統(tǒng)性超敏性。所有動(dòng)物都在接觸14天后(第15天)或14天恢復(fù)期后(第29天)實(shí)施安樂死，進(jìn)行全尸檢，并由每只動(dòng)物收集一套完整組織。組織病理學(xué)評(píng)價(jià)由高劑量和對(duì)照組動(dòng)物的全部組織以及低劑量組和恢復(fù)動(dòng)物的呼吸道組織的顯微鏡檢查組成。
ASM8制劑易于氣溶膠化，產(chǎn)生的接觸氣溶膠始終穩(wěn)定并可呼吸，組間質(zhì)量中位直徑(MMAD)和幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差(GSD)值分別在1.7-1.8μm和2.12-2.22之間。對(duì)于組2-4，獲得的估計(jì)達(dá)到劑量分別接近0.05、0.22和2.5mg/kg/天的目標(biāo)，表7-8。
沒有死亡，猴對(duì)劑量良好耐受。對(duì)體重、食物消耗、心電圖、檢眼鏡檢查或臨床病理學(xué)和超敏測試沒有影響，揭示ASM8給藥無作用。在尸檢后，器官重量檢測未產(chǎn)生毒性證據(jù)。所有器官的外觀檢查揭示，在ASM8處理動(dòng)物中只是腎臟有灰白變色。但是，由于沒有已證實(shí)的微觀變化、臨床病理學(xué)觀察結(jié)果或器官重量變化以及在恢復(fù)14天后未觀察到變色的事實(shí)，所以認(rèn)為該觀察結(jié)果的生物學(xué)和毒物學(xué)意義不明確。
TOP004和TOP005的血漿水平以及其近似的(n-1)代謝物在血漿中非常低，低和中劑量組在定量限度以下。對(duì)于高劑量組(2.5mg/kg/天)，TOP004和TOP005濃度通常在給藥后0.5小時(shí)的最早取樣時(shí)間或1小時(shí)時(shí)間點(diǎn)時(shí)最大。在大部分給藥后時(shí)間點(diǎn)，TOP004的平均濃度類似于TOP005的濃度，圖20A和圖20B。
如圖21A和圖21B所示，重復(fù)地每日給予達(dá)14天，血漿中的任一種寡核苷酸組分(或其n-1代謝物)都沒有累積。血漿濃度沒有一致性差異。循環(huán)寡核苷酸的顯著性百分率以TOP004和TOP005這二者的近似n-1代謝物給出，盡管所述百分率往往稍低于TOP004。對(duì)于兩種寡核苷酸及其n-1代謝物，在24小時(shí)收集期內(nèi)明顯由血室(血漿)中清除出去。在終末期處死時(shí)(最后1劑ASM8吸入后1天)，在高劑量動(dòng)物氣管中檢測到可感知量的ASM8的完整寡核苷酸組分(TOP004和TOP005)。在14天恢復(fù)期結(jié)束時(shí)(第29天)，TOP004及其n-1代謝物的水平相對(duì)于第15天時(shí)已消除，經(jīng)檢測稍微高于測定的檢測限度。相反，在恢復(fù)期處死時(shí)間點(diǎn)時(shí)TOP005或其代謝物不可定量。這些結(jié)果提示，TOP004具有高于TOP005的組織穩(wěn)定性。
在除呼吸道以外的任何器官中都未觀察到處理相關(guān)的微觀變化。按照4點(diǎn)評(píng)分，呼吸道中觀察到的所有變化都被評(píng)為最低(最小)。對(duì)肺觀察到的變化包括以0.22或2.5mg/kg/天給藥的動(dòng)物中的泡沫狀肺泡巨噬細(xì)胞、2.5mg/kg/天給藥的動(dòng)物中的肺泡內(nèi)粒細(xì)胞炎癥、2.5mg/kg/天給藥的2只動(dòng)物中的灶性出血和1只動(dòng)物中的病灶性細(xì)支氣管組織轉(zhuǎn)化；對(duì)鼻腔觀察到的變化包括2.5mg/kg/天給藥的6只動(dòng)物中有2只的鼻中隔扁平上皮出現(xiàn)病灶性侵蝕，伴有急性炎癥，并在1只猴中出現(xiàn)炎癥滲出液；對(duì)支氣管淋巴結(jié)觀察到的變化包括2.5mg/kg/天給藥的動(dòng)物中有泡沫狀巨噬細(xì)胞。在中和高劑量動(dòng)物中觀察到的變化的嚴(yán)重性較小，在肺實(shí)質(zhì)中不伴有局部損傷或細(xì)胞浸潤的證據(jù)。炎癥細(xì)胞稀少，僅在少量ASM8高劑量動(dòng)物中觀察到，變化的分布與測試物的吸入相一致。灶性出血非常小，被解讀成可能是偶然的。因此，報(bào)告的變化一般與和吸入測試物的吞噬作用和清除相關(guān)的正常肺部機(jī)制相一致。撤消處理14天導(dǎo)致持續(xù)存在若干泡沫狀肺泡巨噬細(xì)胞，在兩只ASM高劑量動(dòng)物中有1只無炎癥。此觀察結(jié)果與病灶的逐漸退化相一致，表明肺實(shí)質(zhì)沒有進(jìn)行性或遷延性變化。
在14天恢復(fù)期后沒有處理作用于鼻組織的證據(jù)。關(guān)于高劑量動(dòng)物中的支氣管淋巴結(jié)觀察結(jié)果，髓竇中的泡沫狀巨噬細(xì)胞與通過由肺進(jìn)行淋巴引流清除測試材料相一致。沒有實(shí)質(zhì)損傷的證據(jù)，淋巴結(jié)似乎未處于活性狀態(tài)中。
總之，以達(dá)2.5mg/kg/天的估計(jì)達(dá)到劑量連續(xù)14天吸入ASM8被良好耐受，對(duì)體重、食物消耗、心電圖、檢眼鏡檢查或臨床病理學(xué)參數(shù)沒有影響，超敏測試揭示ASM8給藥無作用。大部分最小組織形態(tài)學(xué)變化有許多在肺(0.22和2.5mg/kg/天)以及鼻腔和支氣管淋巴結(jié)(2.5mg/kg/天)中觀察到。這些變化在恢復(fù)14天后嚴(yán)重性下降或消失。
盡管本文已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，可對(duì)這些實(shí)施方案進(jìn)行改變，而不背離本發(fā)明的精神或所附權(quán)利要求書的范圍。
序列表<110>Topigen Pharmaceutique Inc.
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tcgtgcagtt cttctttttc a 21<210>10<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>10cagactagct tctcagtttt g 21<210>11<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>11tgctaattta gtgaagtcct t 21<210>12<211>22<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>12cttctccctg aaaatctctt ct 22<210>13<211>19<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
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<221>misc_feature<222>(142)..(143)<223>n是a、c、g或t<220>
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<221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>Xaa為Gln或Arg<400>37Ala Glu Glu Thr Ile Pro Leu Xaa Thr Leu Arg Cys1 5 10<210>38<211>12<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>38Ala Glu Glu Thr Ile Pro Leu Gln Thr Leu Arg Cys1 5 10<211>39<211>12<212>PRT<213>黑猩猩<400>39Leu Ser Glu Thr Ile Pro Leu Gln Thr Leu Arg Cys1 5 10<210>10<211>12<212>PRT<213>豬
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權(quán)利要求
1.一種用于治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的反義寡核苷酸，所述寡核苷酸針對(duì)編碼蛋白的核酸序列，所述蛋白選自CCR3趨化因子受體和IL-3、IL-5與GM-CSF受體的共同β亞基，以及能夠接觸IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β亞基的其它蛋白，其中所述寡核苷酸是以下中的一種(i)選自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的序列，和(ii)選自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的序列的修飾寡核苷酸。
2.權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有包含SEQID NO.1的序列。
3.權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有包含SEQID NO.13的序列。
4.權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有包含SEQID NO.14的序列。
5.權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸用于治療和/或預(yù)防哮喘。
6.權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸用于治療和/或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)。
7.權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸用于治療和/或預(yù)防嗜酸性粒細(xì)胞增多癥。
8.權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸用于治療和/或預(yù)防全身性炎癥。
9.權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸用于治療和/或預(yù)防癌癥。
10.權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中所述癌癥是白血病。
11.權(quán)利要求1定義的至少一種反義寡核苷酸的用途，所述反義寡核苷酸用于治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種。
12.權(quán)利要求11的用途，其中所述至少一種反義寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.1的序列。
13.權(quán)利要求11的用途，其中所述至少一種反義寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.13的序列。
14.權(quán)利要求11的用途，其中所述至少一種反義寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.14的序列。
15.權(quán)利要求11的用途，其中所述至少一種反義寡核苷酸為至少兩種反義寡核苷酸，它們分別具有包含SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14的序列。
16.權(quán)利要求11的用途，其中所述至少一種寡核苷酸用于治療和/或預(yù)防哮喘。
17.權(quán)利要求11的用途，其中所述至少一種寡核苷酸用于治療和/或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)。
18.權(quán)利要求11的用途，其中所述至少一種寡核苷酸用于治療和/或預(yù)防嗜酸性粒細(xì)胞增多癥。
19.權(quán)利要求11的用途，其中所述至少一種寡核苷酸用于治療和/或預(yù)防全身性炎癥。
20.權(quán)利要求11的用途，其中所述至少一種寡核苷酸用于治療和/或預(yù)防癌癥。
21.權(quán)利要求11的用途，其中所述癌癥是白血病。
22.一種用于治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的藥物組合物，所述組合物包含至少一種權(quán)利要求1定義的反義寡核苷酸以及藥物可接受的載體。
23.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述至少一種反義寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.1的序列。
24.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述至少一種反義寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.13的序列。
25.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述至少一種反義寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.14的序列。
26.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述至少一種反義寡核苷酸為至少兩種反義寡核苷酸，它們分別具有包含SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的序列。
27.權(quán)利要求22-26中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述藥物組合物是局部藥物組合物。
28.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述藥物組合物用于治療和/或預(yù)防哮喘。
29.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述藥物組合物用于治療和/或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)。
30.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述藥物組合物用于治療和/或預(yù)防嗜酸性粒細(xì)胞增多癥。
31.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述藥物組合物用于治療和/或預(yù)防全身性炎癥。
32.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述藥物組合物用于治療和/或預(yù)防癌癥。
33.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述癌癥是白血病。
34.權(quán)利要求22-27中任一項(xiàng)的藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種。
35.權(quán)利要求34的用途，其中所述藥物組合物用于治療和/或預(yù)防哮喘。
36.權(quán)利要求34的用途，其中所述藥物組合物用于治療和/或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)。
37.權(quán)利要求34的用途，其中所述藥物組合物用于治療和/或預(yù)防嗜酸性粒細(xì)胞增多癥。
38.權(quán)利要求34的用途，其中所述藥物組合物用于治療和/或預(yù)防全身性炎癥。
39.權(quán)利要求34的用途，其中所述藥物組合物用于治療和/或預(yù)防癌癥。
40.權(quán)利要求34的用途，其中所述癌癥是白血病。
41.一種治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的方法，所述方法包含給予有效量的至少一種權(quán)利要求1定義的反義寡核苷酸的步驟。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.1的序列。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.13的序列。
44.權(quán)利要求41的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.14的序列。
45.權(quán)利要求41的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸為至少兩種反義寡核苷酸，它們分別具有包含SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14的序列。
46.權(quán)利要求41的方法，其中所述方法用于治療和/或預(yù)防哮喘。
47.權(quán)利要求41的方法，其中所述方法用于治療和/或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)。
48.權(quán)利要求41的方法，其中所述方法用于治療和/或預(yù)防嗜酸性粒細(xì)胞增多癥。
49.權(quán)利要求41的方法，其中所述方法用于治療和/或預(yù)防全身性炎癥。
50.權(quán)利要求41的方法，其中所述方法用于治療和/或預(yù)防癌癥。
51.權(quán)利要求41的方法，其中所述癌癥是白血病。
52.一種治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的方法，所述方法包含給予有效量的權(quán)利要求22-27中任一項(xiàng)定義的藥物組合物的步驟。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述方法用于治療和/或預(yù)防哮喘。
54.權(quán)利要求52的方法，其中所述方法用于治療和/或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)。
55.權(quán)利要求52的方法，其中所述方法用于治療和/或預(yù)防嗜酸性粒細(xì)胞增多癥。
56.權(quán)利要求52的方法，其中所述方法用于治療和/或預(yù)防全身性炎癥。
57.權(quán)利要求52的方法，其中所述方法用于治療和/或預(yù)防癌癥。
58.權(quán)利要求52的方法，其中所述癌癥是白血病。
59.權(quán)利要求1的至少一種反義寡核苷酸用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于治療哮喘。
60.權(quán)利要求1的至少一種反義寡核苷酸用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于治療變態(tài)反應(yīng)。
61.權(quán)利要求1的至少一種反義寡核苷酸用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于治療嗜酸性粒細(xì)胞增多癥。
62.權(quán)利要求1的至少一種反義寡核苷酸用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于治療全身性炎癥。
63.權(quán)利要求1的至少一種反義寡核苷酸用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于治療癌癥。
64.權(quán)利要求1的至少一種反義寡核苷酸用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于治療白血病。
65.權(quán)利要求59-64中任一項(xiàng)的用途，其中所述至少一種寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.1的序列。
66.權(quán)利要求59-64中任一項(xiàng)的用途，其中所述至少一種寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.13的序列。
67.權(quán)利要求59-64中任一項(xiàng)的用途，其中所述至少一種寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.14的序列。
68.權(quán)利要求59-64中任一項(xiàng)的用途，其中所述至少一種寡核苷酸為至少兩種寡核苷酸，它們分別具有包含SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14的序列。
全文摘要
本發(fā)明提供用于治療和/或預(yù)防哮喘、變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的反義寡核苷酸。所述寡核苷酸針對(duì)編碼受體的核酸序列，所述受體選自CCR3受體以及IL－3、IL－5和GM－CSF受體的共同亞基。
文檔編號(hào)A61K31/711GK101087623SQ200580044861
公開日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2005年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月29日
發(fā)明者K·澤姆祖米, P·倫齊 申請(qǐng)人:托皮根藥品公司