專利名稱：植物源性醇溶蛋白基質(zhì)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種用于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的蛋白基質(zhì)及其制備方法，特別是一種用于預(yù)防形成由內(nèi)置血管引起的急性血栓的具有藥物緩釋作用的植物源性醇溶蛋白基質(zhì)及其制備方法。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)支架置入技術(shù)與放療和化療已成為心血管疾病治療的主要手段。隨著血管內(nèi)支架置入技術(shù)的日益成熟，人們開發(fā)了多種支架材料。但生物相容性始終是其難以克服的首要問題。在應(yīng)用時，往往會引起急性血管阻塞，導致血管再狹窄和血栓形成，臨床顯示這一幾率為20％-40％。所以，需要持續(xù)數(shù)天給病人注射抗凝血劑，來預(yù)防急性血栓的形成；甚至需要再次進行內(nèi)置血管手術(shù)治療再狹窄血管。這無論在身體還是心理上都給病人帶來了很大痛苦。目前針對支架材料引發(fā)的心血管繼發(fā)性病變主要有四種解決方法。一是給病人連續(xù)服用(或注射)抗凝血藥。雖然它可以實現(xiàn)抑制血栓形成的目的，但引起大出血的幾率增高，而且通過口服給藥時，如果沒有合適的藥物載體或藥物劑型，則很難達到預(yù)期的血藥濃度；第二種方法是對支架材料表面進行化學修飾，使其具有良好的生物相容性，尤其是血液相容性。雖然這種方法減少了手術(shù)后血管再狹窄的幾率，但是這一數(shù)值仍然高達40％。第三種方法是在支架材料表面涂一層抗凝血藥物[2Jeffrey F.W.Keuren，Simone J.H.Wielders，George M.Willems，Marco Morra，LindaCahalan，Patrick Cahalan，Theo Lindhout.Thrombogenicity ofpolysaccharide-coated surfaces.Biomaterials 2003；241917-1924.多糖涂層表面的血栓形成性。Biomaterials 2003；241917-1924。]。這種方法已經(jīng)取得了一定的進展，但由于抗凝血藥物與材料表面鍵合弱，涂層很容易被血流剝離，難以達到預(yù)期目的；第四種方法是在材料表面種植由病人自身分離的內(nèi)皮細胞，形成單細胞層后可阻止血液與材料接觸，抑制凝血因子的活化[3van der GiessenWJ，Serruys PW，Visser WJEndothelialization of intravascular stents.J Interv Cardiol 1988；1109-120。血管內(nèi)支架的內(nèi)皮化。J Interv Cardiol 1988；1109-120]。這種方法是最理想選擇，但是由于內(nèi)皮細胞來源和數(shù)量的限制至今仍沒有得到推廣使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足和缺陷，提供一種植物源性醇溶蛋白基質(zhì)及其制備方法。使其由包含有肝素的醇溶蛋白微球通過常規(guī)的溶劑揮發(fā)的方法制備而成，該法簡便易行，藥物仍保持較高生物活性；利用具有肝素緩釋效果，作為涂層材料用于預(yù)防由內(nèi)置血管引起的急性血栓的形成。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明的植物源性醇溶蛋白基質(zhì)由醇溶蛋白微球或者是包含有肝素的醇溶蛋白微球制備而成的。
所述的植物源性醇溶蛋白是小麥、大麥、裸麥、燕麥或玉米的醇溶性蛋白。
所述的醇是C1-4的脂肪醇；所述的脂肪醇進一步限定為乙醇。
本發(fā)明的植物源性醇溶蛋白基質(zhì)的制備方法是通過相分離技術(shù)和溶劑揮發(fā)技術(shù)來完成的，具體如下①由植物源性醇溶蛋白用含50％-90％醇的水溶液溶解，和肝素共溶后，調(diào)節(jié)醇濃度為10％-40％。
首先制備成包含有肝素的，直徑為40nm-20000nm粒徑的微球。由該步驟得到的藥物蛋白微球的藥物包封率為5-40％，操作流程簡單，材料來源廣泛。
②將藥物蛋白微球溶液涂在玻璃、金屬或者塑料等介質(zhì)上，再經(jīng)常溫溶劑揮發(fā)形成厚度在0.5μm-2000μm的薄膜。
該步驟得到的緩釋藥物蛋白基質(zhì)中藥物仍然保持較高的生物活性。
在進行步驟①時，植物源性醇溶蛋白和肝素分別溶解在50％-90％醇的水溶液，二者混合后，超聲波處理1-10分鐘；在進行步驟②時，將制備的薄膜加在玻璃、金屬或者塑料上，自然干燥成膜。
本發(fā)明微球制備前期將上述的溶液用超聲波處理，可以獲得粒徑均一的微球。本發(fā)明所述的醇溶蛋白降解產(chǎn)物是經(jīng)胃蛋白酶-檸檬酸緩沖液消化得到的。
本發(fā)明提供的醇溶蛋白及其降解產(chǎn)物的生物相容性經(jīng)MTT(二甲基噻咪二苯基四唑溴鹽)法檢測證明具有良好的生物相容性。天然可降解玉米醇溶蛋白及其降解產(chǎn)物對人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞具有促增殖作用，有利于血管內(nèi)支架置入手術(shù)后新內(nèi)皮的生成。同時，經(jīng)過加工處理后，形成包含有肝素的蛋白基質(zhì)，能夠以一定的速度釋放肝素，藥物釋放時間維持20天以上，這可以有效的預(yù)防血管內(nèi)支架置入后引起的血栓形成，同時血管新內(nèi)皮的形成將有助于防止血管再狹窄的發(fā)生。


圖1本發(fā)明的植物源性玉米醇溶蛋白原料及蛋白微球掃描電鏡照片，a原料(標尺＝74μm)，b蛋白微球(標尺＝170nm)。
圖2玉米醇溶蛋白基質(zhì)及其降解產(chǎn)物的生物相容性，細胞培養(yǎng)3天的MTT結(jié)果圖，a對照，b玉米醇溶蛋白基質(zhì)，c降解產(chǎn)物(1mg/ml，相當于蛋白基質(zhì)的量)?！?”代表與對照相比存在顯著差異(n＝6，p＜0.05)。
圖3包含肝素的玉米醇溶蛋白基質(zhì)掃描電子顯微鏡照片，a薄膜厚度(標尺＝14μm)，b薄膜微觀形態(tài)(標尺＝5μm)。
圖4包含肝素的玉米醇溶蛋白基質(zhì)肝素緩釋動力學曲線圖(n＝3)。
具體實施例方式
實施例1玉米醇溶蛋白微球及其制備方法將玉米蛋白溶解在60％的乙醇水溶液中，配制成8mg/mL，室溫超聲波處理5分鐘，迅速調(diào)整乙醇濃度到40％，得到玉米醇溶蛋白微球混懸液，干冰/丙酮溶液冷凍后，冷凍干燥得蛋白微球粗制粉末。
經(jīng)噴金處理后，掃描電子顯微鏡觀察微球形態(tài)，結(jié)果如圖1所示，所制備的蛋白微球直徑控制在40nm-100nm之間。
實施例2玉米醇溶蛋白基質(zhì)及其制備方法將所得玉米醇溶蛋白微球混懸液加入24孔培養(yǎng)板(300μl/孔)或相同表面積的蓋玻片，室溫干燥，形成顆粒型醇溶蛋白基質(zhì)。
實施例3
玉米醇溶蛋白基質(zhì)及其降解產(chǎn)物的生物相容性玉米醇溶蛋白基質(zhì)紫外滅菌，降解產(chǎn)物溶于細胞培養(yǎng)液后0.22μm濾膜過濾滅菌后備用。將人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)，進行傳代后，種植在玉米醇溶蛋白基質(zhì)上；同時種植在細胞培養(yǎng)板上并以相同的培養(yǎng)液培養(yǎng)，作為對照；另外用添加有降解產(chǎn)物的培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞作為第三組。在培養(yǎng)兩天后，MTT檢測細胞生長活力。結(jié)果如圖2所示，玉米醇溶蛋白基質(zhì)及其降解產(chǎn)物顯示出了對血管內(nèi)皮細胞的促增值作用，為作為涂層材料的應(yīng)用提供了實驗數(shù)據(jù)支持。
實施例4包含肝素的玉米醇溶蛋白基質(zhì)及其制備方法將玉米蛋白和肝素分別溶解在60％的乙醇水溶液中，混合后，迅速調(diào)整乙醇濃度到40％，加入24孔培養(yǎng)板(300μl/孔)或相同表面積的蓋玻片，室溫干燥，形成顆粒型醇溶蛋白基質(zhì)。
樣品經(jīng)過噴金處理后，掃描電子顯微鏡觀察，薄膜形態(tài)結(jié)果如圖3所示，薄膜厚度控制在20μm-30μm之間，組成薄膜的含肝素蛋白微球直徑控制在1000nm-3000nm之間。
實施例5包含肝素的玉米醇溶蛋白基質(zhì)中肝素的體外釋放動力學將制備的包含肝素的玉米醇溶蛋白基質(zhì)浸泡在lmL磷酸緩沖液(PBS，pH7.2，37℃)中，定期半量更換新鮮PBS溶液，并利用Smith法檢測肝素含量，計算肝素釋放速率，結(jié)果如圖4所示。肝素釋放維持20天以上，故可以用于血管內(nèi)支架置入手術(shù)時急性血栓形成的預(yù)防。
實施例6包含肝素的玉米醇溶蛋白基質(zhì)的抗凝作用家兔，清醒狀態(tài)下心臟采血，用3.8％枸櫞酸鈉溶液(9∶1)抗凝。離心(3000rpm)，取上清血漿待用。將含肝素的蛋白基質(zhì)浸泡在血漿中，同時加入CaCl2(0.1mol/L)和37℃預(yù)溫的凝血活酶(100units/ml)溶液，混勻后立即放入37℃水浴中溫育，同時開始計時。每隔2-3秒傾斜液面1次，記錄纖維蛋白凝固、液面不動所需時間，求出每管平均值。結(jié)果顯示含肝素的蛋白基質(zhì)顯示了優(yōu)良的抗凝血性能，血漿始終保持不凝，基質(zhì)中的肝素表現(xiàn)出了較高的生物活性。證明了該用于藥物緩釋的醇溶蛋白基質(zhì)制備方法的可行性；進一步肯定了包含肝素的玉米醇溶蛋白基質(zhì)在預(yù)防血管內(nèi)支架置入手術(shù)時急性血栓形成中的作用。
權(quán)利要求
1.一種植物源性醇溶蛋白基質(zhì)，其特征在于，由醇溶蛋白微球或者是包含有肝素的醇溶蛋白微球制備而成，所述的植物源性醇溶蛋白是小麥、大麥、裸麥、燕麥或玉米的醇溶性蛋白，所述的醇是C1-4的脂肪醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物源性醇溶蛋白基質(zhì)，其特征是，對所述的脂肪醇進一步限定為乙醇。
3.一種植物源性醇溶蛋白基質(zhì)的制備方法，其特征在于，通過相分離技術(shù)和溶劑揮發(fā)技術(shù)來完成，具體如下①由植物源性醇溶蛋白用含50％-90％醇的水溶液溶解，和肝素共溶后，調(diào)節(jié)醇濃度為10％-40％；②將藥物蛋白微球溶液涂在玻璃、金屬或者塑料等介質(zhì)上，再經(jīng)常溫溶劑揮發(fā)形成厚度為0.5μm-2000μm的薄膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物源性醇溶蛋白基質(zhì)的制備方法，其特征是，在進行步驟①時，植物源性醇溶蛋白和肝素分別溶解在50％-90％醇的水溶液中，二者混合后，超聲波處理1-10分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物源性醇溶蛋白基質(zhì)的制備方法，其特征是，在進行步驟②時，將制備的薄膜加在玻璃、金屬或者塑料上，自然干燥成膜。
全文摘要
一種用于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的植物源性醇溶蛋白基質(zhì)及其制備方法，植物源性醇溶蛋白基質(zhì)由醇溶蛋白微球或者是包含有肝素的醇溶蛋白微球制備而成，所述的植物源性醇溶蛋白是小麥、大麥、裸麥、燕麥或玉米的醇溶性蛋白，所述的醇是C
文檔編號A61P7/00GK1634613SQ20041006678
公開日2005年7月6日 申請日期2004年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月29日
發(fā)明者王瑾曄, 王華杰 申請人:上海交通大學