專利名稱：抗癌或抗病毒組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗癌或抗病毒組合物，尤其是一種包括治療有效量的檸檬酸和/或鋅和L-精氨酸以及藥學(xué)可接受載體的抗癌或抗病毒組合物。
背景技術(shù)：
隨著化療的發(fā)展，癌癥患者的存活和康復(fù)率的改善。然而，抗癌制劑存在毒性大并危害正常細(xì)胞的弊端。
為克服上述副作用，最近開展了很多研究以開發(fā)可替代性抗癌物質(zhì)并選擇性地抑制腫瘤細(xì)胞的增生，因此得到很多具有抗癌活性的候選藥物。這些抗癌化合物包括公開在國(guó)際專利申請(qǐng)WO 96/40142，WO 97/13771和WO 95/23141中的物質(zhì)。然而，新的開發(fā)出來的能夠特異性抑制腫瘤細(xì)胞增生的抗癌化合物是通過化學(xué)合成手段得到，因此在體內(nèi)可能具有嚴(yán)重的副作用。
傳統(tǒng)抗癌制劑的弊端促使很多研究人員致力于開發(fā)副作用小、同時(shí)具有良好抗癌活性的抗癌物質(zhì)，一些研究者已經(jīng)找到具有抗癌活性的天然物質(zhì)。本發(fā)明是基于這樣的事實(shí)，即人類精液具有抑制卵巢上皮癌的抗癌作用。
卵巢上皮癌是卵巢癌中最常見的一種惡性腫瘤，是婦產(chǎn)科醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)中的主要死亡因素。卵巢上皮癌的高死亡率是由于卵巢上皮癌的惡化隱蔽，導(dǎo)致大多數(shù)患者在發(fā)展到嚴(yán)重階段時(shí)才表現(xiàn)出明顯癥狀(Ozols，R.F.Semin.Oncol.，1995，Vol.22，p61.)。即使通過手術(shù)切除腫瘤或采用積極的化療手段，由于藥物耐受性很快出現(xiàn)，因此也只有20-30％的患者能夠存活。
直到現(xiàn)在，導(dǎo)致卵巢上皮癌的原因和危險(xiǎn)因素還沒有被普遍認(rèn)知。大量的研究表明，排卵頻率和卵巢上皮癌的發(fā)展相關(guān)，這種關(guān)系表現(xiàn)在卵巢上皮癌多發(fā)生在年輕婦女和老年婦女(早初潮和晚絕經(jīng))、未婚婦女和先前未受孕婦女中這一事實(shí)(Franceshi et al.Int.J.Cancer，1991，Vol.49，p57；Taylor et al.Cancer，1959，Vol.12，pl207；Fraumeni et al.J.Natl.CancerInst.，1969，Vol.42，p455；Weiss et al.J.Natl.Cancer Inst.，1977，Vol.58，p913；Nergri et al.Int.J.Cancer，1991，Vol.49，p50；Stanford，J.L. Contraception 43，1991，p543；以及Franceshi etal.Iht.J.Cancer，1991，Vol.49，p61.)。普遍認(rèn)為，口服避孕藥對(duì)卵巢上皮癌的發(fā)展具有保護(hù)作用。
根據(jù)普遍的理論，卵巢上皮癌由于在排卵期間卵巢表皮的重復(fù)性破裂和修復(fù)而導(dǎo)致(Fathalla，M.F.Lancet.，1971，Vol.2，p163.)。在卵巢上皮面的修復(fù)過程中，轉(zhuǎn)變了的上皮細(xì)胞發(fā)生自然變異，腫瘤抑制基因鈍化，而腫瘤基因很易被致癌物質(zhì)活化。
據(jù)報(bào)道，人類精液具有以下生理功能和抗癌作用。性交后，精漿對(duì)細(xì)胞毒性的淋巴細(xì)胞所引起的對(duì)精子的免疫性損害進(jìn)行修復(fù)(Stities et al.Nature，1975，Vol.253，p727；James et al.Immunol.，1985，Vol.6，p61.)，人類精液抑制體液免疫的發(fā)展以及腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)(Anderson et al.Immunol.，1985，Vol.128，p535；and Michaelis et al.Anticancer Drugs，2000，Vol.11，p369.)。此外，人類精液對(duì)于宮頸上皮癌細(xì)胞中的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9 mRNA的生成也有一定作用，因此，據(jù)信其通過性行為對(duì)宮頸癌的進(jìn)展有一定影響。(Jeremias etal.Am.J.Obstet.Gynecol.，1999，Vol.181，p591.)。根據(jù)最近的報(bào)道，牛精核糖核酸酶(BS-RNase)以時(shí)間和劑量依賴方式導(dǎo)致人類淋巴細(xì)胞和人類腫瘤細(xì)胞的凋亡。BS-RNase對(duì)那些耐受化療藥物的成神經(jīng)細(xì)胞瘤(NB)細(xì)胞表現(xiàn)出選擇性的細(xì)胞毒性(Cinatl et al.Anticancer Res.，2000，Vol.20，p853；Cinatl et al.Int.J.Oncol.，1999，Vol 15，plu01.)。
此外，Gjorgov對(duì)精液的抗癌作用進(jìn)行了生態(tài)學(xué)研究，比較了各種病例，其中還進(jìn)行了接觸與人類精液減少和乳腺癌發(fā)生率的關(guān)系的研究。在該研究中，對(duì)屏障避孕方法(使用安全套)與使用避孕品(避孕藥、子宮內(nèi)裝置(IUD)、安全期避孕法或輸卵管接扎)的女性的乳腺癌發(fā)病率進(jìn)行比較，結(jié)果是采用屏障避孕方法(使用安全套)的女性的乳腺癌發(fā)病率高出5.2倍(Gjorgov et al.Folia Med.，1998，Vol.40，p17.)。
精液中具有抗癌活性的主要成分包括白蛋白、乳鐵傳遞蛋白、鐵傳遞蛋白、免疫球蛋白、酸性磷酸酯酶、L-肉堿、L-精氨酸、L-組氨酸、檸檬酸、果糖、鎂、鋅、前列腺素和甘油磷酸膽堿(glycero phosphocholine)。
基于人類精液組分具有抗癌活性的事實(shí)，本發(fā)明人致力于開發(fā)一種抗癌制劑，該制劑具有優(yōu)良的抗癌作用，且副作用低。
本發(fā)明人還注意到乳突淋瘤病毒引起宮頸癌的現(xiàn)象。
乳突淋瘤病毒是已知的可作用于動(dòng)物體內(nèi)多種組織的上皮細(xì)胞的病毒，并且誘導(dǎo)腫瘤，即通常所說的“疣”，其生長(zhǎng)在手、足、皮膚和喉部等。至今，已經(jīng)鑒定出100多種人類乳突淋瘤病毒(HPV)基因型，其中，有幾種基因型被報(bào)道對(duì)感染部位具有特異性，并引起多種疾病(Broker et al.，Cold Spring HarborLaboratory，1989，p17.)。盡管大多數(shù)HPV感染不能被有效治療，導(dǎo)致患者嚴(yán)重疼痛，但這些感染由于沒有發(fā)展成致命疾病而沒有得到重視。最近，幾種HPV，尤其是HPV 16和18型被報(bào)道與生殖器官、口腔、皮膚等部位的惡性腫瘤的發(fā)病相關(guān)，其是宮頸癌中超過90％的子宮癌的主要致病因素，HPV 6b和11型也被披露可引起生殖器官的腫瘤″尖銳濕疣(或生殖器疣)″。此外，大量的表皮學(xué)研究的證據(jù)表明子宮癌是乳突淋瘤病毒感染導(dǎo)致，這些證據(jù)包括發(fā)現(xiàn)了子宮癌主要由性接觸傳播因素而發(fā)展致病的(Durst et al.，Natl.Acad.Sci.，1983，Vol.80，p3812.)；85-100％的惡性病變，如宮頸內(nèi)皮癌(CIN)是由乳突淋瘤病毒引起的(Hansen，H.，Science，1991，Vol.254，pli73.)。
子宮癌患者體內(nèi)存在HPV 16和18型的分別占50-70％和15-25％，超過25％的感染有HPV-16的癌癥患者和超過50％的感染有HPV-18的癌癥患者發(fā)展成轉(zhuǎn)移性腫瘤(Lorincz et al.，Obstetrics and Gynecology，1992，Vol.79，p328.)。
因此，基于子宮癌是乳突淋瘤病毒引起的事實(shí)，本發(fā)明意欲利用具有抗癌作用的人類精液中的抗病毒物質(zhì)預(yù)防并治療各種病毒感染而致的疾病，這些物質(zhì)包括檸檬酸、鋅和L-精氨酸。

發(fā)明內(nèi)容
基于排卵期中減少與人精液的接觸是引起卵巢上皮癌發(fā)病的病理風(fēng)險(xiǎn)因素的事實(shí)，本發(fā)明人認(rèn)為人類精液能夠有效去除惡性轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了一種組合物，其含有具有抗癌作用的人類精液，該組合物能夠抑制由乳突淋瘤病毒感染導(dǎo)致的宮頸癌細(xì)胞中病毒蛋白的生成。
因此，本發(fā)明提供了如下的抗癌或抗病毒組合物。
本發(fā)明一方面提供了一種抗癌組合物，其包括治療有效量的檸檬酸和/或鋅和L-精氨酸以及藥學(xué)可接受載體。
本發(fā)明另一方面提供了一種抗病毒組合物，其包括治療有效量的檸檬酸和/或鋅和L-精氨酸以及藥學(xué)可接受載體。
附圖簡(jiǎn)要說明通過以下詳細(xì)描述并結(jié)合附圖的說明，能夠更清楚地理解本發(fā)明的上述和其它目的、特征以及優(yōu)點(diǎn)。


圖1顯示了本發(fā)明的包括檸檬酸和L-精氨酸為活性組分的抗癌組合物對(duì)人類卵巢腺癌細(xì)胞系SKOV-3(來自于惡性瘤者腹水)(▲)和人類神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87(◆)的生存能力的作用，其中細(xì)胞的生存能力通過MTT檢測(cè)進(jìn)行分析；圖2顯示了本發(fā)明的包括鋅和L-精氨酸為活性組分的抗癌組合物對(duì)人類卵巢腺癌細(xì)胞系SKOV-3(▲)和人類神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87(◆)的生存能力的作用，其中細(xì)胞的生存能力通過MTT檢測(cè)進(jìn)行分析；圖3顯示了本發(fā)明的包括檸檬酸、鋅和L-精氨酸為活性組分的抗癌組合物對(duì)人類卵巢腺癌細(xì)胞系SKOV-3(▲)、人類卵巢腺癌細(xì)胞系NIHOVCAR-3(◆)和人類卵巢表皮正常上皮細(xì)胞系NOSE(■)的生存能力的作用，其中細(xì)胞的生存能力通過MTT檢測(cè)進(jìn)行分析；圖4顯示了本發(fā)明的包括檸檬酸、鋅和L-精氨酸為活性組分的抗癌組合物對(duì)人類宮頸癌細(xì)胞系Ca Ski(▲)、HeLa(◆)和C-33 A(■)的生存能力的作用，其中細(xì)胞的生存能力通過MTT檢測(cè)進(jìn)行分析；圖5是流式分析的結(jié)果，其顯示了本發(fā)明的包括檸檬酸、鋅和L-精氨酸為活性組分的抗癌組合物對(duì)人類宮頸癌細(xì)胞系Ca Ski的細(xì)胞周期的影響；圖6是流式分析的結(jié)果，其顯示了本發(fā)明的包括檸檬酸、鋅和L-精氨酸為活性組分的抗癌組合物對(duì)人類宮頸癌細(xì)胞系HeLa的細(xì)胞周期的影響；圖7是流式分析的結(jié)果，其顯示了本發(fā)明的包括檸檬酸、鋅和L-精氨酸為活性組分的抗癌組合物對(duì)人類宮頸癌細(xì)胞系C-33 A的細(xì)胞周期的影響；圖8是顯示從人類宮頸癌細(xì)胞系Ca Ski、HeLa和C-33 A中提取的DNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的照片，上述細(xì)胞已經(jīng)過本發(fā)明的包括檸檬酸、鋅和L-精氨酸為活性組分的抗癌組合物的處理；圖9是顯示采用免疫印記法對(duì)人類宮頸癌細(xì)胞系Ca Ski、HeLa和C-33 A中的P53蛋白表達(dá)進(jìn)行分析的照片，上述細(xì)胞已經(jīng)過本發(fā)明的包括檸檬酸、鋅和L-精氨酸為活性組分的抗癌組合物的處理；圖10是顯示采用免疫印記法對(duì)人類宮頸癌細(xì)胞系Ca Ski、HeLa和C-33 A中的P21蛋白表達(dá)進(jìn)行分析的照片，上述細(xì)胞已經(jīng)過本發(fā)明的包括檸檬酸、鋅和L-精氨酸為活性組分的抗癌組合物的處理；圖11是顯示采用免疫印記法人類宮頸癌細(xì)胞系Ca Ski、HeLa和C-33 A中的C-Myc蛋白表達(dá)進(jìn)行分析的照片，上述細(xì)胞已經(jīng)過本發(fā)明的包括檸檬酸、鋅和L-精氨酸為活性組分的抗癌組合物的處理；圖12顯示了人類宮頸癌細(xì)胞系Ca Ski、HeLa和C-33 A中用DAPI染色的細(xì)胞核，上述細(xì)胞已經(jīng)過本發(fā)明的包括檸檬酸、鋅和L-精氨酸為活性組分的抗癌組合物的處理；圖13顯示了人類宮頸癌細(xì)胞系Ca Ski和HeLa中人類乳突淋瘤病毒(HPV)16或18型的E6和E7蛋白的表達(dá)水平，上述細(xì)胞已經(jīng)過本發(fā)明的包括檸檬酸、鋅和L-精氨酸為活性組分的抗病毒組合物的處理；圖14顯示了將本發(fā)明的包括檸檬酸、鋅和L-精氨酸為活性組分的抗病毒組合物施用至尖銳濕疣女性患者的陰戶對(duì)尖銳濕疣進(jìn)行治療的效果；圖15顯示了將本發(fā)明的包括檸檬酸和/或鋅和L-精氨酸為活性組分的抗病毒組合物用于感染腸道病毒的細(xì)胞時(shí)對(duì)細(xì)胞病變的抑制效應(yīng)的結(jié)果；圖16顯示了將本發(fā)明的包括檸檬酸和/或鋅和L-精氨酸為活性組分的抗病毒組合物用于感染脊髓灰質(zhì)炎病毒的細(xì)胞對(duì)細(xì)胞病變的抑制效應(yīng)的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的一個(gè)方案在于提供一種包括檸檬酸和L-精氨酸作為活性組分的抗癌組合物。
上述抗癌組合物的特征在于其包括的活性組分檸檬酸的重量含量為0.01-20％，優(yōu)選為0.5-5％，L-精氨酸的重量含量為0.01-20％，優(yōu)選為0.5-10％，所述重量比基于組合物的總重量，還包含藥學(xué)可接受載體?？拱┙M合物中的載體包括制藥領(lǐng)域常用的載體、輔料和溶媒。
本發(fā)明的另一個(gè)方案在于提供一種包括鋅和L-精氨酸作為活性組分的抗癌組合物。
上述抗癌組合物的特征在于其包括的活性組分鋅的重量含量為0.001-5％優(yōu)選為0.01-1％，L-精氨酸的重量含量為0.01-20％，優(yōu)選為0.5-10％，所述重量比基于組合物的總重量，還包含藥學(xué)可接受載體。抗癌組合物中的載體包括制藥領(lǐng)域常用的載體、輔料和溶媒。
本發(fā)明的進(jìn)一步方案在于提供了一種包括檸檬酸、鋅和L-精氨酸作為活性組分的抗癌組合物。
上述抗癌組合物的特征在于其包括的活性組分檸檬酸的重量含量為0.01-20％，優(yōu)選為0.5-5％，鋅的重量含量為0.001-5％，優(yōu)選為0.01-1％，L-精氨酸的重量含量為0.01-20％，優(yōu)選為0.5-10％，所述重量比基于組合物的總重量，還包含藥學(xué)可接受載體。抗癌組合物中的載體包括制藥領(lǐng)域常用的載體、輔料和溶媒。
各方案中選擇使用檸檬酸、鋅和L-精氨酸，可以以下列形式的本發(fā)明的抗癌組合物使用，但并不限于這些形式。
本發(fā)明的檸檬酸的形式可以是從各種植物的種子或果實(shí)汁中提取得到的，其中檸檬酸的存在形式是游離型。檸檬酸還可以利用黑曲霉菌(Aspergillusniger)通過表面發(fā)酵方法或深層發(fā)酵方法進(jìn)行制備，這樣的檸檬酸也可用于本發(fā)明的抗癌組合物中。在制備檸檬酸過程中，利用糖蜜作為能源進(jìn)行發(fā)酵，還需使用各種離心分離器，包括帶有自動(dòng)清洗碗的離心器，帶有噴嘴碗和螺旋玻璃水瓶的離心器。
本發(fā)明所使用的鋅的形式可以是從牡蠣、甲殼類、魚類、動(dòng)物產(chǎn)品，如瘦肉以及各種蔬菜產(chǎn)品，包括谷類、豆類、堅(jiān)果類以及種子中提取得到的任何形式，這些物質(zhì)中鋅的含量豐富。本發(fā)明的抗癌組合物中的鋅可以是多種形式。硫酸鋅最廣泛用于臨床試驗(yàn)中，但其它形式的鋅離子也易于吸收而被人體利用。鋅的可使用形式的實(shí)例還包括與吡啶羧酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鈉、甘油酸鹽和單甲硫氨酸進(jìn)行鰲合的鋅離子。
本發(fā)明使用的L-精氨酸可以是通過發(fā)酵制備或從蛋白中提取得到的任何形式，優(yōu)選為發(fā)酵制備得到的形式。發(fā)酵制備L-精氨酸可包括利用抗精氨酸類似物的微生物發(fā)酵(Agricultural Biological Chemistry，1972，Vol.36，p1675；Journal of General Applied Microbiology，1973，Vol.19，p339；Japanese Pat.Publication No.3391-1973 and U.S.Pat.No.3723249)，L-精氨酸可直接從碳源和氮源中得到，如利用制備谷氨酸的微生物，其屬于短桿菌屬(Brevibacterium)或棒狀桿菌(Corynebacterium)(Japanese Pat.Laid-open Publication Nos.Sho57-163487，Sho60-83593 and Sho62-265988)，利用制備氨基酸的微生物并具有改進(jìn)了的生長(zhǎng)特性通過細(xì)胞融合進(jìn)行制備(Japanese Pat.Laid-open Publication No.Sho58-158185)，或利用轉(zhuǎn)染了載有編碼參與L-精氨酸生物合成的酶的基因的重組表達(dá)載體的微生物進(jìn)行合成(Japanese Pat.Laid-open Publication No.Sho63-79597，Japanese Pat.Publication No.66989/1985 and U.S.Pat.No.4,775,623)。
抗癌組合物通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而具有刺激腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞死亡或抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性。與壞死不同，壞死意味著病理性細(xì)胞死亡，凋亡是內(nèi)在基因控制下的程序性細(xì)胞死亡，其是通過由特定的外在或內(nèi)在因素活化的與凋亡相關(guān)的基因的編碼程序所誘導(dǎo)。凋亡誘導(dǎo)基因的活化導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡基因的翻譯產(chǎn)物的生物合成或降解，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究DNA分裂時(shí)，通常采用生化方法觀察DNA片段化情況來評(píng)價(jià)細(xì)胞的凋亡，或采用分子生物學(xué)方法檢測(cè)與凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)。最近有大量報(bào)道闡述誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的物質(zhì)控制著腫瘤細(xì)胞的死亡，并有效抑制癌癥的增殖。
本發(fā)明利用了前述方法以確定了由本發(fā)明的抗癌組合物是通過凋亡機(jī)理來特異性誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的。也就是說，在本發(fā)明的抗癌組合物處理后的腫瘤細(xì)胞中提取得到的DNA樣品中發(fā)現(xiàn)有DNA片段化(圖8)。且，在本發(fā)明的抗癌組合物處理后的腫瘤細(xì)胞中還檢測(cè)到與凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)(圖9，10和11)。本發(fā)明的抗癌組合物所識(shí)別的與凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)是P21、P53和C-Myc蛋白。本領(lǐng)域共知，P53蛋白的表達(dá)導(dǎo)致了P21蛋白的合成從而抑制刺激細(xì)胞進(jìn)行分化的因子的活性。因此，P53和P21蛋白通過抑制細(xì)胞分化而阻止癌癥的發(fā)展。C-Myc是一種致癌蛋白，其刺激腫瘤細(xì)胞中的DNA復(fù)制，從而激活腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞分化。
由于本發(fā)明的抗癌組合物具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的抗癌作用，因此，將本發(fā)明中被用于治療卵巢上皮癌這個(gè)示例性癌癥的該組合物用于治療其他類型的癌癥，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
因此，本發(fā)明的抗癌組合物可被用于治療下列各種癌癥，但并不限于這些種類膀胱癌、乳腺癌、腸癌、腎癌、肝癌、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌)、腦瘤、食道癌、膽囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宮頸癌、甲狀腺癌、前列腺癌和皮膚癌(包括鱗狀上皮細(xì)胞癌)；淋巴系統(tǒng)性造血性腫瘤，包括白血病、急性淋巴白血病、急性成淋巴細(xì)胞白血病、B-細(xì)胞淋巴瘤、T-細(xì)胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、多毛狀細(xì)胞淋巴瘤和勃克氏淋巴瘤；骨髓中造血性腫瘤和慢性骨髓性白血病、骨髓增生異常綜合征和早幼粒細(xì)胞白血??；中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的腫瘤，包括星細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和神經(jīng)鞘瘤；以及其它腫瘤，包括黑素瘤、精原細(xì)胞瘤、畸胎瘤、骨肉瘤、色素性干皮癥、角化棘皮瘤、濾泡性甲狀腺癌和卡波濟(jì)氏肉瘤。
本發(fā)明的抗癌組合物優(yōu)選用于抑制或治療肺癌、腦瘤、乳腺癌、大腸癌、妊娠絨毛膜癌(gestational choriocarcinoma)、子宮癌和卵巢癌，尤其優(yōu)選的是卵巢上皮癌。
本發(fā)明的進(jìn)一步方案在于提供一種包括檸檬酸和L-精氨酸作為活性組分的抗病毒組合物。
上述抗病毒組合物的特征在于其包括的活性組分檸檬酸的重量含量為0.001-20％，優(yōu)選為0.01-5％，L-精氨酸的重量含量為0.001-20％，優(yōu)選為0.01-10％，所述重量比基于組合物的總重量，還包含藥學(xué)可接受載體?？共《窘M合物中的載體包括制藥領(lǐng)域常用的載體、輔料和溶媒。
本發(fā)明的另一個(gè)方案在于提供一種包括鋅和L-精氨酸作為活性組分的抗病毒組合物。
上述抗病毒組合物的特征在于其包括的活性組分鋅的重量含量為0.0001-5％，優(yōu)選為0.001-1％，L-精氨酸的重量含量為0.001-20％，優(yōu)選為0.01-10％，所述重量比基于組合物的總重量，還包含藥學(xué)可接受載體?？共《窘M合物中的載體包括制藥領(lǐng)域常用的載體、輔料和溶媒。
本發(fā)明的進(jìn)一步方案在于提供了一種包括檸檬酸、鋅和L-精氨酸作為活性組分的抗癌組合物。
上述抗癌組合物的特征在于其包括的活性組分檸檬酸的重量含量為0.001-20％，優(yōu)選為0.01-5％，鋅的重量含量為0.0001-5％，優(yōu)選為0.001-1％，L-精氨酸的重量含量為0.001-20％，優(yōu)選為0.01-10％，所述重量比基于組合物的總重量，還包含藥學(xué)可接受載體。抗病毒組合物中的載體包括制藥領(lǐng)域常用的載體、輔料和溶媒。
本發(fā)明的抗病毒組合物的活性可以通過對(duì)癌細(xì)胞系中的病毒蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析而確定。也就是，用本發(fā)明的抗病毒組合物對(duì)癌細(xì)胞系進(jìn)行處理后，分離出細(xì)胞系中的蛋白，然后采用本領(lǐng)域熟知的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病毒蛋白進(jìn)行分析。還可以通過將組合物直接用于病毒感染部位以評(píng)價(jià)對(duì)病毒感染的抑制或治療效果以驗(yàn)證本發(fā)明的抗病毒組合物的活性。
本發(fā)明的實(shí)施方案中，對(duì)HPV 16或18型中的乳突淋瘤病毒蛋白E6和E7進(jìn)行了分析，這些蛋白是熟知的子宮癌的致病性蛋白。在該實(shí)施例中，本發(fā)明的抗病毒組合物表現(xiàn)出減少宮頸癌細(xì)胞系中的E6和E7蛋白表達(dá)(圖13)。當(dāng)將本發(fā)明的抗病毒組合物用于患有HPV感染所致生殖器疣的女性患者的陰戶時(shí)，該組合物表現(xiàn)出對(duì)生殖器疣的治療作用(圖14)。而且，當(dāng)用本發(fā)明的抗病毒組合物處理感染有腸病毒或脊髓灰質(zhì)炎病毒的細(xì)胞時(shí)，由于對(duì)病毒的抑制作用，因而沒有出現(xiàn)細(xì)胞病變效果(CPE)(圖15和16)。
本發(fā)明的抗病毒組合物還可用于預(yù)防或治療由病毒感染引起的多種疾病。因此，可被本發(fā)明的抗病毒組合物預(yù)防或治療的由病毒感染引起的非限定性疾病實(shí)例包括，由乳突淋瘤病毒感染導(dǎo)致的皮膚上生長(zhǎng)的疣，這樣的疣刺激細(xì)胞在皮膚表皮上進(jìn)行局部繁殖，從而使角蛋白層增大；在生殖器周圍或肛門附近感染乳突淋瘤病毒而引起的尖銳濕疣。本發(fā)明的抗病毒組合物還具有抑制病毒繁殖的作用，因此抑制導(dǎo)致艾滋病(獲得性免疫缺陷綜合征)的AIDS病毒、流感病毒、引起腦膜炎的腸道病毒、引起小兒麻痹的脊髓灰質(zhì)炎病毒。
在一個(gè)優(yōu)選方案中，本發(fā)明的抗病毒組合物可以預(yù)防或治療由乳突淋瘤病毒、AIDS病毒、腸道病毒或脊髓灰質(zhì)炎病毒引起的疾病。
本發(fā)明的抗癌或抗病毒組合物(以下稱作本組合物)的載體包括制藥領(lǐng)域常用載體、輔料和溶媒，在此通稱為藥學(xué)可接受載體。本發(fā)明的抗癌組合物中使用的藥學(xué)可接受載體非限定性地包括離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白、緩沖劑(如，磷酸鈉、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸鉀、植物飽和脂肪酸的部分甘油酯混合物)、水、鹽或電解質(zhì)(如，硫酸精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉和鋅鹽)、硅膠、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、含纖維素物質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉，多芳基化物、蠟、聚乙烯—聚氧丙烯—嵌段共聚物、聚乙二醇和羊毛脂。
本發(fā)明組合物的給藥途徑可以是任何一種常規(guī)途徑，只要組合物能夠到達(dá)所治療的組織。因此，本組合物可以通過以下方式給藥局部、口服、胃腸外、眼內(nèi)、皮下、直腸內(nèi)和腔內(nèi)(intraluminally)，并可制成以下劑型液體、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、持續(xù)釋放制劑、膏、霜等。本發(fā)明的“胃腸外給藥”包括皮下、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑液內(nèi)、胸內(nèi)、心臟內(nèi)、鞘內(nèi)、病損內(nèi)以及顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)制成固體制劑用于口服時(shí)，本組合物可包括，除活性成分外，稀釋劑(如乳糖、葡萄糖、蔗糖、纖維素、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉)、潤(rùn)滑劑(如硅土、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂或鈣、和/或聚乙二醇)、粘結(jié)劑(如淀粉、阿拉伯膠、凝膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮)、分解劑(如淀粉、海藻酸、藻酸鹽或羧甲淀粉鈉)、成形混合劑(formalmixtures)、染料、甜味劑、濕潤(rùn)劑(如卵磷脂、聚山梨醇酯、月桂基硫酸鹽)以及常用的制藥用惰性物質(zhì)?？诜腆w劑型可以通過本領(lǐng)域已知方法，如包括混合、制粒、壓片和包糖衣或包膜的步驟進(jìn)行制備。
當(dāng)本組合物被制成液體口服劑型如溶液、乳劑、懸浮液、糖漿或酏劑時(shí)，本組合物可包括常用惰性稀釋劑(如純化的水、乙醇)。如果需要，液體組合物可進(jìn)一步包括賦形劑，如濕潤(rùn)劑和乳化劑、甜味劑、芳香劑和防腐劑。
本組合物還可制成水溶液進(jìn)行胃腸外給藥。優(yōu)選使用的是適宜的緩沖溶液，如Hank′s液、林格液或生理緩沖鹽。水性注射懸浮液中可以添加能增加懸浮液黏度的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和右旋糖苷。此外，活性組分的懸浮液，如油性注射懸浮液，包括親脂性溶劑或載體，如諸如芝麻油的含脂肪的油、如油酸乙脂、甘油三酸酯或脂質(zhì)體的合成性脂肪酸酯。聚陽(yáng)離子型非脂溶性氨基聚合物也可被用作溶媒。任選地，懸浮液可包括適宜的穩(wěn)定劑或能增加組分的穩(wěn)定性的藥物從而獲得高濃度的組分。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本組合物優(yōu)選的形式是滅菌注射劑，如滅菌注射用水性或油性懸浮液。這些懸浮液可利用適宜的分散劑或潮濕劑(如吐溫80)和懸浮劑，根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行制備。滅菌注射劑還可以是非毒性胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的滅菌注射溶液或懸浮液，如1，3-丁二醇中的溶液?？山邮苋苊胶腿軇┌ǜ事洞?、水、林格液、等滲氯化鈉溶液。此外，滅菌的難揮發(fā)油可常規(guī)性地被用作溶劑或懸浮基質(zhì)。基于該目的，任何新型的難揮發(fā)油都可被利用，其包括合成的單或二甘油酯。還有，脂肪酸，如油酸和其甘油酯衍生物，也可用于制備注射型制劑中，同樣是制藥可接受天然油(如，橄欖油或蓖麻油)，尤其是其聚氧乙酸鹽衍生物。
前述水性組合物的滅菌主要通過過濾器過濾除去細(xì)菌，與消毒劑混合或輻射滅菌。滅菌后的組合物可通過如冷凍干燥進(jìn)行硬化而得到硬化產(chǎn)品。使用時(shí)，將硬化組合物溶于無菌水中或滅菌的稀釋液中。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗病毒組合物優(yōu)選的形式是皮下給藥劑型，其包括治療有效量的活性組分以及藥學(xué)可接受載體。術(shù)語“皮下給藥”是指將藥物組合物局部用于皮膚時(shí)，藥物組合物中的治療有效量的活性組分被輸送至皮膚內(nèi)。
本發(fā)明的皮下給藥劑型包括霜、膏、洗劑、凝膠劑、外用液、貼劑、擦劑、外用粉劑、氣霧劑、皮下吸收劑。這些劑型在藥物化學(xué)領(lǐng)域的指南性書籍中有描述(Remington′s Pharmaceutical Science，15tel′Editions，1975，Mack PublishingCompany，Easton，Pennsylvania，18042，Chapter 87Blaug，Seymour)。
代表性地，本發(fā)明的霜?jiǎng)┌ɡ渌?、?rùn)膚劑、剃須膏、拋光霜和手霜。優(yōu)選為拋光霜，該霜?jiǎng)┦撬托?o/w)，通常含有硬脂酸和水。當(dāng)拋光霜用于皮膚上時(shí)，水被蒸發(fā)掉，留下的是薄的硬脂酸層。冷霜是半固體白色的油包水型(w/o)，其由鯨蠟醇、蜂蠟、白蠟、硼酸納和蒸餾水組成。本發(fā)明的膏劑通常分為烴基質(zhì)、吸收基質(zhì)、可除水基質(zhì)和水溶性基質(zhì)，以及制藥領(lǐng)域熟知的所有膏劑型。本發(fā)明的膏劑通常分為懸浮液和乳液，通常通過乳化劑或其他適宜的穩(wěn)定劑制備得到。制藥領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的所有膏劑型也包括在本發(fā)明中。
參考上面描述，作為本發(fā)明的示例性皮下給藥制劑的霜、膏、凝膠劑和貼劑將在下面進(jìn)行描述。
作為皮下給藥制劑的代表性實(shí)例的霜?jiǎng)┑闹苽淙缦滤?。將油相和水相分別加熱至65-75℃，所述的油相由醇、蜂蠟、山梨醇單油酸酯等組成，水相由山梨醇溶液、聚山梨醇酯、對(duì)羥基苯甲酸甲酯(methylparabene)、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、甘油、氫氧化鉀、蒸餾水等組成。在攪拌中將油相緩慢加到水相中，得到粗乳液。該乳液被冷卻到不發(fā)生揮發(fā)和降解的溫度下進(jìn)行勻化，以指定的速度攪拌直至凝結(jié)。
膏劑可以大規(guī)模生產(chǎn)，也可以小規(guī)模制備。當(dāng)采用特定的制劑方法制備膏劑時(shí)，主要依賴于膏中成分的理化性質(zhì)決定制備方法。當(dāng)小規(guī)模制各膏劑時(shí)，各組分可以采用幾種方法進(jìn)行混合。當(dāng)大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可采用熔化方法，將膏中所有或部分組分熔化，然后在指定速度下攪拌冷卻直至凝結(jié)。未熔組分在冷卻時(shí)通常需要混合步驟。通常，膏劑是在低溫下制備的，以使對(duì)熱不穩(wěn)定的物質(zhì)或易揮發(fā)物質(zhì)不發(fā)生降解或揮發(fā)。
凝膠劑的制備如下所述。將羥丙甲纖維素(Metocel)分散在預(yù)熱到80-90℃的蒸餾水中。溫化12小時(shí)后，將凝膠劑組合物分散到蒸餾水中得到分散溶液。然后，將氫氧化鈉溶液加到分散溶液中，調(diào)節(jié)溶液的PH值至中性。然后將所得溶液與對(duì)羥基苯甲酸甲酯、羥丙甲纖維素(metocel)、聚羰乙烯、丙二醇等混合，從而得到凝膠劑。
貼劑可通過將貼劑組合物在適宜容器如研缽中研磨成粉，然后與凡士林等均勻混合而制備。
本發(fā)明的皮下給藥制劑可通過已知的物理和化學(xué)方法促進(jìn)活性組分檸檬酸、鋅和L-精氨酸的經(jīng)皮下吸收。適宜的物理方法主要包括加熱、通電和超聲，優(yōu)選的方法是化學(xué)方法。本發(fā)明的化學(xué)方法中可采用的皮下吸收促進(jìn)劑列于下表1中。
表1代表性皮下吸收促進(jìn)劑及其類型

本發(fā)明中的“治療有效量”是指本組合物在治療某種癌癥時(shí)，活性組分呈現(xiàn)出改善或治療作用的量。本組合物的治療有效量根據(jù)患者的年齡和性別、治療部位、給藥頻率、給藥時(shí)間、劑型和輔料類型的不同而不同。通常，對(duì)于注射劑，本組合物的給藥量為50-5000mg，優(yōu)選為100-4000mg，最優(yōu)選為250-3000mg，每天給藥超過1-5次。對(duì)于口服給藥制劑，本組合物通常的給藥量為1-2,000mg，優(yōu)選為250-1,000mg，最優(yōu)選為300-500mg，每天給藥1-5次。對(duì)于皮下給藥制劑，為獲得預(yù)防或治療效果，本組合物通常的給藥量為500-2000mg，每天給藥一次或兩次，給藥2-3周。
本發(fā)明參照下列實(shí)施例，同時(shí)結(jié)合附圖進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例只是用于舉例說明而并非用于限定本發(fā)明。
實(shí)施例1注射劑的制備本發(fā)明的組合物包括各種活性組分的多種組合，其制備如下。根據(jù)下述表2的混合比例選擇性地混合檸檬酸(Sigma，美國(guó))、鋅(Sigma，美國(guó))、和L-精氨酸(Sigma，美國(guó))，再將每種混合物溶于無菌水中。將混合物灌注到小藥瓶中(100mg)。
表2本發(fā)明組合物的活性成分含量(wt％)

實(shí)施例2片劑的制備根據(jù)表2的混合比例選擇性地混合檸檬酸(Sigma，美國(guó))、鋅(Sigma，美國(guó))、和L-精氨酸(Sigma，美國(guó))，將每種混合物與30wt％的乳糖、5wt％的硬脂酸鎂、10wt％的羥乙酸淀粉鈉、以及無菌水相混合。所得混合物在攪拌中，于30-60℃下，溫育1小時(shí)，然后冷卻至室溫。利用常規(guī)方法將混合物壓片，得到的片劑每片含有350mg的粉末混合物。
實(shí)施例3透皮給藥制劑的制備本發(fā)明的抗病毒組合物被制成透皮給藥劑型。將2wt％檸檬酸、0.1wt％鋅、5wt％L-精氨酸溶于燒杯中的1L乙醇中，-20℃下放置24小時(shí)。然后，收集得到的凝結(jié)物，將其用作皮下給藥制劑的活性成分。凝結(jié)物約為10倍濃縮。
(1)霜的制備油相硬脂酸 13wt％硬脂醇 1wt％乙醇 1wt％制備的凝結(jié)物 5wt％水相甘油 10wt％對(duì)羥基苯甲酸甲酯 0.1wt％對(duì)羥基苯甲酸丙酯 0.05wt％氫氧化鉀 0.9wt％純化水 加至100wt％油相和水相都根據(jù)上述組成進(jìn)行制備，分別加熱至65℃。然后，將油相緩慢加到水相中，同時(shí)攪拌，得到粗乳液。攪拌中冷卻該乳液，直至凝結(jié)，得到霜?jiǎng)?br> (2)膏的制備凡士林 80wt％硬脂醇 3wt％白蠟 9wt％膽固醇 3wt％制備的凝結(jié)物 5wt％將硬脂醇、白蠟、膽固醇和制備的凝結(jié)物在蒸汽浴中融化。將凡士林加到混合物中，加熱所得混合物直至液化。然后，冷卻所得溶液，同時(shí)攪拌，直至凝結(jié)，得到膏劑。
(3)凝膠劑的制備羥丙甲纖維素(Metoce190 H.C.4000) 0.8wt％聚羰乙烯(Carbopo1934) 0.24wt％丙二醇 16.7wt％對(duì)羥基苯甲酸甲酯 0.015wt％制備的凝結(jié)物 5wt％氫氧化鈉 加至pH＝7.0純化水 加至100wt％將羥丙甲纖維素分散到熱水(80-90℃)中，在冰箱中冷卻過夜，得到液態(tài)溶液。另外，將羥丙甲纖維素和凝結(jié)物分散到水中，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH7.0，然后加水至最終體積為40ml。同樣，單獨(dú)將對(duì)羥基苯甲酸甲酯溶于丙二醇中。將上述三種溶液混合得到凝膠劑。
(4)貼劑的制備氧化鐵 25wt％淀粉 25wt％Kelamin 5wt％制備的凝膠 5wt％凡士林 加至100wt％用氧化鐵滴定Kelamin，將凝結(jié)物和淀粉在研缽中研成粉末，與凡士林均勻混合，得到貼劑。
實(shí)施例4包括活性組分檸檬酸和L-精氨酸的抗癌組合物對(duì)腫瘤細(xì)胞存活的影響評(píng)價(jià)對(duì)包括活性組分檸檬酸和L-精氨酸的抗癌組合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。制備多種組合物，其中檸檬酸的濃度列于下表3，用這些組合物處理腫瘤細(xì)胞以觀察細(xì)胞存活情況。試驗(yàn)采用了SKOV-3細(xì)胞(人卵巢腺瘤細(xì)胞系(來自惡性瘤患者的腹水)，ATCC No.HTB-77)和U87(人神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，ATCC No.HTB-14)。
將SKOV-3和U-87細(xì)胞置于96-孔板中，細(xì)胞密度為3×103個(gè)細(xì)胞，在加有10％(v/v)FBS(胎牛血清)，100μg/ml鏈霉素、100U/ml青霉素和100μg/ml的L-精氨酸的DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，Life Technology，Inc.，U.S.A.)中培養(yǎng)12個(gè)小時(shí)。
用含有各種濃度的檸檬酸和L-精氨酸的各組合物處理培養(yǎng)的細(xì)胞，并在37℃，5％CO2下培養(yǎng)24小時(shí)，各組合物的制備方法同實(shí)施例1。然后評(píng)價(jià)細(xì)胞的存活情況。
表3組合物中檸檬酸和L-精氨酸的含量(wt％)

通過已知的MTT(3-(4，5二甲基噻唑-2-基)-2，5-2H-四唑溴化物)檢測(cè)分析細(xì)胞的存活力(Hansen，M.B.et al.，J.Immunol.Methods，172，203-210(1989))。將20μl的MTT溶液(溶于PBS(磷酸鹽緩沖液)中的10mg/ml MTT)加到各孔中，將培養(yǎng)板在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)。將培養(yǎng)基去除后，向每孔中加入200μl的DMSO(二甲基亞砜)以融解甲臢(formazan)晶體，隨后在室溫下振搖10分鐘。用Bio-Rad型3550分析儀(Richmond，CA.)測(cè)量540nm的吸收度。將沒有經(jīng)過包含檸檬酸的組合物處理后的細(xì)胞作為對(duì)照。結(jié)果見圖1。
如圖1所示，當(dāng)用含有檸檬酸和L-精氨酸的組合物處理腫瘤細(xì)胞系SKOV-3(▲)和U-87(◆)時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活力與活性成分檸檬酸和L-精氨酸的濃度成反比。尤其是，用組合物5進(jìn)行處理的腫瘤細(xì)胞存活率下降至60％以下，而用組合物7處理的細(xì)胞存活率下降至20％以下。
實(shí)施例5包括活性組分鋅和L-精氨酸的抗癌組合物對(duì)腫瘤細(xì)胞存活的影響評(píng)價(jià)對(duì)包括活性組分鋅和L-精氨酸的抗癌組合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。制備多種組合物，其中鋅和L-精氨酸的濃度列于下表4，用這些組合物處理腫瘤細(xì)胞以觀察細(xì)胞存活情況。試驗(yàn)采用了SKOV-3和U87細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)、用組合物處理腫瘤細(xì)胞及分析細(xì)胞存活率的方法同實(shí)施例4，結(jié)果見圖2。
表4組合物中鋅和L-精氨酸的含量(wt％)

如圖2所示，當(dāng)用含有鋅和L-精氨酸的組合物處理腫瘤細(xì)胞系SKOV-3(▲)和U-87(◆)時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率與活性成分鋅和L-精氨酸的濃度成反比。特別是，用組合物5進(jìn)行處理的腫瘤細(xì)胞存活率下降至50％以下，而用組合物7處理的細(xì)胞存活率下降至20％以下。
實(shí)施例6包括活性組分檸檬酸、鋅和L-精氨酸的抗癌組合物對(duì)腫瘤細(xì)胞存活的影響評(píng)價(jià)對(duì)包括活性組分檸檬酸、鋅和L-精氨酸的抗癌組合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。制備多種組合物，其中檸檬酸、鋅和L-精氨酸的濃度列于下表5，用這些組合物處理腫瘤細(xì)胞以觀察細(xì)胞存活情況。試驗(yàn)采用了SKOV-3，NIH:OVCAR-3(人卵巢腺瘤細(xì)胞系，ATCC No.HTB-161)和NOSE(人卵巢表皮正常上皮細(xì)胞系)。細(xì)胞培養(yǎng)、用組合物處理腫瘤細(xì)胞及分析細(xì)胞存活率的方法同實(shí)施例4，結(jié)果見圖3。
表5組合物中檸檬酸、鋅和L-精氨酸的含量(wt％)

如圖3所示，當(dāng)用含有檸檬酸、鋅和L-精氨酸的組合物處理腫瘤細(xì)胞系SKOV-3(▲)、NIH:OVCAR-3(◆)和NOSE(■)時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率隨活性成分檸檬酸、鋅和L-精氨酸的濃度成反比。特別是，用組合物6處理時(shí)，SKOV-3和NIH:OVCAR-3的存活率下降至20％以下，而用組合物6和7處理的NOSE細(xì)胞，其存活率仍保持50％以上。該結(jié)果表明抗癌組合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用具有特異性，從而最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。
實(shí)施例7包括活性組分檸檬酸、鋅和L-精氨酸的抗癌組合物對(duì)腫瘤細(xì)胞存活的影響評(píng)價(jià)對(duì)包括活性組分檸檬酸、鋅和L-精氨酸的抗癌組合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用的組合物為實(shí)施例5制備的幾種組合物，其中檸檬酸、鋅和L-精氨酸的濃度列于表5，用這些組合物處理腫瘤細(xì)胞以觀察細(xì)胞存活情況。試驗(yàn)采用了Ca Ski(ATCC No.CRL-1550)、HeLa(ATCC No.CCL-2)和C-33(ATCC No.HTB-31)。細(xì)胞培養(yǎng)、用組合物處理腫瘤細(xì)胞及分析細(xì)胞存活率的方法同實(shí)施例4，結(jié)果見圖4。
如圖4所示，當(dāng)用含有檸檬酸、鋅和L-精氨酸的組合物處理腫瘤細(xì)胞系Ca Ski(▲)、HeLa(◆)和C-33A(■)時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率隨活性成分檸檬酸、鋅和L-精氨酸的濃度升高而降低。具體而言，用組合物5處理腫瘤細(xì)胞，其存活率下降至60％以下，而用組合物7處理的腫瘤細(xì)胞，其存活率降至20％以下。
實(shí)施例8用本發(fā)明的抗癌組合物處理的流式分析通過流式分析評(píng)價(jià)實(shí)施例1制備的本發(fā)明的抗癌組合物對(duì)DNA分裂的作用。
將WI 38、OVCAR-3和SK-OV-3細(xì)胞置于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為2×106個(gè)細(xì)胞，將100μl實(shí)施例1制備的抗癌組合物(表1的組合物3)加入各孔中，如實(shí)施例4的方法，將板培養(yǎng)6小時(shí)和24小時(shí)。對(duì)照為未受抗癌組合物處理的細(xì)胞。收集細(xì)胞，用預(yù)冷卻的PBS清洗兩次。然后用100％乙醇在4℃下固定24小時(shí)。將所得細(xì)胞懸浮于500μl的PBS中，用20μg/ml的RNase在37℃下處理30分鐘，在冰上冷卻10分鐘。用50μg/μl的PI(碘化丙啶)染色分離出的DNA，用流式細(xì)胞分析儀(Becton Dickinson FACS system，美國(guó))分析DNA的分裂情況。用冷卻了的15mW氬激光器加強(qiáng)丙啶的熒光，用617長(zhǎng)通光濾波器收集發(fā)射光。用ModFit軟件(ModFit，Verity Software House，Topsham，ME，U.S.A.)確定細(xì)胞周期。結(jié)果見圖5、6和7。
如圖5、6和7所示，在抗癌組合物處理后的Ca Ski、HeLa和C-33 A細(xì)胞系中，G1期(DNA合成)的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)減少。G0-G1(亞G1)期的細(xì)胞增多，而S期(DNA合成)和G2-M期(有絲分裂)的細(xì)胞生成顯著減少，表明產(chǎn)生凋亡。
實(shí)施例9本發(fā)明的抗癌組合物處理細(xì)胞的DNA條帶(DNA ladder)檢測(cè)DNA條帶檢測(cè)適用于研究本發(fā)明抗癌組合物導(dǎo)致的細(xì)胞死亡(實(shí)施例8所觀察的)的機(jī)理。將Ca Ski，HeLa和C-33 A細(xì)胞置于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為2×106個(gè)細(xì)胞，將100μl實(shí)施例1制備的抗癌組合物(表1的組合物3)加入各孔中，如實(shí)施例4的方法將培養(yǎng)板培養(yǎng)6、12、24和48小時(shí)。然后，分別收集細(xì)胞，用常規(guī)方法分離DNA，如(Leszczynski D.et.al.Photochem.Photobiol.，1996，Vol.64，p936-.)中的方法。將收集的細(xì)胞懸浮于由0.5％SDS(十二烷基硫酸鈉)、2mM EDTA(四乙酸乙二胺)、100mg/ml的蛋白酶K和50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)組成的裂解緩沖液中，在55℃培養(yǎng)3小時(shí)，然后用等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)進(jìn)行提取。用0.1體積的乙酸銨和2.5體積的冷卻的純粹的乙醇沉淀DNA，然后在-20℃放置過夜。將DNA沉淀溶于TE緩沖液(1M Tris-HCl緩沖液中含0.5M EDTA，pH8.0)中，然后在37℃，用100mg/ml的RNase A處理1小時(shí)。將得到的DNA樣品在含有0.5μg/ml的溴化乙啶(EB)的1.5％瓊脂糖膠上進(jìn)行分離，分離電壓為60V，分離1個(gè)小時(shí)，然后置于UV燈下。結(jié)果見圖8。
如圖8所示，在本發(fā)明抗癌組合物處理的Ca Ski、HeLa和C-33 A細(xì)胞中，處理12小時(shí)和24小時(shí)后，可觀察到約100-bp的DNA條帶。通常，細(xì)胞凋亡時(shí)，核小體在核小體單元之間的連接部分?jǐn)嗔逊蛛x，得到約100-bp的DNA條帶。這些結(jié)果表明本發(fā)明的抗癌組合物導(dǎo)致細(xì)胞死亡的機(jī)理是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
實(shí)施例10用本發(fā)明的抗癌組合物處理的細(xì)胞中的致癌蛋白和與凋亡相關(guān)的蛋白的表達(dá)分析分析致癌蛋白C-Myc和與凋亡相關(guān)的蛋白P53和P21的表達(dá)類型以研究抗癌組合物誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)理。
Ca Ski、HeLa和C-33 A細(xì)胞置于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為2×106個(gè)細(xì)胞，將100μl實(shí)施例1制備的抗癌組合物(表1的組合物3)加入各孔中，如實(shí)施例4的方法，將板培養(yǎng)30分鐘、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)。培養(yǎng)后，分別收集細(xì)胞，用裂解緩沖液(10mM Tris，1mM EDTA，ImM DTT，1mMPMSF，蛋白酶抑制劑)裂解細(xì)胞。將細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-電泳，將分離出的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到ECL硝化纖維膜(Amersham Life Science，U.K.)上。用封閉液(TBST，含有5％脫脂奶；10mMTris-HCI，pH8.0.150mM NaCl，0.1％吐溫20)，在4℃封閉膜過夜。然后，利用免疫印記分析研究與凋亡相關(guān)的蛋白。將P21，P53和C-Myc的一級(jí)抗體用封閉液稀釋至1∶500。封閉后的膜與稀釋的一級(jí)抗體在4℃下反應(yīng)過夜，然后在室溫下，加入以1∶5000的比例用封閉液稀釋的二級(jí)抗體(山羊抗兔IgG-HRP；Santa Cruz Biotechnology，USA)，反應(yīng)1個(gè)小時(shí)。用一級(jí)和二級(jí)抗體處理完畢后，清洗各膜3次，每次清洗15分鐘，然后置于ECL Hyperfilm(Amersham Life Science，U.K.)上。結(jié)果見圖9、10和11。
如圖9和10所示，抗癌組合物處理后的細(xì)胞中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，P21和P53蛋白抑制細(xì)胞分裂的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。如圖11所示，用抗癌組合物處理后的細(xì)胞中，C-Myc蛋白激活腫瘤細(xì)胞分裂的表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減小。這些結(jié)果表明本發(fā)明的抗癌組合物抑制腫瘤細(xì)胞的增生并最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡。
實(shí)施例11本發(fā)明的抗癌組合物處理后的細(xì)胞的核染色為了研究本發(fā)明的抗癌組合物誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(如實(shí)施例8所觀察到的)的機(jī)理，對(duì)抗癌組合物處理后的細(xì)胞的核進(jìn)行染色。
將滅菌蓋玻片置于60-mm的培養(yǎng)皿中，其中的Ca Ski、HeLa和C-33 A細(xì)胞的密度為1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。然后，用100μl實(shí)施例1制備的抗癌組合物(表1的組合物3)處理細(xì)胞。24小時(shí)后，用PBS清洗細(xì)胞兩次，用3.7％的甲醛固定細(xì)胞。再用PBS清洗三次，用4μg/ml的DAPI(4’，6’-二乙?；?2-苯基吲哚)溶液(Sigma，USA)在室溫下，染色10分鐘。用PBS清洗三次，蒸餾水清洗兩次，在熒光顯微鏡(Olympus Optical Co.，Ltd.，USA)下觀察固定在蓋玻片上的染色細(xì)胞。結(jié)果見圖12。
如圖12所示，在未經(jīng)抗癌組合物處理的Ca Ski，HeLa and C-33 A細(xì)胞中可觀察到正常核。但是，經(jīng)抗癌組合物處理的三種細(xì)胞都顯示了凋亡引起的核的形態(tài)變化，如染色質(zhì)濃縮，核破裂，核收縮。具體而言，濃縮的染色質(zhì)邊緣不完整，濃縮的染色質(zhì)無序分散在核四周。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的抗癌組合物以特異性方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。
實(shí)施例12子宮癌細(xì)胞中的乳突淋瘤病毒表達(dá)的評(píng)價(jià)為了確定本發(fā)明的抗病毒組合物是否減少子宮癌細(xì)胞系中的乳突淋瘤病毒蛋白的表達(dá)，對(duì)HPV 16或18型的E6和E7蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析。
將Ca Ski和HeLa細(xì)胞置于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為2×106個(gè)細(xì)胞，將100μl實(shí)施例1制備的抗癌組合物(表1的組合物3)加入各孔中，如實(shí)施例4的方法，將板培養(yǎng)6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)。培養(yǎng)后，分別收集細(xì)胞，用裂解緩沖液(10mM Tris，1mM EDTA，ImM DTT，1mM PMSF，蛋白酶抑制劑)裂解細(xì)胞。將細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-電泳，將分離出的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到ECL硝化纖維膜(Amersham Life Science，U.K.)上。用封閉液(TBST，含有5％脫脂奶；10mMTris-HCI，pH8.0.150mM NaCl，0.1％吐溫20)在4℃封閉膜過夜。
然后，利用免疫印記分析研究HPV 16或18型的E6和E7蛋白。將HPV16型的E6和HPV 18型的E7的一級(jí)抗體(Santa Cruz Biotechnology，USA)以1∶500稀釋在封閉液中。封閉后的膜與稀釋的一級(jí)抗體在4℃下反應(yīng)過夜，然后在室溫下加入以1∶5000的比例稀釋在封閉液中的二級(jí)抗體(山羊-抗-兔IgG-HRP；Santa Cruz Biotechnology，USA)，反應(yīng)1個(gè)小時(shí)。一級(jí)和二級(jí)抗體處理完畢后，清洗各膜3次，每次清洗15分鐘，然后置于ECL Hyperfilm(Amersham Life Science，U.K.)上。結(jié)果見圖13。
如圖13所示，抗病毒組合物處理后的細(xì)胞中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，致癌蛋白HPV 16型的E6的表達(dá)逐漸減少。抗病毒組合物處理后的細(xì)胞中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，致癌蛋白HPV 18型的E7的表達(dá)逐漸減少。該結(jié)果表明本發(fā)明的抗病毒組合物對(duì)子宮癌細(xì)胞中的致癌蛋白HPV 16或18型的E6和E7的表達(dá)具有抑制作用。
實(shí)施例13本組合物對(duì)乳突狀瘤病毒導(dǎo)致的尖銳濕疣的治療效果將1g實(shí)施例3制備的膏劑(實(shí)施例3的透皮制劑(2))施用至尖銳濕疣女性患者的陰戶，每日用藥兩次。根據(jù)生殖器疣的病變大小治療2-12周。圖14顯示了其中一名患者給藥前后的生殖器疣照片。
實(shí)施例14對(duì)由腸道病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒導(dǎo)致的細(xì)胞病變效應(yīng)的分析為了表明本發(fā)明的抗病毒組合物能夠抑制病毒的增殖，對(duì)用抗病毒組合物處理后的感染有腸道病毒或脊髓灰質(zhì)炎病毒的細(xì)胞的病變效應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。
使Vero E6細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)在含有10％FBS的MEM培養(yǎng)基中，于37℃在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)之前，將細(xì)胞置于48孔板中一天，細(xì)胞密度為1×105個(gè)細(xì)胞。在以腸道病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行感染前用PBS清洗培養(yǎng)的細(xì)胞。以菌斑試驗(yàn)測(cè)定腸道病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒，然后在-70℃下儲(chǔ)藏，直至使用。將6pfu的腸道病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒分別在37℃的培養(yǎng)箱中放置1個(gè)小時(shí)，用PBS清洗，然后置入細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)中，再培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)。用本發(fā)明的抗病毒組合物(表1的組合物)處理感染了病毒的細(xì)胞，評(píng)價(jià)是否抑制了細(xì)胞病變效應(yīng)。將僅用檸檬酸、鋅或人精液處理的細(xì)胞作為對(duì)照。結(jié)果見圖15和16。
當(dāng)用本發(fā)明的抗病毒組合物處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞病變效應(yīng)的抑制率超過60％。而僅用檸檬酸、鋅或人精液處理的對(duì)照細(xì)胞的病變效應(yīng)的抑制率低于50％。
該結(jié)果表明，本發(fā)明的抗病毒組合物抑制病毒增殖，最終導(dǎo)致感染病毒的細(xì)胞死亡。
權(quán)利要求
1.一種抗癌組合物，其包括治療有效量的檸檬酸和/或鋅和L-精氨酸以及藥學(xué)可接受載體。
2.如權(quán)利要求1所述的抗癌組合物，其中，檸檬酸的含量占組合物總重量的0.01-20％，和/或鋅占組合物總重量的0.001-5％，和L-精氨酸占組合物總重量的0.01-20％。
3.如權(quán)利要求1或2所述的抗癌組合物，其中將所述組合物施用至選自患有肺癌、腦瘤、乳腺癌、大腸癌、妊娠絨毛膜癌、子宮癌和卵巢上皮癌的個(gè)體中。
4.如權(quán)利要求3所述的抗癌組合物，其中將所述組合物施用至患有子宮癌或卵巢上皮癌的個(gè)體中。
5.如權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)的抗癌組合物，其中所述組合物為口服或腸胃外給藥劑型。
6.一種治療癌癥的方法，其包括將權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)的抗癌組合物施用至癌癥患者中，以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。
7.一種抗病毒組合物，其包括治療有效量的檸檬酸和/或鋅和L-精氨酸以及藥學(xué)可接受載體。
8.如權(quán)利要求7所述的抗病毒組合物，其中，檸檬酸的含量占組合物總重量的0.001-20％，和/或鋅占組合物總重量的0.0001-5％，和L-精氨酸占組合物總重量的0.001-20％。
9.如權(quán)利要求7或8所述的抗病毒組合物，其中將所述組合物應(yīng)用于乳突淋瘤病毒、AIDS病毒、腸道病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒。
10.如權(quán)利要求7-9任意一項(xiàng)的抗病毒組合物，其中，所述組合物為口服抗病毒制劑或腸胃外給藥的霜?jiǎng)?、膏劑、凝膠劑或貼劑。
11.一種抗病毒的方法，其包括將權(quán)利要求7-10任意一項(xiàng)的抗病毒組合物施用至患有由感染病毒而導(dǎo)致疾病的患者中，以降低病毒蛋白的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗癌或抗病毒組合物，其包括治療有效量的檸檬酸和/或鋅和L－精氨酸以及藥學(xué)可接受載體。本發(fā)明的抗癌組合物具有強(qiáng)抗癌作用，而無副作用。本發(fā)明的抗病毒組合物用于治療由病毒感染導(dǎo)致的疾病。
文檔編號(hào)A61K33/30GK1708310SQ200380102452
公開日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2003年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月31日
發(fā)明者樸來玉 申請(qǐng)人:樸來玉