專利名稱：“sars”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子及其制備方法，具體地講，本發(fā)明涉及一種以滅活的“SARS”病毒為抗原制得的“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子及其制備方法。
背景技術(shù)：
SARS病毒是在今年我國乃至世界范圍內(nèi)肆虐的SARS病的元兇。它的傳播嚴(yán)重影響了人們的正常生活秩序。SARS病毒是一種嶄新的冠狀病毒，非某種已知冠狀病毒的近期變種。冠狀病毒是一種RNA病毒。2003年3月以來，國內(nèi)外相繼報(bào)道了引起SARS冠狀病毒的基因序列，該病毒含有完整的5’末端序列、編碼序列和3’末端序列，全RNA基因組長度為29727核苷酸，基因編碼區(qū)的組成結(jié)構(gòu)與其他冠狀病毒類似，包括多個(gè)開放閱讀框架(ORFs)，分別編碼病毒的多聚合酶蛋白(polymerase 1a，1b)和結(jié)構(gòu)蛋白。
轉(zhuǎn)移因子(Transfer factor)是白細(xì)胞中有免疫活性的淋巴細(xì)胞所釋放的一種低分子核苷酸和多肽，其本質(zhì)是少量核酸和小分子多肽的混合物。它可以將被某種抗原(病原)免疫的特異性免疫反應(yīng)從某一個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)體，非特異性地提高受者的免疫功能，促進(jìn)免疫細(xì)胞因子釋放。
轉(zhuǎn)移因子具有可透析性，不含蛋白，粗制轉(zhuǎn)移因子中含多肽、核酸，其活性不為胰蛋白酶、DNA酶和RNA酶所破壞，在-20℃條件下可長期保存，分子量小于5000。
轉(zhuǎn)移因子還具有轉(zhuǎn)移細(xì)胞免疫的能力。在使用很小的劑量就能使受體產(chǎn)生局部或全身反應(yīng)，作用時(shí)間快，3-4h就可激活宿主的淋巴細(xì)胞，使受體致敏，持續(xù)時(shí)間可長達(dá)一年之久。在體外轉(zhuǎn)移因子可使未致敏的淋巴細(xì)胞致敏，胸腺嘧啶滲入增加，使喪失與綿羊紅細(xì)胞形成玫瑰花能力的淋巴細(xì)胞部分地恢復(fù)。轉(zhuǎn)移因子不能在種間交叉轉(zhuǎn)移，現(xiàn)已證明，動物種間、成人與動物之間均可相互轉(zhuǎn)移，僅僅是轉(zhuǎn)移程度有差異。
轉(zhuǎn)移因子在國內(nèi)生產(chǎn)和臨床應(yīng)用多年，包括非特異性轉(zhuǎn)移因子和特異性轉(zhuǎn)移因子。非特異性轉(zhuǎn)移因子主要用于提高人體的免疫功能和抗病能力，而特異性轉(zhuǎn)移因子除了具備非特異性轉(zhuǎn)移因子的功能外，還可以激發(fā)針對某種抗原的免疫反應(yīng)。轉(zhuǎn)移因子一般從脾臟和淋巴結(jié)等免疫器官和白細(xì)胞中提取。
我國專利申請03108006.5公開了一種抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子制備方法，首先，非典病毒經(jīng)Hep-2細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞、人胚肺細(xì)胞或雞胚培養(yǎng)增殖，制備非典病毒抗原以及根據(jù)非典病毒的基因序列用基因工程方法表達(dá)制備的保護(hù)性抗原。其次，以不連續(xù)梯度密度離心純化病毒抗原或以20％蔗糖沉層濃縮抗原。然后，用所提取的病毒抗原免疫動物。最后，從免疫動物中提取抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子。
至今，人們?nèi)晕囱兄瞥鲆环N能有效地治療SARS的藥物。明年SARS病毒有可能會卷土重來，威脅人類的健康。研究對有效治療和預(yù)防SARS的藥物的任務(wù)迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種制備“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的方法。
在本發(fā)明的制備“SARS”病毒特異性免疫核糖核酸的方法中包括如下步驟(1)對“SARS”病毒進(jìn)行滅活，制得滅活的“SARS”病毒；(2)用滅活的“SARS”病毒與免疫佐劑混合后注射到動物體內(nèi)；(3)從免疫后的動物的組織中提取“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子；(4)將提取的“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子進(jìn)行精制、純化和分裝。
上述的制備方法基于下面的原理滅活的“SARS”病毒中的抗原成分可以誘導(dǎo)和刺激動物產(chǎn)生免疫反應(yīng)，激活體內(nèi)免疫活性細(xì)胞等，而這些細(xì)胞會分泌轉(zhuǎn)移因子，從而激活針對“SARS”病毒的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的發(fā)明人根據(jù)這一原理，利用在廣州分離獲得的“SARS”病毒，經(jīng)滅活后制成滅活疫苗，然后與可以加強(qiáng)免疫刺激效應(yīng)的佐劑一起注射到豬等動物體內(nèi)，誘發(fā)動物產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)。證實(shí)產(chǎn)生免疫反應(yīng)后，提取肝、脾、淋巴結(jié)等組織中的轉(zhuǎn)移因子，從特異性免疫的角度生產(chǎn)出一種抗“SARS”的有效治療藥物。
在步驟(1)之前，可以通過PCR擴(kuò)增SARS病毒。步驟(1)中滅活可以是甲醛滅活或者是溫度滅活，也可以采用其他的滅活方法。流感病毒采用市售的滅活病毒，而“SARS”病毒要經(jīng)過滅活。滅活條件的控制的關(guān)鍵在于對滅活溫度、時(shí)間或甲醛濃度的控制。采用溫度滅活時(shí)溫度控制在46-66℃范圍，時(shí)間控制在10-100分鐘內(nèi)。例如可以采用56℃60分鐘。甲醛濃度在0.10％-1.00％。滅活的時(shí)間為數(shù)小時(shí)至數(shù)十小時(shí)。例如，可以用0.2％的甲醛滅活SARS病毒24小時(shí)以上，或者0.4％的甲醛滅活SARS病毒2小時(shí)以上，可以使SARS病毒喪失感性，滅活率為100％；病毒滅活前后抗原不受影響。盡管0.2％的甲醛作用24小時(shí)以上可以滅活病毒，但能檢測出高拷貝的核酸，因此優(yōu)選采用0.4％的甲醛滅活24小時(shí)作為滅活SARS疫苗的條件。這種滅活方法能有效地滅活病毒，并且滅活前后抗原不受影響。
在步驟(2)中除了滅活的“SARS”病毒和免疫佐劑之外，還采用流感病毒的滅活疫苗一起進(jìn)行混合后，來聯(lián)合免疫動物。
其中，佐劑可以增強(qiáng)免疫效果，使用的佐劑可以是佛氏佐劑包括佛氏完全佐劑(FCA)和佛氏不完全佐劑(FIA)、氫氧化鋁佐劑、CpG佐劑中的一種或幾種，優(yōu)選為使用佛氏佐劑完全佐劑或不完全佐劑。更優(yōu)選為使用佛氏佐劑完全佐劑和不完全佐劑。
免疫的動物可以是小鼠、大鼠、兔、豬、牛、猴或馬，優(yōu)選為豬。
免疫的方法可以是單獨(dú)用SARS滅活疫苗免疫動物，也可以是用SARS滅活疫苗與流感疫苗同時(shí)對動物進(jìn)行免疫。由于用“SARS”和流感病毒抗原聯(lián)合免疫動物，制造出來的轉(zhuǎn)移因子對“SARS”和流感都具有特異性，是本發(fā)明的關(guān)鍵所在，因此優(yōu)選采用此方案。
免疫(接種)可以是單次注射，也可以是多次注射。由于一般要多次注射才能達(dá)到高免疫狀態(tài)，所以優(yōu)選為多次注射。接種方法優(yōu)選為背部多點(diǎn)肌肉注射。選擇合適的免疫的時(shí)間間隔和長度可以達(dá)到較好的免疫效果。一般需要數(shù)天的時(shí)間。優(yōu)選為0天、15天、21天、40天進(jìn)行接種。
在步驟(3)中采集免疫后動物的肝、脾和/或淋巴結(jié)組織，將其細(xì)胞破碎，然后提取“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。其中，細(xì)胞破碎的方法可以采用組織搗碎機(jī)搗碎、超聲波破碎等，但是常用組織搗碎機(jī)搗碎，制成勻漿。提取“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的方法為凍融透析法、孵育透析法或乙醇提取法。
在步驟(4)中可以按照現(xiàn)有技術(shù)采用微孔濾膜過濾、超濾、透析等方法進(jìn)行精制和純化。在步驟(4)之后可以根據(jù)需要進(jìn)行鑒定、活性檢測，例如用核酸測定法檢測濃度，用生物活性法測定特異性和作用。精制和純化后得到的“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子可以在無菌條件下進(jìn)行分裝。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種由方法制備的“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子，既可以是以滅活的“SARS”病毒為抗原制得的，也可以是以滅活的“SARS”病毒和流感病毒滅活疫苗為抗原制得的。對“SARS”病毒和流感病毒都有特異性，從而能夠?qū)Α癝ARS”和流感均起到有效的治療效果。
經(jīng)嚴(yán)格的檢測，由這種方法制得的“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子符合國家生物制品標(biāo)準(zhǔn)，該特異性免疫的轉(zhuǎn)移因子對提升人體抗“SARS”病毒感染的能力具有明顯效果，對“SARS”和流感治療都有特異治療作用，對人體無毒副作用的優(yōu)點(diǎn)，填補(bǔ)了“SARS”治療無有效和特異藥物的國內(nèi)外空白，對防治“SARS”有特殊意義。
以下結(jié)合實(shí)施例，來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例，任何依照本發(fā)明的基本精神的改進(jìn)或替代，仍屬于本發(fā)明權(quán)利要求書中所要求保護(hù)的范圍。
具體實(shí)施例方式
下列實(shí)施例中所使用的材料為1.流感疫苗上海生物制品廠生產(chǎn)。
2.佐劑佛氏完全佐劑和佛氏不完全佐劑，Sigma產(chǎn)品。
3.HRP標(biāo)記兔抗豬IgG和IgM酶標(biāo)抗體，美國產(chǎn)品。
4.超濾器美國Millipore公司產(chǎn)品。
實(shí)施例1 SARS滅活疫苗的制備在底面積為275cm2細(xì)胞瓶內(nèi)培養(yǎng)VeroE6(中國國家病毒研究所)，待細(xì)胞長成致密單層后，用無血清培養(yǎng)液洗細(xì)胞3次，加入100ml無血清培養(yǎng)液，分別接種F69和Z2-Z3SARS-Cov病毒株，細(xì)胞病變至75％-100％時(shí)，滴定病毒，TCID50為log10×107/ml。將培養(yǎng)瓶置-20℃冰箱凍融3次，搖勻置2-8℃冰箱過夜，用0.4％甲醛滅活24hr后，5000rpm×30min，棄去沉淀，上清作為SARS滅活疫苗。
實(shí)施例2 免疫程序(SARS滅活疫苗單獨(dú)免疫)健康去勢公豬17頭(體重50Kg，廣州市良種豬場)用實(shí)施例SARS滅活疫苗(TCID50Log107/ml)。共4次，第1次為佛氏完全佐劑+SARS滅活疫苗；第2次為佛氏不完全佐劑+SARS滅活疫苗，第3次和第4次為單純SARS滅活疫苗免疫；劑量3×TCID50；接種方法背部多點(diǎn)肌肉注射。免疫的時(shí)間間隔為0d，15d，21d，40d。從耳靜脈采集全血1-3ml，血清采集的時(shí)間間隔為0d，5d，7d，10d，15d，21d，28d，35d和42d。然后離心分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2.免疫程序(SARS滅活疫苗和流感疫苗聯(lián)合免疫)健康去勢公豬13頭(體重50Kg，廣州市良種豬場)。用SARS滅活疫苗(TCID50Log107/ml)+流感疫苗免疫，共4次，第1次為佛氏完全佐劑+SARS滅活疫苗+流感疫苗免疫；第2次佛氏不完全佐劑+SARS滅活疫苗+流感疫苗免疫，第3次和第4次為SARS滅活疫苗+流感疫苗免疫。劑量SARS為3×TCID50；流感病毒第1次為3人份/豬，以后3次為1人份/豬；接種方法背部多點(diǎn)肌肉注射。免疫的時(shí)間間隔為0d，15d，21d，40d。從耳靜脈采集全血1-3ml，血清采集的時(shí)間間隔為0d，5d，7d，10d，15d，21d，28d，35d和42d。然后離心分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例3.免疫效果的檢驗(yàn)中和抗體檢測將實(shí)施例1和2中的免疫豬按照滅活疫苗免疫效果評價(jià)檢測的方法進(jìn)行。
1.病毒稀釋 將滴定后的病毒稀釋成100TCID50/25ul。
2.動物血清 SARS病毒免疫接種豬不同時(shí)期的血清，將血清在無菌的96孔板上從1∶10開始，連續(xù)倍稀釋至1∶10240，每一稀釋度2孔，同時(shí)采集免疫接種前的各種動物作為對照用。
3.中和試驗(yàn) 在以上血清稀釋孔內(nèi)加入25ul 100TCID50/25ul的Z2-Y3病毒應(yīng)用液，輕輕搖勻后置36℃ 5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照與病毒滴度回滴實(shí)驗(yàn)。
4.結(jié)果的觀察 從第4天起觀察結(jié)果，第7天(細(xì)胞100％出現(xiàn)病變)判定結(jié)果。
結(jié)果表明實(shí)施離例2和3中的豬均在第5天檢測到抗SARS病毒的中和抗體，第4次免疫接種后，其中和抗體效價(jià)達(dá)到1∶240，符合免疫核糖核酸制備的要求。
實(shí)施例4.免疫效果的檢驗(yàn)IgG檢測將實(shí)施例1和2中的免疫豬采用間接ELISA法進(jìn)行IgG檢測(1)用pH9.6的碳酸緩沖液將SARS滅活疫苗1∶100稀釋后包被96孔板，4℃過夜；(2)以15％小牛血清PBST(1‰吐溫)進(jìn)行封閉；(3)樣本血清用含5％小牛血清PBST稀釋100倍后加樣；(4)加HRP標(biāo)記的單抗鼠IgG抗體；(5)加鄰苯二胺底物液及H2O2，避光顯色；(6)用2M的H2SO4終止反應(yīng)；(7)用Bio-Rad505酶標(biāo)儀測各孔490nm的吸光值。
實(shí)施例5.特異性轉(zhuǎn)移因子(TF)的提取方法(凍融透析法)
Lawrence法(凍融透析法)如以脾臟或淋巴結(jié)為原料，方法是取新鮮或冰凍保存的脾，去其表面被膜，脂肪等結(jié)締組織，剪碎，置高速組織搗碎機(jī)中搗碎(10000-12000rpm，開機(jī)3min，停5min，反復(fù)3次)，鏡檢組織勻漿中無完整的淋巴細(xì)胞，然后置-40℃冰凍72h，融凍后透析，以下步驟同上。
實(shí)施例6.特異性轉(zhuǎn)移因子的提取方法(孵育透析法)孵育透析法取致敏動物的淋巴結(jié)或脾臟，去除被膜，脂肪等結(jié)締組織，剪碎，制成淋巴細(xì)胞懸液，用不銹鋼篩將細(xì)胞濾到Hanks液中，調(diào)pH為7.3；細(xì)胞濃度為1×109個(gè)/15ml，置37℃恒溫水浴中，孵育4h，并不斷攪拌，后離心(1500-2000rpm)，取其上清液，用10倍量的去離子水，在4℃條件下，透析16-18h，取其透析外液，即為粗制TF。
實(shí)施例7.特異性轉(zhuǎn)移因子的提取方法(乙醇提取法)乙醇提取法取新鮮淋巴組織(包括脾、淋巴結(jié)及外周血白細(xì)胞)，切成小塊，加1倍體積冷卻的80％乙醇及3倍體積的40％乙醇，高速搗碎3min，調(diào)pH5.0-5.1，隨后在冰浴中放置30-60min，后在0-4℃條件下離心(2500rpm)20min，取其上清液，加等體積去離子水，冷凍干燥，按每克淋巴組織抽取物加2ml去離子水溶解，進(jìn)行超濾，然后除菌分裝。國外的試驗(yàn)證明，在淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中加入相應(yīng)抗原或加入微量轉(zhuǎn)移因子(TF)，都可刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生大量TF。
權(quán)利要求
1.一種制備“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的方法，該方法包括如下步驟(1)對“SARS”病毒進(jìn)行滅活，制得滅活的“SARS”病毒；(2)用滅活的“SARS”病毒與免疫佐劑混合后注射到動物體內(nèi)；(3)從免疫后的動物的組織中提取“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子；(4)將提取的“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子進(jìn)行精制、純化和分裝。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中，采用的滅活方法是甲醛滅活或溫度滅活。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中，采用甲醛滅活時(shí)甲醛的濃度為0.10％-1.00％。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中，采用溫度滅活時(shí)溫度控制在46-66℃范圍，時(shí)間控制在10-100分鐘內(nèi)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，除了滅活的“SARS”病毒和免疫佐劑之外，還采用滅活的流感病毒一起進(jìn)行混合后，來聯(lián)合免疫動物。
6.如權(quán)利要求1-5之一所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的免疫佐劑是佛氏完全佐劑和/或佛氏不完全佐劑。
7.如權(quán)利要求1-5之一所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中，采集免疫后動物的肝、脾和/或淋巴結(jié)組織，將其細(xì)胞破碎，然后提取“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，提取“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的方法為凍融透析法、孵育透析法或乙醇提取法。
9.一種按前述權(quán)利要求之一所述方法制備的“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子，其特征在于，該“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子是以滅活的“SARS”病毒為抗原制得的。
10.如權(quán)利要求9所述的“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子，其特征在于，該“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子是以滅活的“SARS”病毒和滅活的流感病毒為抗原制得的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子及其制備方法。本發(fā)明的方法主要包括以下步驟“SARS”病毒的滅活、免疫動物、提取特異性轉(zhuǎn)移因子、特異性轉(zhuǎn)移因子的精制、純化。本發(fā)明的“SARS”病毒特異性轉(zhuǎn)移因子可以采用滅活的“SARS”病毒為抗原進(jìn)行制備，所得產(chǎn)物可以特異性結(jié)合“SARS”病毒；也可以聯(lián)合采用滅活的“SARS”病毒和流感病毒滅活疫苗為抗原進(jìn)行制備，所得產(chǎn)物對“SARS”病毒和流感病毒都有特異性的功效，從而能夠?qū)Α癝ARS”和流感均起到有效的治療效果。
文檔編號A61K38/02GK1546521SQ20031011237
公開日2004年11月17日 申請日期2003年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月28日
發(fā)明者陸家海, 王一飛, 潘興華 申請人:陸家海