專利名稱：一種新的HER2/neu mRNA體外轉錄載體的構建及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物學和醫(yī)學領域，更具體地涉及一種HER2/neu mRNA體外轉錄載體的構建，用途及其在HER2/neu陽性腫瘤預防和治療中的應用。
背景技術：
HER2/neu是人類腫瘤常發(fā)生改變的一個癌基因，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，是表皮生長因子受體(EGFR)家族的第二位成員。表皮生長因子受體家族，也稱為HER或ErbB2家族，在細胞信號轉導中發(fā)揮重要作用，是細胞生長、分化及存活的重要調(diào)節(jié)者。人HER2/neu基因定位于17號染色體短臂，表達產(chǎn)物為分子量185KDa的單鏈跨膜糖蛋白，即p185。
p185含有1255個氨基酸殘基，細胞內(nèi)段具有酪氨酸激酶活性，是一種酪氨酸激酶受體。正常情況下，與配體結合后，HER2/neu與EGFR、HER3(erbB3)或HER4(erbB4)形成異二聚體，導致這些受體的磷酸化，啟動一個信號鏈導致下游信號分子的活化，調(diào)控細胞的生長。HER2/neu的過度表達能引起HER2/neu同二聚體的激活而無需配體的結合，從而引起不受控制的細胞生長和癌基因的轉化。
通常情況下，HER2/neu只在胎兒時期表達，到成年以后，用免疫組化染色只能在極少組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)其低水平表達于細胞表面。在人類癌癥，多種腫瘤組織均存在HER2/neu過度表達，如乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、原發(fā)性腎細胞癌等。
大多數(shù)病例中HER2/neu過度表達是基因擴增引起的。HER2/neu基因的擴增導致HER2/neu基因轉錄增加，受體的合成增加，在細胞表面的表達增加。HER2/neu蛋白水平在HER2/neu陽性細胞表面比相鄰的正常上皮高幾個數(shù)量級。已知HER2/neu陽性狀態(tài)與乳腺癌的預后較差有關，這種關系提示HER2/neu可能在癌的發(fā)生方面起關鍵作用。日益增多的證據(jù)支持HER2/neu可作為乳腺癌化療和激素治療的重要的反應預示指標。HER2/neu過度表達在乳腺癌細胞表面的發(fā)生率和已明確的預后價值，意味著HER2/neu代表一個新的重要的治療靶點。
近年來以HER2/neu為靶點的抗腫瘤治療在HER2/neu抗體、肽疫苗、DNA疫苗等方面取得一定進展。
HER2/neu抗體美國FDA已批準人源化的抗HER2/neu單克隆抗體-trastuzumab(Herceptin)用于治療晚期乳腺癌。臨床研究顯示它能有效抑制體內(nèi)HER2/neu高表達乳腺癌細胞的增殖，顯著延長HER2/neu陽性乳腺癌病人的生存期。Herceptin或抗體4D5(針對HER2/neu的鼠抗體)能增強化療藥物對HER2/neu過表達腫瘤細胞的敏感性。Herceptin單藥對轉移性乳腺癌的有效率約15.0％，紫杉醇單藥的有效率僅25.0％左右，而兩藥合用的有效率高達57.3％；4D5能使HER2/neu過表達細胞中的E-cadherin和整合素α2亞單位恢復至正常水平；另外4D5能降低VEGF的產(chǎn)生，因此抑制HER2/neu的功能還可能會抑制腫瘤的轉移(Sliwkowski M.X.等，Semin Oncol，1999年，26期，第60-70頁)。但HER2/neu抗體做為一種生物大分子具有滲透性差給藥不方便和治療費用昂貴不利因素。經(jīng)典的化療藥的副作用如脫發(fā)、粘膜炎、血液系統(tǒng)毒性等在Herceptin單藥時的發(fā)生率不到1％～4％，但高劑量下30％病例可見有中度的副作用如發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹瀉、皮疹、頭痛等。最令人擔心的副作用是心臟毒性。Herceptin單藥治療時，4.7％的病人有心功能和心臟病理異常。
HER2/neu肽疫苗HER2/neu蛋白也是癌癥主動免疫治療的理想靶點，因為(1)HER2/neu蛋白與細胞惡性轉化有關，是癌癥病因?qū)W中一種生物學相關蛋白；(2)某些腫瘤病人存在HER2/neu特異性抗體或CTL，表明HER2/neu疫苗能誘導免疫反應；(3)已證明被動免疫療法如HER2/neu抗體抗腫瘤作用，預測主動免疫可能也是有效的。Ikuta等人以小鼠HER2/neu來源的H2Kd限制性的肽HER2P780，致敏同基因小鼠DC(樹突狀細胞，dendritic cell)，可在小鼠體內(nèi)誘導處HER2/neu特異性的CTL。并可有效抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長。HER2/neu HLA-A2限制性表位E75已分別在美國和日本被批準進入臨床試驗。以E75致敏的自體樹突狀細胞皮下免疫。臨床試驗結果顯示，E75致敏的自體樹突狀細胞在患者體內(nèi)誘導出了特異性的免疫反應。
但肽類疫苗往往免疫原性較弱、局限于某些表位并受病人個體的單倍型限制，對腫瘤的治療或預防意義有限。
HER2/neu的DNA疫苗DNA疫苗亦稱基因疫苗或核酸疫苗，是指構建攜帶目的基因的重組真核表達質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒做為疫苗通過各種方式導入動物體內(nèi)，直接免疫機體，轉染宿主細胞，使載體上的基因在體內(nèi)持續(xù)表達出天然抗原物質(zhì)，這些目的蛋白經(jīng)正確的糖基化修飾等加工處理后，與主要組織相容性復合物(MHC)分子形成復合物并被提呈到細胞表面，誘導機體產(chǎn)生特異性細胞免疫和體液免疫，尤其是能誘導產(chǎn)生細胞毒T淋巴細胞(CTL)。
Pilon等以表達HER2/neu的胞外區(qū)的DNA疫苗免疫小鼠，可以有效地在小鼠體內(nèi)誘發(fā)特異性CTL應答，而且對HER2/neu陽性腫瘤細胞在體內(nèi)生長有明顯的抑制作用。但DNA疫苗普遍存在抗原基因表達量低，所誘導的免疫應答不足的缺點。
樹突狀細胞腫瘤疫苗是新一代的腫瘤疫苗，這種新型疫苗的的特點是采用機體內(nèi)功能最強的抗原遞呈細胞樹突狀細胞作為瘤苗載體(或稱佐劑)，以腫瘤抗原體外沖擊使其致敏，不僅可以保證腫瘤抗原被有效地攝取，而且可以提供所需的共刺激信號，顯示了優(yōu)于“常規(guī)”疫苗的前景。
樹突狀細胞(dendritic cell，簡稱為“DC”)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強大的抗原遞呈細胞(APC)，DC系統(tǒng)作為機體內(nèi)免疫反應的始動者和調(diào)解者，具有強大的激活CD8+CTL和CD4+T輔助細胞的能力，控制著體內(nèi)免疫應答反應的過程，因而成為抗腫瘤免疫反應的中心環(huán)節(jié)。近年來隨著體外大量擴增DC和制備DC疫苗技術的日趨成熟，采用DC疫苗進行抗腫瘤治療已成為當今腫瘤生物治療領域備受關注的焦點之一。
目前已有許多研究均證明，mRNA致敏的DC體外可有效活化T淋巴細胞。Nair等將CEA mRNA通過簡單孵育或脂質(zhì)體介導轉染DC后，誘導出了CEA特異性的T淋巴細胞。在此研究中，用嵌合型的CEA/LAMP-1 mRNA，不僅誘導出了CEA特異性的CD8+T淋巴細胞，而且誘導出了特異性的CD4+T淋巴細胞。Thornburg等以脂質(zhì)體介導編碼人乳頭狀瘤病毒E6和E7腫瘤抗原的mRNA致敏DC，誘導出了E6、E7特異性的細胞免疫應答(Thornburg C等，J Immunother，2000年，第23期，第412-418頁)。Heiser等研究顯示機體對某些特定抗原的耐受，并不是絕對的，通過有效地刺激是可以逆轉的(Heiser A等，J Immunol，2000年，第164期，第5508-5522頁)。編碼前列腺特異抗原(PSA)的mRNA經(jīng)簡單孵育致敏DC后刺激外周血單個核細胞，被證明是一種治療前列腺癌的有效地免疫治療措施。如上所述，Su等在體外也誘導出了端粒酶特異性的T淋巴細胞(Su Z等，Cancer Res，2002年，第62期，第5041-5049頁)?？傊@些研究均顯示，mRNA致敏的DC是一種有效地免疫治療措施。
1999年起，Gilboa等即開始了一系列的臨床試驗，以mRNA致敏的DC治療腎癌及前列腺癌患者。他們進行的第一個臨床試驗是以體外轉錄的PSA mRNA通過簡單共孵育致敏DC免疫激素難控的、轉移性的前列腺癌患者。臨床前研究顯示，PSA mRNA轉染的前列腺癌患者的DC體外可誘導出PSA特異性的T細胞反應。而且，男性或女性健康志愿者以及腫瘤患者來源的DC經(jīng)PSA mRNA致敏后，均可有效地誘導PSA特異的CTL。提示自身耐受或腫瘤介導的T細胞無能均不是誘導自身抗原CTL的巨大障礙。而且有趣的是所誘導出的PSA特異性的CTL對與PSA高度同源的(60-80％同源性)血清中高豐度蛋白Kallikrein無交叉反應性。在此基礎上，對16例激素難控的、轉移性的前列腺癌患者進行了I期臨床試驗，間隔兩周，逐漸增加PSA mRNA轉染的DC用量。結果顯示，此疫苗可被較好的耐受，未見明顯的毒性作用，僅有輕微的I級皮膚反應和/或感冒癥狀。未見前列腺炎或其它的疫苗引起的自身免疫反應。所有完成整個治療過程的患者體內(nèi)均檢測到了PSA特異性的T細胞免疫反應。7例進行評價的患者中6例PSA水平明顯下降(HeiserA等，J Clin Invest.，2002年，第109期，第409-426頁)。
接著Gilboa等進行了第二個I期臨床試驗，以自體腫瘤mRNA通過簡單共孵育致敏DC后免疫轉移性腎細胞癌(RCC)患者。臨床前研究顯示，RCC患者自體腫瘤RNA致敏DC后，體外可誘導出腫瘤特異性的T細胞反應。誘導出的CTL可特異性的殺傷RCC RNA轉染的DC，但不能殺傷PBMC RNA或正常腎上皮RNA轉染的DC。這種選擇性的激活腫瘤特異性的而不是正常腎上皮特異性的CTL反應的特性，說明RNA致敏的DC疫苗可避免導致自身免疫性疾病的危險。在此基礎上，對10例轉移性腎癌患者進行了I期臨床試驗。結果顯示，所有患者中未見治療相關的副作用。未檢測到自身免疫性病理反應，如脈管炎、甲狀腺炎、心肌炎，或疫苗誘導的抗DNA抗體或抗線粒體抗體。在檢測的6例患者中，5例檢測到了腫瘤特異性的多克隆T細胞免疫反應。
目前用于臨床試驗的腫瘤抗原mRNA體外轉錄載體主要有兩種Promega公司商業(yè)化的的載體pGEM4Z和美國Duke大學Gilboa實驗室以載體pGEM4Z為基礎自行構建的pGEM4Z/A64。
在以pGEM4Z為載體進行CEA mRNA的體外轉錄時，首先將CEA的編碼序列插入pGEM4Z的多克隆酶切位點處，在CEA編碼序列的下游以限制性內(nèi)切酶BamHI將載體線性化。以線性化的載體為模板應用Ambion公司的體外轉錄試劑盒，體外轉錄帶有7-甲基鳥嘌呤5’帽子結構的CEA mRNA?；厥誄EA mRNA，再用多聚腺苷酸聚合酶在其3’端加上polyA尾(長度較短)。純化后即可用于致敏自體樹突狀細胞。
載體pGEM4Z/A64的構建是以載體pGEM4Z為基礎，在限制性酶切位點EcoRI和NarI之間加入一段體外合成的64bp的poly(A-T)寡核苷酸構建而成。在pGEM4Z/A64的多克隆酶切位點處插入PSA的編碼序列，即構建成PSA體外轉錄載體。其體外轉錄出的PSA mRNA 5’端帶有7-甲基鳥嘌呤帽子結構，3’端帶有較短的polyA尾。
目前以此兩種載體體外轉錄出的PSA和CEA mRNA致敏自體樹突狀細胞，制備而成的腫瘤疫苗，已分別進入I、II期臨床試驗。
絕大多數(shù)真核細胞mRNA在3’-末端具有polyA(polyadenylic acid)。該PolyA尾是在轉錄后經(jīng)polyA聚合酶的作用添加上去的。研究表明，polyA尾不僅與mRNA從細胞核到細胞質(zhì)的轉移有關，而且還與mRNA的半壽期有關，新合成mRNA的polyA尾較長，而衰老mRNA的polyA尾較短。而通過現(xiàn)有技術，要合成較長并能與載體有效連接的polyA尾，仍具有很大的難度，而且成本高，故而使得polyA尾的有效長度受限。
綜上所述，雖然近年來以HER2/neu為靶點的抗腫瘤治療在HER2/neu抗體、肽疫苗、DNA疫苗、mRNA疫苗等方面取得了一定的進展。但是這些方法所存在的缺陷阻礙了它們在腫瘤治療中的推廣和使用HER2/neu抗體做為一種生物大分子具有滲透性差給藥不方便、治療費用昂貴、以及副作用明顯等不利因素；肽類疫苗往往免疫原性較弱、局限于某些表位并受病人個體的單倍型限制，對腫瘤的治療或預防意義有限；DNA疫苗則普遍存在抗原基因表達量低，所誘導的免疫應答不足的缺點；雖然mRNA疫苗可克服以上疫苗的缺點，但仍存在體內(nèi)易降解、半壽期短的缺點。
因此，本領域急需開發(fā)出新的、具有較長半壽期的(尤其是通過連接較長的polyA尾來實現(xiàn)半壽期提高的)、用于致敏樹突狀細胞(DC)的抗腫瘤mRNA疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明正是提供了一種新的、具有較長半壽期的、用于致敏樹突狀細胞(DC)的抗腫瘤mRNA疫苗，并提供一種新的HER2/neu mRNA體外轉錄載體的構建及其用途。
本發(fā)明的第一方面，提供了一種核酸分子，所述的核酸分子包含以下元件(a)位于5’端的7-甲基鳥嘌呤帽子結構元件；(b)位于3’端的長度為110-200bp的polyA尾；(c)位于元件(a)和(b)之間的HER2/neu的編碼序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的HER2/neu的編碼序列具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的polyA尾的長度為120-180bp。
在另一優(yōu)選例中，所述的核酸分子是DNA或mRNA。
本發(fā)明的第二方面，提供了一種載體，所述載體含有如上所述的核酸分子。在另一優(yōu)選例中，所述的載體是質(zhì)粒。
本發(fā)明的第三方面，提供了一種如上所述的核酸分子的用途，所述核酸分子用于制備致敏的樹突狀細胞。
在另一優(yōu)選例中，所述致敏后的樹突狀細胞用于制備針對HER2陽性腫瘤的治療性疫苗。
較佳地，所述的HER2陽性腫瘤包括乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、或原發(fā)性腎細胞癌。
本發(fā)明的第四方面，提供了一種藥物組合物或免疫組合物，所述組合物含有藥學上可接受的載體及賦形劑，以及如上所述的核酸分子或用如上所述的核酸分子所致敏的樹突狀細胞。
在另一優(yōu)選例中，所述的核酸分子是mRNA。
本發(fā)明的第五方面，提供了一種體外轉錄載體的構建方法，所述的轉錄載體用于產(chǎn)生如上所述的核酸分子，所述方法包括步驟(1)通過PCR方法擴增出長度為110-200bp的polyA元件，并將多聚腺苷酸PCR產(chǎn)物poly(A-T)連接入轉錄載體，獲得帶有所述polyA元件的轉錄載體；(2)將HER2/neu的編碼序列插入到步驟(1)中制備的帶有所述polyA元件的轉錄載體，并且插入位置為所述polyA元件的上游，且與所述polyA元件的5‘端相距0-20bp，從而制得體外轉錄載體。
在另一優(yōu)選例中，所述的HER2/neu的編碼序列是SEQ ID NO1中151-2220位。
在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中所述的轉錄載體是pCI載體。
在另一優(yōu)選例中，所述的polyA尾的長度為120-180bp。


圖1為pMD-HER2/neu載體酶切鑒定圖；圖2為pCIpA150載體酶切鑒定圖；圖3為HER2/neu mRNA體外轉錄載體pHHX17酶切鑒定圖；
圖4為HER2-PDC小鼠體內(nèi)誘導的CTL抗原特異性殺傷活性圖。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)可以通過體外轉錄的方法獲得HER2/neu mRNA，并且在其3’端帶上長度較大(如110-200bp)的polyA尾可顯著提高該mRNA在體內(nèi)的半壽期，從而意外地獲得了更好的致敏效果。在此基礎上完成了本發(fā)明。
具體地，本發(fā)明人以表達載體pCI(Promega公司)為基礎，在限制性酶切位點HpaI處插入一段150A-Tbp的寡核苷酸，構建成體外轉錄載體pCIpA150，在其多克隆酶切位點Kpn I和Xho I間插入HER2/neu151-2220的編碼序列，即構建成HER2/neu體外轉錄載體pHHX17。其中插入的HER2/neu序列編碼HER2/neu的信號肽(1-21aa)、胞外段(22-652aa)、跨膜區(qū)(653-675aa)和部分胞內(nèi)區(qū)(676-690aa)。其體外轉錄出的HER2/neu mRNA 5’端帶有7-甲基鳥嘌呤帽子結構，3’端帶有150bp長度的polyA尾?；蚱伟鄠€已被證明的CTL表位，同時又不包含其酪氨酸激酶活性區(qū)域，消除了其酪氨酸激酶活性，可用于修飾樹突狀細胞，并誘導產(chǎn)生針對HER2陽性腫瘤的特異性免疫應答，可用于HER2陽性腫瘤如乳腺癌等腫瘤的預防及治療。在一優(yōu)選例中，本發(fā)明人構建了一種新的HER2/neu mRNA體外轉錄載體，獲得了所需的帶有長達150bp的polyA尾的HER2/neu mRNA，并測定了經(jīng)其致敏的樹突狀細胞在體內(nèi)可顯著誘導HER2/neu特異性細胞免疫應答的活性。
活性成分如本文所用，術語“HER2/neu”、“HER2”和“neu”可互換使用，都指GenBank登錄號為M11730對應的核酸分子或編碼的蛋白。在GenBank登錄號為M11730中，HER2的ORF為151-2220bp。該ORF區(qū)域也示于SEQ ID NO1中。
如本文所用，“活性成分”是指“HER2/neu mRNA”、“HER2陽性腫瘤特異性mRNA”、“HER2/neu DNA”、“HER2陽性腫瘤的治療性疫苗”和“致敏樹突狀細胞(DC)的抗腫瘤mRNA疫苗”(且各術語可互換使用)。本文所用的活性成分即，通過本發(fā)明構建的HER2/neu mRNA體外轉錄載體獲得的HER2/neu mRNA。該mRNA的5’端帶有7-甲基鳥嘌呤帽子結構，編碼區(qū)包括信號肽、胞外段、跨膜區(qū)和部分胞內(nèi)區(qū)，3’端為長達150bp的polyA尾，基因片段包含多個已被證明的CTL表位，同時又不包含其酪氨酸激酶活性區(qū)域，消除了其酪氨酸激酶活性，可用于修飾樹突狀細胞，并誘導產(chǎn)生針對HER2陽性腫瘤的特異性免疫應答，可用于HER2陽性腫瘤如乳腺癌等腫瘤的預防及治療。
如本文所用，術語“樹突狀細胞”指用本發(fā)明的活性成分可致敏的并可在胞內(nèi)含有導入的外源腫瘤抗原mRNA的樹突狀細胞。
藥物組合物及給藥方法利用本發(fā)明制備的HER2/neu核酸分子和載體，可以用常規(guī)方法制備HER2/neumRNA。
用本發(fā)明方法制備的mRNA疫苗可以廣泛應用于預防和治療各種HER2陽性腫瘤，代表性的例子包括(但并不限于)乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、原發(fā)性腎細胞癌。
因此本發(fā)明還提供了一種用于預防和治療各種HER2陽性腫瘤藥物組合物，它含有安全有效量(如104-108個樹突狀細胞)的本發(fā)明上述的腫瘤抗原mRNA致敏的樹突狀細胞的細胞群，以及藥學上可接受的載體、賦型劑和/或稀釋劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約104-108個樹突狀細胞，更佳地為105-107個樹突狀細胞。
配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
在治療和預防腫瘤時，本發(fā)明的樹突狀細胞可以單用，還可同時和其他治療劑聯(lián)用，如TNF-α、TGF-β、IFN-α、Angiostatin、Endostatin、甘磷酰芥、血卟啉、石蒜堿內(nèi)銨鹽、鴉膽子乳、足葉乙甙(即依托泊甙)、脫水衛(wèi)矛醇、阿霉素、三苯氧胺、5-氟尿嘧啶、去甲斑螯素、雙呋喃氟尿嘧啶、葫蘆素、三尖杉酯堿、冬凌草乙素、馬藺子甲素、云芝糖肽、阿糖胞苷、卡波鉑、紫杉醇、香菇多糖、氟他胺、異環(huán)磷酰胺、烏苯美司、醋酸亮丙瑞林、脫氧氟尿苷、洛波鉑、依林諾特肯、來屈唑和替尼泊甙等。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的腫瘤抗原mRNA致敏的樹突狀細胞施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常每天約104-108個樹突狀細胞，更佳地為105-107個樹突狀細胞。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(a)本發(fā)明的HER2 mRNA在體內(nèi)較穩(wěn)定，具有較長的半壽期；(b)本發(fā)明的HER2 mRNA致敏的DC疫苗的抗腫瘤譜廣，特異性強。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1HER2/neu151-2220cDNA片段的克隆1.反轉錄收集生長狀態(tài)良好的HER2/neu陽性的人乳腺癌細胞株SK-BR-3(購買自ATCC，No.HTB-30)，用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取細胞總RNA，在oligo-dT(Takara公司)的引導下，利用AMV逆轉錄酶(Progema公司)完成。
在200μl無RNase PCR反應管中加入總RNA 1.2μl、oligo-dT 1.0μl和無RNase水7.8μl，混勻，離心，置65℃水浴10分鐘，迅速置冰上冷卻5分鐘，然后在上述反應體系中加入5×緩沖液(AMV)4μl、10mM dNTP 1μl、AMV 1μl和無RNase水4μl，混勻后，42℃孵育1小時，72℃10分鐘，加入80μl水。
該反轉錄產(chǎn)物可直接作為模板用于擴增目的基因片段。
2.PCR擴增以上述反轉錄產(chǎn)物為模板，用PCR方法克隆HER2/neu cDNA目的片段。
克隆目的序列的引物序列為5’-CAGTGAGCACCATGGAGCTGG-3’(SEQ ID NO2)和5’-TCACAGTCTCCGCATCGTGTACTTCC-3’(SEQ ID NO3)。
在200μl PCR反應管中依次加入反轉錄產(chǎn)物1μl、dNTP混合物4μl、引物各1μl、2×GC緩沖液12.5μl、LATaq酶0.25μl、水4.95μl，混勻，離心，在PCR儀(PTC-200，MJ Research公司)上完成反應。
反應參數(shù)為95℃1分鐘；94℃30秒；58℃30秒；72℃2分鐘；30個循環(huán)；72℃10分鐘。
3.連接和轉化回收PCR產(chǎn)物。將人HER2/neu cDNA目的片段克隆入pMD18-T載體(Takara公司)。利用T4 DNA連接酶將HER2/neu cDNA目的片段連入T載體。
在200μl PCR反應管中依次加入T4 DNA連接酶0.5μl、10×連接酶緩沖液1μl、pMD18-T載體0.5μl、HER2/neu基因片段8μl，混勻后，連接反應產(chǎn)物在16℃過夜。然后將連接反應產(chǎn)物轉化DH5α大腸桿菌感受態(tài)，涂板，待克隆長出后，挑單克隆接種2ml Amp+的LB溶液，搖菌過夜，抽提質(zhì)粒。
4.鑒定質(zhì)粒應用XbaI/HindIII雙酶切進行鑒定。
在1.5ml的離心管中依次加入小量制備的質(zhì)粒5μl、10×緩沖液M 1μl、XbaI 0.5μl、HindIII 0.5μl和水3.0μl。37℃溫育1小時，進行瓊脂糖凝膠電泳，能切下片段即為陽性克隆，并將此載體命名為pMD-HER2/neu。pMD-HER2/neu載體酶切鑒定結果見圖1。
實施例2體外轉錄載體pCIpA150的構建1.多聚腺苷酸(polyA)的擴增通過PCR方法擴增出150bp的寡核苷酸polyA。
模板質(zhì)粒HNA6G1(購自第二軍醫(yī)大學免疫學研究所)。
擴增引物(由上海生工生物公司合成)序列為5’-ACAGGCCTCCACTCCGTTTGCTG-3’(SEQ ID NO4)和5’-CCTCGAGGGATACTCTAGAGCG-3’(SEQ ID NO5)。
在200μl PCR反應管中依次加入質(zhì)粒1μl(濃度為100ng/μl)、dNTP Mixture4μl、引物(濃度為10μM)各0.5μl、10×Pyrobest緩沖液2.5μl、Pyrobest Enzyme 0.125μl和水16.375μl?；靹蚝?，在PCR儀上完成反應。
反應參數(shù)95℃1分鐘；94℃30秒；58℃30秒；72℃30秒；25個循環(huán)；72℃10分鐘。
反應產(chǎn)物進行1％的瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR產(chǎn)物回收。
2.pCI載體的酶切用Hpa I酶(Takara公司)對載體進行酶切。
在1ml PCR反應管中依次加入小量制備的pCI載體質(zhì)粒(Progema公司)5μl、10×緩沖液K 1μl、Hpa I Enzyme 0.5μl和水3.5μl。混勻后，37℃溫育1小時，酶切產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳。
3.多聚腺苷酸PCR產(chǎn)物連接入pCI載體利用T4 DNA連接酶(Takara公司)將多聚腺苷酸PCR產(chǎn)物poly(A-T)連接入pCI載體。
在200μl PCR反應管中依次加入T4 DNA連接酶0.5μl、10×連接酶緩沖液1μl、pCI載體/Hpa I 1μl、多聚腺苷酸PCR產(chǎn)物7.5μl。連接反應產(chǎn)物在16℃過夜，轉化大腸桿菌DH5α，搖菌過夜后，使用抽提質(zhì)粒。
4.鑒定用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I(Takara公司)進行酶切鑒定，陽性插入質(zhì)粒記為pCIpA150。pCIpA150載體酶切鑒定結果見圖2。
實施例3HER2/neu mRNA體外轉錄載體pHHX17的構建1.載體pCIpA150的酶切用Xho I/Kpn I(Takara公司)雙酶切載體pCIpA150。
在1.5ml的PCR反應管中依次加入小量制備的質(zhì)粒5μl、10×緩沖液M 1μl、Hpa I Enzyme 0.5μl、Kpn I Enzyme 0.5μl和水3μl?；靹?，37℃溫育1.5小時，進行1％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的片段。
2.載體pMD-HER2/neu的酶切用Kpn I和Sal I雙酶切。
在1.5ml的PCR反應管中依次加入小量制備的質(zhì)粒5μl、10×緩沖液T 1.5μl、Sal I Enzyme 0.5μl、Kpn I Enzyme 0.5μl、和水2.5μl?；靹颍?7℃溫育1.5小時，進行1％瓊脂糖凝膠電泳，37℃溫育1.5小時，酶切產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳。
3.HER2/neu mRNA體外轉錄載體pHHX17的構建使用T4DNA連接酶將載體酶切后膠回收的pCIpA150載體片段和HER2/neuDNA片段連接。
在1.5ml的PCR反應管中依次加入T4 DNA連接酶0.5μl、10×連接酶緩沖液1μl、pCIpA150酶切回收產(chǎn)物2μl、HER2/neu DNA片段6μl和水0.5μl。混勻，連接反應產(chǎn)物在16℃過夜，轉化大腸桿菌DH5α，搖菌過夜后，質(zhì)粒抽提。
用限制性內(nèi)切酶EcoR I/Kpn I進行雙酶切鑒定，在1.5ml的PCR反應管中依次加入小量制備的質(zhì)粒5μl、10×緩沖液M 1.0μl、EcoR I Enzyme 0.5μl、Kpn IEnzyme 0.5μl和水3.0μl?；靹?，37℃溫育1.5小時，酶切產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察(見圖3)。
酶切鑒定陽性的克隆采用末端終止法進一步進行測序鑒定。使用ABI PRISMBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit測序試劑盒(Perkin-Elmer)，數(shù)據(jù)采集及分析使用AB1377型全自動測序儀。結果顯示，已經(jīng)插入了所設計的HER2/neu151-2220以及150bp長的polyA序列，測定正確的克隆記為pHHX17。
實施例4HER2/neu mRNA的制備1.體外轉錄載體pHHX17的線性化載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶Mun I酶切后，采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收線性化的載體pHHX17。紫外分光光度儀檢測線性化載體的濃度，不低于500μg/ml。
2.HER2/neu mRNA的體外轉錄用T7RNA聚合酶體外轉錄HER2/neu mRNA。
3.HER2/neu mRNA的純化體外轉錄所得的產(chǎn)物通過乙酸胺沉淀和Oligo(dT)-Cellulose Type 7親和層析柱進一步純化，再經(jīng)乙酸鈉及乙醇沉淀后，溶于無RNAase水中即為HER2/neu mRNA制品。
紫外分光光度儀檢測mRNA濃度為500ng/μl，純度OD260/OD280為1.79。
實施例5樹突狀細胞的培養(yǎng)及致敏1.骨髓來源的樹突狀細胞(Bone marrow-derived dendritic cell，BMDC)的獲得頸椎脫位法處死HLA-A2.1/Kb轉基因小鼠，無菌取股骨，用一次性1ml注射器沖洗出骨髓細胞。1000×g，離心5分鐘，棄上清，用剩余的液體彈起沉淀，加入2ml Tris-NH4Cl溶去紅細胞，迅速加入無血清1640，1000xg，離心5分鐘，棄上清，加入抗Ia、B220、CD4、CD8單抗(終濃度均為10μg/ml)及補體(10∶1稀釋)，37℃水浴45分鐘溶除T、B及Ia+細胞，洗兩次后，以1×107個細胞/孔加入6孔板培養(yǎng)，加mGM-CSF 10ng/ml、mIL-41ng/ml，(Peprotech公司)培養(yǎng)3天后，吸棄培養(yǎng)基及懸浮細胞，重新加入新鮮RPMI1640完全培養(yǎng)基及mGM-CSF、mIL-4，繼續(xù)培養(yǎng)2天后，吹打下疏松貼壁的增殖性細胞聚集體，即為富集的骨髓來源的樹突狀細胞(Bone marrow-derived dendritic cell，BMDC)。
2.HER2/neu mRNA致敏的樹突狀細胞(HER2/neu mRNA Pulsed HumanDendritic Cells，HER2-PDC)的獲得將收集的DC用無RNase的PBS洗兩遍，調(diào)細胞濃度為1×107個/ml。取200μl加入4mm電擊杯中。同時加入5μg HER2/neu mRNA，冰上放置10分鐘。應用Bio-Rad電穿孔儀Gene Pulser Xcell進行電穿孔，參數(shù)為500V，300μs。電穿孔后，立即小心加入樹突狀細胞完全培養(yǎng)基中。4小時后加入20ng/ml TNF-α(Peprotech公司)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至48小時。用50ml離心管收取HER2/neu mRNA轉染，并用TNF-α成熟化的樹突狀細胞懸液，1000×g離心5分鐘，收取細胞。再加入40ml無菌生理鹽水，1000×g離心5分鐘洗滌，連續(xù)3次。收集細胞即為HER2/neu mRNA致敏的樹突狀細胞(HER2/neu mRNA Pulsed Human Dendritic Cells，HER2-PDC)。
實施例6HER2/neu mRNA致敏的樹突狀細胞誘導的HER2/neu特異性細胞免疫用無菌生理鹽水調(diào)細胞濃度為1×106個/400μl，體內(nèi)免疫前鈷60照射(30Gy)。
分組處理將6～8周HLA-A2.1/Kb轉基因小鼠隨機分為3組，每組10只，分別腹腔注射處理(每只小鼠共免疫三次，間隔一周)第一組，HER2/neu mRNA致敏的樹突狀細胞(1×106個/鼠)；第二組，未經(jīng)致敏的樹突狀細胞(1×106個/鼠)；第三組，400μl生理鹽水。
HLA-A2.1/Kb轉基因小鼠末次免疫后7天，無菌操作摘取小鼠脾臟，制成單細胞懸液。脾細胞懸液(2×106個/ml)與HER2-PDC以10∶1比例置于RPMI 1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。7天后，收集效應細胞，進行特異性殺傷活性測定，采用標準的4小時51Cr釋放實驗。
靶細胞分別用人結腸癌細胞系SW620(購買自ATCC，ATCC No.CCL-227，HLA-A2.1+及HER2/neu+)、陽性對照負載HER2/neu HLA-A2.1限制性表位E75(對應于HER2/neu基因產(chǎn)物的369-377位氨基酸，KIFGSLAFL)、無關對照表位CAP-1(YLSGANLNL)的T2細胞及未加負載的T2細胞作為靶細胞。
首先進行靶細胞的標記，將靶細胞濃度調(diào)至1×106個/ml，加入Na251CrO4(Amersham公司，100μCi/106個細胞)，置37℃水浴中標記90分鐘，無血清RPMI 1640洗3遍，徹底洗去殘余Na251CrO4，標記好的靶細胞用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml，加入96孔圓底板，每孔100μl。按50∶1、25∶1、12.5∶1三個不同效靶比加入相應的效應細胞，混勻，500×g離心5分鐘，37℃孵育4小時，收集各孔上清各100μl，用γ計數(shù)儀檢測cpm值，結果用三復孔均值表示。最大釋放組各孔為單獨的靶細胞加100μl 2％Triton X-100；自發(fā)釋放孔為單獨的靶細胞加100μl完全培養(yǎng)基。
殺傷率％＝(實驗組cpm-自發(fā)釋放組cpm)/(最大釋放組cpm-自發(fā)釋放組cpm)結果見圖4。
結果表明采用HER2/neu mRNA致敏的小鼠樹突狀細胞免疫的小鼠的T細胞可以殺傷負載HER2/neu HLA-A0201限制性T細胞表位E75的T2細胞，和表達HLA-A0201和HER2/neu的小鼠腫瘤細胞SW620，但不殺傷負載無關抗原肽CAP-1、表達HLA-A0201的T2細胞以及未負載抗原的T2細胞，表明采用HER2/neumRNA致敏的樹突狀細胞可以誘導出HER2/neu特異性的細胞免疫，用于HER2/neu陽性腫瘤的治療和預防。因此，HER2/neu mRNA致敏的樹突狀細胞能夠在小鼠體內(nèi)有效誘導HER2/neu特異性細胞免疫應答。
實施例7不同長度polyA對致敏效果的影響比較組(1)按實施例1所述方法制得HER2/neu151-2220cDNA片段的克?。?2)利用T4 DNA連接酶(Takara公司)將人工合成的長度為40bp、或50bp的poly(A-T)連接入pCI載體，經(jīng)連接、轉化、酶切鑒定，獲得陽性插入質(zhì)粒記為pCIpA40和pCIpA60；(3)按實施例3、4、5、6所述的方法對所得比較mRNA進行特異性殺傷活性測定；(4)將比較組殺傷率％與采用了pCIpA150載體的HER2/neu mRNA的殺傷率％進行比較。
結果顯示，采用帶有40bp和50bp長度polyA尾的比較HER2/neu mRNA致敏的小鼠樹突狀細胞免疫的小鼠T細胞對HER2/neu特異性細胞的殺傷率％僅為帶有150bp長度polyA尾的HER2/neu mRNA的40-60％。
結果提示，帶有較長的150bp的polyA尾時，HER2/neu mRNA不易降解且半壽期延長，從而更有效地進行轉錄和表達并致敏樹突狀細胞，因此獲得了更好的誘導HER2/neu特異性細胞免疫應答的效果。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海海欣生物技術有限公司<120>一種新的HER2/neu mRNA體外轉錄載體的構建及其用途<130>059024<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2070<212>DNA<213>寡核苷酸<220>
<221>CDS<222>(1)..(2070)<400>1atg gag ctg gcg gcc ttg tgc cgc tgg ggg ctc ctc ctc gcc ctc ttg48Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu1 5 10 15ccc ccc gga gcc gcg agc acc caa gtg tgc acc ggc aca gac atg aag96Pro Pro Gly Ala Ala Set Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys20 25 30ctg cgg ctc cct gcc agt ccc gag acc cac ctg gac atg ctc cgc cac144Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His35 40 45ctc tac cag ggc tgc cag gtg gtg cag gga aac etg gaa ctc acc tac192Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr50 55 60ctg ccc acc aat gcc agc ctg tcc ttc ctg cag gat atc cag gag gtg240Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val65 70 75 80cag ggc tac gtg ctc atc gct cac aac caa gtg agg cag gtc cca ctg288Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Ash Gln Val Arg Gln Val Pro Leu85 90 95cag agg ctg cgg att gtg cga ggc acc cag ctc ttt gag gac aac tat336Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr100 105 110gcc ctg gcc gtg cta gac aat gga gac ccg ctg aac aat acc acc cct384Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro115 120 125gtc aca ggg gcc tcc cca gga ggc ctg cgg gag ctg cag ctt cga agc432Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser130 135 140ctc aca gag atc ttg aaa gga ggg gtc ttg atc cag cgg aac ccc cag480
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln145 150 155 160ctc tgc tac cag gac acg att ttg tgg aag gac atc ttc cac aag aac528Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn165 170 175aac cag ctg gct ctc aca ctg ata gac acc aac cgc tct cgg gcc tgc576Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys180 185 190cac ccc tgt tct ccg atg tgt aag ggc tcc cgc tgc tgg gga gag agt624His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser195 200 205tct gag gat tgt cag agc ctg acg cgc act gtc tgt gcc ggt ggc tgt672Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys210 215 220gcc cgc tgc aag ggg cca ctg ccc act gac tgc tgc cat gag cag tgt720Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys225 230 235 240gct gcc ggc tgc acg ggc ccc aag cac tct gac tgc ctg gcc tgc ctc768Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu245 250 255cac ttc aac cac agt ggc atc tgt gag ctg cac tgc cca gcc ctg gtc816His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val260 265 270acc tac aac aca gac acg ttt gag tcc atg ccc aat ccc gag ggc cgg864Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg275 280 285tat aca ttc ggc gcc agc tgt gtg act gcc tgt ccc tac aac tac ctt912Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu290 295 300tct acg gac gtg gga tcc tgc acc ctc gtc tgc ccc ctg cac aac caa960Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln305 310 315 320gag gtg aca gca gag gat gga aca cag cgg tgt gag aag tgc agc aag1008Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys325 330 335ccc tgt gcc cga gtg tgc tat ggt ctg ggc atg gag cac ttg cga gag1056Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu340 345 350gtg agg gca gtt acc agt gcc aat atc cag gag ttt gct ggc tgc aag1104Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys355 360 365aag atc ttt ggg agc ctg gca ttt ctg ccg gag agc ttt gat ggg gac1152Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp370 375 380cca gcc tcc aac act gcc ccg ctc cag cca gag cag ctc caa gtg ttt1200Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe385 390 395 400gag act ctg gaa gag atc aca ggt tac cta tac atc tca gca tgg ccg1248Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro405 410 415gac agc ctg cct gac ctc agc gtc ttc cag aac ctg caa gta atc cgg1296
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg420 425 430gga cga att ctg cac aat ggc gcc tac tcg ctg acc ctg caa ggg ctg1344Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu435 440 445ggc atc agc tgg ctg ggg ctg cgc tca ctg agg gaa ctg ggc agt gga1392Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly450 455 460ctg gcc ctc atc cac cat aac acc cac ctc tgc ttc gtg cac acg gtg1440Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val465 470 475 480ccc tgg gac cag ctc ttt cgg aac ccg cac caa gct ctg ctc cac act1488Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr485 490 495gcc aac cgg cca gag gac gag tgt gtg ggc gag ggc ctg gcc tgc cac1636Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His500 505 510cag ctg tgc gcc cga ggg cac tgc tgg ggt cca ggg ccc acc cag tgt1584Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys515 520 525gtc aac tgc agc cag ttc ctt cgg ggc cag gag tgc gtg gag gaa tgc1632Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys530 535 540cga gta ctg cag ggg ctc ccc agg gag tat gtg aat gcc agg cac tgt1680Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys545 550 555 560ttg ccg tgc cac cct gag tgt cag ccc cag aat ggc tca gtg acc tgt1728Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys565 570 575ttt gga ccg gag gct gac cag tgt gtg gcc tgt gcc cac tat aag gac1776Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp580 585 590cct ccc ttc tgc gtg gcc cgc tgc ccc agc ggt gtg aaa cct gac ctc1824Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu595 600 605tcc tac atg ccc atc tgg aag ttt cca gat gag gag ggc gca tgc cag1872Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln610 615 620cct tgc ccc atc aac tgc acc cac tcc tgt gtg gac ctg gat gac aag1920Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys625 630 635 640ggc tgc ccc gcc gag cag aga gcc agc cct ctg acg tcc atc gtc tct1968Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Val Ser645 650 655gcg gtg gtt ggc att ctg ctg gtc gtg gtc ttg ggg gtg gtc ttt ggg2016Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly660 665 670atc ctc atc aag cga cgg cag cag aag atc cgg aag tac acg atg cgg2064Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg675 680 685aga ctg2070
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Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys325 330 335Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu340 345 350Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys355 360 365Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp370 375 380Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe385 390 395 400Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro405 410 415Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg420 425 430Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu435 440 445Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly450 455 460Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val465 470 475 480Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr485 490 495Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His500 505 510Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys515 520 525Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys530 535 540Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys545 550 555 560Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys565 570 575Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp580 585 590Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu595 600 605Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln610 615 620Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys625 630 635 640Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Val Ser645 650 655Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly660 665 670Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg675 680 685Arg Leu690<210>3
<211>21<212>DNA<213>寡核苷酸<400>3cagtgagcac catggagctg g21<210>4<211>26<212>DNA<213>寡核苷酸<400>4tcacagtctc cgcatcgtgt acttcc 26<210>5<211>23<212>DNA<213>寡核苷酸<400>5acaggcctcc actccgtttg ctg 23<210>6<211>22<212>DNA<213>寡核苷酸<400>6cctcgaggga tactctagag cg 2權利要求
1.一種核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子包含以下元件(a)位于5’端的7-甲基鳥嘌呤帽子結構元件；(b)位于3’端的長度為110-200bp的polyA尾；(c)位于元件(a)和(b)之間的HER2/neu的編碼序列。
2.如權利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述的HER2/neu的編碼序列具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.如權利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述的polyA尾的長度為120-180bp。
4.如權利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子是DNA或mRNA。
5.一種載體，其特征在于，它含有權利要求1所述的核酸分子。
6.一種權利要求1所述的核酸分子的用途，其特征在于，用于制備致敏的樹突狀細胞。
7.如權利要求6所述的用途，其特征在于，所述致敏后的樹突狀細胞用于制備針對HER2陽性腫瘤的治療性疫苗。
8.如權利要求7所述的用途，其特征在于，所述的HER2陽性腫瘤包括乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、或原發(fā)性腎細胞癌。
9.一種藥物組合物或免疫組合物，其特征在于，它含有藥學上可接受的載體及賦形劑，以及權利要求1所述的核酸分子或用權利要求1所述的核酸分子所致敏的樹突狀細胞。
10.一種體外轉錄載體的構建方法，所述的轉錄載體用于產(chǎn)生權利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述方法包括步驟(1)通過PCR方法擴增出長度為110-200bp的polyA元件，并將多聚腺苷酸PCR產(chǎn)物poly(A-T)連接入轉錄載體，獲得帶有所述polyA元件的轉錄載體；(2)將HER2/neu的編碼序列插入到步驟(1)中制備的帶有所述polyA元件的轉錄載體，并且插入位置為所述polyA元件的上游，且與所述polyA元件的5‘端相距0-20bp，從而制得體外轉錄載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于制備HER2陽性腫瘤治療性疫苗的HER2/neu核酸分子及其用途，它包括以下元件(a)位于5’端的7－甲基鳥嘌呤帽子結構元件；(b)位于3’端的長度為110－200bp的polyA尾；(c)位于元件(a)和(b)之間的HER2/neu的編碼序列。其中，所述的編碼序列包含多個已被證明的CTL表位，同時又不包含其酪氨酸激酶活性區(qū)域，消除了其酪氨酸激酶活性，可用于修飾樹突狀細胞，并誘導產(chǎn)生針對HER2陽性腫瘤的特異性免疫應答，因而可用于HER2陽性腫瘤如乳腺癌等腫瘤的預防及治療。本發(fā)明還提供了所述HER2/neu mRNA的體外轉錄載體的構建方法。
文檔編號A61K48/00GK1966684SQ200510110390
公開日2007年5月23日 申請日期2005年11月16日 優(yōu)先權日2005年11月16日
發(fā)明者萬濤, 王燕蘭, 王建莉 申請人:上海海欣生物技術有限公司