專利名稱：抑制人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因表達(dá)的siRNA和表達(dá)載體及其在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種siRNA，特別是涉及一種靶向抑制人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因表達(dá)的siRNA和表達(dá)載體及其在制藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前抑制致癌基因表達(dá)的腫瘤基因治療方法主要是用反義寡核苷酸技術(shù)(Agraival，Trends in Biotech，1992，10152)阻斷有害基因的表達(dá)，其作用機(jī)理已經(jīng)清楚，它通過堿基互補(bǔ)配對與雙鏈DNA形成三鏈，或與RNA形成雜交雙鏈，從而阻斷基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工或翻譯。它也可以激發(fā)RNaseH活力，降解RNA、DNA雜交雙鏈中的RNA鏈或以其它的方式最終阻斷基因的表達(dá)。人們使用反義寡核苷酸技術(shù)抑制某些基因的過度表達(dá)。但由于反義寡核苷酸技術(shù)沒有放大效應(yīng)，一般用量均較大，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染研究中有些使用達(dá)2μmol以上，抑制基因表達(dá)效果大約在50％-90％左右，對一些受體和特殊蛋白的抑制作用僅有10-20％。在臨床試用的一些反義寡核苷酸，如Bcl-2癌基因的反義寡核苷酸劑量達(dá)4.1mg/m2到73.6mg/m2(Webb A，Lancet 1997，3491137)。這樣靶向作用癌細(xì)胞的效率就大大降低。也限制了反義寡核苷酸技術(shù)的廣泛應(yīng)用。
端粒酶的表達(dá)水平與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，因此已成為新的腫瘤標(biāo)志物和腫瘤治療靶點(diǎn)。已有研究報(bào)道用端粒酶反義寡核苷酸治療多種腫瘤(Teng L et al.J Clin Endocrinol Metab 2003，881362；Schindler A et al.IntJ Oncol 2001，1925；張素珍等，Chinese J of Cancer，2002，21493；王孝養(yǎng)等，中華內(nèi)科雜志，2002，413；許寧等，中華泌尿外科雜志，2000，216)，有一定的治療效果。他們利用端粒酶反義寡核苷酸分別作用于甲狀腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、肺癌、腎癌細(xì)胞，都能不同程度抑制癌細(xì)胞端粒酶的活性及癌細(xì)胞的增殖，缺點(diǎn)是所用劑量較大，抑制效果仍不能達(dá)到要求。
最近RNA干涉(RNA interference，RNAi)技術(shù)的應(yīng)用給癌癥的基因治療帶來新的應(yīng)用前景。國際上最早是1998年2月由Fire和Mello首次在《Nature》上發(fā)表了在一種線蟲上應(yīng)用了該技術(shù)，隨后許多研究者在果蠅、植物和動物卵細(xì)胞上進(jìn)行了大量研究，結(jié)果表明RNAi現(xiàn)象在上述生物體內(nèi)都能發(fā)生。直到2001年5月和2001年12月，德國科學(xué)家Elabshir、Harborth和Tuschl等人在《Nature》和《J.Cell Sci.》上相繼發(fā)表了用RNAi技術(shù)分別使哺乳類細(xì)胞中16個基因表達(dá)水平降低或沉默，從而證明RNAi對哺乳類細(xì)胞也是有影響的，這使得這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于治療某些由于特定基因表達(dá)過多引起的疾病(如癌基因的過度表達(dá)引起的癌癥)成為可能。有望此項(xiàng)技術(shù)能成為新的癌癥基因治療的有效手段。這種技術(shù)可使靶向的mRNA表達(dá)在短時間內(nèi)明顯降低，并且具有放大瀑布式效應(yīng)，使靶向基因在較長時間內(nèi)表達(dá)持續(xù)降低，所用劑量小，抑制效果高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靶向抑制人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomerasereverse transcriptase，hTRT)基因mRNA表達(dá)的siRNA。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種能表達(dá)上述siRNA的質(zhì)粒載體。
本發(fā)明還有一個目的是提供上述siRNA及其表達(dá)質(zhì)粒載體在制備治療或預(yù)防腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達(dá)到本發(fā)明的原理是通過構(gòu)建一種質(zhì)粒載體(命名為psiRNATE)，這種質(zhì)粒載體能產(chǎn)生19-23個核苷酸的小雙鏈RNA(siRNA)，該siRNA與hTRT mRNA存在互補(bǔ)關(guān)系，能靶向識別hTRT mRNA上與其互補(bǔ)的序列，并能與之結(jié)合，從而影響端粒酶基因表達(dá)的活性。
據(jù)此設(shè)計(jì)，首先在基因庫中尋找靶向基因hTRT的mRNA序列，并從起始密碼后75個堿基開始尋找AA+N19+UU序列或AA+N19序列(N19為任意19個mRNA核苷酸序列)，然后計(jì)算所選擇的19-23 nts mRNA堿基序列中G+C比例在30％到70％之間，再將19-23 nts mRNA序列用Blast搜尋EST基因庫，確認(rèn)所靶向的基因是唯一的，再設(shè)計(jì)19-23個核苷酸的反義RNA，并用SiACE-RNAi方法合成二條RNA鏈，形成一種特異性抑制人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因表達(dá)的小雙鏈RNA，它包含下列四種小雙鏈RNA中的任意一種或幾種，它們的堿基序列見表1。
表1小雙鏈RNA序列及靶向作用人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因部位(序列號AF015950)

本發(fā)明的目的還可以通過下列措施實(shí)現(xiàn)一種能抑制人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因表達(dá)的小雙鏈RNA的表達(dá)質(zhì)粒系列，它具有以下的基本結(jié)構(gòu)由啟動子、小雙鏈RNA編碼區(qū)和DNA序列順序連結(jié)而成的環(huán)狀雙鏈DNA分子，其中啟動子為任何真核基因的啟動子，它是啟動它下游的小雙鏈DNA表達(dá)成小雙鏈RNA表達(dá)元件；小雙鏈RNA編碼區(qū)是由能表達(dá)表1中的小雙鏈RNA序列的雙鏈DNA構(gòu)成主體的雙鏈DNA，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)形成雙向或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的小雙鏈RNA；DNA序列為任何真核質(zhì)粒在啟動子、編碼區(qū)之外的DNA序列，含有抗生素抗性基因，包括使細(xì)菌獲得針對某種抗生素的抗性基因或使真核細(xì)胞獲得針對某種抗生素的抗性基因。
所述的小雙鏈RNA在制備治療和預(yù)防腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
所述的質(zhì)粒在制備治療和預(yù)防腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)將表1中的雙鏈RNA(siRNA)二鏈的3’末端延伸合成2-5個dT序列，以減少細(xì)胞內(nèi)降解，并將合成的小雙鏈RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以確認(rèn)這些小雙鏈RNA能特異性靶向抑制端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因表達(dá)，然后將這些小雙鏈RNA通過雙向或發(fā)夾結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的雙鏈DNA克隆到質(zhì)粒載體中，使這種質(zhì)粒能在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成3’末端延伸2-5個U同表1相同序列的雙鏈RNA。
將上述能形成表1相同雙鏈序列的雙鏈RNA(siRNA)的表達(dá)質(zhì)粒載體psiRNATE用脂質(zhì)體包裹分別轉(zhuǎn)染或通過病毒載體直接感染Hela宮頸癌細(xì)胞、SMMC7721肝癌細(xì)胞、MKN-45胃癌細(xì)胞，建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)psiRNA載體的細(xì)胞株。與對照組(未轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞株)相比，用western法檢測上述轉(zhuǎn)psiRNATE質(zhì)粒細(xì)胞株中hTRT的含量，結(jié)果表明(具體數(shù)據(jù)見實(shí)施例)本發(fā)明psiRNATE質(zhì)粒載體能明顯抑制上述幾種癌細(xì)胞中hTRT的活性。進(jìn)一步測定轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞株中的端粒酶活性，結(jié)果明顯低于未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒癌細(xì)胞組。將各種轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株分別接種到含有移植瘤的裸鼠體內(nèi)，觀察瘤體生長情況，結(jié)果表明該質(zhì)粒能有效地抑制瘤體的生長。構(gòu)建的能產(chǎn)生小雙鏈RNA的質(zhì)粒載體及該小雙鏈RNA，能靶向作用于hTRT mRNA，抑制癌細(xì)胞中端粒酶的活性，并能在整體動物實(shí)驗(yàn)中抑制移植瘤的生長，其抑制效應(yīng)比端粒酶反義寡核苷酸的效應(yīng)更明顯，持續(xù)時間更久。表明該發(fā)明可應(yīng)用于制備治療和預(yù)防腫瘤的藥物。


圖1空載體pcDNA3.1(+)圖譜圖21.5％瓊脂糖凝膠電泳U6+1+antisense DNA條帶圖31.5％瓊脂糖凝膠電泳U6+1+sense DNA條帶圖41.5％瓊脂糖凝膠電泳U6+1+antisense和U6+1+sense條帶圖5Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染psiRNATE對端粒酶基因表達(dá)蛋白的抑制圖6psiRNATE轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞、SMMC7721細(xì)胞、MKN-45細(xì)胞對端粒酶活性的影響圖7裸鼠接種Hela細(xì)胞25天后瘤體生長體積圖8pRK5空質(zhì)粒載體圖譜圖9Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染psiRNA-TRT對端粒酶基因表達(dá)蛋白的抑制圖10psiRNA-TRT轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞、SMMC7721細(xì)胞、MKN-45細(xì)胞對端粒酶活性的影響圖11裸鼠接種Hela細(xì)胞25后瘤體生長體積具體實(shí)施方式
通過下列的實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1構(gòu)建由正義鏈(sense鏈)和反義鏈(antisense鏈)形成的雙向小雙鏈RNA表達(dá)載體抑制端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因表達(dá)。
1.小雙鏈RNA表達(dá)載體的構(gòu)建(1)包涵目的基因的雙鏈DNA的形成為了將設(shè)計(jì)好的小雙鏈RNA序列(以SEQ ID NO.1為例)能在質(zhì)粒中表達(dá)出來，首先合成3個引物，利用PCR技術(shù)形成相應(yīng)的分別包涵U6+1啟動子的雙鏈DNA片段。3個引物的序列分別是3’末端正義鏈(sense)引物序列為5’-ATT GGG CCC GTC GAC ATC GAT AAA AAA GAA GCC GAA GGC CAG CACGTT CGG TGT TTC GTC CTT TCC AC-3’(SEQ ID NO.5)3’末端反義鏈(antisense)引物序列為5’-CCG GAA TCC TCT AGA AAA AAA GAA CGT GCT GGC CTT CGG CTT CGGTGT TTC GTC CTT TCC AC-3’(SEQ ID NO.6)5’末端引物序列為5’-ATA AGA ATG CGG CCG CCC CGG GGA TCC AAG GTC GGG-3’(SEQ ID NO.7)分別將3’末端的正鏈和負(fù)鏈引物與5’末端引物通過PCR擴(kuò)增形成兩條DNA雙鏈(sense鏈、antisense鏈)，PCR模板為pTZU6+1，PCR的過程94℃ 1分鐘，57℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，35個循環(huán)后，72℃ 10分鐘，4℃保存。
(2)酶切包涵目的基因U6+1+antisense的雙鏈DNA及質(zhì)粒載體pcDNA3.1(5.428kb)PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下在350bp左右有一條很深很亮的條帶，是U6+1+antisense DNA條帶，用Qiagen凝膠回收試劑盒回收。取17μl回收的含U6+1+antisense DNA，加10×限制性內(nèi)切酶XbaI緩沖液2μl，再加入限制性內(nèi)切酶XbaI1μl，混勻，37℃酶切過夜，再在反應(yīng)體系中加限制性內(nèi)切酶BamHI 1μl，37℃酶切3h。同樣的方法用XbaI和BamHI酶切空質(zhì)粒載體pcDNA3.1(5.428kb)。電泳并回收，得到含U6+1+antisense小片段DNA(酶切位點(diǎn)為XbaI和BamHI)以及大片段質(zhì)粒載體pcDNA3.1(酶切位點(diǎn)為XbaI和BamHI)。-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (3)酶切包涵目的基因U6+1+sense的雙鏈DNA及空質(zhì)粒載體pcDNA3.1PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下在350bp左右有一條很深很亮的條帶，是U6+1+sense DNA條帶，用Qiagen凝膠回收試劑盒回收。取17μl回收的含U6+1+senseDNA，加10×限制性內(nèi)切酶NotI緩沖液2μl，再加入限制性內(nèi)切酶NotI 1μl，混勻，37℃酶切過夜，然后反應(yīng)體系中加入16μl 4M醋酸銨溶液，84μl無水乙醇，混合，-20℃ 30分鐘，14000g 4℃ 15分鐘離心，去上清，吹干后，加入17μl無菌水和10×限制性內(nèi)切酶ApaI，酶切3h。同樣的方法用NotI和ApaI酶切空質(zhì)粒載體pcDNA3.1(5.428kb，圖譜見圖1)。得到含U6+1+sense小片段DNA(酶切位點(diǎn)為NotI和ApaI和)以及大片段質(zhì)粒載體pcDNA3.1(酶切位點(diǎn)為NotI和ApaI)。-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (4)將目的基因U6+1+antisense連接到質(zhì)粒載體pcDNA3.1中取酶切大片段質(zhì)粒載體pcDNA3.1(酶切位點(diǎn)為XbaI和BamHI)1μl，再取U6+1+antisense小片段DNA(酶切位點(diǎn)為XbaI和BamHI)7μl，加入10μl的無菌水，2μl的10×T4 DNA連接酶緩沖液和1μl的T4 DNA連接酶，22℃孵育1小時。在孵育液中加入100μl的感受態(tài)大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后涂布在含100μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)16-18h，隨機(jī)挑取菌落于含100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增細(xì)菌，抽提質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI酶切鑒定，反應(yīng)液在1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，結(jié)果見圖2，圖中2、3、4、5、6、7為含有U6+1+antisenseDNA片斷的陽性克隆菌。選擇出現(xiàn)350bp插入片段的質(zhì)粒，保存?zhèn)溆谩?br> (5)將目的基因U6+1+sense連接到質(zhì)粒載體pcDNA3.1中取酶切大片段質(zhì)粒載體pcDNA3.1(酶切位點(diǎn)為NotI和ApaI)1μl，再取U6+1+sense小片段DNA(酶切位點(diǎn)為NotI和ApaI)7μl，加入10μl的無菌水，2μl的10×T4 DNA連接酶緩沖液和1μl的T4 DNA連接酶，22℃孵育1小時。在孵育液中加入100μl的感受態(tài)大腸桿菌DH5a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后涂布在含100μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)16-18h，隨機(jī)挑取菌落于含100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增細(xì)菌，抽提質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶NotI和ApaI酶切鑒定，反應(yīng)液在1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，結(jié)果見圖3，圖中1、2、3、6為含有U6+1+sense DNA片斷的陽性克隆菌。出現(xiàn)350bp插入片段的質(zhì)粒，保存?zhèn)溆谩?br> (6)將步驟(4)中的陽性克隆菌提質(zhì)粒，并用Apa I酶切3h后，在反應(yīng)液中加0.5μl平頭酶，37℃孵育15min，75℃滅活10min，然后反應(yīng)體系中加入16μl 4M醋酸銨溶液，84μl無水乙醇，沉淀，離心。去上清，吹干后，加入17μl無菌水和10×限制性內(nèi)切酶HindIII緩沖液和1μl HindIII，酶切3h。1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，得到350bp的含U6+1+antisense小片段DNA，其酶切位點(diǎn)為HindIII和Apa I(平)。膠回收備用。
(7)將步驟(5)中的陽性克隆菌提質(zhì)粒，并用EcoR I酶切2h后，在反應(yīng)液中加0.5μl平頭酶，37℃孵育15min，75℃滅活10min，然后反應(yīng)體系中加入16μl 4M醋酸銨溶液，84μl無水乙醇，沉淀，離心。去上清，吹干后，加入17μl無菌水和10×限制性內(nèi)切酶HindIII緩沖液和1μl HindIII，酶切3h。1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，得到包含U6+1+sense的大片段，其酶切位點(diǎn)為HindIII和EcoRI(平)。膠回收備用。
(8)psiRNATE質(zhì)粒的構(gòu)建取步驟(7)中的包含U6+1+sense的大片段1μl，再取步驟(6)中的U6+1+antisense小片段DNA(酶切位點(diǎn)為XbaI和BamHI)7μl，按步驟(4)中的連接方法將小片段介入大片段中。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后涂布在含100μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)16-18h，隨機(jī)挑取菌落于含100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增細(xì)菌，抽提質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切鑒定，1.5％瓊脂糖凝膠電泳U6+1+antisense和U6+1+sense條帶分離，出現(xiàn)350bp片段的為陽性克隆菌，結(jié)果見圖4，圖中1號為包含U6+1+antisense和U6+1+sense片斷的陽性克隆菌。對陽性克隆菌測序，結(jié)果表明新構(gòu)建的質(zhì)粒載體中包含U6+1+antisense和U6+1+sense，其質(zhì)粒命名為psiRNATE。
陽性克隆菌的測序結(jié)果5′-CTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCAAGGCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGAAGCCGAAGGCCAGCACGTTCTTTTTTTCTAGAGATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCCCCGGGGATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGAACGTGCTGGCCTTCGGCTTCTTTTTATCGATGTCNANGGGCCCGTNNAACCCNCTGTNCNNCCTCNACTGGGCCTNCTAANTTGNCCNCANNCGGNGGTNGCCCTCCCCNNN-3′(SEQ ID NO.8)其中包含兩段U6+1啟動子序列(41-309)(381-650)5′-GGATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG-3′(SEQ ID NO.9)
和antisense鏈序列(311-330)5′-GCCGAAGGCCAGCACGTTC-3′(SEQ ID NO.10)以及sense鏈序列(651-670)5′-GAACGTGCTGGCCTTCGGC-3′(SEQ ID NO.11)。
2、基因轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)將宮頸癌Hela細(xì)胞，在含有10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液、37℃、5％CO2、飽和濕度環(huán)境的條件下連續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天，將3.0×105對數(shù)期生長的上述三種細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，1.5×105個細(xì)胞/孔，過夜培養(yǎng)后，細(xì)胞的貼壁率在40％左右時，吸去培養(yǎng)液，用不含青霉素、鏈霉素和小牛血清的1640洗1次。接下來取psiRNATE質(zhì)粒4μg，加入250μl Opti-MEM混合稀釋，另一試管加入10μl lipofectamin 2000，用250μl Opti-MEM混合稀釋。兩試管在室溫?zé)o菌條件下放置5分鐘，兩試管合并混合后室溫?zé)o菌條件下放置20分鐘，待溶液變稠后移入6孔板中，每孔加入560μl培養(yǎng)介質(zhì)，37℃5％CO2下培養(yǎng)4小時，每孔再加入含2倍小牛血清和2倍青霉素、鏈霉素的1640培養(yǎng)液1440μl，37℃5％CO2下培養(yǎng)72h后再用G418 250μg/ml篩選。每2-3天換一次液，最終挑選出陽性細(xì)胞克隆。擴(kuò)增培養(yǎng)。
3.用western blot法檢測hTRT在上述Hela細(xì)胞中的表達(dá)將上述轉(zhuǎn)psiRNATE質(zhì)粒的宮頸癌Hela細(xì)胞培養(yǎng)，加1％SDS裂解液消化，收集細(xì)胞。超聲破碎細(xì)胞。聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，剪下目的蛋白條帶。用1％脫脂奶粉封閉30min，按1∶200加入兔抗hTRT多克隆抗體一抗，37℃孵育2h，1％脫脂奶粉洗3次，再按1∶50加入二抗(山羊抗兔IgG-HRP，購自華美生物工程公司)，37℃孵育2h，1％脫脂奶粉洗5次，0.05M Tris-HCl pH7.4洗一次。用DAB(二氧基聯(lián)苯胺)濃縮液按1∶50稀釋液顯色。結(jié)果見圖5，圖中1為正常Hela細(xì)胞組，2為轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組，3為轉(zhuǎn)染psiRNATE組。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染psiRNATE質(zhì)粒的Hela宮頸癌細(xì)胞中的hTRT明顯減少。
4.端粒酶活性測定分別在Hela宮頸癌細(xì)胞、SMMC7721肝癌細(xì)胞、MKN-45胃癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染psiRNATE質(zhì)粒，溫育3d，PBS溶液洗1次，4℃ 1000r/min離心1min，沉淀加入150μl洗滌緩沖液(10mmol/L HEPES-KOH，pH7.5，1.5mmol/L MgCl2，10mmol/L KCl，1mmol/L DTT)洗滌，離心1min，棄洗液，加50μl裂解緩沖液(10mmol/L Tris-HCl pH7.5，1mmol/L MgCl2，1mmol/L EGTA，0.1mmol/L PMSF， 5mmol/L巰基乙醇，0.5％CHAPS，10％甘油。)，懸浮，混勻，置冰浴30min，4℃14000r/min離心20min，取上清2μl做TRAP反應(yīng)模板。取反應(yīng)管，各加入45μl反應(yīng)混合物，加入2μl已處理的標(biāo)本，混勻，加入30μl液體石蠟，至25℃水浴保溫30min，在PCR儀上循環(huán)，94℃ 120s；94℃ 30s；48℃ 30s；72℃ 92s；72℃300s循環(huán)35次。循環(huán)結(jié)束后，在微孔板各孔中加入雜交反應(yīng)液，再加入擴(kuò)增產(chǎn)物20μl混勻，設(shè)立空白對照，至37℃恒溫反應(yīng)60min，然后加入顯色劑，37℃避光顯色10min，加入反應(yīng)終止液(200mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl pH7.0)，終止反應(yīng)。在波長570-630nm讀取A值，結(jié)果見圖6，圖中1為Hela細(xì)胞對照組；2為SMMC7721細(xì)胞對照組；3為MKN-45細(xì)胞對照組；4為Hela-psiRNATE細(xì)胞組；5為SMMC7721-psiRNATE細(xì)胞組；6為MKN-45-psiRNATE細(xì)胞組。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染psiRNATE質(zhì)粒的Hela宮頸癌細(xì)胞、SMMC7721肝癌細(xì)胞、MKN-45胃癌細(xì)胞端粒酶活性明顯受到抑制。
5.動物致瘤性實(shí)驗(yàn)將BALB/C(nu/nu)裸小鼠隨機(jī)分成對照組、轉(zhuǎn)空白質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)psiRNATE質(zhì)粒組，每組6只，均為雌性。取對數(shù)生長期的Hela宮頸癌細(xì)胞，0.25％胰酶消化后置于無血清1640培養(yǎng)液中，調(diào)整濃度為5×107/ml，分別接種于BALB/C(nu/nu)裸小鼠的右腋皮下，每只0.1ml，待形成肉眼可見腫瘤后，隔日用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長(L)和寬(W)，腫瘤體積按下列公式計(jì)算V＝(L×W7)×0.52。各組均在注射腫瘤細(xì)胞25天后，頸椎脫臼處死裸鼠，剖出腫瘤，測量腫瘤體積大小。結(jié)果見圖7，圖中1為對照組，2為轉(zhuǎn)空白質(zhì)粒組，3為轉(zhuǎn)染psiRNATE組。結(jié)果顯示對照組在接種裸鼠后14天內(nèi)就形成肉眼可見腫瘤，第25天時腫瘤平均體積為498mm3，轉(zhuǎn)空白質(zhì)粒組腫瘤平均體積為474mm3而轉(zhuǎn)psiRNATE質(zhì)粒組在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤速度明顯較慢，在腫瘤細(xì)胞接種后25天腫瘤平均體積為37.2mm3。表明psiRNATE質(zhì)?？擅黠@抑制腫瘤的生長，可用于制備治療腫瘤的藥物。
實(shí)施例2.構(gòu)建發(fā)夾狀小雙鏈RNA表達(dá)載體抑制hTRT基因表達(dá)U6啟動子能高效表達(dá)小雙鏈RNA，但一般的質(zhì)粒載體中不存在這一啟動子，因此首先需要構(gòu)建這種啟動子。
1.U6+1啟動子的構(gòu)建(1)U6+1啟動子PCR引物的設(shè)計(jì)和PCR的過程引物3’端引物AATCTGCAGAAAAAGCGGACCGAAGTCCGCTCTAGATGCATGCTCGAGGTCGTCCGGTGTTTCGTCCTTTC
CAC(SEQ ID NO.12)5’端引物CGCGGATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC(SEQ ID NO.13)PCR模板pTZU6+1PCR的過程94℃ 1分鐘，57℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，35個循環(huán)后，72℃ 10分鐘，4℃保存。
(2)PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下在280bp有一條很深很亮的條帶，這就是U6+1啟動子的條帶，切下，用Qiagen凝膠回收試劑盒回收凝膠上的雙鏈DNA，取17μl回收的DNA，加10×限制性內(nèi)切酶PstI緩沖液2μl，再加入限制性內(nèi)切酶PstI 1μl，混勻，37℃保溫酶解5小時，反應(yīng)后，反應(yīng)體系中加入16μl 4M醋酸銨溶液，84μl無水乙醇，混合，20℃30分鐘，14000g 4℃ 15分鐘離心，去上清，吹干后，加入17μl無菌水和10×限制性內(nèi)切酶BamHI緩沖液2μl，再加入限制性內(nèi)切酶BamHI 1μl，混合，37℃保溫酶解2小時。最后，1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下在280bp有一條很深很亮的條帶，切下，用Qiagen凝膠回收試劑盒回收凝膠上的雙鏈DNA，溶解于20μl無菌水中，是為A液，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.pRK5空質(zhì)粒載體的酶切和與U6+1啟動子的連接(1)取空質(zhì)粒載體pRK5(4716bp，圖譜見圖8)0.5μg(0.5μl)，加10×限制性內(nèi)切酶PstI緩沖液2μl，無菌水17μl和限制性內(nèi)切酶PstI 1μl，混勻，37℃保溫酶解5小時，反應(yīng)后，反應(yīng)體系中加入16μl 4M醋酸銨溶液，84μl無水乙醇，混合，-20℃30分鐘，14000g 4℃ 15分鐘離心，去上清，吹干后，加入17μl無菌水和10×限制性內(nèi)切酶BamHI緩沖液2μl，再加入限制性內(nèi)切酶BamHI 1μl，混合，37℃保溫酶解2小時。最后，1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下在4500bp上方有一條帶，切下，用Qiagen凝膠回收試劑盒回收凝膠上的雙鏈DNA，溶解于20μl無菌水中，是為B液，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)取上述的A液7μl，B液1μl，加入10μl的無菌水，2μl的10×T4 DNA連接酶緩沖液和1μl的T4 DNA連接酶，22℃孵育1小時。
(3)在孵育液中加入100μl的感受態(tài)大腸桿菌DH5a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后涂布在100μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)16-18小時，隨機(jī)挑取菌落于含100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增細(xì)菌，抽提質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶PstI和BamHI酶切，反應(yīng)液在1％瓊脂糖凝膠電泳分離，選擇出現(xiàn)350bp插入片段的質(zhì)粒，保存?zhèn)溆谩?br> 3.抑制hTRT基因表達(dá)的發(fā)夾狀小雙鏈RNA的制備和連接本發(fā)明所提供的發(fā)夾狀雙鏈RNA(siRNA)，與hTRT基因(序列號AF015950)的部分雙鏈序列相同(位點(diǎn)在340-358)，但在雙鏈一側(cè)加了9個核苷酸序列的環(huán)，此環(huán)的序列為TTCAAGAGA。增加此環(huán)的目的是提高小雙鏈RNA的表達(dá)量。
siRNA抑制hTRT mRNA的作用位點(diǎn)見表1，這些RNA序列必須符合以下原則從基因序列中的起始密碼后75個堿基開始尋找AA+N19+UU序列或AA+N19序列，其中N19任意19個mRNA核苷酸序列。一般從中找出21個核苷酸中G+C比例為50％左右，并不高于70％或不低于30％的核苷酸。將符合要求的21個堿基序列在NCBI database中通過BLAST搜索小核苷酸序列同源性和EST Library，以保證所靶向的目的基因是唯一的。按設(shè)計(jì)好的21個堿基的sense RNA和antisense RNA的3’端用2-4個dT或2-6個U修飾，可減少細(xì)胞內(nèi)降解。
發(fā)明人根據(jù)以上原則，設(shè)計(jì)合成了表1中的NO.2序列(SEQ ID NO.2)，序列為5’-CGU GCU GGC CUU CGG CUU C-3’3’-GCA CGA CCG GAA GCC GAA G-5’作用于hTRT mRNA的第340-358位點(diǎn)。
兩端留下SalI和XbaI的酶切位點(diǎn)，具體的發(fā)夾狀RNA的基因序列為N端5’-GATCCGAACGTGCTGGCCTTCGGCTTCAAGAGAGCCGAAGGCCAGCACGTTCTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO.14)C端5’-AGCTTTTCCAAAAAAGAACGTGCTGGCCTTCGGCTCTCTTGAAGCCGAAGGCCAGCACGTTCG-3’(SEQ ID NO.15)(1)把分別合成的上述兩條單鏈DNA配成雙鏈把配成50μM的單鏈DNA各取2μl，加入46μl的annealing Buffer(100mM醋酸鉀，30mM Hepes-KOH pH7.4，2mM醋酸鎂)，在PCR儀中，95℃ 4分鐘，70℃ 10分鐘，關(guān)機(jī)后冷卻至室溫，4℃存放后，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)合成雙鏈DNA的磷酸化2μl合成雙鏈DNA1μl T4多聚核苷酸激酶的緩沖液A1μl 1mM ATP1μl T4 PNK5μl無菌水把總體積為10μl的液體混勻，37℃ 30min，70℃ 10min，然后冷卻至室溫，4℃存放后，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (3)取已經(jīng)連接上U6啟動子的pRK5質(zhì)粒16μl(1μg)，加10×限制性內(nèi)切酶SalI緩沖液2μl，限制性內(nèi)切酶SalI和XbaI各1μl，混勻，37℃保溫酶解5h，反應(yīng)后，1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下在5000bp下方有一條帶，切下，用Qiagen凝膠回收試劑盒回收凝膠上的雙鏈DNA，溶解于20μl無菌水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (4)將上述酶切的質(zhì)粒1μl和上述磷酸化的合成的雙鏈DNA 7μl，加入10μl的無菌水，2μl的10×T4 DNA連接酶緩沖液和1μl的T4 DNA連接酶，22℃孵育1h。
(5)在孵育液中加入100μl的感受態(tài)大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后涂布在100μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)16-18h，隨機(jī)挑取菌落于含100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增細(xì)菌，抽提質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶SalI和XbaI酶切，反應(yīng)液在2.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，出現(xiàn)64bp插入片段的為陽性克隆菌，將其質(zhì)粒命名為pRTRT。
4.含G418抗性基因雙鏈RNA質(zhì)粒psiRNA-TRT的構(gòu)建方法(1)把已經(jīng)構(gòu)建好的pRTRT質(zhì)粒，取17μl(約1μg)，加10×限制性內(nèi)切酶EcoRI緩沖液2μl，限制性內(nèi)切酶EcoRI 1μl，混勻，37℃保溫酶解1小時，反應(yīng)后，反應(yīng)體系中加入16μl 4M醋酸銨溶液，84μl無水乙醇，混合，-20℃30分鐘，14000g 4℃ 15分鐘離心，去上清，吹干后，加入17μl無菌水和10×限制性內(nèi)切酶XbaI緩沖液2μl，再加入限制性內(nèi)切酶XbaI 1μl，混合，37℃保溫酶解5小時。最后，1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下在400bp有一條帶，切下，用Qiagen凝膠回收試劑盒回收凝膠上的雙鏈DNA，溶解于20μl無菌水中，是為A液，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)取pcDNA3.1質(zhì)粒17μl(約1μg)，加10×限制性內(nèi)切酶EcoRI緩沖液2μl，限制性內(nèi)切酶EcoRI 1μl，混勻，37℃保溫酶解2小時，反應(yīng)后，反應(yīng)體系中加入16μl4M醋酸銨溶液，84μl無水乙醇，混合，-20℃30分鐘，14000g 4℃ 15分鐘離心，去上清，吹干后，加入17μl無菌水和10×限制性內(nèi)切酶XbaI緩沖液2μl，再加入限制性內(nèi)切酶XbaI 1μl，混合，37℃保溫酶解5小時。最后，1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下在5400bp有一條帶，切下，用Qiagen凝膠回收試劑盒回收凝膠上的雙鏈DNA，溶解于20μl無菌水中，是為B液，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (3)質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化和鑒定取上述的A液7μl，B液1μl，加入10μl的無菌水，2μl的10×T4 DNA連接酶緩沖液和1μl的T4 DNA連接酶，22℃孵育1小時。
在孵育液中加入100μl的感受態(tài)大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后涂布在100μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)18小時，隨機(jī)挑取菌落于含100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增細(xì)菌，抽提質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI酶切，反應(yīng)液在1％瓊脂糖凝膠電泳分離，選擇出現(xiàn)400bp插入片段的質(zhì)粒為陽性克隆菌，其質(zhì)粒命名為psiRNA-TRT。
5.psiRNA-TRT質(zhì)粒對Hela細(xì)胞hTRT基因表達(dá)的抑制作用(1)Hela細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞來自上海中科院細(xì)胞所，1640培養(yǎng)基+10％小牛血清培養(yǎng)，待培養(yǎng)到細(xì)胞的貼壁率在80％左右，鋪6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，1.5×105個細(xì)胞/孔，過夜培養(yǎng)后，細(xì)胞的貼壁率在40％左右時，吸去培養(yǎng)液，用不含青霉素、鏈霉素和小牛血清的1640洗1次。接下來取p siRNA-TRT質(zhì)粒4μg，加入250μl Opti-MEM混合稀釋，另一試管加入10μl lipofectamin2000，用250μl Opti-MEM混合稀釋。兩試管在室溫?zé)o菌條件下放置5分鐘，兩試管合并混合后室溫?zé)o菌條件下放置20分鐘，待溶液變稠后移入6孔板中，每孔加入560μl培養(yǎng)介質(zhì)，37℃ 5％ CO2下培養(yǎng)4小時，每孔再加入含2倍小牛血清和2倍青霉素、鏈霉素的1640培養(yǎng)液1440μl，37℃5％CO2下培養(yǎng)72小時。
(2)細(xì)胞的篩選吸去培養(yǎng)介質(zhì)，用含100μg/ml G418的1640培養(yǎng)基篩選陽性細(xì)胞，中間不斷更換新鮮的含100μg/ml G418的1640培養(yǎng)基，待細(xì)胞完全貼壁后，此即為含有p siRNA-TRT質(zhì)粒的Hela細(xì)胞。
(3)細(xì)胞的回收和抑制效果的鑒定把含有psiRNA-TRT質(zhì)粒的Hela細(xì)胞在不含G418的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)72h后，吸去培養(yǎng)介質(zhì)，用Hank’s液洗一次，每孔加入50μl 1％SDS，取出細(xì)胞后，輕微超聲粉碎細(xì)胞10秒，-70℃凍存。同時取出3μl用Bio-Rad DC測蛋白濃度，OD750測吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出蛋白濃度。調(diào)節(jié)蛋白濃度使每個樣品的蛋白量為100μg作10％SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，進(jìn)行western法檢測。含有樣品的硝酸纖維素膜用2％脫脂奶粉配制的PBS(0.1M，pH7.0)洗30min，用鼠單抗(鼠抗hTRT單克隆抗體，下同)按1∶250用2％脫脂奶粉-PBS稀釋后，振蕩反應(yīng)1.5小時，用2％脫脂奶粉-PBS洗30min。然后用HRP-山羊抗兔二抗(山羊抗兔IgG-HRP)1∶1000 2％脫脂奶粉-PBS稀釋后反應(yīng)1小時，PBS洗30min，DAB試劑盒顯色處理，結(jié)果見圖9，圖中1為正常Hela細(xì)胞組，2為轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組，3為轉(zhuǎn)染psiRNA-TRT組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，轉(zhuǎn)染有psiRNA-TRT質(zhì)粒的細(xì)胞中其抑制hTRT基因的表達(dá)在90％以上。
6.端粒酶活性測定將轉(zhuǎn)染psiRNA-TRT質(zhì)粒的Hela細(xì)胞溫育3d，PBS溶液洗1次，4℃1000r/min離心1min，沉淀加入150μl洗液洗滌，離心1min，棄洗液，加50μl裂解液，懸浮，混勻，置冰浴30min，4℃14000r/min離心20min，取上清2μl做TRAP反應(yīng)模板。取反應(yīng)管，各加入45μl反應(yīng)混合物，加入2μl已處理的標(biāo)本，混勻，加入30μl液體石蠟，至25℃水浴保溫30min，在PCR儀上循環(huán)，94℃ 120s；94℃ 30s；48℃ 30s；72℃ 92s；72℃ 300s循環(huán)35次。循環(huán)結(jié)束后，在微孔板各孔中加入雜交反應(yīng)液，在加入擴(kuò)增產(chǎn)物20μl混勻，設(shè)立空白對照，至37℃恒溫反應(yīng)60min，然后加入顯色劑，37℃避光顯色10min，加入終止液，終止反應(yīng)。在波長570-630nm讀取A值，結(jié)果見圖10，圖中1為Hela細(xì)胞對照組；2為SMMC7721細(xì)胞對照組；3為MKN-45細(xì)胞對照組；4為Hela-psiRNA-TRT細(xì)胞組；5為SMMC7721-psiRNA-TRT細(xì)胞組；6為MKN-45-psiRNA-TRT細(xì)胞組。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染psiRNA-TRT質(zhì)粒的Hela細(xì)胞的端粒酶活性明顯受到抑制。
7.動物致瘤性實(shí)驗(yàn)將BALB/C(nu/nu)裸小鼠隨機(jī)分成轉(zhuǎn)空白質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)psiRNA-TRT質(zhì)粒質(zhì)粒組，每組6只，均為雌性。取對數(shù)生長期的空白質(zhì)粒Hela細(xì)胞、以及轉(zhuǎn)psiRNA-TRT質(zhì)粒的Hela-psiRNA-TRT，0.25％胰酶消化后置于無血清1640培養(yǎng)液中，調(diào)整濃度為5×107/ml，分別接種于BALB/C(nu/nu)裸小鼠的右腋皮下，每只0.1ml，待形成肉眼可見腫瘤后，隔日用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長(L)和寬(W)，腫瘤體積按下列公式計(jì)算V＝(L×W7)×0.52。各組均在注射腫瘤細(xì)胞22天后，頸椎脫臼處死裸鼠，剖出腫瘤，測量腫瘤體積大小，結(jié)果見圖11，圖中1為對照組，2為轉(zhuǎn)空白質(zhì)粒組，3為轉(zhuǎn)psiRNA-TRT組。結(jié)果顯示對照組Hela宮頸癌細(xì)胞在接種裸鼠后14天內(nèi)就形成肉眼可見腫瘤，第25天時腫瘤平均體積為456mm3，轉(zhuǎn)空白質(zhì)粒組第25天腫瘤平均體積為437mm3而Hela-psiRNA-TRT細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤速度明顯較慢，在腫瘤細(xì)胞接種后25天腫瘤平均體積為19mm3。
序 列 表<110>徐根興<120>抑制人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因表達(dá)的siRNA和表達(dá)載體及其在制藥中的應(yīng)用<160>15<210>1<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>1gaacgugcug gccuucggc19<210>2<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>2cgugcuggcc uucggcuuc19
<210>3<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>3cacggugacc gacgcacug19<210>4<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>4ggcgucuggg augcgaacg19<210>5<211>68<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述雙向作用的雙鏈RNA 3’端正義鏈引物序列<400>5attgggcccg tcgacatcga taaaaaagaa gccgaaggcc agcacgttcg gtgtttcgtc 60ctttccac 68<210>6<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述雙向作用的雙鏈RNA 3’端反義鏈引物序列<400>6ccggaatcct ctagaaaaaa agaacgtgct ggccttcggc ttcggtgttt cgtcctttcc 60ac62<210>7<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述雙向作用的雙鏈RNA 5’端引物序列<400>7ataagaatgc ggccgccccg gggatccaag gtcggg 36
<210>8<211>764<212>DNA<213>含有psiRNATE質(zhì)粒的大腸桿菌序列<220>
<221>misc_signal<222>(686，688，697，698，704，709，711，712，717，727，732，736，739，742，743，747，751，761，762，763)<223>n＝a或g或c或t<400>8ctggctagcg tttaaactta agcagcttgg taccgagctc ggatccaagg cgggcaggaa 60gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 120ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 180aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 240atgcttacgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac 300gaaacaccga agccgaaggc cagcacgttc tttttttcta gagattctgc agatatccag 360cacagtggcg gccgccccgg ggatccaagg tcgggcagga agagggccta tttcccatga 420ttccttcata tttgcatata cgatacaagg ctgttagaga gataattaga attaatttga 480ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt 540agtttgcagt tttaaaatta tgtttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa 600gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg gaacgtgctg 660gccttcggct tctttttatc gatgtcnang ggcccgtnna acccnctgtn cnncctcnac 720tgggcctnct aant tgnccn canncggngg tngccctccc cnnn 764<210>9<211>271
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述U6+1啟動子序列<400>9ggatccaagg tcgggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata 60cgatacaagg ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta 120gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta 180tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct 240ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc g271<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述構(gòu)建的DNA雙鏈的antisense鏈序列<400>10gccgaaggcc agcacgttc 19<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述構(gòu)建的DNA雙鏈的sense鏈序列<400>11gaacgtgctg gccttcggc19<210>12<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述U6啟動子PCR 3’端引物<400>12aatctgcaga aaaagcggac cgaagtccgc tctagatgca tgctcgaggt cgtccggtgt 60ttcgtccttt ccac 74<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述U6啟動子PCR 5’端引物<400>13cgcggatcca aggtcgggca ggaagagggc30
<210>14<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述單鏈DNA的N端<400>14gatccgaacg tgctggcctt cggcttcaag agagccgaag gccagcacgt tcttttttgg 60aaa63<210>15<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述單鏈DNA的C端<400>15agcttttcca aaaaagaacg tgctggcctt cggctctctt gaagccgaag gccagcacgt 60tcg 6權(quán)利要求
1.一種特異性抑制人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因表達(dá)的小雙鏈RNA，其特征在于它包含下列四種小雙鏈RNA中的任意一種或幾種，它們的堿基序列如下a.5’-GAA CGU GCU GGC CUU CGG C-3’3’-CUU GCA CGA CCG GAA GCC G-5’b.5’-CGU GCU GGC CUU CGG CUU C-3’3’-GCA CGA CCG GAA GCC GAA G-5’c.5’-CAC GGU GAC CGA CGC ACU G-3’3’-GUG CCA CUG GCU GCG UGA C-5’d.5’-GGC GUC UGG GAU GCG AAC G-3’3’-CCG CAG ACC CUA CGC UUG C-5’
2.一種能抑制人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因表達(dá)的小雙鏈RNA表達(dá)質(zhì)粒系列，其特征在于它具有以下的基本結(jié)構(gòu)由啟動子、小雙鏈RNA編碼區(qū)和DNA序列順序連結(jié)而成的環(huán)狀雙鏈DNA分子，其中啟動子為任何真核基因的啟動子，它是啟動它下游的小雙鏈DNA表達(dá)成小雙鏈RNA表達(dá)元件；小雙鏈RNA編碼區(qū)是由能表達(dá)權(quán)利要求1所述的小雙鏈RNA序列的雙鏈DNA構(gòu)成主體的雙鏈DNA，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)形成雙向或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的小雙鏈RNA；DNA序列為任何真核質(zhì)粒在啟動子、編碼區(qū)之外的DNA序列，含有抗生素抗性基因，包括使細(xì)菌獲得針對某種抗生素的抗性基因或使真核細(xì)胞獲得針對某種抗生素的抗性基因。
3.權(quán)利要求1所述的小雙鏈RNA在制備治療或預(yù)防腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的質(zhì)粒在制備治療或預(yù)防腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種特異性抑制人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因表達(dá)的siRNA及該siRNA的表達(dá)質(zhì)粒和它們在制備與人端粒酶活化有關(guān)的腫瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明利用生物計(jì)算機(jī)信息技術(shù)從GenBank中獲得一組人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因序列，并以RNA干擾技術(shù)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)出一組可能誘發(fā)RNA干擾的siRNA，通過化學(xué)法合成或質(zhì)粒載體表達(dá)一定量的siRNA，從而特異性抑制人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因的表達(dá)。該siRNA及其表達(dá)質(zhì)粒可制備高效快速、特異性強(qiáng)、副作用少的抗腫瘤藥。
文檔編號A61K48/00GK1580260SQ20031011734
公開日2005年2月16日 申請日期2003年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月7日
發(fā)明者郭丹, 劉文華, 肖祥華, 傅更鋒, 樊燕蓉, 劉新卷, 徐根興 申請人:徐根興