專(zhuān)利名稱：大豆異黃酮作為預(yù)防腦缺血損傷藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大豆異黃酮的藥物用途，特別是其作為預(yù)防腦缺血損傷藥物的用途。
大豆作為糧食消費(fèi)已有近千年的歷史，隨著人們對(duì)大豆及其制品的營(yíng)養(yǎng)作用研究的深入，發(fā)現(xiàn)大豆不但是優(yōu)秀蛋白質(zhì)和油脂的重要來(lái)源，還含有許多有益的生物活性物質(zhì)，如大豆低聚糖、大豆異黃酮、大豆磷脂等。尤其是近年來(lái)的研究表明，大豆異黃酮具有抗氧化、抗癌、預(yù)防心血管疾病、預(yù)防骨質(zhì)疏松、改善婦女更年期障礙等生理功能。特別是隨著人類(lèi)生活水平的日益提高，人們?cè)絹?lái)越重視自身的健康保健，大豆異黃酮對(duì)人體的生理代謝有益的調(diào)節(jié)和我國(guó)豐富的大豆資源，為大豆異黃酮的開(kāi)發(fā)展示了廣闊前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供大豆異黃酮的新用途，具體就是大豆異黃酮作為預(yù)防腦缺血損傷藥物的應(yīng)用。
大豆中大豆異黃酮(Soybean Isoflavone)存在形式主要是以丙二?；涮求w形式存在。大豆異黃酮是一種混合物，為具有2-苯基色酮骨架的化合物群。天然狀態(tài)存在的大豆異黃酮共有12種。游離異黃酮和糖苷異黃酮結(jié)構(gòu)分別如下 和
從大豆異黃酮的分子結(jié)構(gòu)看出，大豆異黃酮中的酚羥基易被氧化，可作為抗氧化劑在生物體內(nèi)產(chǎn)生一系列生物活性。自由基是人體生命活動(dòng)過(guò)程中生物化學(xué)反應(yīng)的中間產(chǎn)物。在正常情況下，體內(nèi)的自由基的產(chǎn)生和其清除處于動(dòng)態(tài)平衡之中。但是，如果體內(nèi)自由基產(chǎn)生過(guò)多或清除過(guò)慢，則自由基會(huì)在分子水平、細(xì)胞水平以及器官水平上給機(jī)體造成損傷，可導(dǎo)致功能和代謝紊亂，加快機(jī)體的衰老過(guò)程，甚至誘發(fā)癌癥、心血管疾病等諸多疾病。大豆異黃酮特有的分子結(jié)構(gòu)決定了大豆異黃酮在體內(nèi)能與超氧陰離子反應(yīng)，阻止自由基引發(fā)，與金屬離子螯合，阻止羥基自由基生成，與脂質(zhì)過(guò)氧化基反應(yīng)，阻止脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程。此外，流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)，常食大豆對(duì)預(yù)防癌癥和心血管疾病發(fā)生、增進(jìn)人體健康有益。大豆異黃酮(SIF)作為大豆中的一類(lèi)微量組分由于具備多種生物活性，如雌激素樣活性、抗氧化、抗癌和抑制血管平滑肌收縮等而日益受到人們的關(guān)注。由于大豆異黃酮能夠有效的清除大腦內(nèi)過(guò)多的活性氧及其自由基，對(duì)腦缺血損傷起著積極的保護(hù)作用，因此，為開(kāi)發(fā)以大豆異黃酮為有效成份的預(yù)防腦缺血損傷類(lèi)藥物提供了進(jìn)一步理論依據(jù)。
本發(fā)明通過(guò)以下試驗(yàn)，即通過(guò)建立并觀察大鼠腦缺血損傷再灌注模型，探討了腦缺血損傷與鐵代謝的關(guān)系，證實(shí)大豆異黃酮對(duì)腦缺血損傷的預(yù)防作用可能是通過(guò)降低鐵誘導(dǎo)的過(guò)氧化反應(yīng)完成的。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一、材料與方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑200-220g Wistar雄性大鼠由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供大豆異黃酮由北京化工大學(xué)饋贈(zèng)。
二、鼠局灶性腦缺血再灌注模型制備①插線的制備單股尼龍線每段5cm，用火柴將尼龍線端燙成圓頭，而后浸泡在75％酒精液中備用。②MCAO模型制作所有大鼠均選擇左側(cè)MCA區(qū)，3％戊巴比妥鈉1ml/100g麻醉，大鼠仰臥位固定，頸正中開(kāi)口，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)和頸外動(dòng)脈(ECA)，在ECA發(fā)出約0.8cm處結(jié)扎。結(jié)扎CCA近心端，在其上做一楔形切口，將尼龍線自切口處輕輕插入CCA，經(jīng)頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉部進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，繼續(xù)向前推進(jìn)，直到ICA顱內(nèi)分叉部阻斷流入大腦中動(dòng)脈(MCA)的血流。該外距CCA分叉部約17mm，固定尼龍線，殘端留1cm長(zhǎng)于皮外。缺血0.5h后，將尼龍線輕輕抽出即可使動(dòng)脈恢復(fù)再通，實(shí)現(xiàn)再灌注。模型成功的標(biāo)志是待清醒后，觀察現(xiàn)象右前肢癱瘓，與左前肢交叉成剪刀狀，行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，左眼變小。將大鼠灌流后斷頭取腦，左大腦局部有白斑。
三、動(dòng)物分組將大鼠分為四組預(yù)防組，非預(yù)防組，對(duì)照組，正常組，每組三只。其中預(yù)防組和對(duì)照組造模前連續(xù)灌胃一個(gè)月。預(yù)防組大鼠灌胃大豆異黃酮，劑量為2.5mg/100g，對(duì)照組為同體積生理鹽水。非預(yù)防組為造模前不灌胃的大鼠。
四、尼氏染色和ABC免疫組化染色尼氏染色尼氏液中染色6min→70％酒精5s→80％酒精5min→90％酒精5min→95％酒精5min→100％酒精I(xiàn) 5min→100％酒精I(xiàn)I 5min→二甲苯I透明5min4→中性樹(shù)膠封片，觀察。
ABC免疫組化染色0.01M磷酸鹽緩沖液PBS(PH 7.4)清洗切片3次，5min/次。0.3％甲醇過(guò)氧化氫室溫下孵育30min。微波修復(fù)5min，低火，自然冷卻。0.01M PBS清洗3次，5min/次。正常血清在37℃溫箱，濕盒內(nèi)孵育60min。用濾紙將血清吸干后，加入一抗1∶500(兔抗大鼠HP)，4℃冰箱濕盒內(nèi)過(guò)夜。取出濕盒，室溫下復(fù)溫(約0.5-1h)PBS清洗3次，5min/次。用濾紙將PBS吸干后，加入羊抗兔生物素化二抗的工作液于37℃溫箱、濕盒內(nèi)孵育60min。PBS清洗3次，5min/次。用濾紙將PBS吸干后，加入VECTASTAIN Elite ABC試劑，于37℃溫箱、濕盒內(nèi)孵育60min。取出濕盒，PBS清洗切片3次，5min/次。DAB顯色，自來(lái)水流水充分沖洗。梯度酒精脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。
五、病理組織學(xué)觀察大鼠腦缺血0.5h，再灌注24h，用4℃的4％多聚甲醛固定液進(jìn)行快速全身灌流固定，取大腦放入4％的甲醛中固定。取出固定大腦，常規(guī)脫水，透明，取背側(cè)海馬(bregma-3～-3.8mm)常規(guī)12μm連續(xù)冠狀切片。HE染色和免疫組織化學(xué)染色，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)健側(cè)及傷側(cè)細(xì)胞形態(tài)變化。
六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果尼氏染色結(jié)果(200×)通過(guò)對(duì)切片在20倍鏡下觀察，預(yù)防組受損傷的一側(cè)腦組織明顯比對(duì)照組受損傷的程度降低，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞群在疏松程度和數(shù)量等方面都有明顯的差異，表明大豆異黃酮對(duì)局灶性腦缺血損傷有一定的預(yù)防作用。預(yù)防組大腦傷側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞群不如健側(cè)分層明顯且較為分散，對(duì)照組大腦兩側(cè)馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞群則無(wú)明顯區(qū)別，預(yù)防組傷側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞與非預(yù)防組相比，細(xì)胞排列較為整齊。
免疫組化染色結(jié)果(200×)結(jié)果證實(shí)，手術(shù)后預(yù)防組大腦損傷側(cè)的Hp陽(yáng)性細(xì)胞明顯比對(duì)照組損傷側(cè)和正常組損傷側(cè)表達(dá)顯著，且通過(guò)與對(duì)側(cè)比較，發(fā)現(xiàn)預(yù)防組的差異最小。
七、討論海馬CA1區(qū)神經(jīng)元對(duì)缺血十分敏感，可能與腦缺血時(shí)有大量具有神經(jīng)毒性的興奮性氨基酸(EAA)釋放至細(xì)胞外液，而CA1區(qū)有大量的谷氨酸受體有關(guān)。雖然海馬血供主要來(lái)自大腦后動(dòng)脈的穿支，但由于CA1區(qū)的缺血敏感性較高加上其血管分布較其它亞區(qū)稀疏，因此大腦中動(dòng)脈(MCA)阻塞即可造成其不可逆損傷。研究表明腦缺血損傷后，會(huì)產(chǎn)生大量的自由基和活性氧，它們可通過(guò)損傷大分子物質(zhì)導(dǎo)致缺血性腦損傷，也能通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)途徑損傷腦組織，而大豆異黃酮?jiǎng)t具有一定的抗氧化作用，能消除腦內(nèi)過(guò)多的自由基和活性氧。本實(shí)驗(yàn)中的通過(guò)對(duì)尼氏染色的腦切片觀察，在對(duì)大鼠連續(xù)1個(gè)月的灌胃大豆異黃酮后，預(yù)防組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷程度與正常組大鼠差別較小，與非預(yù)防組相比差別較大，表明大豆異黃酮對(duì)缺血性腦損傷確實(shí)有一定的預(yù)防作用。Hp蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的重要的鐵釋放輔助蛋白，參與細(xì)胞鐵的釋放，研究結(jié)果亦顯示，大豆異黃酮可明顯提高該蛋白在神經(jīng)細(xì)胞的分布，提示其抗氧化損傷的作用可能是通過(guò)降低細(xì)胞鐵水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
八、結(jié)論大豆異黃酮作為大豆中的一類(lèi)微量組分，其抗氧化作用能夠清除腦內(nèi)過(guò)多的自由基和活性氧，對(duì)腦缺血疾病的發(fā)生可以起到一定的預(yù)防作用。
大豆異黃酮可以制備成以大豆異黃酮為有效成分的片劑，膠囊劑，粉劑等劑型，用以預(yù)防腦缺血損傷，其日服用有效成分大豆異黃酮的量為10-60mg。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用以說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例以大豆異黃酮為有效成分作為預(yù)防腦缺血損傷藥物可以是多種制劑形式。
一、片劑的制備工藝

1、按比例將大豆異黃酮，大豆卵磷脂，膠化淀粉，蛋白糖粉末混合均勻，到入干凈的研缽中，加入50-75％的乙醇溶液迅速研磨制軟材，以緊握成團(tuán)，稍觸即散為宜；2、將軟材用力壓過(guò)18目尼龍篩制粒以無(wú)長(zhǎng)條，塊狀，細(xì)粉為宜；3、將軟材顆粒在60℃恒溫箱中烘干，3-6min后在16目篩中整粒；4、將整粒后的顆粒置于燒杯中，加入微晶纖維素混合均勻；5、依次加入膨速王和硬脂酸鎂，混合均勻；6、填料混合均勻，然后壓片。
二、膠囊劑的制備工藝按大豆異黃酮∶大豆卵磷脂∶淀粉＝0.5～1.2∶0.4～1.3∶4～10混合均勻，50-75％的乙醇溶液迅速研磨，60℃恒溫箱中烘干，將顆粒粉碎成細(xì)粉，過(guò)篩，混勻，裝入膠囊，即得。
三、粉劑的制備工藝將大豆異黃酮(日有效量為10-50mg)，大豆磷脂，麥芽糖(或麥芽糖醇)和普通大豆粉充分混合，四者比例為1-1.5∶0.5-1∶1.5-5∶5-12，然后進(jìn)行研磨，分裝即得。
將上述制劑分別用以預(yù)防腦缺血損傷，日服用有效成分大豆異黃酮的量為10-60mg，證實(shí)可以預(yù)防腦缺血疾病的發(fā)生。
權(quán)利要求
1.大豆異黃酮的藥物應(yīng)用，其特征在于以大豆異黃酮為有效成分制備預(yù)防腦缺血損傷藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種大豆異黃酮在制藥領(lǐng)域的新用途。大豆異黃酮在體內(nèi)與超氧陰離子反應(yīng)，可阻止自由基引發(fā)，能夠有效的清除大腦內(nèi)過(guò)多的活性氧及其自由基，對(duì)腦缺血疾病的發(fā)生可以起到一定的預(yù)防作用；此外，大豆異黃酮可以提高Hp蛋白在神經(jīng)細(xì)胞的分布，降低細(xì)胞鐵誘發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，阻止脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程。以大豆異黃酮為有效成分制備的預(yù)防腦缺血損傷藥物可以是片劑，膠囊劑，粉劑等劑型，將其分別用以預(yù)防腦缺血損傷，日服用有效成分大豆異黃酮的量為10－60mg，證實(shí)可以預(yù)防腦缺血損傷疾病的發(fā)生。
文檔編號(hào)A61P9/00GK1768739SQ200510012930
公開(kāi)日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日
發(fā)明者常彥忠, 段相林, 田艷燕, 楊震玲 申請(qǐng)人:河北師范大學(xué)