專利名稱：一種治療肉瘤的強化疫苗試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其涉及一種治療肉瘤的強化疫苗試劑盒及其應(yīng)用，屬于免疫制劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
中國專利申請?zhí)枮椤?00410103986.1”的申請文件中公開了一種用于治療肉瘤的混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物疫苗，該熱休克蛋白/肽復(fù)合物疫苗可通過以下方法制備而成新鮮的肉瘤組織剪碎，將肉瘤細胞裂解，裂解液離心，取上清，所得上清濃縮或透析后上層析柱，截取分子量在50～150KD段，分裝，凍干即得。該肉瘤疫苗的組成成分以HSP-60為主，同時含有Gp-96、HSP-90、HSP-70，以HSP-70含量為最少。動物實驗結(jié)果表明，該熱休克蛋白/肽復(fù)合物疫苗對于肉瘤具有一定的預(yù)防和治療作用，但其效果尚有待提高。
白介素-12是一種最強的抑制腫瘤生長的細胞因子，它可促進及活化自然殺傷細胞及T淋巴細胞，分泌γ-IFN(干擾素)，還可活化趨向因子IP-10，抑制血管增生，在國外曾應(yīng)用它治療腫瘤，但在臨床II期時因大量給藥時毒副作用過大(2例死亡)而停止。在動物實驗中也表明白介素-12對無免疫預(yù)存的腫瘤無效。目前，為減低白介素-12的毒副作用，國外進行了給藥途徑及恰當(dāng)劑量的研究，其給藥途徑包括皮內(nèi)、皮下、粘膜、鼻腔及瘤內(nèi)注射等。也有應(yīng)用白介素-12與其他疫苗(黑色素瘤)共用，以增強其疫苗的預(yù)防作用，可達劑量低而無副作用，但還沒有白介素-12與疫苗共用于治療腫瘤的報道，而現(xiàn)有的各種疫苗單獨使用時，對于腫瘤的治療效果尚差強人意。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種治療肉瘤的強化疫苗試劑盒，該試劑盒包括置于其中，但分開包裝的混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物、環(huán)磷酰胺(Cy)及白介素-12(IL-12)；其中三種組分的重量夠用一個治療肉瘤的療程即可。
優(yōu)選的，三種組分的用量為混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物75ug、環(huán)磷酰胺430mg-460mg及白介素-121500ug。
其中，本發(fā)明試劑盒中環(huán)磷酰胺的用量可參照如下標(biāo)準人體每一平方米體表面積需要使用300mg環(huán)磷酰胺。
所述的混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物可按照中國專利申請?zhí)枮椤?00410103986.1”所公開的方法制備；也可直接按照如下方法制備新鮮的肉瘤組織剪碎，將肉瘤細胞裂解，裂解液離心，取上清，所得上清濃縮或透析后上層析柱，截取分子量在50～150KD的部分，分裝，凍干即得。
本發(fā)明將混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物、環(huán)磷酰胺及白介素-12聯(lián)合在一起組成一種治療肉瘤的強化疫苗試劑盒，首先利用混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物免疫后導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生免疫預(yù)存，隨后再依次使用環(huán)磷酰胺和白介素-12，使白介素-12能夠發(fā)揮出最佳抑制腫瘤的效果。
本發(fā)明強化疫苗試劑盒的用法與用量一個療程首先用混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物免疫3次，間隔7天，25ug/次，用混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物第3次免疫后的次日用環(huán)磷酰胺靜脈注射1次，用量為430mg-460mg；3天后用白介素-12皮下注射，每天1次，每次300ug，連續(xù)注射5次，總劑量為1500ug。


圖1用混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物疫苗免疫荷載S180肉瘤小鼠后的腫瘤病理切片，圖示腫瘤區(qū)內(nèi)多灶性免疫細胞侵潤。
圖2用混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物疫苗免疫荷載S180肉瘤小鼠后的腫瘤病理切片，圖示腫瘤區(qū)內(nèi)血管內(nèi)淋巴細胞靠邊，欲游走出血管。
圖3未用混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物疫苗免疫荷載S180肉瘤小鼠的腫瘤病理切片，腫瘤區(qū)內(nèi)無免疫細胞侵潤，即無免疫預(yù)存。
圖4對照組小鼠30天，腫瘤長的很大。
圖5第III組小鼠(HSP/肽+Cy+IL-12)，腫瘤移植40天后，9/10腫瘤消退，達到無瘤生存，但停止治療后，又有一只鼠腫瘤漸長大，于90天死亡，總生存率為80％。
以下通過實施例來進一步描述本發(fā)明的有益效果，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。
具體實施例方式本發(fā)明強化疫苗試劑盒的免疫效果試驗Balb/c小鼠，體重18-20克，購自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，分別移植S180肉瘤細胞4×104，分為6組，分別編號為I-VI。
試驗方法第I組(對照組)腫瘤移植后不給藥。
第II組用混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物疫苗(即HSP/肽，該疫苗按照中國專利申請?zhí)枮椤?00410103986.1”所公開的方法制備而成)免疫，接種腫瘤后第2天開始第1次免疫，皮下注射，每次20ug，間隔7天，共免疫3次。
第III組用本發(fā)明強化疫苗試劑盒治療，具體如下首先用混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物疫苗(即HSP/肽，該疫苗按照中國專利申請?zhí)枮椤?00410103986.1”所公開的方法制備而成)免疫，接種腫瘤后第2天開始第1次免疫，皮下注射，每次20ug，間隔7天，共免疫3次(同II組)，最后一次免疫的次日，用環(huán)磷酰胺(Cy)腹腔注射一次，劑量為100mg/kg體重，3天后，皮下注射白介素-12(IL-12)，連續(xù)5天，每次100ng。
第IV組不用混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物疫苗免疫，與第III組同時用Cy腹腔注射100mg/kg，3天后，皮下注射L-12，連續(xù)5天，每次100ng。
第V組混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物疫苗(即HSP/肽，該疫苗按照申請?zhí)枮椤?00410103986.1”所公開的方法制備而成)免疫，接種腫瘤后第2天開始第1次免疫，皮下注射，每次20ug，間隔7天，共免疫3次，最后一次免疫的3天后，皮下注射白介素-12(IL-12)，連續(xù)5天，每次100ng。但不給Cy。
第VI組混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物疫苗(即HSP/肽，該疫苗按照中國專利申請?zhí)枮椤?00410103986.1”所公開的方法制備而成)免疫，接種腫瘤后第2天開始第1次免疫，皮下注射，每次20ug，間隔7天，共免疫3次，最后一次免疫的次日，用環(huán)磷酰胺(Cy)腹腔注射一次，劑量為100mg/kg。
試驗結(jié)果對照組在40天內(nèi)全部因腫瘤長大而死亡(見圖4)，用本發(fā)明強化疫苗試劑盒治療的肉瘤小鼠，60天后觀察結(jié)果有90％活存(見圖5)，長期(3個月)活存達80％。Cy+IL-12組90天后30％存活。HSP/肽組2/20(10％)活存。HSP/肽+IL-12組，HSP/肽+Cy組90天后全部死亡(見表1)。HSP/肽免疫后，在S180肉瘤組織中產(chǎn)生了預(yù)存免疫，在腫瘤組織中有多灶性淋巴細胞及單核細胞侵潤，血管中有大量淋巴細胞靠邊，將游走出血管，出現(xiàn)免疫預(yù)存(見圖1和圖2)，而未用混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物疫苗免疫的腫瘤組織中，沒有淋巴細胞侵潤，無免疫預(yù)存(見圖3)。
表1 本發(fā)明強化疫苗試劑盒治療小鼠S180肉瘤的結(jié)果

上述試驗結(jié)果表明，本發(fā)明強化疫苗試劑盒對肉瘤有顯著的治療作用。
權(quán)利要求
1.一種治療肉瘤的強化疫苗試劑盒，該試劑盒包括置于其中，但分開包裝的用于一個療程的下述三種組分混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物、環(huán)磷酰胺及白介素-12。
2.按照權(quán)利要求1的強化疫苗試劑盒，其特征是三種組分的重量為混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物75ug、環(huán)磷酰胺430mg-460mg及白介素-121500ug。
3.權(quán)利要求1的強化疫苗試劑盒在制備抑制腫瘤藥物中的用途。
4.按照權(quán)利要求2的用途，其特征是所述的腫瘤為肉瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的治療肉瘤的強化疫苗試劑盒及該試劑盒的使用方法。本發(fā)明治療肉瘤的強化疫苗試劑盒包括置于其中，但分開包裝的下述三種組分混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物75ug、環(huán)磷酰胺430mg－460mg及白介素－121500ug。本發(fā)明強化疫苗試劑盒的使用方法如下首先用混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物免疫3次，每次25ug，間隔七天注射一次，再用430mg－460mg的環(huán)磷酰胺皮下注射1次，一天后，再用白介素－12皮下注射5次，每次300ug，每天一次。動物試驗結(jié)果表明，本發(fā)明強化疫苗試劑盒對于肉瘤有顯著的治療作用。
文檔編號A61P35/00GK1990040SQ20051013524
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月29日
發(fā)明者袁玫, 盧世璧, 崔雪梅, 宋舸, 眭翔, 彭江, 張莉 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院