專利名稱：南葶藶子油在制備具有腦神經(jīng)調(diào)節(jié)功能組合物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對一種以天然植物提取物，具體講是將南葶藶子油在制備具有腦神經(jīng)調(diào)節(jié)功能組合物中的應(yīng)用，包括在制備成對多種腦病及其癥狀體征具有輔助性治療、調(diào)節(jié)和康復(fù)作用的藥物、保健品或食品等方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腦病是指因遺傳、先天性腦發(fā)育不全、腦外傷、腦腫瘤、腦出血、腦梗阻、感染、化學(xué)藥物中毒等多種原因引起的大腦神經(jīng)組織損傷，進(jìn)而導(dǎo)致患者智力低下、思維、語言障礙、感覺異常、肢體癱瘓甚至大小便失禁等癥狀體征或精神抑郁的一大類疾病，常見的可分為三類一是遺傳、先天發(fā)育不良造成的小兒腦癱，智力低下等；二是外傷造成的急性腦損傷后遺癥、腦血管病造成的腦中風(fēng)后遺癥等；三是因中樞神經(jīng)纖維損傷進(jìn)而造成腦神經(jīng)細(xì)胞衰老退化造成的慢性退行性疾病，包括老年癡呆癥、腦萎縮、帕金森病及等；同時還包括了由于腦細(xì)胞凋亡與再生平衡破壞所致的抑郁癥。
上述各種腦病的病變本質(zhì)，多是由于神經(jīng)信息傳導(dǎo)通道(腦路)——神經(jīng)纖維的堵塞，造成神經(jīng)各種信息的傳導(dǎo)不暢，致使腦神經(jīng)細(xì)胞功能缺失。例如中風(fēng)是由于腦血管堵塞或破裂導(dǎo)致神經(jīng)纖維傳導(dǎo)功能的損傷、堵塞、斷裂，進(jìn)而使神經(jīng)細(xì)胞變性、損傷或死亡，出現(xiàn)偏癱、失語等感覺、運(yùn)動功能障礙；胎兒腦神經(jīng)纖維發(fā)育受阻、不能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化成熟，新生兒缺血、缺氧，可造成以中樞性運(yùn)動功能障礙為主的腦性癱瘓；大腦黑質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量減少，合成多巴胺不足，會導(dǎo)致帕金森；信息傳導(dǎo)通道——纖維的衰老與凋亡加劇，導(dǎo)致腦細(xì)胞的衰老，腦組織萎縮可成老年性癡呆；腦細(xì)胞凋亡和平衡破壞或應(yīng)激性腦損傷使神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能失去平衡導(dǎo)致抑郁癥。
據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，腦梗塞、腦出血、腦萎縮癡呆癥、小兒腦癱、癲癇、帕金森病、腦外傷等腦病、神經(jīng)損傷性疾病占人類疾病總數(shù)的30％左右。而且腦梗塞、腦出血等還具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率等四高的特征。同時，作為威脅人類健康的第四大疾患，抑郁癥發(fā)病率也有逐漸升高的趨勢，威脅患者生命，影響患者家庭生活，增加家庭負(fù)擔(dān)及社會負(fù)擔(dān)，損耗醫(yī)療資源。
目前可用于上述腦病治療和/或預(yù)防的藥品并不多，能針對各類原因所致腦病的治療預(yù)防藥物更為少見。目前的藥物多只是針對上述腦病中的單一疾病或癥狀，且品種單一，而治療所需的費(fèi)用巨大，治療用途卻相對狹窄，不能滿足市場需求。
因此，開發(fā)可用于預(yù)防和/或治療上述腦病的產(chǎn)品，例如能具有腦神經(jīng)調(diào)節(jié)功能的藥品、保健品和/或食品等，特別是根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)藥食同源的理論，開發(fā)以天然原料和/或提取物為成分具有生理功能的產(chǎn)品，更具有重要的社會意義與經(jīng)濟(jì)效益。
例如，本發(fā)明所涉及的南葶藶子油，是一種由播娘蒿植物的種子提取得到油性成分，富含包括亞麻酸和亞油酸等在內(nèi)的不飽和脂肪酸。據(jù)文獻(xiàn)記載，南葶藶子一般是以水煎劑形式用于心血管疾病和呼吸道疾病。中國專利文獻(xiàn)CN 1313040A報道，播娘蒿油與一些成分組合可以作為一種降脂降壓保健食品。CN 1326764A報道，播娘蒿油與其它成分組合可以作為具有降血脂效果的藥物。CN 1211443A報道，含有播娘蒿油的亞麻酸源復(fù)合油與亞油酸源復(fù)合油、亞麻酸源復(fù)合油、復(fù)合維生素、復(fù)合微量元素及復(fù)合核苷酸等多種成分，可以成為一種具有防治過敏色斑衰老肥胖的藥食化妝兼用營養(yǎng)素。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述情況，本發(fā)明將提供一種南葶藶子油在制備具有腦神經(jīng)調(diào)節(jié)功能組合物中的應(yīng)用，并通過大量試驗證明其對于各種原因所致的腦病，例如在包括因遺傳、先天性腦發(fā)育不全、腦外傷、腦腫瘤、腦出血、腦梗阻、感染、化學(xué)藥物中毒等引起的大腦神經(jīng)組織損傷、腦中風(fēng)后遺癥、老年癡呆、腦癱、腦萎縮、記憶力減退、失眠健忘和抑郁癥在內(nèi)的腦病，以及進(jìn)而導(dǎo)致的智力低下、思維、語言障礙、感覺異常、肢體癱瘓甚至大小便失禁或精神抑郁等癥狀體征能具有顯著的功效，可以制備成藥物和/或保健品，或是作為食品添加成分而制備成多種食品等方式，發(fā)揮其在提高腦神經(jīng)的活性，防止腦神經(jīng)衰老；調(diào)節(jié)神經(jīng)介質(zhì)和受體；促進(jìn)腦神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育生長和腦細(xì)胞間的連接；有利于穩(wěn)定神經(jīng)系統(tǒng)及促進(jìn)腦疲勞的恢復(fù)，從而改善大腦，增強(qiáng)記憶；誘導(dǎo)神經(jīng)纖維的自我生長及分裂及重塑神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的作用方面的輔助性治療、調(diào)節(jié)和康復(fù)作用。
本發(fā)明所說的南葶藶子油在制備具有腦神經(jīng)調(diào)節(jié)功能組合物中的應(yīng)用，除可以直接單獨(dú)使用外，更好的方式是與人體可接受的其他成分，例如包括以南葶藶子油為活性成分，與藥學(xué)可接受的輔助成分共同組成的具有所說輔助性治療、調(diào)節(jié)和康復(fù)作用的相應(yīng)藥物，例如與常規(guī)所用的賦形劑、調(diào)味劑、崩解劑、防腐劑、抗氧化劑、潤滑劑、濕潤劑、粘合劑、溶劑、增稠劑、增溶劑等藥物輔料成分，制成為適合于臨床使用的片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液體等口服型或注射型的藥物制劑，以及將南葶藶子油作為食品添加成分，與食品生產(chǎn)可接受的其他原料，共同組成具有所說輔助性治療、調(diào)節(jié)和康復(fù)作用的相應(yīng)食品，例如將南葶藶子油與其它食品成分混合并以常規(guī)生產(chǎn)方式而制成為相應(yīng)的食品，如調(diào)和油、奶粉等多種形式具有保健、調(diào)節(jié)和康復(fù)功能的食品。
上述所說的南葶藶子油，是來源于民間和臨床上常用的天然中藥野生植物播娘蒿(Descurania sophia(L.)Webb.ex Prantl)的種子南葶藶子的提取物，可以參照包括上述文獻(xiàn)在內(nèi)的現(xiàn)已報道或使用的方式提取得到。
本發(fā)明所說的南葶藶子油在腦神經(jīng)調(diào)節(jié)功能方面所具有的顯著作用，可以通過下述的試驗結(jié)果得到證實(shí)。其中試驗所用各劑量組的南葶藶子油均是采用上述文獻(xiàn)報道的方法，由南葶藶子提取得到的。
一、南葶藶子油對快速老化腦萎縮模型小鼠SOD、MDA、CAT、GSH-Px的影響實(shí)驗動物隨機(jī)選取2月齡的SAM-P/10小鼠120只，大劑量、中劑量、小劑量、陽性對照組、模型組各15只，并選同品系正常老化的SAM-R/1只小鼠作為對照組，雌雄各半實(shí)驗方法南葶藶子油口服高劑量組(40ml/Kg)、中劑量組(20ml/Kg)、低劑量組(10ml/Kg)和陽性對照組(腦復(fù)康片240mg/Kg)每日灌胃給藥，模型組及正常對照組每日給予等量生理鹽水灌胃。小鼠給藥在1月、4月、7月后分3批，每組各10只，斷頭處死，冰臺上快速取腦，制備組織勻漿，取上清進(jìn)行SOD、MDA、CAT、GSH-Px檢測。
實(shí)驗結(jié)果南葶藶子油高、中劑量組能夠提高快速老化腦萎縮模型小鼠SOD、CAT和GSH-Px的活性，與模型組相比具有顯著性差異(P＜0.01，0.05)；對模型小鼠MDA的升高具有顯著的抑制作用(P＜0.01，0.05)，試驗結(jié)果如表1、2、3所示。實(shí)驗結(jié)果說明南葶藶子油對腦萎縮有治療及預(yù)防作用。
表1 對給藥1月快速老化腦萎縮模型小鼠SOD、MDA、CAT、GSH-Px的影響

注與正常對照組相比**P＜0.01，*P＜0.05；與模型組相比ΔΔP＜0.01，ΔP＜0.05。
表2 對給藥4月快速老化腦萎縮模型小鼠SOD、MDA、CAT、GSH-Px的影響

注與正常對照組相比**P＜0.01；與模型組相比ΔΔP＜0.01，ΔP＜0.05。
表3 對給藥7月快速老化腦萎縮模型小鼠SOD、MDA、CAT、GSH-Px的影響

注與正常對照組相比**P＜0.01，*P＜0.05；與模型組相比ΔΔP＜0.01，ΔP＜0.05。
二、南葶藶子油對實(shí)驗性小鼠閉合性腦外傷的影響實(shí)驗動物取實(shí)驗小鼠60只，隨機(jī)分為6組，即葶藶子油高、中、低劑量組，劑量分別為40ml/Kg、20ml/Kg、10ml/Kg，腦復(fù)康組240mg/Kg，模型組和正常對照組，每組10只。灌胃給藥，每天1次，連續(xù)3天，正常組和模型組給等容量的生理鹽水。末次給藥后40min，除正常組外，將其他各組小鼠乙醚麻醉，然后固定在自制的自由落體腦損傷裝置的底部平臺上，用直徑約4mm的撞擊錘尖端頂在小鼠顱腦矢狀面左側(cè)2～4mm處，取50g砝碼，從18cm高處自由落下，通過撞擊錘復(fù)制閉合性腦外傷小鼠模型。
實(shí)驗方法1、對閉合性腦外傷模型小鼠斷頭喘氣時間的影響按以上方法將實(shí)驗小鼠分組、給藥、造模。造模后8h，用剪刀在小鼠雙耳線處快速斷頭，記錄喘氣時間。
2、對閉合性腦外傷模型小鼠血腦屏障(BBB)的影響按以上方法將實(shí)驗小鼠分組、給藥、造模。造模后18h，尾靜脈注射伊文思藍(lán)溶液(劑量25mg/kg)。注射后6h，頸椎脫臼處死小鼠，取腦組織烘干。比色法測定干腦組織伊文思藍(lán)含量。
3、對閉合性腦外傷模型小鼠腦指數(shù)和腦組織含水量的影響按以上方法將實(shí)驗小鼠分組、給藥、造模。造模后4h，頸椎脫臼處死小鼠，迅速剖開顱骨取腦組織稱濕重，將濕腦組織置50℃烘箱中烘烤24h，稱重。計算腦組織含水量和腦指數(shù)。腦組織含水量＝(濕重-干重)/濕重×100％，腦指數(shù)＝腦濕重×100f體重。
4、對閉合性腦外傷模型小鼠腦組織TNF-α及血清ET含量的影響按以上方法將實(shí)驗小鼠分組、給藥、造模。造模后18h，斷頭處死小鼠，取血，離心分離血清，放免法測定血清ET含量。取腦組織，每1g腦組織加10mL 0.1％的醋酸，煮沸10min，研磨成勻漿，4℃3000r/min離心10min，取上清液，放免法測定腦組織TNF-α含量。
實(shí)驗結(jié)果1.高、中、低劑量組均能顯著延長模型小鼠斷頭喘氣時間，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01，0.05)。結(jié)果見表4。
表4 對閉合性腦外傷模型小鼠斷頭喘氣時間的影響(n＝10)

注與正常對照組相比**P＜0.01；與模型組相比ΔΔP＜0.01，ΔP＜0.05。
2.高、中劑量組能顯著降低模型小鼠腦組織伊文思藍(lán)含量，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01，0.05)。結(jié)果見表5。
表5 對閉合性腦外傷模型小鼠腦組織伊文思藍(lán)含量的影響(n＝10)

注與正常對照組相比**P＜0.01；與模型組相比ΔΔP＜0.01，ΔP＜0.05。
3.高、中劑量組均能顯著降低模型小鼠腦組織含水量及腦指數(shù)，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01，0.05)。結(jié)果見表6。
表6 對閉合性腦外傷模型小鼠腦組織含水量及腦指數(shù)的影響(n＝10)

注與正常對照組相比**P＜0.01，*P＜0.05；與模型組相比ΔΔP＜0.01，ΔP＜0.05。
4.南葶藶子油高、中、低劑量組均能顯著降低模型小鼠TNF-α含量，而高、中劑量組亦能顯著降低模型小鼠血清ET含量，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01，0.05)。結(jié)果見表7。
表7 對閉合性腦外傷模型小鼠腦組織TNF-僅及血清ET含量的影響(n＝10)

注與正常對照組相比**P＜0.01；與模型組相比ΔΔP＜0.01，ΔP＜0.05。
以上實(shí)驗結(jié)果說明，南葶藶子油對實(shí)驗性腦外傷有一定的治療作用。
三、南葶藶子油對帕金森綜合癥的影響1、南葶藶子油對氧合震顫素致小鼠震顫的影響實(shí)驗?zāi)Ｐ椭谱髋c分組選用昆明種小鼠雌雄各半，每組十六只，體重22-26克，隨機(jī)分成5組，即(1)模型組；2)美多芭組；(3)南葶藶子油小劑量組；(4)南葶藶子油中激劑量組；(5)南葶藶子油大劑量組。模型組每日給予等量生理鹽水灌胃。(2)組每天灌美多芭120mg/kg，(3)組每天灌南葶藶子油40ml/Kg，(4)組每天灌南葶藶子油20ml/Kg，(5)組每天灌南葶藶子油10ml/Kg，連續(xù)14天。末次給藥后60min腹腔注射氧合震顫素(0.15mg/kg)。電極插入小鼠右后肢體，以多導(dǎo)生理記錄儀記錄動物出現(xiàn)震顫的潛伏期、震顫持續(xù)時間及震顫幅度。結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
實(shí)驗結(jié)果模型組小鼠腹腔注射M膽堿受體激動劑氧合震顫素后，表現(xiàn)為全身顫抖、弓背、豎尾、伴有流涎、流淚、排便等癥狀。與模型組比較，南葶藶子油高中低劑量組震顫幅度顯著降低(P＜0.01)；南葶藶子油高劑量組震顫持續(xù)時間明顯縮短(P＜0.05)，南葶藶子油三個劑量組震顫潛伏期未見明顯改變。對照藥美多芭組震顫潛伏期、震顫持續(xù)時間及震顫幅度，均未見明顯改變，結(jié)果見表8。
表8 南葶藶子油對氧合震顫素致小鼠震顫模型的影響

注與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.012、南葶藶子油對抗MPTP致小鼠帕金森病模型的影響。
實(shí)驗動物按上述方法隨機(jī)分六組，灌胃給藥，每天一次，連續(xù)21天。模型組和給藥組動物于第16天腹腔注射MPTP30mg/kg，對照組腹腔注射等體積生理鹽水，每日一次，連續(xù)五天，末次給藥后60min，動物迅速斷頭取出大腦，稱重，液氮固定。動物組組加工作液，電動勻漿20s(110,000r/min)，提取上清液。過濾分裝備用。自動進(jìn)樣器進(jìn)樣，測定DA，DOPAC，HVA等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量。對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
實(shí)驗結(jié)果在本試驗條件下，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度在0-600ng/ml范圍內(nèi)與峰面積之間有良好的線性關(guān)系。與對照組比較，模型組小鼠腹腔注射MPTP5d后，腦內(nèi)DA，DOPAC，HVA等含量顯著降低(P＜0.01)；與模型組比較，南葶藶子油大劑量DA，DOPAC，HVA等含量均有明顯增加(P＜0.05)，小劑量組HVA含量明顯高于模型組(P＜0.01)；美多芭組DA，DOPAC，HVA等含量均明顯增加(P＜0.01)，結(jié)果見表9。
表9 對小鼠腦內(nèi)每克腦組織DA，DOPAC，HVA含量的影響

注與對照組比較ΔΔP＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01上述實(shí)驗結(jié)果說明，南葶藶子油對帕金森癥有顯著的治療作用且有一定的預(yù)防作用。
四、南葶藶子油對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的保護(hù)作用試驗動物新生7日齡的SD大鼠90只，體重12～16g，雌雄兼用，隨機(jī)分為假手術(shù)組，HIE模型對照組，南葶藶子油高、中、低三個劑量組、腦活素陽性對照組共6組，每組15只動物。
HIE模型建立及給藥方法大鼠稱重后用0.2氯胺酮0.1g/kg靜脈麻醉，切開頸部皮膚，分離左頸總動脈，按Race方法行左側(cè)頸總動脈結(jié)扎(假手術(shù)組只分離不結(jié)扎)，縫合傷口，休息2h后放人37℃，8％的氧氣罐中2h，制成HIE模型。模型制成后南葶藶子油高、中、低三個劑量組按(40、20、10ml/Kg)灌胃給藥，腦活素陽性對照組立即腹腔注射腦活素50ml/kg，每日1次，共3d；模型對照組灌胃給藥等劑量的生理鹽水，連用3d；假手術(shù)組不予處理。
各組大鼠第四天斷頭處死，快速取腦，經(jīng)10％中性福爾馬林緩沖液固定2h后，以視交叉、乳頭體中部、大腦后緣與小腦連接處為切點(diǎn)，將腦按冠狀切成四片，常規(guī)石蠟包埋，切片(厚約6μm)分別進(jìn)行常規(guī)HE染色光鏡觀察和原位末端標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡。
實(shí)驗結(jié)果細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果表示模型對照組凋亡細(xì)胞比例明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)，南葶藶子油高、中、低三個劑量組和腦活素陽性對照組凋亡細(xì)胞的比例明顯低于HIE組，(P＜0.05)，而與假手術(shù)組無明顯差別。結(jié)果見表10。
表10 各組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞比例比較

注與假手術(shù)組相比**P＜0.01；與模型對照組相比*P＜0.05。
HE染色結(jié)果顯示假手術(shù)組光鏡下顯示腦組織各部位結(jié)構(gòu)及細(xì)胞層次清楚，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整；模型對照組腦水腫明顯，細(xì)胞層次混亂，細(xì)胞體積小，胞漿皺縮，大量神經(jīng)細(xì)胞壞死；南葶藶子油高、中、低三個劑量組和腦活素陽性對照組腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞變性均較模型對照組輕。上述試驗結(jié)果說明南葶藶子油對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷有保護(hù)作用。
五、南葶藶子油對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的治療作用試驗動物新生7日齡的SD大鼠90只，體重12～16g，雌雄兼用，隨機(jī)分為假手術(shù)組，HIE模型對照組，南葶藶子油高、中、低三個劑量組、腦活素陽性對照組共6組，每組20只動物。
HIE模型建立及給藥方法大鼠稱重后用0.2氯胺酮0.1g/kg靜脈麻醉，切開頸部皮膚，分離左頸總動脈，按Race方法行左側(cè)頸總動脈結(jié)扎(假手術(shù)組只分離不結(jié)扎)，縫合傷口，休息2h后放人37℃，8％的氧氣罐中2h，制成HIE模型。模型制成后南葶藶子油高、中、低三個劑量組按(40、20、10ml/Kg)灌胃給藥，腦活素陽性對照組立即腹腔注射腦活素50ml/kg，每日1次，共4d；模型對照組灌胃給藥等劑量的生理鹽水，連用4d；假手術(shù)組不予處理。
各組實(shí)驗動物分別于缺血缺氧后6，24，72，96h斷頭取左側(cè)腦組織，以視交叉前2mm為切點(diǎn)向前取一片厚約3mm，向后取一片約3mm，用于做MDA、SOD檢測。采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定MDA含量。采用羥胺比色法測定SOD活力。
試驗結(jié)果MDA試驗結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，HIE模型對照組MDA的含量在缺血缺氧6h顯著升高(P＜0.01)，24h達(dá)到高峰，以后逐漸降低，72h與假手術(shù)組相比仍然差異顯著(P＜0.05)，96h盡管高于假手術(shù)組，但是與假手術(shù)組相比已無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，說明模型成功。南葶藶子油高劑量組以及腦活素陽性對照組與模型對照組比較，MDA含量在缺血缺氧后已經(jīng)開始下降(P＜0.05).24h降低尤為顯著(P＜0.01)；南葶藶子油中劑量組和南葶藶子油低劑量組與模型對照組比較，MDA含量在缺血缺氧后已經(jīng)開始下降，但無統(tǒng)計學(xué)差異.24h降低較為顯著(P＜0.05)，72h各治療組與模型對照組比較，差異不顯著(P＞0.05)。結(jié)果見表11。
SOD試驗結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，HIE模型對照組SOD的活力值在缺血缺氧后6h顯著降低(P＜0.01)，24h下降到最低點(diǎn)，然后逐漸回升。72h雖然已明顯上升，但是與假手術(shù)組相比仍然有顯著差異(P＜0.01)，96h后則差異不顯著(P＞0.05)。而南葶藶子油高劑量組和腦活素陽性對照組與模型對照組比較，SOD的活力值在缺血缺氧后6h已經(jīng)開始上升(P＜0.05)，24h升高顯著(P＜0.01)，96h與模型對照組比較，差異不顯著(P＞0.05)。南葶藶子油中劑量組和南葶藶子油低劑量組與模型對照組比較，SOD活力值在缺血缺氧后已經(jīng)開始上升，但無統(tǒng)計學(xué)差異.24h升高較為顯著(P＜0.05)，72h各治療組與模型對照組比較，差異不顯著(P＞0.05)，結(jié)果見表12。試驗結(jié)果說明南葶藶子油對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷有治療作用。
表11 各組大鼠腦組織MDA的動態(tài)變化(nmol/mL)

注與假手術(shù)組相比**P＜0.01，*P＜0.05；與模型對照組相比ΔΔP＜0.01，ΔP＜0.05。
表12 各組大鼠腦組織SOD的動態(tài)變化(U/mL)

注與假手術(shù)組相比**P＜0.01，*P＜0.05；與模型對照組相比ΔΔP＜0.01，ΔP＜0.05。
六、葶藶子油對三氯化鋁造型小鼠學(xué)習(xí)與記憶的測定實(shí)驗?zāi)Ｐ椭谱髋c分組選用昆明種小鼠雌雄各半，每組十六只，體重22-26克，隨機(jī)分成6組，即正常組、癡呆模型組、模型加腦復(fù)康組、模型加南葶藶子油小劑量組、模型加南葶藶子油中激劑量組、模型加南葶藶子油大劑量組。正常組每天灌等量的生理鹽水。其余各組灌三氯化鋁100mg/Kg，隔天一次。陽性藥物組每天灌腦復(fù)康5mg/d，南葶藶子油高、中、低三個劑量組按(40、20、10ml/Kg)灌胃給藥。
1、用Y迷宮法測定癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶按模型制作與分組連續(xù)給小鼠造型灌藥兩個月。
用Y迷宮法對小鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)與記憶的測定，每只小鼠測10次，記錄正確和錯誤的的次數(shù)，24小時后測定小鼠記憶的情況，見表13。實(shí)驗結(jié)果說明南葶藶子油對模型小鼠的學(xué)習(xí)與記憶有顯著的治療作用。
表13 南葶藶子油對三鋁化鋁造型小鼠學(xué)習(xí)與記憶的影響

注與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.0。
2、南葶藶子油對三氯化鋁造型的癡呆小鼠腦生化指標(biāo)的影響各組小鼠在測定學(xué)習(xí)和記憶后，斷頭處死，取全腦(去小腦)，于正中失狀縫分開，一半測定腦內(nèi)過氧化脂質(zhì)(MDA)，另一半測定B型單腦氧化酶(MAO-B)。MDA的測定用0.05M磷酸緩沖液制成10％的腦勻漿，用考馬斯亮蘭法測定蛋白質(zhì)含量，用TBA比色法測定腦組織中的丙二醛的含量。腦內(nèi)MAO-B的測定用0.2M磷酸緩沖液配制成10％腦勻漿(預(yù)冷)，勻漿在24Kc超聲，在10000r/min下離心10min，去沉淀，上清液在17000r/min下離心30min。沉淀用0.2磷酸緩沖液懸浮，即粗酶，參考McEwen法測定MOA-B活性。實(shí)驗結(jié)果見表15。實(shí)驗結(jié)果說明南葶藶子油對三氯化鋁造型的癡呆小鼠腦生化指標(biāo)有一定的降低作用，對老年性癡呆有顯著的治療及預(yù)防作用。
表14 南葶藶子油對的影響三氯化鋁造型的癡呆小鼠腦生化指標(biāo)的影響

注與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
七、南葶藶子油對實(shí)驗性大鼠腦缺血的改善試驗動物SD大鼠(250-300g)，雌雄各半，隨機(jī)分為6組，每組15只動物。分別為正常對照組，模型組，陽性對照組，南葶藶子油口服高、中、低三個劑量組。
南葶藶子油口服高劑量組(40ml/Kg)、中劑量組(20ml/Kg)、低劑量組(10ml/Kg)和陽性對照組(維腦路通100mg/kg)每日灌胃給藥，正常對照組每日給予等量生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥7d，末次給藥后1h用10％水合氯醛(467mg/kg)麻醉大鼠，剝離并結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈及迷走神經(jīng)。正常對照組只行手術(shù)而不結(jié)扎動脈。結(jié)扎3h后，斷頭，開顱取腦，去腦干，沿腦中線將腦一分為二。一份稱重，計算腦指數(shù)(腦指數(shù)＝腦重×100/體重)。在110℃烘箱中烘至恒重，計算腦含水量百分比，腦含水量百分比＝(濕重-干重)/濕重×100％；另一份經(jīng)固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋制片，染色，光鏡檢查。
試驗結(jié)果腦缺血模型組腦含水量與正常對照組比較有顯著差異，腦含水量增加；而不同劑量給藥組及陽性對照組腦含水量明顯減少，較模型組有顯著差異；腦缺血模型組與正常對照組比較腦指數(shù)增加；不同劑量給藥組及陽性對照組腦指數(shù)有減少趨勢，口服南葶藶子油高劑量組較腦缺血模型組有顯著差異。說明南葶藶子油對實(shí)驗性實(shí)驗性大鼠腦缺血有保護(hù)作用。試驗結(jié)果見表15。
表15 對實(shí)驗性實(shí)驗性大鼠腦缺血保護(hù)作用(X±S)

注與正常組比較*P＜0.05；與模型組比較ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01八、南葶藶子油對大鼠體內(nèi)血栓形成的影響試驗動物SD大鼠(250-300g)，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只動物。分別為正常對照組，模型組，陽性對照組，葶藶子油口服高、中、低三個劑量組。
南葶藶子油口服高劑量組(40ml/Kg)、中劑量組(20ml/Kg)、低劑量組(10ml/Kg)和陽性對照組(阿司匹林50mg/kg)每日灌胃給藥，正常對照組每日給予等量生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥7d，未次給藥60min后用戊巴比妥鈉30mg·kg-1ip麻醉，固定，分離左頸外靜脈和右頸總動脈，在內(nèi)徑為2mm的聚乙烯管中放人一根長7cm的4號手術(shù)線，用肝素生理鹽水50u·ml-1充滿三段相連的聚乙烯管中，將該管一端插入左頸外靜脈，再經(jīng)此管另一端準(zhǔn)確注人肝素50u·kg-1抗凝，并將此端插入右頸總動脈中。立即放開動脈夾，準(zhǔn)確記錄血流，15min后終止血流。取出絲線稱重，總重量減去絲線重即血栓濕重。
試驗結(jié)果南葶藶子油給予小鼠后，與阿司匹林一樣均可使大鼠血栓濕重減輕，經(jīng)統(tǒng)計分析，高劑量組與生理鹽水組相比較具有顯著差異(P＜0.05)，說明葶藶子油有抗血栓作用。結(jié)果見表16。
表16 對大鼠體內(nèi)血栓形成的影響

注與正常組比較*P＜0.05。
九、南葶藶子油對急型血瘀模型大鼠血液流變的影響試驗動物SD大鼠(250-300g)，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只動物。分別為模型組，陽性對照組，陽性對照組，南葶藶子油口服高、中、低三個劑量組。
南葶藶子油口服高劑量組(40ml/Kg)、中劑量組(20ml/Kg)、低劑量組(10ml/Kg)和陽性對照組(復(fù)方丹參片150mg/kg)每日灌胃給藥，正常對照組每日給予等量生理鹽水灌胃。每日1次，連續(xù)7d，第7天灌胃2h后各組分別用1g·L-1腎上腺素0.2ml/只皮下注射共2次，間隔4h，其間進(jìn)行1次冰水冷刺澈5min，處理后停食，次晨斷頭取血。適量肝索抗凝分別測定血流變學(xué)指標(biāo)。
試驗結(jié)果血瘀模型大鼠血液流變性呈粘、濃、凝改變，即全血比粘度(高、低切變率)增高，反映“粘”。試驗表明，南葶藶子油給予小鼠后，與復(fù)方丹參一樣均可使大鼠血瘀模型之粘、濃、凝改變明顯減輕，說明南葶藶子油有活血作用。結(jié)果見表17。
表17 對急型血瘀模型大鼠血液流變的影響(n＝10)

注與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
十、南葶藶子油對大鼠凝血時間的影響試驗動物SD大鼠(250-300g)，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只動物。分別為模型組，陽性對照組，陽性對照組，南葶藶子油口服高、中、低三個劑量組。
南葶藶子油口服高劑量組(40ml/Kg)、中劑量組(20ml/Kg)、低劑量組(10ml/Kg)和陽性對照組(阿司匹林21mg/kg)每日灌胃給藥，正常對照組每日給予等量生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥7d，在最末一次給藥后1小時，先用毛細(xì)玻璃管從大鼠眼內(nèi)眥球后靜脈叢取血。自血液流入管內(nèi)開始計時，每隔30秒折斷毛細(xì)管約0.5cm，并緩慢向左右拉開，觀察血凝絲出現(xiàn)時間，即血凝時間。
試驗結(jié)果葶藶子油給予大鼠后，與阿司匹林一樣均明顯延長大鼠凝血時間。經(jīng)統(tǒng)計分析，高劑量組與生理鹽水組相比較具有顯著差異(P＜0.01)，說明南葶藶子油有活血化瘀作用。結(jié)果見表18。
表18 南葶藶子油對大鼠凝血時間的影響

注與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
十一、南葶藶子油對小鼠懸尾不動時間的影響試驗動物KM種小鼠，雌雄各半，體重18～22g，隨機(jī)分為5組，每組10只動物。分別為正常對照組，陽性對照組，南葶藶子油口服高、中、低三個劑量組。
南葶藶子油口服高劑量組(40ml/Kg)、中劑量組(20ml/Kg)、低劑量組(10ml/Kg)和陽性對照組(鹽酸氟西汀80mg/kg)每日灌胃給藥，正常對照組每日給予等量生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥7d，未次給藥后30min將其尾部2cm處的部分貼在一水平木棍上，使動物成倒掛狀態(tài)，其頭部離臺面約5cm，懸掛兩側(cè)用板隔開動物視線，觀察記錄給藥組及對照組在6min內(nèi)的不動時間。
試驗結(jié)果南葶藶子油給予小鼠后，與鹽酸氟西汀一樣均可縮短小鼠強(qiáng)迫懸尾不動時間，經(jīng)統(tǒng)計分析中、高劑量組與生理鹽水組相比較具有顯著差(P＜0.01)，低劑量組懸尾不動時間雖然有所縮短，但與生理鹽水比較差異無顯著意義，實(shí)驗結(jié)果說明南葶藶子油可以對抗小鼠因強(qiáng)迫懸尾造成的抑郁癥狀。見表19。
表19 南葶藶子油對小鼠強(qiáng)迫懸尾不動時間的影響

注與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
十二、南葶藶子油對小鼠強(qiáng)迫游泳不動時間的影響試驗動物KM種小鼠，雌雄各半，體重18～22g，隨機(jī)分為5組，每組10只動物。分別為正常對照組，陽性對照組，南葶藶子油口服高、中、低三個劑量組。
南葶藶子油口服高劑量組(40ml/Kg)、中劑量組(20ml/Kg)、低劑量組(10ml/Kg)和陽性對照組(鹽酸氟西汀80mg/kg)每日灌胃給藥，正常對照組每日給予等量生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥7d，未次給藥30min后，放入水缸(2000ml燒杯，高20cm，直徑14cm，水深10cm)中，調(diào)節(jié)水溫23～25℃，每缸一只，置水中觀察6min，記錄小鼠后4min內(nèi)累計不動時間。
試驗結(jié)果南葶藶子油給予小鼠后，與鹽酸氟西汀一樣均可縮短小鼠強(qiáng)迫游泳不動時間，經(jīng)統(tǒng)計分析，低、中、高劑量組與生理鹽水組相比較具有顯著差異(P＜0.05～0.01)，說明南葶藶子油可以對抗小鼠因強(qiáng)迫游泳造成的抑郁癥狀。結(jié)果見表20。
表20 南葶藶子油對小鼠強(qiáng)迫游泳不動時間的影響

注與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
十三、南葶藶子油對5-HTP誘導(dǎo)的小鼠甩頭行為的影響試驗動物KM種小鼠，雌雄各半，體重18～22g，隨機(jī)分為5組，每組10只動物。分別為正常對照組，陽性對照組，南葶藶子油口服高、中、低三個劑量組。
南葶藶子油口服高劑量組(40ml/Kg)、中劑量組(20ml/Kg)、低劑量組(10ml/Kg)和陽性對照組(鹽酸氟西汀80mg/kg)每日灌胃給藥，正常對照組每日給予等量生理鹽水灌胃。實(shí)驗在上午8～12時進(jìn)行，各組小鼠灌胃給予單胺氧化酶抑制劑嗎氯貝胺0.1g/kg，1.5h后，除氟西汀陽性對照組灌胃給予鹽酸氟西汀80mg/kg外，其余各組按上述給藥不變，30min后，靜注給予10mg/kg DL-5-HTP。注射不久后小鼠表現(xiàn)躁動，陽性小鼠出現(xiàn)特征性甩頭行為，陰性小鼠則無，10min后記錄6min內(nèi)小鼠的甩頭次數(shù)。
試驗結(jié)果小鼠5-HTP增強(qiáng)甩頭試驗表明，小劑量的南葶藶子油未能使小鼠發(fā)生甩頭反應(yīng)，只有在中劑量和大劑量時才能使小鼠甩頭表現(xiàn)陽性，說明小劑量時南葶藶子油抑制5-HT重攝取的能力有限，加大劑量時方能顯著抑制5-HT的重攝取，證明了葶藶子油可以通過抑制5-HT的重攝取來發(fā)揮其抗抑郁作用。結(jié)果見表21。
表21 南葶藶子油對小鼠強(qiáng)迫游泳不動時間的影響

注與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
十四、南葶藶子油對對小鼠因利血平引起的眼瞼下垂度影響試驗動物KM種小鼠，雌雄各半，體重18～22g，隨機(jī)分為6組，每組10只動物。分別為正常對照組，模型組，陽性對照組，南葶藶子油口服高、中、低三個劑量組。
南葶藶子油口服高劑量組(40ml/Kg)、中劑量組(20ml/Kg)、低劑量組(10ml/Kg)和陽性對照組(鹽酸氟西汀80mg/kg)每日灌胃給藥，正常對照組每日給予等量生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥7d，未次給藥30min后，每只小鼠按2.5mg/kg腹腔注射利血平(0.1ml/10g)，觀察小鼠眼險下垂情況，準(zhǔn)確記錄1h時的眼瞼下垂度和體溫，觀察自發(fā)活動、耳尾顏色及腹瀉等情況。按Rubin分級標(biāo)準(zhǔn)，判斷下垂度。0度正常開目；1度眼瞼下垂1/4；2度眼瞼下垂1/2；3度眼瞼下垂3/4；4度眼瞼完全閉合。
試驗結(jié)果經(jīng)實(shí)驗，小鼠給予利血平(2.5mg/kg)后，出現(xiàn)了明顯的上瞼下垂、運(yùn)動不能和體溫下降癥狀，小鼠全部閉眼、倦縮，耳、尾皮膚顏色灰暗，1h時有腹瀉發(fā)生，與正常小鼠比較差異有極顯著性(P＜0.01)，說明給正常小鼠腹腔注射利血平后，可以造成抑郁動物模型。用南葶藶子油和鹽酸氟西汀給抑郁模型動物進(jìn)行治療，結(jié)果模型動物的抑郁癥狀得到明顯改善，小鼠部分有自發(fā)活動，耳、尾顏色較紅潤，眼瞼下垂程度和體溫下降程度降低，但腹瀉情況變化不大。南葶藶子油低、中、高劑量組動物的眼瞼下垂度與生理鹽水組比較差異有較顯著性(P＜0.05～0.01)，南葶藶子油中、高劑量組動物的體溫下降與生理鹽水組相比較差異有顯著性(P＜0.05)，說明南葶藶子油可以對抗小鼠因利血平引起的抑郁癥狀。結(jié)果見表22。
表22 南葶藶子油對利血平引起小鼠抑郁模型的影響(X±S)

注與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與正常組比較ΔΔP＜0.01。
十五、毒性觀察1.給小鼠灌食或注射最大給藥濃度和劑量都不致死，不能測出南葶藶子油的半數(shù)致死量。
2.用南葶藶子油進(jìn)行了大鼠致畸胎試驗、Ames試驗、小鼠骨髓微核試驗和染色體畸變試驗，證明該藥無致畸和致突作用。
由以上的各項實(shí)驗結(jié)果可以看出，本發(fā)明提出的對南葶藶子油的應(yīng)用，開拓了其在醫(yī)療、保健領(lǐng)域的新用途。其無明顯毒副作用，且原料來源豐富，提取和制備成相應(yīng)的藥物或食品的方法并無特殊要求和限制，在提高腦神經(jīng)的活性，防止腦神經(jīng)衰老；調(diào)節(jié)神經(jīng)介質(zhì)和受體；促進(jìn)腦神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育生長和腦細(xì)胞間的連接；有利于穩(wěn)定神經(jīng)系統(tǒng)及促進(jìn)腦疲勞的恢復(fù)，從而改善大腦，增強(qiáng)記憶；誘導(dǎo)神經(jīng)纖維的自我生長及分裂及重塑神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等方面具有理想的綜合藥理作用，具有很好的應(yīng)用于藥品及保健品的前景，可在治療各種原因所致的腦病，如腦中風(fēng)后遺癥、老年癡呆、腦癱、腦萎縮、記憶力減退、失眠健忘等發(fā)揮滿意的輔助治療、保健和康復(fù)作用。
以下通過實(shí)施例的具體實(shí)施方式
再對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段做出的各種替換或變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
具體實(shí)施例方式
將播娘蒿種子南葶藶子，按前述文獻(xiàn)報道的常規(guī)方法榨取，或是采用CO2臨界萃取，或用有機(jī)溶劑萃取等方式，得到純凈的南葶藶子油作為原料，進(jìn)行下述制備。
實(shí)施例1 南葶藶子油片劑藥物原料南葶藶子油 100g，淀粉 60g，乳糖30g， 硬酯酸鎂 10g。
制備方法將南葶藶子油、淀粉、乳糖混勻，成規(guī)方法制粒后，加入硬酯酸鎂整粒，壓片，共制成1000片，得到每片含南葶藶子油100mg的片劑藥物。
實(shí)施例2 南葶藶子油軟膠囊藥物原料南葶藶子油10Kg制備方法將南葶藶子油按常規(guī)方式與PEG400、甘油、吐溫等常用輔料混合均勻后，用灌裝機(jī)灌裝在明膠膠囊的包裝中，得到南葶藶子油軟膠囊制劑藥物。
實(shí)施例3 南葶藶子油注射劑藥物原料南葶藶子油100g制備方法將南葶藶子油與化學(xué)類(如吐溫-80、泊洛沙姆等)或天然成分(如膽甾醇、卵磷脂、豆磷脂、阿拉伯膠、膽酸類等)乳化劑，以及在乳劑注射液的其它常規(guī)輔料(如抗壞血酸、谷胱甘肽等抗氧劑；羧甲基纖維素納、聚乙烯吡咯烷醇等助懸劑；苯甲醇、尼泊金甲酯等抑菌劑)混勻，按油乳劑型注射劑工藝加工，共制成2000支注射劑。每支注射劑藥物中含南葶藶子油50mg。
實(shí)施例4 含南葶藶子油的調(diào)和油將南葶藶子油按適當(dāng)比例，與食用菜籽油、玉米油、花生油、葵花子油、大豆油、南瓜子油、棕櫚油、橄欖油或其他形式的調(diào)和油混合均勻，即得到含南葶藶子油的食用調(diào)和油。
實(shí)施例5 含南葶藶子油的配方奶粉將南葶藶子油50-80千克，脫脂乳60-100千克，乳清蛋白濃縮物3-5千克，乳糖16-18千克混合溶解后，按食品允許的添加量加入適當(dāng)?shù)乃苄跃S生素和/或微量元素0.1-0.2千克，以及脂溶性維生素和/或膽固醇適量，混合、均質(zhì)、加熱殺菌、濃縮后常規(guī)方式噴霧干燥。得到含南葶藶子油強(qiáng)化添加成分的配方奶粉110-180千克。
實(shí)施例6 含南葶藶子油的嬰幼兒配方奶粉將南葶藶子油150-180千克，酪蛋白和乳清粉10-40千克混合溶解后，按食品允許的添加量加入水溶性維生素及微量元素0.4-0.7千克及乳化劑、穩(wěn)定性的鹽類適量，混合、均質(zhì)、加熱殺菌、濃縮后常規(guī)方式噴霧干燥，得到強(qiáng)化添加南葶藶子油的嬰幼兒配方奶粉140-210千克。
權(quán)利要求
1.南葶藶子油在制備具有腦神經(jīng)調(diào)節(jié)功能組合物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是由南葶藶子油為活性成分，與藥學(xué)可接受的輔助成分共同組成的藥物。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是所說的藥物為口服型制劑。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是所說的藥物為注射型制劑。
5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是以南葶藶子油作為食品添加成分，與食品生產(chǎn)可接受的其他原料共同組成的食品。
6.如權(quán)利要求1至5之一所述的應(yīng)用，其特征是所說的腦神經(jīng)調(diào)節(jié)功能是指對包括腦神經(jīng)組織損傷、腦中風(fēng)后遺癥、老年癡呆、腦癱、腦萎縮、記憶力減退、失眠健忘和抑郁癥在內(nèi)的腦病及其癥狀體征具有的調(diào)節(jié)康復(fù)功能。
全文摘要
南葶藶子油在制備具有腦神經(jīng)調(diào)節(jié)功能組合物中的應(yīng)用，將南葶藶子油與人體可接受的其他成分共同制成為藥物、保健品或多種食品，以發(fā)揮其具有提高腦神經(jīng)的活性，防止腦神經(jīng)衰老；調(diào)節(jié)神經(jīng)介質(zhì)和受體；促進(jìn)腦神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育生長和腦細(xì)胞間的連接；有利于穩(wěn)定神經(jīng)系統(tǒng)及促進(jìn)腦疲勞的恢復(fù)，從而改善大腦，增強(qiáng)記憶；誘導(dǎo)神經(jīng)纖維的自我生長及分裂及重塑神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的作用，可用于多種原因所致的腦病，如腦神經(jīng)組織損傷、腦中風(fēng)后遺癥、老年癡呆、腦癱、腦萎縮、記憶力減退、失眠健忘等病癥的輔助康復(fù)治療。
文檔編號A61K131/00GK1927248SQ20051002162
公開日2007年3月14日 申請日期2005年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月6日
發(fā)明者羅霞, 曹定知, 江南, 楊士明, 余夢瑤, 曾瑾, 劉高陽, 陶桓晟 申請人:四川省中醫(yī)藥研究院