專利名稱：蛋白質(zhì)過敏原衍生物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及降低野生型蛋白質(zhì)過敏原的致敏活性的方法、新型過敏原衍生物和過敏反應疫苗接種方案。
背景技術：
過敏反應是對通常無害的外來(即，非本體)物質(zhì)(“過敏原”)的反應能力的遺傳或后天特異性變異。過敏反應與受侵襲器官系統(tǒng)(皮膚、結(jié)膜、鼻子、咽、支氣管粘膜、胃腸道)中的炎性反應、急性疾病癥狀(例如過敏性鼻炎、結(jié)膜炎、皮炎、過敏性休克和哮喘)和慢性疾病表現(xiàn)(例如哮喘和特異性皮炎中的晚期反應)相關聯(lián)。
I型過敏反應代表遺傳決定的超敏癥，其侵擾大約20％的工業(yè)化世界人口。I型過敏反應的病理生理標志是對無害抗原(過敏原)產(chǎn)生免疫球蛋白E(IgE)抗體。
目前，過敏反應治療的唯一成因(causative)形式是過敏原特異性的免疫療法，其中對患者施用遞增的過敏原劑量以引發(fā)過敏原特異性的無應答狀態(tài)。盡管數(shù)個研究已經(jīng)證實了過敏原特異性的免疫療法的臨床效力，但沒有充分理解其中的機制。
過敏原特異性免疫療法的主要缺點是依賴于天然過敏原提取物的使用，這些提取物難以(即使不是不可能)至少標準化至工業(yè)生產(chǎn)水平。這類天然過敏原提取物由不同的致敏和不致敏化合物構(gòu)成，由于該事實，在施用的提取物中可能不存在某些過敏原，或甚至更糟糕的是，患者可能在治療過程中對組分產(chǎn)生新的IgE-特異性。提取物為基礎的療法的另一缺點源于下述事實——即生物活性過敏原制品的施用可能引發(fā)過敏性副作用。
分子生物技術在過敏原表征領域中的應用能夠分離出為所有相關環(huán)境過敏原編碼的cDNAs并能夠生產(chǎn)重組過敏原。使用這類重組過敏原可以通過體外診斷法(即在血清中檢測過敏原特異性的IgE抗體)或體內(nèi)測試來確定各個患者的反應性狀況(profile)?；谶@種技術，似乎可以開發(fā)出針對過敏反應，尤其是針對I型過敏反應的新型組分為基礎的疫苗接種方案，這些方案可以根據(jù)患者的敏感狀況進行調(diào)節(jié)。但是，由于重組過敏原與其天然對應物的相似性，重組過敏原也表現(xiàn)出顯著的致敏活性。由于重組過敏原近似地模仿野生型過敏原的致敏活性，在施用天然過敏原的免疫療法中與這種致敏活性相聯(lián)的所有缺點也存在于重組過敏原中。為了改進免疫療法，必須降低重組過敏原的致敏活性，由此可以提高過敏原施用劑量而僅具有低的過敏性副作用風險。
已經(jīng)建議通過施用僅含T細胞抗原決定簇的肽而只影響過敏原特異性T細胞的活性。T細胞抗原決定簇代表完整過敏原被抗原提呈細胞蛋白水解消化(proteolytic digestion)而產(chǎn)生的小肽。這類T細胞抗原決定簇可以作為合成肽制造。但是，迄今用T細胞抗原決定簇進行的試驗僅表現(xiàn)出差的結(jié)果和低的效力。已經(jīng)考慮了對T細胞肽為基礎的免疫療法的低效力的一些解釋首先，可能難以施用最佳劑量以實現(xiàn)T細胞耐受而非活化。其次，小T細胞抗原決定簇肽在體內(nèi)具有短半衰期。第三，顯著證據(jù)表明特異反應性個體體內(nèi)的IgE生成代表了不要求新生(de novo)類轉(zhuǎn)換的記憶免疫應答并因此不受T細胞衍生的細胞因子控制。僅以T細胞抗原決定簇的施用為基礎的治療形式因此可以通過已轉(zhuǎn)換的記憶B細胞調(diào)節(jié)過敏原特異性T細胞的活性，而可能對過敏原特異性IgE抗體的生成幾乎沒有影響。
已經(jīng)進一步提出通過重組DNA技術或肽合成來制造低致敏過敏原衍生物或片段。這類衍生物或片段含有T細胞抗原決定簇并可以誘發(fā)與天然過敏原的IgE識別競爭的IgG抗體。20多年前證實，過敏原的蛋白水解消化產(chǎn)生小過敏原片段，它們部分保持其IgE結(jié)合能力但沒有引起急性反應。盡管過敏原的蛋白水解難以控制和標準化，但分子生物學已經(jīng)開辟了生產(chǎn)IgE結(jié)合半抗原的新途徑。這類IgE結(jié)合半抗原經(jīng)提議可用于具有降低的過敏性效應風險的積極免疫法，以及用于被動治療法以在過敏原接觸之前使效應細胞結(jié)合IgE達到飽和并由此阻斷過敏原引發(fā)的介體釋放。
另一建議是以下述觀察為基礎通過基因工程制造低致敏過敏原形式——過敏原可以作為僅在一些氨基酸殘基方面和/或在具有低IgE結(jié)合能力的構(gòu)象方面不同的異構(gòu)體天然存在。例如，通過基因工程，主要樺樹花粉過敏原Bet v 1的低聚產(chǎn)生具有顯著降低的致敏活性的重組三聚體?；蛘撸呀?jīng)建議引入點突變以在過敏原結(jié)構(gòu)中引起構(gòu)象變化并由此破壞不連續(xù)的IgE抗原決定簇，或直接影響IgE結(jié)合能力(Valenta等人，Biol.Chem.380(1999)，815-824)。
還已經(jīng)證明，由于它們的native-like folds的缺失，過敏原分裂成數(shù)部分(例如，分裂成兩部分)導致過敏原的IgE結(jié)合能力和致敏活性幾乎完全喪失(Vrtala等人(J.Clin.Invest.99(1997)，1673-1681)報導了Bet v 1，Twardosz等人(BBRC 239(1997)，197-204)報導了Bet v 4，Hayek等人(J.Immunol.161(1998)，7031-7039)報導了Alng 4，Zeiler等人(J.Allergy Clin.Immunol.100(1997)，721-727)報導了牛毛屑過敏原，Elfman(Int.Arch.Allergy Immunol.117(1998)，167-173)報導了Lep d2)，Westritschnig(J.Immunol.172(2004)，5684-5692)報道了Phlp 7)....)。主要含有不連續(xù)/構(gòu)象IgE抗原決定簇的蛋白質(zhì)的分裂導致抗原的IgE結(jié)合能力顯著降低?；谶@一認識，在現(xiàn)有技術中研究了這類低致敏過敏原片段是否可以在體內(nèi)引發(fā)保護性免疫應答(Westritschnig等人(Curr.Opinion in Allergy and Clin.Immunol.3(2003)，495-500))。
本發(fā)明的目的是基于上述認識提供改進過敏反應免疫療法的手段和方法。這類方法和手段應該是有效的，具有低過敏性休克風險，容易順應各個患者的需求并容易轉(zhuǎn)化成工業(yè)規(guī)模。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供了具有降低的致敏活性的野生型蛋白質(zhì)過敏原衍生物的制造方法，其特征在于包括下列步驟-提供具有致敏活性的野生型蛋白質(zhì)過敏原，-將所述野生型蛋白質(zhì)過敏原剪切成兩部分，所述兩部分具有降低的致敏活性或缺乏致敏活性，并-將所述兩個片段以相反方向(inverse orientation)重新接合。
本發(fā)明的方法基于下述事實——主要含有不連續(xù)/構(gòu)象IgE抗原決定簇的蛋白質(zhì)的分裂導致過敏原的IgE結(jié)合能力顯著降低。但是，某些過敏原的片段的致免疫性太低以致不能引發(fā)保護性抗體應答(Westritschnig等人，(2004))。
使用本方法，提供了新型和指定蛋白質(zhì)過敏原衍生物，其結(jié)合了以T細胞和B細胞抗原決定簇為基礎的方法的優(yōu)點。同時，本發(fā)明的過敏原衍生物不存在僅用片段或用片段的復雜排列(例如結(jié)合半抗原和與三個或更多片段改組(shuffling)的IgE)進行疫苗接種的缺點。
實際上，本發(fā)明表明，使用在結(jié)構(gòu)要素的完整性方面最接近野生型過敏原(例如，具有野生型過敏原的所有氨基酸)但沒有其致敏活性(或致敏活性充分降低)的結(jié)構(gòu)可以獲得最佳結(jié)果。當然，如果在在過敏原衍生物生成過程中僅缺失(刪除)或添加(插入)數(shù)個氨基酸殘基或如果各部分通過連接體結(jié)合而非直接結(jié)合，本發(fā)明的優(yōu)點仍然存在。通過將過敏原分成指定片段的已知和一般原理實現(xiàn)致敏活性的這種降低或消除。除了這種一般原理外，本發(fā)明還將所得過敏原的兩部分以相反方向重新接合，這產(chǎn)生含有過敏原的幾乎所有相關結(jié)構(gòu)信息(因為在本發(fā)明的過敏原衍生物中包含完全或幾乎完全的氨基酸序列)但與野生型過敏原相比只有低(或沒有)殘留致敏活性的過敏原衍生物。
本發(fā)明的這些“頭-尾倒置(head-to-tail)”衍生物能夠為過敏反應患者帶來適當?shù)?、個人化的和有效的免疫療法，其容易用常規(guī)步驟擴大規(guī)模。本發(fā)明的衍生物誘發(fā)保護性IgG抗體，其可以阻斷患者的IgE與野生型過敏原的結(jié)合并抑制過敏原誘發(fā)的嗜堿細胞脫粒。
本發(fā)明的方法尤其適用于重組DNA技術。一旦通過基因工程構(gòu)筑衍生物，其可以容易地以工業(yè)規(guī)模在合適的宿主中通過轉(zhuǎn)基因表達以相當大的量獲得。本發(fā)明的過敏原衍生物優(yōu)選在具有高表達能力的宿主中制造。
通過本發(fā)明改性的優(yōu)選過敏原包括例如在www.allergen.org/List.htm下可得的所有主要蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選的過敏原類別包括前纖維蛋白(profilins)，尤其是Ph1 p12，樺樹過敏原，尤其是Bet v 4，塵螨過敏原，尤其是Der p2，儲螨過敏原，尤其是Lep d 2，梯牧草過敏原，尤其是Phl p 7，和表A中所列的過敏原。
表A通過根據(jù)本發(fā)明連接(shuffling)而改性的優(yōu)選過敏原(包括參比例)














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使用本剪接/頭-尾倒置改性，可以獲得致敏活性的顯著降低。根據(jù)該方法，從野生型蛋白質(zhì)過敏原中大部分消除這種活性。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，通過與野生型過敏原相比至少10％，優(yōu)選至少20％，尤其至少30％的抑制IgE結(jié)合能力的降低測量致敏活性的降低。優(yōu)選方法顯示在下列實施例章節(jié)。
另一優(yōu)選的確定致敏活性降低的方法使用IgE結(jié)合的測量。過敏原致敏的患者血清的IgE抗體與所述衍生物的斑點印跡的結(jié)合的缺乏被視為大部分顯著降低的指征。該方法同樣顯示在下列實施例章節(jié)中。
根據(jù)本發(fā)明獲得的衍生物可以容易地與藥用賦形劑結(jié)合，并最終制成藥物制劑。
優(yōu)選地，衍生物與合適的疫苗佐劑結(jié)合并最終制成藥用疫苗制劑。
根據(jù)優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的衍生物與其它過敏原結(jié)合成組成疫苗。這類過敏原優(yōu)選為野生型過敏原，尤其是野生型過敏原的混合物、重組野生型過敏原、野生型蛋白質(zhì)過敏原的衍生物或它們的混合物?？梢詫ｉT針對某一患者的需求(過敏原狀況)制造這類混合物。
在優(yōu)選實施方案中，這類藥物制劑進一步含有過敏原提取物。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了野生型蛋白質(zhì)過敏原的過敏原衍生物，所述野生型蛋白質(zhì)過敏原具有1至Z的氨基酸序列，其特征在于所述衍生物在氨基末端至羧基末端的方向上相鄰地含有兩種野生型過敏原片段X至Z和1至X，所述兩種野生型過敏原片段具有降低的致敏活性或沒有致敏活性。
優(yōu)選地，本發(fā)明的過敏原衍生物的特征在于，X至Z和1至X為至少30個氨基酸殘基長，優(yōu)選至少50個氨基酸殘基，尤其是至少60個氨基酸殘基。
更優(yōu)選地，X至Z和1至X的長度相差50％或更少，優(yōu)選30％或更少，尤其是20％或更少。
本發(fā)明的尤其優(yōu)選的過敏原衍生物選自I型過敏原，優(yōu)選選自表A的過敏原，更優(yōu)選為梯牧草(phelum pratense)花粉，尤其是Phl p 12，樺樹(Betula verrucosa)花粉，尤其是Bet v 2和Bet v 4，黃蜂(Vespulavulgaris)毒液，紙巢蜂(Polistes annularis)毒液，parietaria judaica花粉，黑麥草花粉、塵螨過敏原，尤其是Der p 2，等等。
優(yōu)選地，本發(fā)明的衍生物以過敏原組合物的形式供應，其中不只存在一種過敏原，而是存在兩種或多種。本發(fā)明的衍生物還可以與過敏原提取物混合，在這些過敏原提取物中補充本發(fā)明的衍生物以替代天然提取物中足量過敏原特異性的缺乏。不只對一種過敏原具有過敏反應的患者尤其需要過敏原混合物。因此，本發(fā)明的衍生物優(yōu)選與其它過敏原組合成組合疫苗。
本發(fā)明的過敏原衍生物因此優(yōu)選與野生型過敏原組合成過敏原組合物，尤其是野生型過敏原的混合物、重組野生型過敏原、野生型蛋白質(zhì)過敏原的衍生物或它們的混合物(各自是相同和/或不同的過敏原和/或其異構(gòu)體或突變體；只要在作為整體的制劑中得到與野生型蛋白質(zhì)或重組過敏原相比總體降低的致敏活性)。
優(yōu)選地，本發(fā)明的制劑進一步含有過敏原提取物。
本發(fā)明的過敏原或過敏原組合物優(yōu)選含有藥用賦形劑。
本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的過敏原衍生物用于制備過敏原特異性免疫療法藥物的用途。
本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明的過敏原衍生物或過敏原組合物用于制備被動免疫法藥物的用途。
本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的過敏原衍生物或過敏原組合物用于制備預防免疫法藥物的用途。
本發(fā)明的過敏原衍生物和組合物可用于個體的預防免疫法，從而有效預防過敏反應。由于本發(fā)明的過敏原衍生物和組合物，例如Der p2過敏原衍生物與野生型過敏原相比表現(xiàn)出降低的致敏免疫應答，它們不會導致不合意的副作用。有利地，這種藥物可施用于1至3歲的兒童。這種在所述兒童與過敏原接觸之前的疫苗接種防止在所述兒童體內(nèi)形成過敏原特異性IgE抗體。
優(yōu)選地，藥物進一步含有其它合適的成分，例如佐劑、稀釋劑、防腐劑、等等。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，每次施用的藥物劑量包含10納克至1克，優(yōu)選100納克至10毫克，尤其是0.5微克至200微克的所述重組過敏原衍生物。優(yōu)選施用方法包括大體而言針對疫苗接種具體而言針對過敏原免疫療法所描述和所提議的所有標準施用方式(口服、經(jīng)皮、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)粘膜，等等)。本發(fā)明包括通過施用有效量的本發(fā)明的藥物制劑來治療和預防過敏反應的方法。
本發(fā)明的另一方面涉及制造本發(fā)明的過敏原衍生物的方法，其特征在于包括下列步驟-提供為本發(fā)明的過敏原衍生物編碼的DNA分子，-用所述DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細胞和-在所述宿主細胞中表達所述衍生物并分離所述衍生物。
優(yōu)選地，所述宿主是具有高表達能力的宿主。
本文所用的“具有高表達能力的宿主”是以至少10毫克/升培養(yǎng)物，優(yōu)選至少15毫克/升，更優(yōu)選至少20毫克/升的量表達相關蛋白質(zhì)的宿主。當然，表達能力還取決于所選宿主和表達體系(例如載體)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選宿主是埃希氏大腸桿菌、甲醇酵母()、枯草芽孢桿菌(baciullus subtilis)、pant細胞(例如衍生自煙草)等等。
當然，本發(fā)明的過敏原還可以通過任何合適的方法，尤其是化學合成或半化學合成法制造。
本發(fā)明的另一方面涉及可通過本發(fā)明的方法獲自第一野生型抑制蛋白(profilin)分子的抑制蛋白衍生物或本發(fā)明的第一野生型抑制蛋白分子的過敏原衍生物用于制造預防或治療由第二野生型抑制蛋白分子引起的過敏癥的藥物的用途。
令人驚訝地證明，通過本發(fā)明的第一野生型抑制蛋白分子的抑制蛋白衍生物直接誘發(fā)的抗體還結(jié)合到其它野生型抑制蛋白分子上。因此，所述衍生物可用于治療或預防許多過敏癥。這類抑制蛋白衍生物可用作廣譜疫苗，其能夠僅用一種或兩種致免疫分子使個體免疫。抑制蛋白代表在所有真核細胞中表達的過敏原并因此代表可以在過敏患者中引發(fā)吸入式過敏癥(例如rhinoconjunctivits、哮喘)以及口服消化后的口腔過敏癥(嘴唇和舌頭發(fā)癢和腫脹)的pan-過敏原。
例如，改組Phl p 12衍生物，MP12在免疫后誘發(fā)識別來自花粉以及來自植物源食品的抑制蛋白的IgG抗體。MP12誘發(fā)的抗體抑制了患者的血清IgE與花粉中的抑制蛋白上以及與植物食品源抑制蛋白的結(jié)合。因此，MP12以及其它重組抑制蛋白分子適用于治療可歸因于抑制蛋白過敏反應的花粉-食品交叉致敏。
根據(jù)優(yōu)選實施方案，所述第一和所述第二抑制蛋白分子選自Phl p12、Bet v 2、Art V 4、Ana c、Api g 4、Mus xp 1、Cor a 2和Dau c 4。
由于它們的結(jié)構(gòu)相似性，這些過敏原尤其適合根據(jù)本發(fā)明使用。但是，明顯地，可以相應使用彼此結(jié)構(gòu)相似的其它過敏原。
所述第一抑制蛋白分子優(yōu)選為Phl p 12，所述第二抑制蛋白分子優(yōu)選選自Bet v 2、Art v 4、Ana c、Api g 4、Mus xp 1、Cor a 2和Dau c 4。
實驗表明，Phl p 12的衍生物尤其可用作廣譜疫苗。特別優(yōu)選的衍生物由融合蛋白構(gòu)成，其中野生型Phl p 12的氨基酸1至77在氨基末端融合到氨基酸78至131上(參見圖1)。
本文所公開的并可通過本發(fā)明的方法獲得的Bet v 2、Art v 4、Anac、Api g 4、Mus xp 1、Cor a 2和Dau c 4的抑制蛋白衍生物優(yōu)選用于治療和/或預防可歸因于抑制蛋白過敏反應的花粉-食物致敏。


通過下列實施例和附圖進一步描述本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。
圖1顯示了MP12(本發(fā)明的改組Phl p 12過敏原)與Phl p 12野生型相比一級結(jié)構(gòu)的示意圖；圖2顯示了Phl p 12野生型和MP12的CD譜。對于一定范圍的波長(x-軸)，顯示Phl p 12和衍生MP12的平均殘基橢圓率[Θ](y-軸)。
圖3顯示了載有用聚脯氨酸柱處理的重組MP12片段的14％SDSPAGE的Coomassie染色。M道代表分子量標記，第1道代表流過部分，第2-4道代表洗出(wash)部分，第5-6道代表洗脫部分。分子量(kDa)顯示在左邊界上；圖4顯示了硝化纖維素打點的Phl p 12和MP12的IgE反應性。使打點的蛋白質(zhì)以及用于陰性對照用途的人血清白蛋白(HSA)暴露在來自24個Phl p 12-過敏患者的血清中(第1-24道)。N道代表來自非過敏對照個體的血清。用抗-人IgE抗體檢測結(jié)合的IgE抗體。
圖5顯示了在兩個Phl p 12過敏患者中嗜堿組胺釋放的誘發(fā)。用各種濃度(x-軸)的Phl p 12(正方形)和MP12(圓形)培養(yǎng)患者的粒細胞。釋放到上清液中的總組胺的百分比顯示在y-軸上。
圖6顯示了兔抗血清與來自梯牧草、樺樹和艾蒿花粉的抑制蛋白的反應性。通過ELISA測試針對Phl p 12(菱形)和MP12(正方形)培養(yǎng)的兔抗血清對Phl p 12(A)、Bet v 2(B)和艾蒿抑制蛋白(C)的反應性。血清的稀釋度顯示在x-軸上，相應的OD值顯示在y-軸上。相應的免疫前血清沒有表現(xiàn)出任何反應性；圖7顯示了抗-rPhl p 12(P12)和抗-MP12-誘發(fā)的IgG對rPhl p 12誘發(fā)的嗜堿細胞脫粒的抑制。已經(jīng)在大鼠嗜堿細胞中加載Phl p 12特異性小鼠IgE；圖8顯示了Der p 2雜種(根據(jù)本發(fā)明的改組Der p 2過敏原)與Der p 2野生型相比的一級結(jié)構(gòu)和生成(generation)的示意圖；圖9顯示了Coomassie染色的SDS-PAGE，其含有作為his-標記蛋白質(zhì)表達rDer p 2和rDer p 2衍生物的BL21蛋白質(zhì)提取物(DE3)(第1道)、純化rDer p 2、rDer p 2片段和rDer p 2雜種(第2道)和分子標記物(第M道)。
圖10顯示了純化rDer p 2和rDer p 2衍生物的質(zhì)譜分析。X-軸顯示了質(zhì)量/電荷比率，信號強度作為相對于最強信號的百分比顯示在y-軸上。
圖11顯示了純化重組Der p 2、rDer p 2片段和rDer p 2雜種的遠紫外線CD譜。蛋白質(zhì)的光譜表示為在給定波長(x-軸)下的平均殘基橢圓率(y-軸)。
圖12顯示了重組Der p 2和重組Der p 2衍生物的IgE-識別。測試來自17個螨類過敏個體(第1-17道)、非過敏個體(第18道)的血清和不含血清的緩沖液(第19道)與斑點印跡的重組Der p 2、rDer p 2片段、rDer p 2雜種和BSA的IgE反應性。用125I-標記的抗-人IgE抗體檢測結(jié)合的IgE并通過放射自顯影法直觀化。
圖13顯示了通過CD203c表達測得的重組Der p 2和rDer p 2衍生物的嗜堿細胞活化。使來自10個螨類過敏患者的血樣暴露在10微克/毫升重組rDer p 2、單獨Der p 2片段、片段混合物、αIgE或緩沖液中。顯示了三個代表性患者的結(jié)果。通過FACS分析測定CD203c表達并作為平均熒光指數(shù)(MFI)顯示。
圖14顯示了通過CD203c表達測得的重組Der p 2和rDer p 2衍生物的嗜堿細胞活化。使來自相同的10個螨類過敏患者的血樣暴露在幾種濃度的rDer p 2和rDer p 2雜種、αIgE或緩沖液(x-軸)中。顯示了六個代表性患者的結(jié)果。通過FACS分析測定CD203c表達并作為刺激指數(shù)(SI)顯示。
圖15顯示了用rDer p 2和rDer p 2衍生物使小鼠免疫而誘發(fā)的Derp 2特異性IgG1的演化。用純化rDer p 2或rDer p 2衍生物使各由5只小鼠組成的組免疫，并通過ELISA測定誘發(fā)的IgG1抗體。Y-軸上顯示的光密度值(OD 405納米)對應于小鼠血清中的IgG1抗體水平。結(jié)果作為盒狀圖顯示，其中50％的值在盒內(nèi)且在條(bars)之間沒有無關值。盒內(nèi)的線代表中間值。開圓和星形代表各個小鼠組的無關值和極限。
圖16顯示了通過從RBL細胞中釋放出β-氨基己糖苷酶而直觀化的rDer p 2衍生物的低體內(nèi)致敏活性。在大鼠嗜堿白血病(RBL)細胞中加載用rDer p 2野生型過敏原和rDer p 2衍生物免疫接種之前(免疫前血清)和之后(免疫血清)獲得的小鼠血清。用rDer p 2誘發(fā)β-氨基己糖苷酶的釋放，并顯示為總β-氨基己糖苷酶釋放的百分比(來自各個小鼠組的5份血清的平均值±SD)(y-軸)。
圖17顯示了兔抗血清與來自梯牧草花粉(Phl p 12)、樺樹花粉(Betv 2)、艾蒿花粉(Art v 4)、腰果花粉(Ana c)、芹菜(Api g 4)、香蕉(Mus xp 1)、榛子(Cor a 2)和胡蘿卜(Dau c 4)的抑制蛋白的反應性。通過ELISA測試針對Phl p 12(菱形)和MP12(正方形)培養(yǎng)的兔抗血清對所述抑制蛋白的反應性。血清稀釋度顯示在x-軸上，相應的OD值顯示在y-軸上。相應的免疫前血清沒有表現(xiàn)出任何反應性。
具體實施例方式
實施例在實施例1至5中，通過抑制蛋白過敏原、梯牧草花粉抑制蛋白Phlp 12例證本發(fā)明的原理。實施例6至11涉及主要螨類(屋塵螨)過敏原，Der p 2。實施例12和13顯示了Phl p 12與梯牧草花粉以外的其它來源的抑制蛋白的交叉反應性，因此證實使用Phl p 12衍生物作為由其它抑制蛋白引起的過敏癥的疫苗的適用性。
實施例1來自梯牧草花粉抑制蛋白的低致敏衍生物的表征a)來自梯牧草花粉抑制蛋白的低致敏變體，Phl p 12的生成、表達和提純使用重疊PCR技術進行重組Phl p 12-衍生物的遺傳工程學。PCR模板是為梯牧草花粉抑制蛋白，Phl p 12編碼的cDNA，在pet17b表達載體中亞克隆。使用下列引物生成用于蛋白質(zhì)提純的含有重疊序列以及NdeI和EcoRI限制位點和為羧基末端6x Histidin殘基編碼的序列的兩個PCR片段。對于片段1，使用引物MDE-15’CATATGAGGCCCGGCGCGGTCATC3’和引物MDE-25’GTACGTCTGCCACGCCATCATGCCTTGTTCAAC3’，對于片段2，使用引物MABC-15’GTTGAACAAGGCATGATGTCGTGGCAGACG3’和引物MABC-25’GAATTCTTAATGGTGATGGTGATGGTGACCCTGGATGACCATGTA3’。在下一步驟中，如所述獲得的兩種PCR產(chǎn)品均作為模板用于使用引物MDE-1和MABC-2的重疊PCR反應以生成為Phl p 12衍生物(即MP12)編碼的DNA(示意性顯示在圖1中)。將MP-12編碼DNA克隆到pBluescript載體體系(Stratagene)中，并通過雙鏈定序法(MWGBiotech，Germany)確定DNA序列。
為了蛋白質(zhì)提純，MP12-編碼cDNA必須使用NdeI和EcoRI限制酶亞克隆到pet17b表達載體體系中，并再通過雙鏈定序法(MWGBiotech)確定DNA序列。
對于蛋白質(zhì)提純，MP-12在液體培養(yǎng)物中在大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene，East Kew，Australia)中表達。使大腸桿菌在含100毫克/升氨芐青霉素的LB-培養(yǎng)基中生長至0.4的OD600。通過添加異丙基-b-硫代半乳糖苷至1mM的最終濃度并進一步在37℃再培養(yǎng)4小時，誘發(fā)重組蛋白質(zhì)的表達。通過離心收取來自500毫升培養(yǎng)物的大腸桿菌細胞，再懸浮在緩沖液A(100mM NaH2PO4，10mM Tris，8M脲，pH 7.5)中。以20,000rpm離心30分鐘后，將上清液轉(zhuǎn)移到Ni-NTA瓊脂糖柱(Quiagen，Hilden，Germany)中，并使用具有遞減pH值的緩沖液A進行6x His-標記MP12蛋白質(zhì)的洗脫。蛋白質(zhì)在4.9的pH值下洗脫，隨后通過含有6-0M脲的緩沖液A，pH 7.5逐步滲析來折疊(refolded)。最終滲析步驟用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)進行，其中如離心實驗所示MP12可溶。
通過SSDS PAGE確認蛋白質(zhì)純度并使用Micro BCA試劑盒(Pierce，USA)進行量化。
b)二級結(jié)構(gòu)分析在Jasco J-715分光偏振器上使用在20℃平衡的0.1厘米路徑長度小室進行圓二色性(CD)測量。以100納米/分鐘的掃描速度用0.5納米分辨率記錄光譜，結(jié)果獲自3次掃描的平均。通過減去在相同條件下獲得的相應MilliQ光譜，對最終光譜進行基線校準。結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)評估程序J-700相符。
結(jié)果顯示出衍生物的相當量的二級結(jié)構(gòu)。Phl p 12的光譜以在218納米的最小值和小于200納米的強最大值為特征，而衍生物的最小值轉(zhuǎn)移至較小波長，且曲線的零交叉低于200納米(圖2)。這些發(fā)現(xiàn)表明了無規(guī)線圈二級結(jié)構(gòu)在衍生物內(nèi)的遞增比例。
c)低致敏Phl p 12衍生物缺乏對聚脯氨酸的親合力對聚脯氨酸的親合力是來自各種生物體的抑制蛋白的共有特征。經(jīng)證實，低致敏Phl p 12衍生物，MP12，不結(jié)合聚脯氨酸，因此表現(xiàn)出改變的生物化學性質(zhì)。
將在PBS中的大約5微克純化重組MP12在用PBS平衡的裝有聚脯氨酸的CnBr活化瓊脂糖柱(Amersham Bioscience，Uppsala，Sweden)處理。在收集流過物之后，將該柱用3體積(PBS)洗滌，并用5×1毫升分別含有2M或6M脲的PBS進行洗脫。對流過物、洗出部分和洗脫部分的10微升等分試樣進行14％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS PAGE)并通過Commassie染色使蛋白質(zhì)直觀化(圖3)。結(jié)果表明由Phl p 12的一級結(jié)構(gòu)的重組造成的聚脯氨酸結(jié)合位點的缺失。
實施例2MP12的IgE結(jié)合能力的降低a)MP12表現(xiàn)出顯著降低的IgE結(jié)合能力使用來自24個抑制蛋白致敏患者的血清，通過斑點分析法，將重組MP12的IgE結(jié)合能力與重組Phl p 12野生型進行比較(圖4)。將Phl p 12和MP12以及對照用的人血清白蛋白(HSA)點到硝化纖維素上，并用來自24個抑制蛋白致敏患者的血清探測。使用125I-標記抗-人-IgE抗體檢測結(jié)合的IgE抗體。所有患者均表現(xiàn)出與Phl p 12野生型的IgE反應性，而24個患者中無一與MP12或與對照蛋白質(zhì)HSA反應(圖4)。
為了量化MP12的IgE結(jié)合能力的降低，實施流體相抑制。為此，將來自6個抑制蛋白致敏患者的血清用10微克Phl p 12或用MP12預培養(yǎng)，隨后用ELISA板-結(jié)合Phl p 12(5微克/毫升)培養(yǎng)。用堿性磷酸酶-標記的抗-人IgE抗體(Pharmingen)檢測結(jié)合的IgE抗體。用下式計算IgE結(jié)合的抑制抑制％＝100×[(A-B)/A]；A代表用BSA培養(yǎng)血清后獲得的代表性OD值，B代表分別用Phl p 12或MP12培養(yǎng)血清后的OD值。
MP12抑制IgE與Phl p 12結(jié)合的能力在表2中作為抑制％顯示，對于MP12，其為20-40％，平均抑制為31.2％，而Phl p 12實現(xiàn)的抑制為76-91(平均86％)。
表2使用Phl p 12和MP12，對抗體與固定Phl 12結(jié)合的抑制。通過用Phl p 12野生型或MP12預培養(yǎng)來自6個抑制蛋白致敏患者的血清，抑制IgE抗體結(jié)合。計算并顯示抗體結(jié)合的平均抑制。

b)MP12表現(xiàn)出降低的致敏活性接著，比較改組Phl p 12與Phl p 12野生型誘發(fā)從來自抑制蛋白致敏患者的嗜堿細胞中釋放出組胺的能力。
通過葡聚糖沉降，從梯牧草花粉過敏患者的肝素化血樣中分離出粒細胞。分離之后，將細胞用各種濃度的Phl p 12、MP12或?qū)φ沼玫膯慰寺】?人IgE抗體(Immunotech，Marseille，F(xiàn)rance)培養(yǎng)。通過放射免疫測定法(Immunotech)測量釋放到上清液中的組胺。在細胞凍-融后測定總組胺。結(jié)果表示為重復測定的平均值，并代表總組胺的百分比。
如圖5中所例證，Phl p 12在來自兩種患者的嗜堿細胞中誘發(fā)強的和劑量依賴型的組胺釋放，其在10-5至10-4微克/毫升的濃度下產(chǎn)生最大組胺釋放，而使用mp12，在直至10-2微克/毫升的濃度下也沒有觀察到組胺釋放，這表明致敏活性降低了1000倍以上。此外，添加MP12后嗜堿細胞的最大組胺釋放明顯低于用Phl p 12野生型實現(xiàn)的量。
實施例3用MP12免疫接種誘發(fā)了IgG抗體，其識別出Phl p 12野生型以及來自其它花粉的抑制蛋白。
為了測試用改組Phl p 12免疫接種是否誘發(fā)與Phl p 12野生型和來自其它花粉的抑制蛋白反應的IgG抗體，使用Freund’s完全和不完全佐劑(200微克/次注射)(Charles River，Kisslegg，Germany)，用Phl p 12或MP12將兔子免疫三次。以四周為間隔獲得血清樣品。將血清儲存在-20℃直至分析。
通過ELISA分析MP12和Phl p 12誘發(fā)的IgG抗體的反應性(圖6)。將Phl p 12以及來自樺樹(Bet v 2)和艾蒿的抑制蛋白涂布到ELISA板上(5微克/毫升)，并用兔抗血清的連續(xù)稀釋物(1∶2000-1∶64000)培養(yǎng)。用1∶1000稀釋的過氧化物酶標記的驢抗-兔抗血清(AmershamPharmacia Biotech)檢測結(jié)合的兔抗體。
MP12誘發(fā)IgG抗-Phl p 12抗體應答，其與用Phl p 12野生型誘發(fā)的相當(圖6A)。此外，Phl p 12-和MP12誘發(fā)的IgG抗體均與來自樺樹和艾蒿的抑制蛋白交叉反應(圖6B，C)。
實施例4抗-MP12抗體抑制了來自草花粉過敏患者的血清IgE與完整Phl p 12的結(jié)合。
通過ELISA競爭檢定法研究MP12誘發(fā)的兔IgG抑制過敏患者的IgE與Phl p 12結(jié)合的能力。ELISA板(Nunc Maxisorp，Rosklide，Denmark)用Phl p 12(1微克/毫升)涂布并用抗-MP12抗血清或Phl p12-抗血清各自的1∶250稀釋物和用對照用的相應免疫前血清預培養(yǎng)。洗滌后，用來自7個Phl p 12致敏草花粉過敏患者的1∶3稀釋血清培養(yǎng)板，并用稀釋1∶1000的單克隆鼠抗人IgE抗體(Pharmingen，San Diego，CA)，然后用1∶2000稀釋的HRP偶聯(lián)羊抗鼠Ig抗血清(Amersham)檢測結(jié)合IgE抗體。用抗-肽或抗-突變體抗血清預培養(yǎng)實現(xiàn)的對IgE結(jié)合的抑制百分比如下計算IgE結(jié)合的抑制％＝100-ODI/ODp×100。ODI和ODp分別代表用兔免疫血清和相應的免疫前血清預培養(yǎng)之后的衰減(extinctions)。如表3中所示，用抗-Phl p 12抗體實現(xiàn)的對患者IgE與Phl p 12結(jié)合的抑制為30.2-66.7％(49.8％的平均抑制)。同樣地，使用針對MP12培養(yǎng)的抗體觀察到抗-Phl p 12IgE反應性的顯著降低，為10.8-27.6％(20.8％平均抑制)(表3)。
表3兔抗體對過敏患者的IgE與rPhl p 12結(jié)合的抑制。對于7個Phl p 12過敏患者，表示用兔抗血清(兔抗-Phl p 12，抗-MP12)預培養(yǎng)實現(xiàn)的對IgE與rPhl p 12結(jié)合的抑制百分比，并顯示計算出的平均抑制。

實施例5抗-MP12抗血清抑制嗜堿細胞脫粒。在指定細胞模型系統(tǒng)中使用加載了過敏原特異性IgE的鼠嗜堿細胞白血病(RBL)細胞研究肽誘發(fā)IgG抗體的生物關聯(lián)性和可能的保護能力。
將RBL-2H3細胞在96孔組織培養(yǎng)板(4×104個細胞/孔)中平板接種，使用7％CO2在37℃培養(yǎng)24小時。用最終稀釋度為1∶30的含有抑制蛋白反應性IgE的鼠血清進行被動致敏2小時。通過在Tyrode’s緩沖液(137mM NaCl、2.7mM KCl、0.5mM MgCl2、1.8mM CaCl2、0.4mMNaH2PO4、5.6mM D-葡萄糖、12mM NaHCO3、10mM HEPES和0.1％w/vBSA，pH 7.2)中洗滌細胞層2次，去除未結(jié)合的抗體。使預先加載了Phl p 12-特異性鼠IgE的RBL細胞暴露在rPhl p 12(0.005微克/毫升)中。將Phl p 12在Tyrode’s緩沖液中用0、2、5、7.5或10％v/v來自Phl p 12-免疫兔、MP12-免疫兔的兔抗血清或相應的免疫前血清在37℃預培養(yǎng)2小時。
將預培養(yǎng)Phl p 12在濕潤氣氛中在37℃添加到RBL細胞中30分鐘，并通過用80μM 4-甲基傘形基-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷(Sigma-Aldrich，Vienna，Austria)在檸檬酸鹽緩沖液(0.1M，pH 4.5)中在37℃培養(yǎng)1小時來分析它們上清液的β-氨基己糖苷酶活性。添加100微升氨基乙酸緩沖液(0.2M氨基乙酸，0.2M NaCl，pH 10.7)終止反應，并使用熒光微板讀數(shù)器(Spectrafluor，Tecan，Austria)在λex360/λem465納米測量熒光。結(jié)果表示為熒光單位和用1％Triton X-100溶解細胞后釋放出的總β-氨基己糖苷酶的百分比。
如圖7中所例證，用遞增濃度(2-10％v/v)的兔抗-MP12抗體和用兔抗-Phl p 12抗體預培養(yǎng)Phl p 12均導致對rPhl p 12誘導的從已經(jīng)預先加載Phl p 12-特異性鼠IgE的RBLs中進行介質(zhì)釋放的劑量依賴型抑制。當過敏原用相同濃度的免疫前Ig預培養(yǎng)時，沒有觀察到嗜堿細胞脫粒的抑制。
實施例6來自屋塵螨過敏原Der p 2(Der p 2雜種)的低致敏衍生物的表達、提純和表征屋塵螨(HDM)過敏反應屬于世界上最常見的過敏反應，其侵擾超過50％的過敏患者。在歐洲，屋塵螨被確定為屋塵中最重要的過敏原來源。
迄今已經(jīng)識別出20組螨過敏原，組2過敏原被確定為主要螨過敏原，其使80％以上的螨過敏患者過敏且主要位于螨排泄物中。組2過敏原首先以具有高IgE結(jié)合活性的14000-18000Da過敏原為特征。為Der p 2編碼的cDNA克隆的分離和分析表明，Der p 2包含具有129個氨基酸殘基、分子量計算值為14000Da且沒有N-糖基化位點的過敏原。組2過敏原含有三個二硫鍵并由兩個反向平行β-片層構(gòu)成。Der p 2的T-細胞抗原決定簇位于蛋白質(zhì)的所有區(qū)域中，且IgE-抗原決定簇表現(xiàn)為是構(gòu)象的(conformational)。
用粗制螨提取物進行的免疫療法研究已經(jīng)證實，在用HDM提取物進行免疫療法的過程中可能發(fā)生危險的全身副作用(Akcakaya，N.，等人(2000)Ann Allergy Asthma Immunol 85317)以及誘發(fā)對海鮮的新IgE反應性(Van Ree，R.，等人(1996)Allergy 51108)。
為了克服提取物基免疫療法的缺點，已經(jīng)使用幾種方案開發(fā)低致敏過敏原衍生物。在Der p 2的情況下，通過定點誘變破壞二硫鍵、通過氨基-和羧基-末端刪除破壞二硫鍵、或引入突變，由此開發(fā)出具有降低的IgE反應性的突變體。但是，它們的生物活性是有疑問的。
在下列實施例中，制造屋塵螨組2過敏原(Der p 2)的兩個包含aa 1-53和aa 54-129的重組片段，以破壞構(gòu)象B-細胞抗原決定簇和保持主要的T-細胞抗原決定簇。此外，構(gòu)造重組Der p 2雜種分子(aa54-129+1-53)，其中兩個rDer p 2片段通過PCR基基因SOEing倒序重組。
通過如實施例1所述的PCR-擴增構(gòu)建Der p 2的包含氨基酸(aa)1-53和aa54-129的兩個重組片段(參見圖8)。通過PCR基基因SOEing(Linhart等人，F(xiàn)ASEB J.16(2002)，1301-1303)倒序(aa 54-129+1-53)生成Der p 2雜種分子。
a)Der D 2、Der D 2片段和Der D 2雜種在大腸桿菌中的表達和提純使用如表4中所示的引物(MWG，Ebersberg Germany)通過PCR擴增生成為His-標記的Der p 2、Der p 2片段(aa 1-53和aa 54-129)和Der p 2雜種(aa 54-129+1-53)編碼的cDNAs，并通過由Der p RNA逆轉(zhuǎn)錄來獲得Der p 2 cDNA。
表4 顯示了正向(F)、反向(R)和重疊引物。EcoRI位點和NdeI位點加了下劃線。為His-tags編碼的核苷酸顯示在粗斜體字母中。
引物1和4用于rDer p 2 c DNA的擴增，引物1和2用于rDer p 2片段1(aa 1-53)的編碼cDNA，引物3和4用于rDer p 2片段2(aa54-129)的cDNA。使用引物2和3和兩個重疊引物5和6通過PCR基基因SOEing生成r Derp 2雜種。上游引物含有NdeI和EcoRI位點，下游引物含有EcoRI位點以及6個His密碼子。用NdeI/EcoRI切下PCR產(chǎn)物，凝膠提純并亞克隆到質(zhì)粒pET17b的NdeI/EcoRI位點中。使用氯化鈣法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌株XL-1 B1ue中。通過NuceloBond AX試劑盒-maxi-prep(Macherey-Nagel，Germany)分離質(zhì)粒DNA并通過在自動化定序系統(tǒng)(MWG，Germany)上將兩條DNA束測序來確定cDNA插入物的序列。
通過用0.5mM異丙基-b-硫代半乳糖苷(IPTG)在1的OD600下在37℃培養(yǎng)5小時，在液體培養(yǎng)物中在大腸桿菌株BL21(DE3)中表達含羧基末端六聚組氨酸尾的重組蛋白質(zhì)。通過在4℃以4,000x g離心15分鐘，收取細胞。
將獲自11個液體培養(yǎng)物的細菌沉淀物(pellet)再懸浮在10毫升25mM咪唑，pH 7.4，0.1％v/v Triton X-100中，并用100微克溶菌酶在室溫處理30分鐘。通過3個冷凍/解凍循環(huán)(-70℃/+50℃)裂解細胞。通過用1微克Dnase I在室溫培養(yǎng)10分鐘，使DNA降解，并通過在4℃以10,000x g離心30分鐘來去除細胞碎片。在可溶部分中發(fā)現(xiàn)rDer p 2片段1并在Ni-NTA樹脂親和柱(QIAGEN，Germany)上在天然條件下提純。
在用8M脲、100mM NaH2PO4、10mM Tris-Cl，pH 8在室溫增溶60分鐘的包含體部分中的沉淀物中發(fā)現(xiàn)rDer p 2、rDer p 2片段2和rDerp 2雜種。通過離心(10,000x g，15分鐘，4℃)去除不溶殘余物，并在Ni-NTA樹脂親和柱(QIAGEN)上在變性條件下提純rDer p 2、rDerp 2片段2和rDer p 2雜種。
使含有超過90％純度的重組蛋白質(zhì)的部分對50mM NaH2PO4pH 7滲析，并通過Micro BCA蛋白質(zhì)檢定試劑盒(Pierce，USA)測定最終蛋白質(zhì)濃度。
上述雜種分子的構(gòu)造中斷了Der p 2的兩個β-片層中的至少一個片層和C8與C119之間的二硫鍵，并由此破壞Der p 2的構(gòu)象IgE抗原決定簇和保存主要的T-細胞抗原決定簇。rder p 2衍生物過度表達，因為大腸桿菌中的可見帶產(chǎn)生明顯的積聚(圖9，第1道)。在可溶部分中發(fā)現(xiàn)rDer p 2片段1，而其它蛋白質(zhì)積聚在不溶包含體部分中，但可以在脲中增溶。rDer p 2和rDer p 2衍生物通過鎳親和色譜法(圖9，第2道)提純，產(chǎn)生20至30毫克蛋白質(zhì)/升大腸桿菌培養(yǎng)物。在通過滲析折疊后，rDer p 2、rDer p 2片段1和rDer p 2雜種在生理緩沖液中以0.5毫克/毫升至1毫克/毫升的濃度保持可溶，而rDer p 2片段2僅以低于0.1毫克/毫升的濃度保持可溶。SDS-PAGE分析表明，蛋白質(zhì)純度高于90％，其以單體形式和二聚物形式遷移(圖9，第2道)。
b)rDer p 2和rDer p 2衍生物的基質(zhì)輔助激光解吸和電離飛行時間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析用飛行時間Compact MALDI II設備(Kratos，U.K.；piCHEM，Austria)以線型模式獲取激光解吸質(zhì)譜。將樣品溶于10％乙腈、0.1％三氟乙酸，并使用α-氰基-4羥基-肉桂酸(溶于60％乙腈、0.1％三氟乙酸)作為基質(zhì)。對于樣品制備，將蛋白質(zhì)與基質(zhì)溶液的1∶1混合物沉積到靶上，并風干。
通過MALDI-TOF質(zhì)譜法分析四種蛋白質(zhì)，表明對于rDer p 2、rDerp 2片段1、rDer p 2片段2和rDer p 2雜種，分子量分別為15072.9Da、6806.7Da、9216.3Da和15001.8Da，這與由其氨基酸序列計算出的蛋白質(zhì)的理論質(zhì)量相符(圖10)。
c)圓二色性(CD)分析在已經(jīng)根據(jù)制造商的建議用釹玻璃進行波長校準的JASCO J715分光偏振器上記錄純化重組蛋白質(zhì)的CD譜。在室溫下用溶于重蒸餾水的rDer p 2和rDer p 2衍生物(c＝0.1至0.5毫克/毫升)進行CD測量。使用路徑長度為0.1厘米的圓形石英比色皿，并以50納米/分鐘的掃描速度用0.2納米分辨率記錄光譜。通過累積至少三次掃描來對該光譜進行信號平均，結(jié)果表示為在給定波長下的平均殘基橢圓率。
純化重組Der p 2的遠紫外線CD譜表現(xiàn)出在217納米的負帶，表明β-片層構(gòu)象(圖11)。相反，rDer p 2衍生物的CD譜表明這些蛋白質(zhì)主要無折疊。rDer p 2片段1表現(xiàn)出由在大約200納米的負帶確定的典型的無規(guī)線圈構(gòu)象。rDer p 2片段2也表現(xiàn)出主要的無規(guī)線圈構(gòu)象，盡管信號強度非常低。rDer p 2雜種譜主要吸附具有少量β-片層結(jié)構(gòu)的無規(guī)線圈構(gòu)象(圖11)?？梢酝ㄟ^圓二色性分析證實三維構(gòu)象的破壞，其表明與rDer p 2野生型相比，rDer p 2衍生物中β片層-結(jié)構(gòu)的缺失和減少。
實施例7重組Der p 2雜種(rDer p 2雜種)表現(xiàn)出顯著降低的IgE結(jié)合能力。
通過非變性斑點印跡分析法測試純化重組Der p 2、兩個rDer p 2片段——片段1(aa 1-53)和片段2(aa 54-129)——和rDer p 2雜種的IgE反應性。將2微升純化蛋白質(zhì)(0.1毫克/毫升)和對照用的BSA點到硝化纖維素膜帶(Shleicher & Schuell，Germany)上。將含有斑點印跡蛋白質(zhì)的硝化纖維素帶在緩沖液A(40mM Na2HPO4、0.6mMNaH2PO4，pH 7.5，0.5％[v/v]Tween 20，0.5％[w/v]BSA，0.05％[w/v]NaN3)中封閉，并用來自螨類過敏患者的血清、來自非過敏個體的血清(稀釋1∶10)和無血清緩沖液A培養(yǎng)。用125I標記的抗-人IgE抗體檢測結(jié)合的IgE抗體并通過放射自顯影術直觀化。
通過非變性斑點印跡分析法將rDer p 2野生型過敏原的IgE結(jié)合能力與兩個rDer p 2片段和rDer p 2雜種進行比較。來自17個螨類過敏個體的血清(第1-17道)表現(xiàn)出與硝基纖維素打點的rDer p 2的不定的IgE反應性，而幾乎沒有檢測出與rDer p 2片段1的IgE反應性。只有3個血清表現(xiàn)出非常微弱的與rDer p 2片段2的結(jié)合且2個血清預rDer p 2雜種反應(圖12)。來自非過敏個體的血清以及無血清緩沖液表現(xiàn)出對rDer p 2和對rDer p 2衍生物沒有IgE反應性(圖12，第18、19道)。沒有發(fā)現(xiàn)對對照蛋白質(zhì)——BSA的IgE反應性(圖12)。由于構(gòu)象缺失和由此的構(gòu)象IgE-抗原決定簇(參見實施例7)，可以證明，rDer p 2衍生物與rDer p 2野生型相比幾乎完全喪失其IgE結(jié)合能力。
實施例8通過CD 203c表達測得的rDer p 2衍生物的降低的致敏活性從過敏患者中獲得肝素化血樣。將血樣(100微升)用各種濃度的rDer p 2、rDer p 2片段、rDer p 2雜種、單克隆抗-IgE抗體(Immunotech，Marseille，F(xiàn)rance)和PBS培養(yǎng)15分鐘(37℃)。如Hauswirth，A.W.，等人(2002)J Allergy Clin Immunol 100102所述測定CD 203c表達。
CD 203c的上調(diào)已經(jīng)被描述為是過敏原誘發(fā)的嗜堿細胞活化和脫粒的替代指標(Hauswirth，A.W.，等人(2002))。因此，通過在來自屋塵螨過敏患者的嗜堿細胞上測量CD 203c上調(diào)，比較重組Der p 2、rDerp 2片段和rDer p 2雜種的致敏活性(圖13，14)。圖13顯示了來自3個患者的代表性結(jié)果。用10微克/毫升rDer p 2野生型進行的嗜堿細胞培養(yǎng)在各個受試患者中顯著上調(diào)了CD 203c表達，而使用相同濃度的單獨片段或兩個片段的等摩爾混合物，沒有獲得上調(diào)(圖13)。此外，使來自相同10個患者的嗜堿細胞在1∶5稀釋步驟中暴露在不同濃度(5微克/毫升-0.32納克/毫升)的rDer p 2和rDer p 2雜種中。圖14顯示了來自6個代表性患者的結(jié)果。嗜堿細胞與rDer p 2雜種的接觸以40納克/毫升至5000納克/毫升的濃度引起CD 203c表達的上調(diào)，而rDer p2野生型在8-200納克/毫升的濃度誘發(fā)CD 203c的上調(diào)。在10個患者中的8個中，rDer p 2雜種與rDer p 2相比，激活嗜堿細胞的能力降低10倍以上。
抗-人IgE抗體在來自所有患者的嗜堿細胞上引發(fā)CD 203c表達的上調(diào)，而僅用緩沖液沒有獲得任何上調(diào)(圖13+14)。
在來自螨類過敏患者的嗜堿細胞上的CD 203c表達的測定表明rDer p 2雜種與rDer p 2野生型相比降低的生物活性，用rDer p 2片段沒有觀察到生物活性。此外，使用RBL細胞的嗜堿細胞活化檢定法表明，用衍生物誘發(fā)的IgE Abs較不致敏。這些結(jié)果表明，當用于免疫療法時，低致敏rDer p 2衍生物與Der p 2野生型過敏原相比引起較低的IgE介導的副作用。
實施例9rDer p 2衍生物與rDer p 2野生型過敏原類似地在螨類中誘發(fā)rDer p 2特異性IgG抗體各由5只8周大雌BALB/c鼠組成的組用5微克純化蛋白質(zhì)(rDerp 2、rDer p 2片段1、rDer p 2片段2和rDer p 2雜種)免疫，在20周期間內(nèi)以4周為間隔在頸部皮下吸附到200微升AluGel-S(SERVA電泳，Germany)中。在每次免疫前一天收集血樣并儲存在-20℃。
在4℃用在PBS中稀釋的rDer p 2(c＝5微克/毫升)涂布ELISA板(Greiner，Austria)過夜。將板用PBST(PBS；0.05％v/v Tween 20)洗滌，并在室溫下用封閉緩沖液(PBST；1％w/v BSA)封閉3小時。將小鼠血清在PBST中稀釋1∶1000以測量Der p 2-特異性IgG1；在4℃在每孔中添加0.5％w/v BSA和100微升這種稀釋物過夜。
將板用PBST洗滌5次，并用單克隆大鼠抗-小鼠IgG1抗體(BDPharmingen，USA)檢測結(jié)合IgG1抗體，然后如Vrtala，S.，等人(1996)J Allergy Clin Immunol 98913所述添加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體(Amersham Bioscience，Sweden)。
在獲自用rDer p 2和rDer p 2衍生物免疫的小鼠的血清樣品中測定Der p 2特異性IgG1水平。rDerp 2以及rDerp 2衍生物均是致免疫的，并在二次免疫(8周)后誘發(fā)IgG1應答(圖15)。在二次免疫后，用rDerp 2片段1和rDer p 2雜種誘發(fā)的IgG1應答甚至高于用rDer p 2誘發(fā)的應答(圖15)。在最后一次免疫后，用rDer p 2衍生物誘發(fā)的IgG1應答與用rDer p 2野生型分子誘發(fā)的相當(圖15)。
實施例10用rDer p 2衍生物免疫接種而誘發(fā)的IgG1抗體抑制了螨類過敏患者的IgE與rDer p 2野生型的結(jié)合用100微升純化rDer p 2涂布ELISA板(Greiner，Austria)，用PBS稀釋至5微克/毫升的濃度，在4℃過夜。用PBST洗滌兩次并在室溫用封閉緩沖液(PBST；1％w/v BSA)封閉3小時，將板在4℃用抗-rDerp 2、抗-rDer p 2片段1、抗-rDer p 2片段2和抗-rDer p 2雜種抗血清和相應的免疫前血清培養(yǎng)過夜。在PBST；0.5％w/v BSA中將鼠抗血清稀釋1∶20，兔抗血清稀釋1∶100。洗滌之后，用來自螨類過敏患者的1∶10稀釋血清將板在4℃培養(yǎng)過夜，并用如(44，45)所述的在PBST；0.5％w/v BSA中稀釋1∶2500的HRP偶聯(lián)羊抗人IgE抗體(KPL，USA)檢測結(jié)合的人IgE抗體。如下計算對IgE結(jié)合的抑制百分比100-(Ods/Odp)×100，其中Ods和Odp分別代表用免疫血清和免疫前血清預培養(yǎng)后的衰減系數(shù)。
通過ELISA競爭實驗研究用rDer p 2和rDer p 2衍生物免疫接種而誘發(fā)的鼠IgG1抗體對螨類過敏患者的IgE與rDer p 2結(jié)合的抑制能力。
鼠IgG抗體對過敏患者的IgE與rDer p 2野生型結(jié)合的抑制百分比顯示在表5和6中。
用鼠抗-rDer p 2抗體獲得的抑制為61至87％(平均75％)，而鼠抗-rDer p 2雜種抗體、抗-rDer p 2片段1抗體和抗-rDer p 2片段2抗體對血清IgE與rDer p 2野生型結(jié)合的抑制分別為47至76％(平均62％)，48至66％(平均54％)和24至52％(平均41％)(表5)。
表5對IgE結(jié)合的抑制％

在附加實驗中，用純化rDer p 2和三種rDer p 2衍生物將兔子免疫。兔抗-血清抑制螨類過敏患者的IgE與rDer p 2結(jié)合的能力也通過ELISA抑制檢定法測定，結(jié)果與鼠血清的類似(表6)。兔抗-rDer p 2抗體對患者IgE與rDer p 2結(jié)合的抑制為47至89％(平均66％)，而抗-rDer p 2雜種抗體對人IgE結(jié)合的抑制為20至86％(平均59％)。用兔抗-rDer p 2片段抗體獲得的抑制為26至70％(平均52％)，用兔抗-rDer p 2片段2抗體獲得的抑制為32至54％(平均42％)。使用抗-片段1和抗-片段2抗體的混合物，對患者IgE與rDer p 2野生型的結(jié)合的抑制僅略微提高至平均55％(表6)。
表6對IgE結(jié)合的抑制％

小鼠的免疫接種表明所有三種rDer p 2衍生物通過其誘發(fā)IgG抗體應答的能力而產(chǎn)生的免疫原性。每一rDer p 2衍生物誘發(fā)的IgG抗體均抑制了來自螨類過敏患者的IgE與Der p 2的結(jié)合，但與用兩個單獨片段誘發(fā)的IgG抗體相比，甚至與片段1和2的混合物誘發(fā)的IgG抗體相比，rDer p 2雜種誘發(fā)的IgG抗體表現(xiàn)出更好的抑制能力。這些結(jié)果是重要的，因為封閉抗體表明在用重組過敏原的SIT中發(fā)揮主要作用。
小鼠的免疫接種誘發(fā)的抗-rDer p 2和抗-rDer p 2衍生物抗體如ELISA抑制檢定法所示抑制了過敏患者的IgE與rDer p 2的結(jié)合。
Der p 2雜種在本小鼠模型中誘發(fā)封閉抗體；片段改組顯著提高了免疫原性。
實施例11基于rDer p 2衍生物的疫苗與基于rDer p 2野生型的疫苗相比，在體內(nèi)具有降低的變應原性。
在37℃，5％CO2，將大鼠嗜堿細胞白血病(RBL)細胞(亞系RBL-2H3)在細胞培養(yǎng)基(100毫升RPMI 1649，10％FCS，4mM L-谷氨酰胺、2mM丙酮酸鈉、10mM HEPES，100μM2-巰基乙醇、1％Pen/Strep)中平板接種在ELISA板(Nuc，Denmark)上(100微升4×104個細胞)過夜。
在37℃在細胞中加載2微升獲自用rDer p 2、rDer p 2片段1、rDerp 2片段2和rDer p 2雜種免疫接種的小鼠的血清2小時，用200微升Tyrode/BSA緩沖液(137mM NaCl、2.7mM KCl、0.5mM MgCl2、1.8mMCaCl2、0.4mM NaH2PO4、5.6mM D-葡萄糖、12mM NaHCO3、10mM N-2-羥乙基-哌嗪-N’-2-乙烷磺酸(HEPES)、0.1％牛血清白蛋白，pH 7.2)(Sigma-Aldrich，Austria)洗滌兩次并用rDer p 2(c＝0.3微克/毫升)刺激。通過添加10微升10％v/v Triton X-100(Merck，Germany)，誘發(fā)總β-氨基己糖苷酶釋放。
為了測量β-氨基己糖苷酶的釋放，將50微升化驗溶液(80μM4-甲基傘形基-N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷，在0.1M檸檬酸鹽緩沖液中，pH 4.5)用50微升上清液在37℃，5％CO2培養(yǎng)1小時。
添加100微升對羥苯基甘氨酸緩沖液(0.2M甘氨酸、0.2M NaCl，pH 10.7)終止反應，并使用熒光微板讀數(shù)器(Dynatech MR 7000，Dynatech Laboratories，USA)在λex360λem465納米測量熒光。結(jié)果表示為總β-氨基己糖苷酶釋放的平均百分比。
為了研究用rDer p 2衍生物免疫接種是否誘發(fā)對Der p 2野生型過敏原的過敏免疫應答，分別用rDer p 2、rDer p 2片段1、rDer p 2片段2和rDer p 2雜種將小鼠免疫。然后使用來自小鼠的血清樣品加載RBL細胞以通過RBL脫粒實驗量化對rDer p 2野生型過敏原的過敏免疫應答。在載有鼠抗-rDer p 2片段1、抗-rDer p 2片段2和抗-rDer p 2雜種抗體的RBLs中用rDer p 2野生型過敏原獲得的釋放為0至16.6％(平均6.4％)，0.2至28.6％(平均13.2％)和4.7至37.1％(平均18.3％)，而載有抗-rDer p 2野生型抗體的RBLs在用rDer p 2野生型刺激后的釋放為35至39％(平均37％)(圖16)。
實施例12MP12誘發(fā)的IgG抗體，其識別出Phl p 12野生型、來自其它花粉的抑制蛋白和植物-食品源抑制蛋白。
為了測試用MP12免疫接種后誘發(fā)的抗體是否識別來自花粉以及來自植物源食品的抑制蛋白，進行ELISA實驗。
將來自梯牧草花粉(Phl p 12)、樺樹花粉(Bet v 2)、艾蒿花粉(Artv 4)、和來自不同植物食品，腰果(Ana c)、芹菜(Api g 4)、香蕉(Musxp 1)、榛子(Cor a 2)和胡蘿卜(Dau c 4)的抑制蛋白涂布到ELISA板(5微克/毫升)上，并用兔抗血清的連續(xù)稀釋物(1∶2000-1∶64000)培養(yǎng)。用POX標記的驢抗兔抗血清檢測結(jié)合的兔抗體。
MP 12誘發(fā)的IgG抗體應答與Phl p 12野生型誘發(fā)的相當(圖17)。Phl p 12和P12誘發(fā)的Ig抗體均與來自花粉(草、樹、雜草)的proflins和植物源食品抑制蛋白交叉反應(圖17)。
實施例13抗-MP12抗體抑制了來自草花粉過敏患者的血清IgE與完整Phl p 12以及與來自其它花粉的抑制蛋白(樹和雜草)和與植物食品抑制蛋白的結(jié)合。
通過ELISA競爭實驗研究MP12誘發(fā)的兔IgG抑制過敏患者的IgE與Phl p 12、與來自不同花粉的抑制蛋白和與植物食品源抑制蛋白結(jié)合的能力。
用來自梯牧草(rPhl p 12)、樺樹花粉(rBet v 1)、胡蘿卜(rDau c4)、榛子(rCor a 2)、香蕉(rMus xp 1)和腰果(rAna c)的抑制蛋白涂布ELISA板(Nunc Maxisorp，Denmark)，并用抗-Phl p 12抗血清、抗-MP 12抗血清的1∶50稀釋物和用對照用的相應免疫前血清預培養(yǎng)。洗滌后，將板用1∶3稀釋的來自8個抑制蛋白過敏患者的血清培養(yǎng)，并用HRP標記的來自羊的抗人IgE抗血清(KPL，USA)檢測結(jié)合的IgE抗體。用抗-Phl p 12和抗-MP 12抗血清預培養(yǎng)實現(xiàn)的對IgE結(jié)合的抑制百分比如下計算對Ig結(jié)合的抑制％＝100-ODI/ODP×100。ODI和ODP分別代表用兔免疫血清和相應的免疫前血清預培養(yǎng)后的衰減(表7)。
表7對IgE與下列材料的結(jié)合的抑制百分比

用Phl p 12誘發(fā)的抗體和MP12誘發(fā)的抗體實現(xiàn)的對IgE與梯牧草花粉抑制蛋白結(jié)合的平均抑制分別相當于83.8％和72.3％(表7)。與用Phl p 12誘發(fā)的抗體(平均抑制64.8％)相比，用MP12特異性抗體更強地抑制了IgE與樺樹花粉抑制蛋白，Bet v 2的結(jié)合(平均抑制74.5％)。兩種抗血清在非常相似的程度上抑制了IgE與植物食品抑制蛋白的結(jié)合(Cor a 2用抗-Phl p 12-IgG 62.3％平均抑制，用抗-MP12-IgG 58.1％；Dau c 4用抗-Phl p 12-IgG 73.3％平均抑制，用抗-MP12-IgG 74.6％；Ana c 1用抗-Phl p 12-IgG 56.8％平均抑制，用抗-MP12-IgG 53.6％)?？?MP 12-IgG(36.1％)與抗-Phl p 12-誘發(fā)的IgG(71.4％)相比，只較低抑制了IgE與香蕉抑制蛋白的結(jié)合(表7)。
抑制蛋白代表了在所有真核細胞中表達的過敏原并因此代表可能在過敏患者中引發(fā)吸入式過敏癥(例如rhinoconjunctivits、哮喘)以及口服后的口腔過敏癥狀(嘴唇和舌頭發(fā)癢和腫脹)的pan-過敏原。
重組Phl p 12衍生物，MP12，在免疫后誘發(fā)識別來自花粉以及來自植物源食品的抑制蛋白的IgG抗體。MP12誘發(fā)的抗體抑制了患者的血清IgE與來白花粉的抑制蛋白以及與植物食品源抑制蛋白的結(jié)合。因此，MP12適用于治療可歸因于抑制蛋白過敏反應的花粉-食品交叉致敏。
序列表<110>碧歐美產(chǎn)品及海德爾公司<120>蛋白質(zhì)過敏原衍生物<130>R 46550<140>PCT/AT2005/000486<141>2005-12-02<150>AT A 2028/2004<151>2004-12-02<160>12<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>24<212>DNA<213>人工<220>
<223>人工序列<400>1catatgaggc ccggcgcggt catc<210>2<211>33<212>DNA<213>人工<220>
<223>人工序列<400>2gtacgtctgc cacgccatca tgccttgttc aac<210>3<211>30<212>DNA<213>人工
<220>
<223>人工序列<400>3gttgaacaag gcatgatgtc gtggcagacg 30<210>4<211>45<212>DNA<213>人工<220>
<223>人工序列<400>4gaattcttaa tggtgatggt gatggtgacc ctggatgacc atgta45<210>5<211>130<212>PRT<213>Phleum pratense<400>5Met Ser Trp Gln Thr Tyr Val Asp Glu His Leu Met Cys Glu Ile Glu1 5 10 15Gly His His Leu Ala Ser Ala Ala Ile Leu Gly His Asp Gly Thr Val20 25 30Trp Ala Gln Ser Ala Asp Phe Pro Gln Phe Lys Pro Glu Glu Ile Thr35 40 45Gly Ile Met Lys Asp Phe Asp Glu Pro Gly His Leu Ala Pro Thr Gly50 55 60Met Phe Val Ala Gly Ala Lys Tyr Met Val Ile Gln Gly Glu Pro Gly
65 70 75 80Ala Val Ile Arg Gly Lys Lys Gly Ala Gly Gly Ile Thr Ile Lys Lys85 90 95Thr Gly Gln Ala Leu Val Val Gly Ile Tyr Asp Glu Pro Met Thr Pro100 105 110Gly Gln Cys Asn Met Trp Glu Arg Leu Gly Asp Tyr Leu Val Glu Gln115 120 125Gly Met130<210>6<211>137<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工序列<400>6Met Glu Pro Gly Ala Val Ile Arg Gly Lys Lys Gly Ala Gly Gly Ile1 5 10 15Thr Ile Lys Lys Thr Gly Gln Ala Leu Val Gly Ile Tyr Asp Glu Pro20 25 30Met Thr Pro Gly Gln Cys Asn Met Val Val Glu Arg Leu Gly Asp Tyr35 40 45Leu Val Glu Gln Gly Met Met Ser Trp Gln Thr Tyr Val Asp Glu His50 55 60
Leu Met Cys GluIle Glu Gly His His Leu Ala Ser Ala Ala Ile Leu65 70 75 80Gly His Asp Gly Thr Val Trp Ala Gln Ser Ala Asp Phe Pro Gln Phe85 90 95Lys Pro Glu Glu Ile Thr GlyIle Met Lys Asp Phe Asp Glu Pro Gly100 105 110His Leu Ala Pro Thr Gly Met Phe Val Ala Gly Ala Lys Tyr Met Val115 120 125Ile Gln Gly His His His His His His130 135<210>7<211>28<212>DNA<213>人工<220>
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<223>人工序列
<400>12catgctaaaa tccgcgatga tcaagtcgat gtcaaa 3權(quán)利要求
1.具有降低的致敏活性的野生型蛋白質(zhì)過敏原衍生物的制造方法，其特征在于包括下列步驟-提供具有致敏活性的野生型蛋白質(zhì)過敏原，-將所述野生型蛋白質(zhì)過敏原剪切成兩部分，所述兩部分具有降低的致敏活性或缺乏致敏活性，并-將所述兩個片段以相反方向重新接合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述衍生物作為重組蛋白質(zhì)在宿主中，尤其是具有高表達能力的宿主中制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述野生型過敏原選自抑制蛋白，尤其是Phl p12，樺樹過敏原，尤其是Bet v4，塵螨過敏原，尤其是Der p2，儲螨過敏原，尤其是Lep d2，梯牧草過敏原，尤其是Phl p7。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項的方法，其特征在于通過與野生型過敏原相比至少10％，優(yōu)選至少20％，尤其至少30％的IgE結(jié)合能力抑制的降低測量致敏活性的降低。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項的方法，其特征在于通過過敏原致敏的患者血清的IgE抗體與所述衍生物的斑點印跡的結(jié)合的缺乏測量致敏活性的降低。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項的方法，其特征在于所述衍生物與藥用賦形劑結(jié)合，并最終制成藥物制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項的方法，其特征在于所述衍生物與合適的疫苗佐劑結(jié)合并最終制成藥用疫苗制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于所述衍生物與其它過敏原結(jié)合成組成疫苗。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征在于所述過敏原是野生型過敏原，尤其是野生型過敏原的混合物、重組野生型過敏原、野生型蛋白質(zhì)過敏原的衍生物或它們的混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求6至9任一項的方法，其特征在于所述制劑進一步含有過敏原提取物。
11.野生型蛋白質(zhì)過敏原的過敏原衍生物，所述野生型蛋白質(zhì)過敏原具有1至Z的氨基酸序列，其特征在于所述衍生物在氨基末端至羧基末端的方向上相鄰地含有兩種野生型過敏原片段X至Z和1至X，所述兩種野生型過敏原片段具有降低的致敏活性或沒有致敏活性。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的過敏原衍生物，其特征在于X至Z和1至X為至少30個氨基酸殘基長，優(yōu)選至少50個氨基酸殘基，尤其是至少60個氨基酸殘基。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的過敏原衍生物，其特征在于X至Z和1至X的長度相差50％或更少，優(yōu)選30％或更少，尤其是20％或更少。
14.根據(jù)權(quán)利要求11至13任一項的過敏原衍生物，其特征在于所述野生型過敏原選自I型過敏原，優(yōu)選選自表A，更優(yōu)選為梯牧草(phelum pratense)花粉，尤其是Phl p12，樺樹(Betula verrucosa)花粉，尤其是Bet v4，黃蜂(Vespula vulgaris)毒液，紙巢蜂(Polistesannularis)毒液，parietaria judaica花粉，黑麥草花粉、塵螨過敏原，尤其是Der p2的過敏原或其混合物。
15.過敏原組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求11至14任一項的過敏原衍生物和其它過敏原，優(yōu)選野生型過敏原，尤其是野生型過敏原的混合物、重組野生型過敏原、野生型蛋白質(zhì)過敏原的衍生物或它們的混合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的過敏原組合物，其特征在于所述組合物進一步含有過敏原提取物。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的過敏原組合物，其特征在于其含有藥用賦形劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求11至17任一項的過敏原衍生物用于制備過敏原特異性免疫療法藥物的用途。
19.根據(jù)權(quán)利要求11至17任一項的過敏原衍生物或過敏原組合物用于制備被動免疫法藥物的用途。
20.根據(jù)權(quán)利要求11至17任一項的過敏原衍生物或過敏原組合物用于制備預防免疫法藥物的用途。
21.根據(jù)權(quán)利要求18至20任一項的用途，其特征在于所述藥物進一步含有佐劑、稀釋劑、防腐劑或它們的混合物。
22.制造根據(jù)權(quán)利要求18至21任一項的用途，其特征在于其包含10納克至1克，優(yōu)選100納克至10毫克，尤其是0.5微克至200微克的所述重組過敏原衍生物。
23.制造根據(jù)權(quán)利要求11至17任一項的過敏原衍生物的方法，其特征在于包括下列步驟-提供為根據(jù)權(quán)利要求11至17任一項的過敏原衍生物編碼的DNA分子，-用所述DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細胞和-在所述宿主細胞中表達所述衍生物并分離所述衍生物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其特征在于所述宿主是具有高表達能力的宿主。
25.制造根據(jù)權(quán)利要求11至17任一項的過敏原衍生物的方法，其特征在于其通過化學合成法制造。
26.可通過根據(jù)權(quán)利要求1至10或23至25任一項的方法獲自第一野生型抑制蛋白分子的抑制蛋白衍生物或根據(jù)權(quán)利要求11至14任一項的第一野生型抑制蛋白分子的過敏原衍生物用于制造預防或治療由第二野生型抑制蛋白分子引起的過敏癥的藥物的用途。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的用途，其特征在于所述第一和所述第二抑制蛋白分子選自Phl p12、Bet v2、Art v4、Ana c、Api g4、Musxp1、Cor a2或Dau c4。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的用途，其特征在于所述第一抑制蛋白分子是Phl p 12，所述第二抑制蛋白分子選自Bet v2、Art v4、Ana c、Api g4、Mus xp1、Cor a2或Dau c4。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28的用途，用于制造治療和/或預防可歸因于抑制蛋白過敏反應的花粉-食物交叉致敏的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有降低的致敏活性的野生型蛋白質(zhì)過敏原衍生物的制造方法，其特征在于包括下列步驟提供具有致敏活性的野生型蛋白質(zhì)過敏原，將所述野生型蛋白質(zhì)過敏原剪切成兩部分，所述兩部分具有降低的致敏活性或缺乏致敏活性，并將所述兩個片段以相反方向重新接合；還涉及過敏原衍生物。
文檔編號A61K38/16GK101068830SQ200580041627
公開日2007年11月7日 申請日期2005年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月2日
發(fā)明者K·韋斯特恩, M·弗克, P·瓦朗, W·凱勒, R·瓦倫察 申請人:碧歐美公司