專利名稱：一種新的候選癌基因hRabJ來源的HLA－A2限制性表位多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物學和醫(yī)學領域，更具體地涉及提供了一種候選癌基因hRabJ來源的HLA-A2限制性表位多肽，以及該表位及其相關的重組蛋白、編碼核苷酸序列、抗原遞呈細胞、組合物，以及針對該表位的特異性免疫效應細胞在表達hRabJ腫瘤治療及預防中的用途。
背景技術：
hRabJ(SEQ ID NO12)是從樹突狀細胞(dendritic cell，DC)cDNA文庫進行大規(guī)模測序的過程中發(fā)現(xiàn)一種新型全長新基因，在GenBank/EMBL數(shù)據(jù)庫中登錄(序列號為AF178983)。hRabJ編碼273個氨基酸的蛋白質(SEQ ID NO13)，是一個Rab樣的GTP水解蛋白酶(GTPase)。RabJ主要分布于睪丸、大腦和卵巢等組織，可以結合和降解GTP，在細胞內可能分布于核內，與熱休克蛋白70(heatshock protein 70，HSP70)可以形成復合體。
通過對RabJ的基因定位、蛋白質一級結構、細胞和組織分布的分析，發(fā)現(xiàn)RabJ可能代表一個新的小G蛋白家族，其特征是在其蛋白質組成中包含三類功能域N端(1-18氨基酸)和中間(210-216氨基酸)的核定位信號(nuclearlocalization signal，NLS)、中間的Rab樣功能域(19-209氨基酸)和C端的J功能域(217-273氨基酸)，并與Ras家族分子有較高同源性。三類功能域分別介導RabJ的核定位；與細胞外信號調控激酶(extracellular signal-regulatedkinase，ERK1/2)激酶(ERK kinase，MEK1/2)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)的P85亞基、P53亞基相互作用；與HSC70和Raf(Ras相關因子，Ras-associated factor)相互作用等功能。RabJ的核苷酸序列和氨基酸序列以及制法公開于中國專利申請CN01126826.3中。
在NIH3T3細胞系內，RabJ的過表達可以促進細胞周期蛋白表達、促進細胞增殖、推動細胞周期進展，在裸鼠體內也可以形成纖維肉瘤，提示RabJ是一個癌基因樣的小G蛋白。同時發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞內RabJ的表達往往甚高，抑制RabJ的表達可以抑制腫瘤細胞的增殖和體內外的致瘤活性。其作用機制可能是通過作為磷酸化MEK1/2的胞核錨著位點，抑制MEK1/2的核漿轉位，從而引起MEK1/2的持續(xù)活化并促進腫瘤的發(fā)生。
RT-PCR顯示，hRabJ是一個在腫瘤細胞中分布比較廣泛的分子，在HeLa、Jurkat、Molt-4、NB4、THP-1、U937、MCF-7、PC-3等多種人源造血細胞系白血病細胞和實體瘤內均有較高的表達，在正常的細胞系內(如NIH3T3、TC-1)內卻沒有表達。阻斷或者抑制hRabJ表達可抑制腫瘤的生長速率和降低其致瘤性，從而使hRabJ可以作為腫瘤治療或診斷的靶基因。
因此，如果以hRabJ為靶標，對機體進行免疫，將會使機體產(chǎn)生針對hRabJ蛋白的特異性免疫應答，從而使機體能有效地抑制、清除腫瘤細胞，為相關腫瘤的預防及治療提供措施。
合成肽疫苗是近年來隨著分子生物學及免疫學的進展而發(fā)展起來的一種新的疫苗，可以誘導機體產(chǎn)生特異性的免疫應答，而且其副作用輕微、安全性好，是目前疫苗研究的一個新的方向，被應用于抗腫瘤及抗病毒免疫治療。目前已經(jīng)有多種基于表位多肽的疫苗進入臨床研究或上市。
細胞免疫在抗腫瘤和抗病毒免疫中起關鍵作用。T細胞識別的抗原為與細胞表面的MHC-I類或II類分子結合的肽，其長度約為8-12個氨基酸。而作為殺傷腫瘤細胞的主要效應細胞CTL(細胞毒T淋巴細胞，Cytotoxic TLymphocytes)則識別與MHC-I類分子結合的內源性肽。已有證據(jù)表明，合成肽能直接與MHC-I類分子結合，而不需要APC的加工、處理，它和天然的內源性肽在激活免疫系統(tǒng)方面具有同等的效力。
多肽疫苗已成為目前抗惡性腫瘤的一項新策略，也是目前研究最多的腫瘤治療性疫苗。研究較多的有(1)gp100來源于gp100的肽G9154(序列為KTWGQYWQV)、G9209(序列為ITDQVPPFSV)均能誘導抗原特異性的CTL。用之致敏來自HLA-A2+的黑色素瘤患者的外周血淋巴細胞(PBL)，能明顯增強其誘導特異性CTL的能力誘導的CTL即能識別未修飾的gp100；(2)CEA采用與上述相似的方法，Zaremba等人的研究表明CEA的肽CAP1-6D不僅能在體外致敏CEA特異的CTL，其效力為CAP1的100-1000倍，在體內也能誘導CEA特異的CTL(而CAP1卻不能)；而且所致敏的CTL同樣能識別CAP1。更為重要的是，這些CTL能溶解同源的表達CEA的人類腫瘤；(3)MAGE-2MAGE-2廣泛存在于黑色素瘤、喉癌、肺癌、肉瘤等多種腫瘤(除睪丸外)，不存在于正常組織。在MAGE-2中已發(fā)現(xiàn)有三段多肽能與MHC-I類分子在37℃下形成穩(wěn)定復合物，其中至少有兩個能被HLA-A*0201加工、呈遞，成為多肽疫苗研究的新候選者；(4)P21WAFI將P21WAFI的肽與內源化肽融合能抑制腫瘤的生長；(5)HER2/neu來源于HER2/neu的肽在體外能致敏特異性的CTL，在小鼠體內也能誘導特異的CTL，且能抑制腫瘤的生長。另外采用HPV多肽疫苗也已經(jīng)進入臨床研究。
HLA-A2是一種在我國人群中具有較高分布的一種MHC-I類分子，陽性率在40-60％之間，占MHC-I類分子各個亞群的首位，由于HLA-A*0201是人群出現(xiàn)頻率最高的位點，基序組成明確，因此是疫苗設計中首選的相關分子。隨著對MHC-I類分子和肽表位分子相互作用認識的深人，科學家們已建立了較為成熟的表位鑒定技術路線，主要步驟如下(1)根據(jù)表位和MHC-I類分子相互作用的特點，預測MHC-I類分子限制性CTL表位，并利用計算機分子模擬技術對預測表位進行進一步篩選；(2)測定表位與MHC-I類分子結合力；(3)利用體外細胞毒分析或免疫荷瘤轉基因小鼠鑒定肽表位能否誘導CTL，尋求最佳優(yōu)勢表位?；谶@一技術路線，已有多種HLA-A*0201限制性CTL表位被鑒定，有的已在臨床顯示了較好療效。
T2細胞是用于測定表位與HLA-A*0201分子結合力的工具細胞之一，它是一株抗原遞呈轉運體缺陷的HLA-A*0201型細胞株，該細胞表面只表達不含有內源性抗原分子的HLA-A*0201分子，從而可利用其與目的肽的結合程度來測定HLA-A0201分子與目的表位間的親和力。
目前尚缺乏有效預防和治療抗腫瘤的治療性疫苗，尤其是安全性高的合成肽疫苗，因此本領域迫切需要開發(fā)新的可用于預防和治療腫瘤的安全性高、具有高免疫原性的合成肽疫苗。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是提供一種安全性高、具有高免疫原性的合成肽及其應用。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種hRabJ來源的HLA-A2限制性表位多肽，所述多肽具有誘導細胞毒T細胞殺傷活性，且選自下組(a)包含如下通式I中的氨基酸序列的多肽Xaa1-FVSKYLATI-Xaa2(I)
式中，Xaa1和Xaa2各為0、1、2或3個任選的氨基酸；(b)將通式氨基酸序列經(jīng)過1-4個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有誘導細胞毒T細胞殺傷活性功能的由(a)衍生的HLA-A2限制性表位多肽。
更佳地，所述的氨基酸選自下組Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val。
更佳地，所述的Xaa1是不存在、R、KR、或EKR。
而Xaa2是不存在、G、GI、或GID。
較佳地，所述的氨基酸序列經(jīng)一個或多個氨基酸的取代、缺失或添加。
在本發(fā)明的一個實施方式中，所述的多肽為FVSKYLATI(SEQ ID NOIDNO1)。
本發(fā)明的第二方面涉及一種重組蛋白，所述的重組蛋白含有如前所述的hRabJ來源的HLA-A2限制性表位多肽。
本發(fā)明的第三方面涉及一種分離的核酸，所述的核酸編碼如前所述的hRabJ來源的HLA-A2限制性表位多肽。
本發(fā)明的第四方面涉及一種抗原遞呈細胞，所述的抗原遞呈細胞是被如前所述的hRabJ來源的HLA-A2限制性表位多肽致敏的。
較佳地，所述的抗原遞呈細胞選自下組樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞、成纖維細胞、內皮細胞。
本發(fā)明的第五方面涉及一種組合物，所述組合物含有(a)0.001-99.99wt％如前所述的hRabJ來源的HLA-A2限制性表位多肽或如前所述的抗原遞呈細胞；和(b)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
較佳地，所述的組合物是藥物組合物，并且所述的載體、稀釋劑或賦形劑是藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
本發(fā)明的第六方面涉及一種如前所述的hRabJ來源的HLA-A2限制性表位多肽或抗原遞呈細胞在制備預防和治療腫瘤的藥物中的用途。
在本發(fā)明的第七方面，提供了本發(fā)明所述的hRabJ來源的HLA-A2限制性表位多肽的用途，它被用于制備包含該限制性表位多肽的重組蛋白(如融合蛋白)，或用于制備致敏的抗原遞呈細胞。


圖1R41-49肽致敏的樹突狀細胞(DC)體內誘導HLA-A2.1/Kb轉基因小鼠細胞毒T淋巴細胞的殺傷活性。其中A圖的效應細胞來自單純用同源DC體內誘導的細胞毒T淋巴細胞；B圖的效應細胞來自R41-49肽致敏的DC體內誘導的細胞毒T淋巴細胞。
圖2R41-49肽致敏的樹突狀細胞(DC)體內誘導HLA-A2.1/Kb轉基因小鼠細胞毒T淋巴細胞IFN-γ分泌情況。其中A圖的效應細胞來自單純用同源DC體內誘導的細胞毒T淋巴細胞；B圖的效應細胞來自R41-49肽致敏的DC體內誘導的細胞毒T淋巴細胞。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞內RabJ的表達往往升高，抑制RabJ的表達可以抑制腫瘤細胞的增殖和體內外的致瘤活性。據(jù)此，本發(fā)明人在對hRabJ進行計算機模擬分析的基礎上，選擇性地合成了多條能與HLA-A*0201結合并誘導機體產(chǎn)生CTL的hRabJ特異的抗原肽，并通過T2細胞結合實驗，篩選出與HLA-A*0201具有強親合力的表位肽，并對其免疫原性進行評價，發(fā)現(xiàn)其不僅可以在HLA-A2.1/Kb轉基因小鼠及健康人外周血中誘導出特異性的、HLA-A*0201限制性的細胞毒T淋巴細胞，而且是一個被細胞自然加工、遞呈的免疫原性多肽。在此基礎上完成了本發(fā)明。
具體地，本發(fā)明人的研究表明，RabJ在睪丸組織中主要分布于初級和次級精母細胞(spermatocyte)、早期精子細胞中(spermatids)，在間質細胞和支持細胞中無表達，與細胞周期蛋白cyclin A和cyclin D1在小鼠睪丸中的表達模式類似，提示RabJ可能與細胞周期調控相關。
在NIH3T3細胞系內，RabJ的過表達可以促進細胞周期蛋白表達、促進細胞增殖、推動細胞周期進展，且可促進該細胞系在軟瓊脂上形成克隆，并在裸鼠體內也可以形成成纖維肉瘤，提示其可能是一個癌基因樣的小G蛋白。
本發(fā)明的研究還發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞內RabJ的表達往往升高，抑制RabJ的表達可以抑制腫瘤細胞的增殖和體內外的致瘤活性。由于RabJ可以和多種蛋白形成復合體，因此用激酶抑制劑抑制各個激酶的活性，發(fā)現(xiàn)MEK/ERK抑制劑可以完全抑制RabJ的體外致瘤能力，提示ERK1/2依賴的信號傳導機制可能是RabJ的致瘤機理。
共聚焦顯微鏡的試驗結果還提示，RabJ是一個MEK1/2的核錨著蛋白，通過增加細胞核的磷酸化MEK1/2的水平，在胞核局部形成ERK1/2的持續(xù)活化，引起腫瘤的發(fā)生。
因此，本發(fā)明人的研究表明，RabJ作為小G蛋白家族成員，在細胞周期調控、細胞增殖、腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要的作用，其機理可能是通過核錨著磷酸化的MEK1/2促進ERK1/2介導的效應，促進細胞增殖和腫瘤的發(fā)生。因此，RabJ是一個癌基因樣的小G蛋白，在臨床腫瘤的診斷和治療中可作為潛在的候選靶標。
據(jù)此，本發(fā)明人在對hRabJ進行計算機模擬分析的基礎上，選擇性地合成了多條有可能與HLA-A*0201結合并誘導機體產(chǎn)生CTL的hRabJ特異的抗原肽，通過T2肽結合實驗，篩選出與HLA-A*0201具有強親合力的表位肽，并對其免疫原性進行評價，發(fā)現(xiàn)其不僅可以在HLA-A2.1/Kb轉基因小鼠及健康人外周血中誘導出特異性的、HLA-A*0201限制性的細胞毒T淋巴細胞，而且是一個被細胞自然加工、遞呈的免疫原性多肽。候選癌基因hRabJ來源的HLA-A2限制性的細胞毒T淋巴細胞表位肽的鑒定，對其腫瘤疫苗以及治療制劑的研制有重要的意義。
如本文所用，“本發(fā)明多肽”、“特異性多肽”、“HLA-A2限制性表位多肽”可互換使用，指氨基酸序列R41-49(SEQ ID NO1)所示的多肽。此外，還包括具有與R41-49相同功能的、SEQ ID NO1序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-20個，較佳地1-10個，更佳地1-5個，最佳地1-3個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域`中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括R41-49的活性衍生物。
一種優(yōu)選的衍生多肽是在SEQ ID NO1的上游添加對應于hRabJ中第37-40位的1個或2個或3個或4個氨基酸(如R、KR、EKR或CEKR)，和/或在SEQ ID NO1的下游添加對應于hRabJ中第50-53位的1個或2個或3個或4個氨基酸(如G、GI、GID或GIDY)。
本發(fā)明多肽可用常規(guī)方法人工合成，也可用重組方法生產(chǎn)。
本發(fā)明多肽也可用于與BSA等分子量的蛋白偶聯(lián)，從而形成多肽偶聯(lián)物。通常，所述的偶聯(lián)物由多肽、交聯(lián)劑、和BSA構成，其中所述的交聯(lián)劑優(yōu)選戊二醛、EDAC。
此外，本發(fā)明的多肽和偶聯(lián)物還可用于制備治療性的藥物組合物或預防性及治療性的疫苗組合物。
因此，另一方面，本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有(a)安全有效量的本發(fā)明多肽、偶聯(lián)物或其組合物；以及(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明多肽的數(shù)量通常為10微克-100毫克/劑，較佳地為100-1000微克/劑。
本文所用的術語“有效量”指治療劑治療、緩解或預防目標疾病或狀況的量，或是表現(xiàn)出可檢測的治療或預防效果的量。對于某一對象的精確有效量取決于該對象的體型和健康狀況、病癥的性質和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預先指定準確的有效量是沒用的。然而，對于某給定的狀況而言，可以用常規(guī)實驗來確定該有效量，臨床醫(yī)師是能夠判斷出來的。
為了本發(fā)明的目的，有效的劑量為給予個體約0.01毫克/千克至50毫克/千克，較佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克體重的本發(fā)明多肽。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
藥物組合物還可含有藥學上可接受的載體。術語“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身不誘導產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體，且給藥后沒有過分的毒性。這些載體是本領域普通技術人員所熟知的。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到關于藥學上可接受的賦形劑的充分討論。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐劑、及其組合。
治療性組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等。此外，免疫組合物中還可以含有免疫佐劑。
通常，可將治療性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。
一旦配成本發(fā)明的組合物，可將其直接給予對象。待預防或治療的對象可以是動物；尤其是人。
本發(fā)明的含本發(fā)明多肽的治療或預防性藥物組合物(包括疫苗)，可以經(jīng)口服、皮下、皮內、靜脈注射等方式應用。治療劑量方案可以是單劑方案或多劑方案。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于本發(fā)明的表位肽是RabJ蛋白來源的、HLA-A2限制性的細胞毒T淋巴細胞表位肽，可安全有效地引起針對腫瘤細胞的免疫應答，則不僅對腫瘤發(fā)病機制的研究，而且對腫瘤治療性疫苗以及治療制劑的研制均有重要的意義。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例實施例1HLA-A*0201高親和力肽的篩選本實施例通過肽結合實驗篩選出與HLA-A*0201高親和力的表位肽。
試驗步驟首先收集T2細胞(一種缺失抗原加工能力的細胞，購買自ATCCCRL-1991)，用無血清1640洗三次后，調細胞濃度至2×105個細胞/ml，鋪于24孔板中，0.5ml/孔。再與50μM的候選多肽，2.5μg/ml的β2微球蛋白于37℃，5％CO2孵箱中共孵育18h。孵育好的細胞用冰PBS洗三遍，加入FITC標記的HLA-A2特異性的mAb BB7.2(購自Sterotec Ltd，Oxford，UK)，冰浴45分鐘，PBS洗后用流式細胞儀檢測平均熒光強度。以陽性已知肽CEA HLA-A2限制性表位多肽CAP-1(SEQ ID NO10，序列為YLSGANLNL)作為陽性對照，未加肽刺激的單純T2細胞作為背景對照。
檢測方法免疫熒光法檢測肽與HLA-A*0201分子的結合情況，是基于外源性多肽與T2細胞表面MHC-I類分子的結合可使其表面的MHC-I類分子的表達量增加，兩者結合越穩(wěn)固，則可檢測到的MHC-I類分子的表達量越多，以平均熒光強度為檢測指標。結果以熒光系數(shù)(FI)作為衡量指標。多肽的FI＞1被認為是高親和力的表位。

試驗結果免疫熒光法測得的hRabJ蛋白來源多肽的T2-HLA-A*0201結合的親和力結果如表1所示。本發(fā)明人從候選癌基因hRabJ來源的多肽中篩選出與HLA-A2高親和力的表位R41-49(SEQ ID NO1，序列為TLFCQGLEV)。
表1hRabJ蛋白來源多肽的T2-HLA-A*0201結合的親和力

高親和力FI＞1實施例2表達RabJ的腺病毒(pAdRabJ)的制備以中國專利01126826.3實施例1中所獲得的包含人RabJ cDNA的質粒為模板，經(jīng)SalI-XhoI酶切，再與質粒pShuttle-CMV(Stratagene公司)按常規(guī)方法重組并轉化至感受態(tài)大腸桿菌BL21，挑取陽性克隆鑒定后純化并測序(ABI公司，BigDye Terminator試劑盒)。將正確序列的人RabJ-pShuttle-CMV載體經(jīng)PmeI線性化后與pAdeasy腺病毒骨架質粒(Stratagene公司)共同轉化大腸桿菌BJ5183(Stratagene公司)。陽性克隆用PacI酶切鑒定，產(chǎn)物行0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析。經(jīng)測序證實，已經(jīng)重組產(chǎn)生了包含人RabJ編碼序列的腺病毒載體。
該腺病毒載體經(jīng)PacI線性化后利用Lipofactamine轉染試劑(Invitrogen)公司轉染AD293細胞(Stratagene公司)，7-10天后待細胞完全變圓，收集細胞，反復凍融獲得病毒上清，通過CsCl梯度離心進行大量病毒的純化，從而獲得表達RabJ的重組腺病毒(pAdRabJ)，病毒滴度為10×1013。
實施例3HLA-A2.1/Kb轉基因小鼠體內針對hRabJ來源的HLA-A2限制性多肽特異性細胞毒T淋巴細胞的誘導效應細胞的制備按常規(guī)方法制備HLA-A2.1/Kb轉基因小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(DC)。收集培養(yǎng)至第7天的DC，調細胞濃度至1×106個細胞/ml，加入R41-49(終濃度10μM/ml)及β2微球蛋白(終濃度3μg/ml)，37℃，5％CO2孵箱中孵育3h。收集肽致敏的DC，用PBS洗三遍，調細胞濃度至1×106個細胞/0.2ml免疫小鼠。每只小鼠腹腔注射1×106個細胞/0.2ml，共免疫三次，間隔一周。末次免疫后7天，無菌操作摘取小鼠脾臟，溶解紅細胞，制成單細胞懸液。將脾細胞懸液(5×106個細胞/ml)與肽致敏的經(jīng)照射的自體樹突狀細胞以10∶1比例置于RPMI 1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)6天后，收集效應細胞。
檢測方法(1)特異性殺傷活性的檢測本實施例采用了標準的4小時51Cr釋放試驗檢測特異性殺傷活性。
分別用負載表位肽R41-49、SSp-1(無關對照，序列為RLNEVAKNL(SEQ IDNO11))的T2細胞、表達RabJ的腺病毒(pAdRabJ)感染的T2(陽性對照)及未加負載的T2細胞作為靶細胞，加入51Cr(購買自Amersham公司，100μCi/106個細胞)，置37水浴中標記90分鐘，每間隔15分鐘輕混勻一次，洗3遍，徹底洗去殘余Na251CrO4，標記好的靶細胞用完全培養(yǎng)基調整細胞濃度為1×105個細胞/ml，加入96孔圓底板，每孔100μl。按50∶1、25∶1、12.5∶1三個不同效靶比加入效應細胞，37孵育4小時，收集各孔上清各100μl，用γ計數(shù)儀檢測cpm值。最大釋放組各孔為單獨的靶細胞加100μl 1％SDS；自發(fā)釋放孔為單獨的靶細胞加100μl完全培養(yǎng)基。
(2)肽特異性CTL胞內IFN-γ的檢測所誘導的效應細胞中加入20μM相應的肽，48小時后，常規(guī)胞內染色。
試驗結果結果顯示，hRabJ來源的HLA-A2限制性多肽R41-49致敏的樹突狀細胞能夠顯著誘導HLA-A2.1/Kb轉基因小鼠產(chǎn)生限制性多肽特異性細胞毒T淋巴細胞和殺傷活性，并能夠刺激IFN-γ產(chǎn)生。R41-49的試驗結果如圖1和圖2所示。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學<120>一種新的候選癌基因hRabJ來源的HLA-A2限制性表位多肽及其應用<130>057874<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Phe Val Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ile1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Gly Ile Asp Tyr Gly Val Thr Lys Val1 5<210>3<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3Trp Leu Ala Glu Met Lys Gln Glu Leu1 5<210>4<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)
<400>4Val Ile Ser Met Gly Asn Ala Glu Val1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>5Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Val Leu1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>6Val Leu Leu His Pro Asp Lys Cys Val1 5<210>7<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>7Asn Met Glu Asn Ile Ile Phe Val Val1 5<210>8<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>8Val Val Asn Ala Arg Thr Ala Leu Leu1 5
<210>9<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>9Asp Met Leu Gly Val Lys Pro Gly Ala1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>10Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu1 5<210>11<211>9<212>PRT<213>對照多肽<400>11Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu1 5<210>12<211>1787<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(25)..(843)<223>
<400>12caagcttatg catgcggccg ctga atg gag gcc aac atg ccg aag cgg aag51Met Glu Ala Asn Met Pro Lys Arg Lys1 5gag ccc ggc agg tct ctc cgc atc aaa gtc arc tcc atg ggc aac gcc 99Glu Pro Gly Arg Ser Leu Arg Ile Lys Val Ile Ser Met Gly Asn Ala
10 15 20 25gaa gtg ggg aaa agc tgt att ata aag cga tac tgt gag aaa aga ttc 147Glu Val Gly Lys Ser Cys Ile Ile Lys Arg Tyr Cys Glu Lys Arg Phe30 35 40gtg tct aaa tac ctg gca aca att gga att gac tat gga gtc aca aag 195Val Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ile Gly Ile Asp Tyr Gly Val Thr Lys45 50 55gta cac gtc aga gac aga gaa atc aaa gtt aac atc ttt gat atg gct 243Val His Val Arg Asp Arg Glu Ile Lys Val Asn Ile Phe Asp Met Ala60 65 70gga cat ccc ttc ttc tat gag gtt cga aat gag ttt tac aag gac aca 291Gly His Pro Phe Phe Tyr Glu Val Arg Asn Glu Phe Tyr Lys Asp Thr75 80 85cag ggt gtg ata ctg gtc tat gat gtt ggg cag aaa gac tcc ttt gac 339Gln Gly Val Ile Leu Val Tyr Asp Val Gly Gln Lys Asp Ser Phe Asp90 95 100 105gcc ctt gat gcg tgg ctg gca gaa atg aag caa gag ctt gga cct cat 387Ala Leu Asp Ala Trp Leu Ala Glu Met Lys Gln Glu Leu Gly Pro His110 115 120gga aac atg gaa aat att ata ttt gta gtt tgt gcc aac aag att gat 435Gly Asn Met Glu Asn Ile Ile Phe Val Val Cys Ala Asn Lys Ile Asp125 130 135tgt acc aaa cat cgc tgt gta gat gaa agt gaa gga cgt ctt tgg gct 483Cys Thr Lys His Arg Cys Val Asp Glu Ser Glu Gly Arg Leu Trp Ala140 145 150gaa agc aaa ggg ttc ctg tac ttt gaa act tca gca caa act gga gaa 531Glu Ser Lys Gly Phe Leu Tyr Phe Glu Thr Ser Ala Gln Thr Gly Glu155 160 165ggc att aat gag atg ttc cag acc ttt tat ata tcc ata gtt gat tta 579Gly Ile Asn Glu Met Phe Gln Thr Phe Tyr Ile Ser ILe Val Asp Leu170 175 180 185tgt gaa aat ggc ggg aaa cgc cct acc acc aat agc agt gct agt ttc 627Cys Glu Asn Gly Gly Lys Arg Pro Thr Thr Asn Ser Ser Ala Ser Phe190 195 200acc aaa gaa caa gca gat gcc att cgc aga att cga aat agt aaa gac 675Thr Lys Glu Gln Ala Asp Ala Ile Arg Arg Ile Arg Asn Ser Lys Asp205 210 215agt tgg gac atg ctg gga gtc aaa cct ggg gcc tca agg gat gaa gtc 723Ser Trp Asp Met Leu Gly Val Lys Pro Gly Ala Ser Arg Asp Glu Val220 225 230aat aaa gcg tat cgg aaa ctt gct gtg ctt ctt cac cct gac aaa tgt 771Asn Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Val Leu Leu His Pro Asp Lys Cys235 240 245gta gca cct ggc agt gaa gat gcc ttc aaa gca gtt gtg aat gct cgg 819Val Ala Pro Gly Ser Glu Asp Ala Phe Lys Ala yal Val Asn Ala Arg250 255 260 265aca gcc ctc ctg aaa aac atc aag tagaaagtac agaaaaaagc cacatgtggg 873Thr Ala Leu Leu Lys Asn Ile Lys270actcaaatgc aaacagactt tccctagagg tgaaataacc aacgtggagt tttccttccc933
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210 215 220Lys Pro Gly Ala Ser Arg Asp Glu Val Asn Lys Ala Tyr Arg Lys Leu225 230 235 240Ala Val Leu Leu His Pro Asp Lys Cys Val Ala Pro Gly Ser Glu Asp245 250 255Ala Phe Lys Ala Val Val Asn Ala Arg Thr Ala Leu Leu Lys Asn Ile260 265 270Lys
權利要求
1.一種hRabJ來源的HLA-A2限制性表位多肽，其特征在于，所述多肽具有誘導細胞毒T細胞殺傷活性，且選自下組(a)包含如下通式I中的氨基酸序列的多肽Xaa1-FVSKYLATI-Xaa2(I)式中，Xaa1和Xaa2各為0、1、2或3個任選的氨基酸；(b)將通式氨基酸序列經(jīng)過1-4個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有誘導細胞毒T細胞殺傷活性功能的由(a)衍生的HLA-A2限制性表位多肽。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的氨基酸序列經(jīng)一個或多個氨基酸的取代、缺失或添加。
3.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽為FVSKYLATI。
4.一種重組蛋白，其特征在于，它含有權利要求1-3任一項所述的hRabJ來源的HLA-A2限制性表位多肽。
5.一種分離的核酸，其特征在于，它編碼權利要求1-3任一項所述的hRabJ來源的HLA-A2限制性表位多肽。
6.一種抗原遞呈細胞，其特征在于，所述的抗原遞呈細胞是被權利要求1-3任一項所述的hRabJ來源的HLA-A2限制性表位多肽致敏的。
7.如權利要求6所述的抗原遞呈細胞，其特征在于，所述的抗原遞呈細胞選自下組樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞、成纖維細胞、內皮細胞。
8.一種組合物，其特征在于，它含有(a)0.001-99.99wt％權利要求1-3任一項所述的hRabJ來源的HLA-A2限制性表位多肽或權利要求6或7所述的抗原遞呈細胞；和(b)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
9.如權利要求8所述的組合物，其特征在于，所述的組合物是藥物組合物，并且所述的載體、稀釋劑或賦形劑是藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
10.一種權利要求1-3任一項所述的hRabJ來源的HLA-A2限制性表位多肽或權利要求6或7所述的抗原遞呈細胞的用途，其特征在于，用于制備預防和治療腫瘤的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種候選癌基因hRabJ來源的HLA－A2限制性表位多肽，以及該表位及其相關的重組蛋白、編碼核苷酸序列、抗原遞呈細胞、組合物，以及針對該表位的特異性免疫效應細胞在表達hRabJ腫瘤治療及預防中的用途。
文檔編號A61K38/17GK1948342SQ200510030529
公開日2007年4月18日 申請日期2005年10月14日 優(yōu)先權日2005年10月14日
發(fā)明者李楠, 孫偉紅, 陳濤涌, 曹雪濤 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學