專利名稱：用于治療白血病的а ) N－{ 5－[ 4－( 4－甲基－哌嗪－1－基－甲基)－苯甲酰氨基 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于同時(shí)、獨(dú)立或相繼應(yīng)用的組合，如一種聯(lián)合制劑或藥物的固定組合，所說的組合包含協(xié)同有效量的(a)至少一種組蛋白脫乙?；敢种苿┖?b)化合物I或其可藥用的鹽、以及任選的至少一種可藥用的載體，其中活性成分在各種情況中以游離形式或可藥用鹽的形式存在。
在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種對(duì)患有白血病的溫血?jiǎng)游镞M(jìn)行治療的方法，其包括給所說的動(dòng)物以對(duì)抗白血病的聯(lián)合治療有效量施用(a)至少一種組蛋白脫乙?；敢种苿┖?b)化合物I。
這里所用的術(shù)語“白血病”非限制性地包括慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)和急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，尤其是費(fèi)城-染色體陽性的急性淋巴細(xì)胞白血病(Ph+ALL)。用這里所公開的方法治療的白血病的變型優(yōu)選地是CML以及對(duì)化合物I有抗藥性的白血病、對(duì)化合物I有抗藥性的Bcr/Abl+白血病。
這里所用的術(shù)語“對(duì)化合物I有抗藥性的白血病”尤其定義的是其中化合物I或其可藥用鹽表現(xiàn)出治療作用降低的白血病，其非限制性地包括由于Bcr/Abl基因擴(kuò)增、Bcr/Abl蛋白表達(dá)增加和Abl激酶結(jié)構(gòu)域突變而對(duì)化合物I的治療表現(xiàn)出抗藥性的白血病。
這里所用的術(shù)語“治療”包括給需要該類治療的溫血?jiǎng)游铮瑑?yōu)選人施用該組合伴侶以治愈疾病或取得疾病消退作用或延遲疾病進(jìn)程的作用。
這里所用的術(shù)語“進(jìn)程的延遲”指的是疾病的進(jìn)程至少被該治療減慢或阻礙并且與未進(jìn)行治療或進(jìn)行單一治療的患者相比患者在存活率方面有所改善。
組合伴侶(a)化合物I是式I的N-{5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基-甲基)-苯甲酰氨基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺
(I)，在本發(fā)明中，化合物I優(yōu)選地是以其單甲磺酸鹽的形式被應(yīng)用的?？梢匀鏦O 99/03854所述的那樣來制備化合物I并將其給藥，尤其是可以如WO 99/03854的實(shí)施例4和6所述的那樣來制備N-{5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基-甲基)-苯甲酰氨基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺的單甲磺酸鹽?；衔颕可以以由GLIVECTM或GLEEVECTM的商標(biāo)市售的形式來進(jìn)行給藥。術(shù)語“化合物I”包括其所有可藥用的鹽并且還可以以水合物的形式進(jìn)行應(yīng)用或者包括結(jié)晶形式，例如α和β結(jié)晶形式，如于2000年5月10日公開的EP 998 473中所述的形式。
這里所用的術(shù)語“組蛋白脫乙?；敢种苿狈窍拗菩缘匕ǘ∷徕c、MS-275(以前稱為MS-27-275)、辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)、aphacidin、縮肽、FK228(以前稱為FR901228)、曲古抑菌素A和以NOVARTIS AG的名義提交的國(guó)際專利申請(qǐng)WO 01/38322(優(yōu)先權(quán)日1999年11月23日)和WO 02/22577(優(yōu)先權(quán)日2000年9月1日)中所公開的化合物，所說的專利申請(qǐng)?jiān)谶@里被引入作為參考。特別是游離形式或可藥用鹽形式的式II的化合物II(優(yōu)選地是其乳酸鹽形式)
和 游離形式或其可藥用鹽形式的式III的化合物III。

在于2002年3月21日公開的以NOVARTIS AG的名義提交的國(guó)際專利申請(qǐng)WO 02/22577的實(shí)施例P2中具體公開了化合物II。
在于2002年3月21日公開的以NOVARTIS AG的名義提交的國(guó)際專利申請(qǐng)WO 02/22577的實(shí)施例200中具體公開了化合物III?；衔颕II是其游離形式或可藥用鹽的形式。
可以從標(biāo)準(zhǔn)摘要“默克索引(The Merck Index)”的現(xiàn)行版本或從數(shù)據(jù)庫，例如國(guó)際專利(例如IMS國(guó)際公布)中得到由代碼、屬名或商品名所確定的活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。其相應(yīng)內(nèi)容在這里被引入作為參考。
本發(fā)明涉及一種組合，如一種聯(lián)合制劑或藥物組合物，其包含用于同時(shí)、獨(dú)立或相繼應(yīng)用的(a)化合物I或其可藥用的鹽，尤其是其單甲磺酸鹽形式，和(b)至少一種選自丁酸鈉、MS-275(之前被稱為MS-27-275)、辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)、aphacidin、縮肽、FK228(之前被稱為FR901228)、曲古抑菌素A、化合物II和化合物III的組蛋白脫乙酰基酶抑制劑，其中活性成分在各種情況中以游離形式或可藥用鹽的形式存在，并且該組合任選地包含至少一種可藥用的載體。
本發(fā)明涉及一種組合，如一種聯(lián)合制劑或藥物組合物，其包含用于同時(shí)、獨(dú)立或相繼應(yīng)用的(a)化合物I或其可藥用的鹽，尤其是其單甲磺酸鹽的形式，和(b)至少一種選自丁酸鈉、MS-275(之前被稱為MS-27-275)、辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)、aphacidin、縮肽、FK228(之前被稱為FR901 228)、化合物II和化合物III的組蛋白脫乙?；敢种苿渲谢钚猿煞衷诟鞣N情況中以游離形式或其可藥用鹽的形式存在，并且該組合任選地包含至少一種可藥用的載體。
當(dāng)在本發(fā)明的組合中所用的組合伴侶以市售的單一藥物進(jìn)行應(yīng)用時(shí)，如果在這里沒有另外提及，則其給藥劑量和給藥方式可以根據(jù)各市售藥物包裝說明書上所提供的信息來進(jìn)行以產(chǎn)生這里所述的有益作用。
以上所列舉專利的終產(chǎn)品、藥物制劑和權(quán)利要求的主題在這里被引入作為參考。同樣包括其中所公開的相應(yīng)立體異構(gòu)體以及相應(yīng)晶體變型，例如溶劑化物和多晶型。如果沒有特別提及，則在這里所公開的組合中用作活性成分的化合物可以分別如所列舉的文件中所述的那樣來進(jìn)行制備和給藥。
應(yīng)當(dāng)清楚的是，涉及組合伴侶(a)和(b)時(shí)還意味著包括可藥用的鹽。如果這些組合伴侶(a)和(b)具有，例如，至少一個(gè)堿性中心，其可以形成酸加成鹽。如果需要的話，還可以形成具有另外存在的堿性中心的相應(yīng)的酸加成鹽。該具有酸性基團(tuán)(例如COOH)的組合伴侶(a)和(b)還可以與堿形成鹽。該組合伴侶(a)或(b)或其可藥用的鹽還可以以水合物的形式使用或者包括用于結(jié)晶的其它溶劑。
這里所用的術(shù)語“聯(lián)合制劑”尤其定義的是“成套的藥盒(kit-of-parts)”，它的意思是指例如，上面所定義的組合伴侶(a)和(b)可以獨(dú)立地給藥或者可以通過使用具有不同量組合伴侶(a)和(b)的不同固定組合來進(jìn)行給藥，即，可以同時(shí)給藥或在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行給藥。成套藥盒的各部分可例如同時(shí)施用或按時(shí)間順序交錯(cuò)施用，也就是說在不同時(shí)間點(diǎn)以相同或不同的時(shí)間間隔施用成套藥盒的任何部分。特別優(yōu)選所選擇的時(shí)間間隔可以使各部分的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)所治療疾病的效果大于僅使用該組合伴侶(a)和(b)中的任何一種所獲得的效果。在聯(lián)合制劑中用于進(jìn)行給藥的組合伴侶(a)與組合伴侶(b)的總量的比例可以進(jìn)行變化，例如，為了符合所治療的患者亞人群的需要或單個(gè)患者的需要(這些患者由于年齡、性別、體重等的不同而具有不同的需要)而進(jìn)行變化。優(yōu)選至少可以獲得一種有益效果，例如組合伴侶(a)和(b)的作用相互增強(qiáng)，特別是具有協(xié)同作用，例如高于相加的作用、額外增加的有利作用、較少的副作用、增強(qiáng)效力的作用，即以組合伴侶(a)和(b)中一種或兩種的非有效劑量獲得聯(lián)合治療效果，并且十分優(yōu)選組合伴侶(a)和(b)具有強(qiáng)的協(xié)同作用。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用一種包含作為組合伴侶的(a)化合物I和(b)選自丁酸鈉、MS-275(之前被稱為MS-27-275)、辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)、aphacidin、縮肽、FK228(之前被稱為FR901228)、曲古抑菌素A、SAHA、化合物II和化合物III的組蛋白脫乙酰基酶抑制劑的組合對(duì)白血病、特別是對(duì)化合物I有抗藥性的白血病進(jìn)行治療。該組蛋白脫乙?；敢种苿﹥?yōu)選地選自丁酸鈉、SAHA、化合物II和化合物III。
包含(a)化合物I或其可藥用的鹽，尤其是其單甲磺酸鹽的形式，和(b)選自丁酸鈉、MS-275(之前被稱為MS-27-275)、辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)、aphacidin、縮肽、FK228(之前被稱為FR901228)、曲古抑菌素A，優(yōu)選選自SAHA、丁酸鈉、化合物II和化合物III的組蛋白脫乙酰基酶抑制劑(其中在各種情況中活性成分以游離形式或可藥用鹽的形式存在)、以及任選的至少一種可藥用的載體的組合在下文中將被稱為本發(fā)明的組合。
包含(a)化合物I或其可藥用的鹽，尤其是其單甲磺酸鹽形式，和(b)選自丁酸鈉、MS-275(之前被稱為MS-27-275)、辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)、aphacidin、縮肽、FK228(之前被稱為FR901228)，優(yōu)選選自SAHA、丁酸鈉、化合物II和化合物III的組蛋白脫乙?；敢种苿?其中在各種情況中活性成分以游離形式或可藥用鹽的形式存在)、以及任選的至少一種可藥用的載體的組合在下文將被稱為本發(fā)明的組合。
本發(fā)明的組合抑制了白血病例如CML、對(duì)化合物I有抗藥性的白血病的發(fā)展。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用本發(fā)明的組合進(jìn)行治療的增殖性疾病是白血病，尤其是Bcr/Abl+白血病并且優(yōu)選對(duì)化合物I有抗藥性的白血病。
更令人吃驚的是，經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與僅使用本發(fā)明組合中所用藥學(xué)活性成分中的一種的單一治療相比，本發(fā)明組合的體內(nèi)給藥不僅產(chǎn)生了更有益的作用，尤其是協(xié)同作用，例如抗增生作用，例如就延遲增殖性疾病進(jìn)程或改變腫瘤體積而言的作用，而且還產(chǎn)生了令人吃驚的有益作用，例如副作用較少和死亡率以及發(fā)病率降低。本發(fā)明的組合特別適用于治療難以用稱為抗癌劑的化療劑進(jìn)行治療的增殖性疾病或難以用化合物I進(jìn)行治療的增殖性疾病。
一種另外的益處是本發(fā)明的組合可以使用更低的活性成分劑量，例如，該劑量不僅常常更低，而且使用的頻率也更低，或者可以用于減少副作用如例如可以減少單獨(dú)使用該組合伴侶中的一種時(shí)所觀察到的腹瀉或惡心的發(fā)生率。其與被治療患者的要求和需要相一致。
通過所確定的試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢宰C實(shí)，本發(fā)明的組合產(chǎn)生了上文所描述的有益作用。相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員完全能選擇相關(guān)的試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠碜C明該類有益作用。例如可以用臨床研究或基本如下文所述的試驗(yàn)方法來證明本發(fā)明組合的藥理學(xué)活性。
適宜的臨床研究特別是用患有晚期疾病的癌癥患者進(jìn)行的隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的平行研究。該類研究特別適用于將使用活性成分進(jìn)行的單一治療和使用本發(fā)明的組合進(jìn)行的治療的作用進(jìn)行比較，并且特別適于證明本發(fā)明的組合的活性成分的協(xié)同作用。該類研究中的主要終點(diǎn)可以是對(duì)疼痛得分、止痛劑應(yīng)用、行為狀態(tài)、生命質(zhì)量得分或到疾病發(fā)展的時(shí)間的影響。通過規(guī)律的時(shí)間周期，例如每隔4、6或8周對(duì)腫瘤進(jìn)行評(píng)估是一種確定本發(fā)明的組合的作用的適宜方法。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種包含治療增殖性疾病聯(lián)合有效量的本發(fā)明組合的藥物組合物。在這種組合物中，組合伴侶(a)和(b)可以可以以一種聯(lián)合的單位劑型的形式或以兩個(gè)獨(dú)立的單位劑型的形式一起給藥、一個(gè)接一個(gè)的給藥或者獨(dú)立給藥。該單位劑型還可以是一種固定組合。
本發(fā)明的藥物組合物可以用本身已知的方法來進(jìn)行制備并且適于腸內(nèi)給藥如口服或直腸給藥、或胃腸外給藥于包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物(溫血?jiǎng)游?，其可僅包含治療有效量的至少一種藥理學(xué)活性的組合伴侶或可以還包含一種或多種可藥用的載體，尤其是適于腸內(nèi)或胃腸外給藥的載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以將一種或多種活性成分靜脈內(nèi)給藥。
例如，該新型藥物組合物可包含約10％至約100％，優(yōu)選約20％至約60％所說的活性成分。用于進(jìn)行腸內(nèi)或胃腸外給藥的聯(lián)合治療的藥物制劑是，例如，單位劑型如糖衣片、片劑、膠囊或栓劑，并且還可以是安瓿劑。如果沒有特定提及，則其可以用本身已知的方法來進(jìn)行制備，例如可以通過常規(guī)混合、制粒、包糖衣、溶解或冷凍干燥方法來進(jìn)行制備。應(yīng)當(dāng)意識(shí)到在各劑型的各劑量中所包含的組合伴侶的單位含量本身不一定構(gòu)成有效量，這是因?yàn)榭梢酝ㄟ^使用多個(gè)劑量單位來達(dá)到所必需的有效量。
本發(fā)明組合的各組合伴侶的治療有效量特別是可以同時(shí)或以任何次序相繼給藥，并且所說的組分可以獨(dú)立給藥或以固定組合的形式進(jìn)行給藥。例如，本發(fā)明延遲增殖性疾病的進(jìn)程或?qū)υ鲋承约膊∵M(jìn)行治療的方法可以包括(i)施用游離或可藥用鹽形式的第一種組合伴侶和(ii)施用游離或可藥用鹽形式的第二種組合伴侶，(i)和(ii)可以同時(shí)進(jìn)行或以任何次序相繼進(jìn)行，其是以聯(lián)合治療有效量，優(yōu)選以協(xié)同有效量，例如以與這里所述的量相一致的日劑量進(jìn)行的。在治療過程中，本發(fā)明組合的各組合伴侶可以以分割或單一組合形式在不同的時(shí)間點(diǎn)獨(dú)立給藥或同時(shí)給藥。此外，術(shù)語給藥還包括使用在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化成該類組合伴侶的組合伴侶的前體藥物。因此，本發(fā)明應(yīng)被理解為包含所有該類同時(shí)或交替治療方案并且術(shù)語“給藥”也具有相應(yīng)解釋。
本發(fā)明的組合中所用各組合伴侶的有效劑量可以根據(jù)所用的特定化合物或藥物組合物、給藥方式、被治療的病癥、被治療病癥的嚴(yán)重程度而變化。因此，可以根據(jù)包括給藥途徑和患者的腎和肝功能在內(nèi)的各種因素來對(duì)本發(fā)明組合的劑量方案進(jìn)行選擇。普通的醫(yī)師、臨床醫(yī)師或獸醫(yī)可以容易地決定和給出用于預(yù)防、反轉(zhuǎn)或抑制疾病進(jìn)程所需單個(gè)活性成分的有效量。獲得位于可產(chǎn)生效力而不會(huì)產(chǎn)生毒性范圍內(nèi)的活性成分濃度的最佳精度需要一種以靶部位對(duì)活性成分利用度的動(dòng)力學(xué)為基礎(chǔ)的方案。這需要考慮活性成分的分布、平衡和消除。
119.5mg化合物I單甲磺酸鹽相當(dāng)于100mg作為活性物質(zhì)的化合物I(游離堿)。根據(jù)種屬、年齡、個(gè)體情況、給藥方式以及所討論的臨床現(xiàn)象，將例如相當(dāng)于約50至1000mg的每日劑量、例如50至800mg的活性物質(zhì)，優(yōu)選50至600mg，例如50至400mg的有效量的化合物I給藥于約70kg體重的溫血?jiǎng)游?。?duì)于患有白血病的成人患者而言，推薦每天400mg的起始劑量。對(duì)于被評(píng)估為用400mg每天治療后響應(yīng)不足的患者而言，可以考慮安全地增加劑量并且只要其可以從治療受益并且不存在限制治療的毒性，患者就可以繼續(xù)進(jìn)行治療。
本發(fā)明還涉及一種給患有白血病的人類個(gè)體施用本發(fā)明的組合的方法，其中將藥學(xué)有效量的化合物I或其可藥用的鹽在超過3個(gè)月的時(shí)期內(nèi)每天給藥于所說的人類個(gè)體。本發(fā)明尤其涉及其中被給藥活性物質(zhì)的日劑量為50至800mg，尤其是50至600mg，例如50至400mg的該類方法。
當(dāng)本發(fā)明的組合中所用的組合伴侶以市售單一藥物的形式進(jìn)行應(yīng)用時(shí)，如果沒有特別提及，則可以根據(jù)各市售藥物包裝傳單上所提供的信息來進(jìn)行給藥以產(chǎn)生這里所述的有益作用。
本發(fā)明的組合可以是聯(lián)合制劑或藥物組合物。
此外，本發(fā)明還涉及一種對(duì)患有白血病的溫血?jiǎng)游镞M(jìn)行治療的方法，其包括以對(duì)增殖性疾病聯(lián)合治療有效量給所說的動(dòng)物施用本發(fā)明的組合并且其中所說的組合伴侶還可以以其可藥用鹽的形式存在。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在該類方法中將本發(fā)明的組合與止瀉劑一起給藥。此外，該治療還可以包含手術(shù)、放療、冷療法和免疫療法。
本發(fā)明還涉及一種抑制患有白血病的溫血?jiǎng)游镄纬赊D(zhuǎn)移瘤的方法，其包括給該患者施用藥學(xué)有效量的本發(fā)明的組合，所說的有效量可以聯(lián)合對(duì)所說的白血病進(jìn)行有效治療，并且其中所說的化合物還可以以其可藥用鹽的形式存在。
本發(fā)明涉及本發(fā)明的組合用于治療白血病，例如對(duì)化合物I有抗藥性的白血病的應(yīng)用以及用于制備治療白血病的藥物的應(yīng)用。
此外，本發(fā)明還涉及化合物I或其可藥用的鹽相結(jié)合用于制備治療白血病的藥物的應(yīng)用。
此外，本發(fā)明還提供了一種包含作為活性成分的本發(fā)明的組合以及說明用于同時(shí)、單獨(dú)或相繼用其來治療白血病，例如CML、對(duì)化合物I有抗藥性的白血病的說明的商品化包裝。
本發(fā)明優(yōu)選地涉及一種對(duì)患有增殖性疾病，優(yōu)選Bcr/Abl+人髓細(xì)胞性白血病的溫血?jiǎng)游镞M(jìn)行治療的方法，其包括給所說的動(dòng)物施用包含對(duì)所說的增殖性疾病聯(lián)合治療有效量的(a)化合物I，尤其是其單甲磺酸鹽形式，和(b)選自SAHA、丁酸鈉、化合物II和化合物III的組蛋白脫乙?；敢种苿┑慕M合，其中所說的化合物可以以其可藥用鹽的形式存在。
本發(fā)明優(yōu)選地涉及包含(a)化合物I或其可藥用的鹽，尤其是其單甲磺酸鹽的形式，和(b)選自SAHA、丁酸鈉、如本文中所述的化合物II和化合物III的組蛋白脫乙?；敢种苿┑慕M合用于制備治療增殖性疾病、優(yōu)選Bcr/Abl+人髓細(xì)胞性白血病、最優(yōu)選對(duì)化合物I有抗藥性的Bcr/Abl+人髓細(xì)胞性白血病的藥物的應(yīng)用。
實(shí)施例1 材料和方法 細(xì)胞K562、HL60、Jurkat和U937人白血病細(xì)胞購自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD。LAMA 84細(xì)胞購自德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(Braunschweig，Germany)。將所有的細(xì)胞在補(bǔ)加了丙酮酸鈉、MEM必需維生素、L-谷氨酸鹽、青霉素、鏈霉素和10％熱滅活FCS(Hyclone，Logan，UT)的RPMI 1640中進(jìn)行培養(yǎng)。將其維持在37℃，5％CO2，完全潮濕的培養(yǎng)器中，每周傳代兩次，并且當(dāng)在對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)(細(xì)胞密度≤4×105細(xì)胞/ml)時(shí)制備用于試驗(yàn)方法的物質(zhì)。
多重耐藥的K562R細(xì)胞按照文獻(xiàn)中的描述(Yanovich等人，Cancer Res1989，494499-4503)通過在逐漸增加的阿霉素濃度下傳代培養(yǎng)而由親本母系獲得。在所有的試驗(yàn)操作之前將其在不存在阿霉素的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。此外，通過將LAM 84細(xì)胞在逐漸升高的化合物I濃度下進(jìn)行培養(yǎng)來產(chǎn)生被稱為L(zhǎng)AMA 84-R的對(duì)化合物I有抗藥性的LAMA 84細(xì)胞。將這些細(xì)胞在所選擇的壓力下維持在包含0.5μM化合物I的培養(yǎng)基中?；衔颕對(duì)于LAMA-S-571和LAMA-R-571的I.C.50值分別為0.3和1.8μM。對(duì)于涉及LAMA 84-R系的研究而言，將細(xì)胞洗去藥物并在實(shí)驗(yàn)前48小時(shí)將其重新混懸于不含藥物的培養(yǎng)基中。
試劑將化合物I在無菌DMSO(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)中制備成的10mM儲(chǔ)備液形式。丁酸鈉和SAHA由Calbiochem，San Diego，CA提供；BOC-fmk和IETD-fmk購自Enzyme Products，Ltd.，Livermore，CA，并且在使用前在無菌DMSO中對(duì)其進(jìn)行配制。
實(shí)驗(yàn)形式將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞放到無菌的塑料T-燒瓶(Corning，Corning，NY)中，向其中加入所指定的藥物并將該燒瓶放回到培養(yǎng)器中放置一定時(shí)間。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，通過在室溫下在400xg下離心10分鐘來使其成團(tuán)，并且如下所述進(jìn)行制備以用于分析。
細(xì)胞凋亡的評(píng)估按照文獻(xiàn)中的描述(Yu等人，Nat.Rev.Cancer1294-202)，在與藥物進(jìn)行接觸后，將細(xì)胞離心制備物用Wright-Giemsa染色并通過光學(xué)顯微鏡觀察來對(duì)細(xì)胞凋亡(即，細(xì)胞皺縮、核聚集、形成凋落小體等等)的程度進(jìn)行評(píng)估。對(duì)于這些研究而言，通過在各種情況中一式三份地對(duì)≥500個(gè)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)估來測(cè)定細(xì)胞凋亡細(xì)胞的百分比。為了確認(rèn)形態(tài)學(xué)分析的結(jié)果，使用膜聯(lián)蛋白V/PI染色。細(xì)胞死亡的膜聯(lián)蛋白V/PI(BDPharMingen，San Diego，CA)分析是根據(jù)制造商的指導(dǎo)來進(jìn)行的。在涉及TNF和TNF可溶性受體的研究中，將兩種化合物相聯(lián)合并在使用前將其在室溫下維持30分鐘。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)而言，每一種情況收獲1-2×105個(gè)細(xì)胞。用Becton-Dickinson FACScan細(xì)胞熒光計(jì)(Mansfield，MA)來進(jìn)行分析。為了確認(rèn)該形態(tài)學(xué)結(jié)果，使用TUNEL染色法。對(duì)于TUNEL染色法而言，獲得細(xì)胞離心制備物并將其用4％甲醛固定。將載玻片用醋酸/乙醇(1∶2)進(jìn)行處理，用包含1×末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)緩沖液(0.25個(gè)單位/μl末端轉(zhuǎn)移酶，2.5mM CoCl2，和2pmol熒光素-12-dUTP；Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)的末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)混合物來染色，并用熒光顯微鏡來進(jìn)行目測(cè)檢驗(yàn)。
MMP(ΔΨm)的測(cè)定用DiOC6[36]來對(duì)MMP進(jìn)行監(jiān)測(cè)。對(duì)于各種情況而言，將4×105個(gè)細(xì)胞在37℃下在1ml 40nM DiOC6(Calbiochem)中培養(yǎng)15分鐘，隨后，用分別具有488和525nM的激發(fā)和發(fā)射裝置的Becton DickinsonFACScan細(xì)胞熒光計(jì)對(duì)其進(jìn)行分析。通過使細(xì)胞與5μM氨基甲?；杌镩g-氯苯腙——一種消除MMP的解偶聯(lián)劑(Sigma Chemical Co.；15分鐘，37℃)進(jìn)行接觸來進(jìn)行證明ΔΨm的損失的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
S-100級(jí)分的制備和細(xì)胞色素C釋放的評(píng)估在按照文獻(xiàn)中的描述(Yu等人，2001，BBRC 2861011-18)進(jìn)行藥物處理后通過在4℃下在600xg下離心10分鐘并用PBS進(jìn)行洗滌來收獲U937細(xì)胞。通過在100μl包含75mM NaCl，8mM Na2HPO4，1mM NaH2PO4，1mM EDTA和350μg/ml洋地黃皂甙的細(xì)胞溶解緩沖液中培養(yǎng)3分鐘來使細(xì)胞(4×106)溶解。將該溶解產(chǎn)物在12,000xg下離心5分鐘，收集上清液并將其加入到等體積的2xLAEMMLI緩沖液中。用15％SDS-PAGE對(duì)該蛋白樣品進(jìn)行定量和分離。
免疫印跡分析免疫印跡按照文獻(xiàn)中的描述(Yu等人，Nat.Rev.Cancer1294-202)來進(jìn)行。簡(jiǎn)單地說，在藥物處理后，通過離心使細(xì)胞沉積，然后立即將其溶解于Laemmli緩沖液[1X＝30mM Tris-堿(pH 6.8)，2％SDS，2.88mM Best wishes，β-巰基乙醇，和10％甘油]中，并將其進(jìn)行簡(jiǎn)短的聲處理。用Coomassie蛋白分析試劑(Pierce，Rockford，IL)對(duì)勻漿定量。將等量的蛋白(20μg)煮沸10分鐘，用SDS-PAGE(5％堆疊劑(stacker)和10％解析)分離，并電轉(zhuǎn)染至硝酸纖維素膜。在將其在22℃下在TBS-T(0.05％)和5％牛奶中阻斷1小時(shí)后，將這些印跡在22℃下在具有適宜稀釋度一級(jí)抗體的新鮮阻斷溶液中培養(yǎng)4小時(shí)?？贵w的來源如下Bcl-xL，兔多克隆，Santa Cruz Biotechnology；XIAP，兔多克隆，R&D Systems，Minneapolis，MN；Mcl-1，小鼠單克隆Pharmingen，San Diego，CA；細(xì)胞周期蛋白D1，小鼠單克??；p21，小鼠單克隆，Pharmingen；ERK 1/2，兔多克隆，細(xì)胞信號(hào)技術(shù)，Beverly，MA；磷酸-ERK 1/2(thr202/tyr204)，兔多克隆，細(xì)胞信號(hào)技術(shù)；JNK，兔多克隆，Santa Cruz Biotechnology；磷酸-JNK，小鼠單克隆，Santa Cruz Biotechnology；磷酸-p38 MAPK，兔多克隆，細(xì)胞信號(hào)技術(shù)；磷酸-p70S6K(421/424)，兔多克隆，細(xì)胞信號(hào)技術(shù)；磷-STAT5，細(xì)胞信號(hào)技術(shù)；pRB，小鼠單克隆，Pharmingen；次-磷酸-RB，小鼠單克隆，PharMingen；半胱天冬酶3，小鼠單克隆，Transduction Laboratories，Lexington，KY；PARP(C-2-10)，小鼠單克隆，BioMol ResearchLaboratories，Plymouth，MA；細(xì)胞色素c，小鼠單克隆，Santa CruzBiotechnology；AIF，小鼠單克隆，Santa Cruz Biotechnology；Smac，兔多克隆，Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY；半胱天冬酶8，兔多克隆，Pharmingen；和α-微管蛋白，Calbiochem。將這些印跡在TBS-T中洗滌3×15分鐘，然后將其用1∶2000稀釋度的辣根過氧化物酶-軛合的二級(jí)抗體(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)在22℃下培養(yǎng)1小時(shí)。將這些印跡再在TBS-T中洗滌3×15分鐘，然后通過增強(qiáng)的化學(xué)熒光(Pierce，Rockford，IL)來顯影。
分化研究 K562細(xì)胞紅細(xì)胞系統(tǒng)的成熟分析按照文獻(xiàn)中的描述(Yang等人，J.Biol.Chem.2001，27625742-52)通過監(jiān)測(cè)血紅蛋白的產(chǎn)生來進(jìn)行。
克隆存活用文獻(xiàn)中描述的克隆試驗(yàn)(Yu等人，Mol.Pharmacol.2001，60143-54)來測(cè)定藥物處理對(duì)白血病細(xì)胞克隆存活的作用。
瞬間轉(zhuǎn)染在人巨細(xì)胞病毒(CMV)即刻-早期(immediate-early)啟動(dòng)子(pEGFP-C2)的轉(zhuǎn)錄控制下編碼增強(qiáng)的綠熒光蛋白的質(zhì)粒和HA-標(biāo)記的活化MEK1(在pUSEEamp中的S218D/S222D)分別得自ClontechLaboratories(Palo Alto，CA)和Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY)。包含該MEK1 cDNA的1285-bp片斷是通過Apa I和部分EcoR I消化獲得的并且被框內(nèi)(in-frame)插入到pEGFP-C2的(C-末端)多克隆位點(diǎn)中。對(duì)位于該融合構(gòu)建體內(nèi)的整個(gè)MEK1 cDNA定序并確定讀碼框。將Log期的K562細(xì)胞在電穿孔低滲緩沖液(Eppendorf)中用BTX electromanipulator600進(jìn)行轉(zhuǎn)染。對(duì)于各種情況而言使用20μgDNA和2.0×107個(gè)細(xì)胞。在培養(yǎng)12小時(shí)后，20％至30％的細(xì)胞表現(xiàn)出綠色熒光。用Cytomation MoFLO細(xì)胞分離器通過熒光-活化細(xì)胞分類(FACS)將整個(gè)細(xì)胞群體中最亮的10％至20％的細(xì)胞分離出來。然后使該細(xì)胞與指定的藥物進(jìn)行接觸，并且如上所述對(duì)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)跡象進(jìn)行檢查。
統(tǒng)計(jì)分析用雙側(cè)學(xué)生t檢驗(yàn)來測(cè)定實(shí)驗(yàn)條件之間差異的顯著性。按照文獻(xiàn)中的描述(Yu等人，2002，Cancer Res.62188-189)用中間劑量作用(Median Dose Effect)分析(Chou和Talalay，1984，Adv.Enz.Regul.2227-55)與可以通過商業(yè)途徑獲得的軟件程序(Calcysyn；Biosoft；Ferguson，MO)一起來對(duì)協(xié)同作用和結(jié)抗作用進(jìn)行分析。
結(jié)果 為了對(duì)化合物I和SAHA在K562細(xì)胞中的相互作用進(jìn)行描述，進(jìn)行劑量響應(yīng)研究。濃度高達(dá)300nM的化合物I與細(xì)胞接觸24小時(shí)幾乎不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而2.0μM SAHA單獨(dú)給藥也具有最小的毒性。但是，當(dāng)細(xì)胞與和100nM化合物I聯(lián)用的SAHA接觸時(shí)，觀察到細(xì)胞凋亡明顯增加(即，～20％)，并且對(duì)于濃度為250nM的化合物I而言，絕大多數(shù)細(xì)胞(即，～75％)發(fā)生細(xì)胞凋亡(表1A)。化合物I(nM)SAHA(μM) 0 2 0 0.6±0.3 3.2±1.1 100 1.1±0.5 20.4±3.2 150 1.3±0.6 34.5±3.8 200 1.6±0.6 44.6±4.1 250 2.8±1.2 65.3±4.3 300 6.3±2.1 71.2±4.8 表1A將K562細(xì)胞與和指定濃度的化合物I聯(lián)用的2.0μM SAHA接觸，然后按照“方法”部分的描述通過Wright Giemsa-染色樣品的形態(tài)學(xué)分析來對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
同樣，當(dāng)細(xì)胞與和濃度增加的SAHA聯(lián)用的250nM化合物I接觸24小時(shí)后，在1.0μM SAHA時(shí)注意到細(xì)胞凋亡急劇增加，并且在1.5μM的SAHA濃度下，大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡(表1B)。 SAHA(μM) 化合物I(nM) 0 250nM 0 0.6±0.2 2.7±1.2 1 0.8±0.4 21.4±3.2 1.5 1.6±0.7 52.3±4.3 2.0 2.7±0.7 64.5±4.5 2.5 14.5±1.3 68.9±4.7 3.0 28.4±3.2 77.8±5.1 表1B.將細(xì)胞與和指定濃度SAHA聯(lián)用的250nM化合物I接觸24小時(shí)，然后如上所述對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行評(píng)估。對(duì)于A和B而言，這些值表示三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±S.D.。
在一定的化合物I和SAHA濃度范圍內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的中等劑量作用分析產(chǎn)生了低于1.0的聯(lián)合指數(shù)(CI)值，其與協(xié)同相互作用相一致(表1C)。SAHA(mM)化合物I(nM)聯(lián)合指數(shù)(CI)作用分?jǐn)?shù) 1.0 125 0.787 0.184 1.5 187.5 0.762 0.406 2.0 250 0.792 0.623 2.5 312.5 0.834 0.727 3.0 375 0.794 0.893 表1C.將K562細(xì)胞與固定比例(10∶1)的各種濃度的SAHA和化合物I接觸24小時(shí)，然后用中等劑量作用分析測(cè)定在作用分?jǐn)?shù)(FA)方面對(duì)細(xì)胞凋亡的聯(lián)合指數(shù)(CI)值進(jìn)行測(cè)定。CI值＜1.0相當(dāng)于協(xié)同相互作用。兩種另外的研究產(chǎn)生了相似的結(jié)果。
如TUNEL-染色細(xì)胞的顯微照片(未表示出來)所示的，與K562細(xì)胞與不含藥物的培養(yǎng)基；SAHA 2.0μM(24小時(shí))；化合物I250nM接觸(24小時(shí))相比，K562細(xì)胞與250nM化合物I+2.0μM SAHA接觸24小時(shí)時(shí)細(xì)胞凋亡顯著增加。
進(jìn)行K562細(xì)胞與250nM化合物I±2.0μM SAHA接觸的時(shí)間過程研究。雖然將這些物質(zhì)各自獨(dú)立給藥在48小時(shí)最低程度地誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，但聯(lián)合治療使得細(xì)胞凋亡增加，在最初12小時(shí)內(nèi)就觀察到這種增加，其在24小時(shí)時(shí)達(dá)到幾乎最大水平。在聯(lián)合治療后48小時(shí)，90％以上的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡(表2A)。小時(shí) 對(duì)照 SAHA 化合物I SAHA+化合物I 0 0.6±0.2 0.6±0.2 0.6±0.2 0.6±0.3 6 0.6±0.3 0.9±0.2 1.1±0.5 6.7±0.8 12 0.6±0.2 1.7±0.5 2.1±0.8 13.7±2.1 18 0.6±0.2 2.3±0.8 3.3±1.0 35.4±3.8 24 0.6±0.3 3.5±1.1 3.5±1.2 65.5±4.8 48 0.6±0.3 14.8±2.1 21.8±3.4 86.3±5.9 表2A將K562細(xì)胞與2.0μM SAHA±250nM化合物I接觸所標(biāo)明的時(shí)間，其后如“方法”部分所述測(cè)定發(fā)生細(xì)胞凋亡細(xì)胞的百分比。
當(dāng)監(jiān)測(cè)線粒體膜電位降低(ΔΨΘm)時(shí)觀察到相似的結(jié)果，但是化合物I本身在這一點(diǎn)上在接觸48小時(shí)后的毒性略微更高(表2B)。小時(shí) 對(duì)照 SAHA 化合物I SAHA+化合物I 0 5.3±1.8 5.4±1.6 5.7±1.8 5.6±1.7 6 5.8±1.7 8.1±1.9 8.8±1.9 16.5±2.1 12 6.1±1.8 10.4±2.1 11.2±2.1 24.6±3.4 18 5.2±1.6 12.3±2.8 11.9±2.3 45.8±3.8 24 6.4±1.8 16.4±2.9 17.8±3.4 65.8±4.5 48 5.9±1.7 20.5±2.8 41.3±4.3 87.2±5.8 表2B將K562細(xì)胞與2.0μM SAHA±250nM化合物I接觸所示的時(shí)間間隔，然后按照“方法”部分的描述對(duì)表現(xiàn)出線粒體膜電位降低(ΔΨm)的細(xì)胞百分比進(jìn)行測(cè)定。
這些結(jié)果一起表明使用化合物I和HDI SAHA進(jìn)行的聯(lián)合治療使得較早地誘導(dǎo)了Bcr/Abl+K562細(xì)胞中的線粒體損傷和細(xì)胞凋亡。
為了測(cè)定用化合物I和HDI聯(lián)合處理的K562細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡增強(qiáng)是否與白血病細(xì)胞自我更新能力的降低有關(guān)，進(jìn)行克隆試驗(yàn)。盡管與250nM化合物I或2.0μM SAHA單獨(dú)接觸24小時(shí)時(shí)大大減少了克隆發(fā)生(即至對(duì)照值的～25％)，但聯(lián)合治療對(duì)集落形成產(chǎn)生了高于2-log的降低(表2C)?？寺〈婊?％對(duì)照)SAHA 21.8±3.6化合物I 22.4±4.5SAHA+化合物I 0.42±0.2 表2C將細(xì)胞用2.0μM SAHA±250nM化合物I處理24小時(shí)，將藥物洗滌掉，并按照“方法”部分的描述將其涂布到軟瓊脂上。在12天培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，對(duì)集落評(píng)分并將存活表示為相對(duì)于未進(jìn)行處理的對(duì)照而言的百分比。
因?yàn)橐呀?jīng)證實(shí)化合物I和HDI如丁酸鹽都可以誘導(dǎo)Bcr/Abl+細(xì)胞中的成熟，所以試圖測(cè)定是否與該類物質(zhì)的聯(lián)合接觸將導(dǎo)致K562細(xì)胞分化增加。為此，對(duì)用SAHA±化合物I進(jìn)行處理的K562細(xì)胞中的血紅蛋白(Hgb)生產(chǎn)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。使K562細(xì)胞與2.0μM SAHA±250nM化合物I接觸所標(biāo)明的時(shí)間，然后按照“方法”部分的描述對(duì)細(xì)胞內(nèi)的Hgb水平進(jìn)行定量來對(duì)細(xì)胞分化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在各種情況中，這些值表示三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±S.D.。在接觸24小時(shí)后，用SAHA處理的細(xì)胞在Hgb生成方面表現(xiàn)出顯著(即～50％)增加，而化合物I在這方面的作用較差。但是，同時(shí)用兩種物質(zhì)進(jìn)行了處理的細(xì)胞并沒有表現(xiàn)出Hgb水平增加。在48小時(shí)后，用SAHA-和化合物I-處理的細(xì)胞在Hgb生產(chǎn)方面都表現(xiàn)出顯著增加。但是，在與兩種物質(zhì)同時(shí)進(jìn)行接觸的細(xì)胞(這時(shí)其發(fā)生大量細(xì)胞凋亡)中的Hgb水平比對(duì)照低(數(shù)據(jù)未表示出來)。這些結(jié)果表明用化合物I和SAHA對(duì)Bcr/Abl+K562細(xì)胞進(jìn)行共同處理不會(huì)促進(jìn)分化，而是表明在這些條件下發(fā)生的廣泛的細(xì)胞凋亡反而阻止了這種過程。
然后，在線粒體損傷、半胱天冬酶活化和細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白表達(dá)方面對(duì)將K562細(xì)胞與SAHA和化合物I聯(lián)合接觸24小時(shí)的作用進(jìn)行監(jiān)測(cè)。使K562細(xì)胞與2.0μM SAHA±250nM化合物I接觸24小時(shí)，其后，用Western分析對(duì)AIF、Smac/DIABLO和細(xì)胞色素C向S-100細(xì)胞溶質(zhì)部分中的釋放進(jìn)行評(píng)估，并對(duì)整個(gè)細(xì)胞提取物在裂解下來的半胱天冬酶9、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8、PARP和Bcr/Abl的表達(dá)方面進(jìn)行分析。各泳道包含25μg蛋白；將這些印跡剝離下來并對(duì)微管蛋白進(jìn)行再探察以確保等量填充和轉(zhuǎn)移。兩項(xiàng)另外的研究產(chǎn)生了相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果?；衔颕(250nM)或SAHA(2.0μM)各自的作用最小，而細(xì)胞與這些物質(zhì)的聯(lián)合接觸使得釋放進(jìn)入到細(xì)胞溶質(zhì)的S-100細(xì)胞級(jí)分中的細(xì)胞色素c、AIF，和Smac/DIABLO顯著增加。這些活動(dòng)伴隨著半胱天冬酶-9裂解和半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8以及PARP降解的顯著增加。有趣地是，雖然單獨(dú)治療具有很小的作用，但是與化合物I和SAHA的聯(lián)合接觸使得Bcr/Abl蛋白水平顯著下降(數(shù)據(jù)未表示出)。因此，用亞毒性濃度的化合物I與HDISAHA一起對(duì)Bcr/Abl+細(xì)胞進(jìn)行的處理使得細(xì)胞凋亡前線粒體蛋白的釋放、半胱天冬酶級(jí)聯(lián)的活化、和Bcr/Abl的表達(dá)降低顯著增加。
然后在對(duì)K562細(xì)胞中各種信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白的作用方面來對(duì)SAHA和化合物I之間的相互作用進(jìn)行檢測(cè)。有趣地是，僅與SAHA接觸(16小時(shí))使得Raf的表達(dá)明顯降低，而化合物I幾乎沒有作用。使K562細(xì)胞與2.0μM SAHA±250nM化合物I接觸16小時(shí)，其后，用Western分析來對(duì)Raf、磷-MEK1/2和-ERK1/2、總ERK1/2、磷-70S6K(ERK-磷酰化部位；421/424)；磷酸-JNK、磷-p38 MAPK、磷-STAT5、磷酸-Akt(423)和總Akt的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估。如上所述的那樣對(duì)K562細(xì)胞進(jìn)行處理，并且對(duì)Bcl-xL、Mcl-1和XIAP的表達(dá)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在如上所述那樣用化合物I±SAHA進(jìn)行處理后用Western分析對(duì)p21CIP1、次-磷?；痯Rb、總pRb和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。CF＝裂解碎片。各泳道包含25μg蛋白；將這些印跡剝離下來并對(duì)微管蛋白再探測(cè)以確保等量填充和轉(zhuǎn)移。兩項(xiàng)另外的研究產(chǎn)生了相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果(數(shù)據(jù)未表示出)。化合物I和SAHA的共同給藥使得Raf表達(dá)進(jìn)一步減少。在磷酸-MEK1/2和磷酸-ERK1/2的水平中觀察到幾乎平行的改變。用化合物I和SAHA進(jìn)行的聯(lián)合治療還顯著降低了ERK-結(jié)合部位(421/424)上p70S6K的磷酸化作用，并且顯著減少了磷酸-SATA5(Bcr/Abl的靶點(diǎn))的表達(dá)。在總Akt表達(dá)方面沒有注意到顯著變化，但是在同時(shí)與SAHA和化合物I都進(jìn)行接觸的細(xì)胞中觀察到磷?；?活化的)Akt適度下降。此外，雖然化合物I和SAHA各自都不能改變磷酸-JNK的表達(dá)，但是聯(lián)合治療使得JNK活化十分劇烈的增加。在用SAHA處理的細(xì)胞中觀察到p38 MAPK的磷酸化作用略微增加，但在加入化合物I時(shí)這一點(diǎn)不會(huì)發(fā)生變化。用化合物I和SAHA進(jìn)行的聯(lián)合治療不會(huì)改變抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-xL或XIAP的表達(dá)。總之，如之前所報(bào)道的那樣，僅用化合物I處理誘導(dǎo)了抗細(xì)胞凋亡蛋白Mcl-1表達(dá)的輕微降低，而加入SAHA(其本身發(fā)揮極小的作用)使得Mcl-1表達(dá)進(jìn)一步減少(數(shù)據(jù)未表示出)。
然后在一些細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)方面對(duì)SAHA和化合物I之間的相互作用進(jìn)行檢查。與在Bcr/Abl-白血病細(xì)胞中注意到的作用相似，用SAHA進(jìn)行的處理產(chǎn)生了很強(qiáng)的p21CIP1誘導(dǎo)作用。出乎意料地是，與化合物I一起進(jìn)行接觸大大減少了SAHA對(duì)p21CIP1的誘導(dǎo)。盡管存在這種作用，細(xì)胞與SAHA和化合物I聯(lián)合進(jìn)行接觸使得次-磷酰化pRb的表達(dá)適度增加，同時(shí)伴有總和次-磷?；鞍椎牧呀狻Ｗ詈螅没衔颕和SAHA一起進(jìn)行處理的K562細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞周期蛋白D1水平降低，一種以前被與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡聯(lián)系起來的現(xiàn)象。這些結(jié)果一起表明K562細(xì)胞與化合物I和SAHA進(jìn)行的共接觸擾亂了多重信號(hào)的表達(dá)、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白(包括Raf的下調(diào))，使MEK1/2、ERK1/2和p70S6K活性減弱、JNK顯著活化、Bcr/Abl、Mcl-1、p21CIP1和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)降低，以及pRb的脫磷酸化/裂解(數(shù)據(jù)未表示出來)。
為了對(duì)半胱天冬酶在這些情況中的作用進(jìn)行評(píng)估，將K562細(xì)胞在存在或不存在全-半胱天冬酶抑制劑BOC-fmk或半胱天冬酶8抑制劑IETD-fmk的情況下用化合物+SAHA處理20小時(shí)(表3)。細(xì)胞凋亡(％) 對(duì)照 0.6±0.2 SAHA+化合物I 50.1±3.9 BOC+SAHA+化合物I 9.8±2.4 IETD+SAHA+化合物I 41.5±3.2 表3將K562細(xì)胞與2.0μM SAHA+250nM化合物I在存在或不存在25μM BOC-fmk或IETD-fmk的情況下處理24小時(shí)，其后如上所述那樣對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行監(jiān)測(cè)。這些值表示三次獨(dú)立試驗(yàn)的均值±S.D.。
將細(xì)胞用SAHA+化合物I±BOC-fmk進(jìn)行處理，其后如上所述那樣對(duì)細(xì)胞色素c或Smac/DIABLO向S-100細(xì)胞溶質(zhì)部分的釋放進(jìn)行評(píng)估(未表示出)。將細(xì)胞用SAHA+化合物I±BOC-fmk進(jìn)行處理，其中用Western分析來對(duì)原半胱天冬酶(procaspase)-3、Bcr/Abl、pRb、次磷酰化pRb、Raf-1、Mcl-1、p21CIP1和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估。各泳道包含25μg蛋白；將這些印跡剝離下來并對(duì)微管蛋白再探測(cè)以確保等量填充和轉(zhuǎn)移。兩項(xiàng)另外的研究產(chǎn)生了相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果(數(shù)據(jù)未表示出來)。BOC-fmk顯著抑制了細(xì)胞凋亡，而IETD-fmk的作用最小，表明對(duì)于在這些細(xì)胞中化合物I/SAHA-介導(dǎo)的致死性的外部途徑而言具有相對(duì)較小的作用。但是，雖然BOC-fmk在阻斷細(xì)胞色素c向與化合物I+SAHA接觸的細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中的釋放方面無效，但是其大大阻斷了Smac/DIABLO釋放，表明后者代表了一種繼發(fā)的、半胱天冬酶-依賴性事件。如所預(yù)期的那樣，BOC-fmk減少了原半胱天冬酶-3以及總和次-磷酰化pRb的裂解。其還部分逆轉(zhuǎn)了化合物I/SAHA-處理細(xì)胞中Bcr/Abl表達(dá)的下調(diào)，表明了這種現(xiàn)象有依賴半胱天冬酶的成分。相反，BOC-fmk對(duì)Raf、Mcl-1、p21CIP1或細(xì)胞周期蛋白D1的下調(diào)幾乎沒有影響，表明這些事件大多不依賴于半胱天冬酶活化。在獨(dú)立的研究中，BOC-fmk的共同給藥對(duì)SAHA單獨(dú)給藥的作用沒有影響(數(shù)據(jù)未表示出來)。
為了測(cè)定化合物I和SAHA之間的協(xié)同作用是否將延續(xù)至包括其它Bcr/Abl+細(xì)胞，用LAMA 84細(xì)胞進(jìn)行了平行研究(表4)。％膜聯(lián)蛋白V/PI對(duì)照 08.2±1.8SAHA 1mM 15.2±2.4化合物I 200nM 13.4±2.3SAHA+化合物I 70.8±4.8 表4將LAMA 84細(xì)胞與200nM化合物I±1.0μM SAHA接觸24小時(shí)，其后如“方法”部分所述用流式細(xì)胞計(jì)測(cè)定膜聯(lián)蛋白V/PI+細(xì)胞的百分比(用帶有上下限的數(shù)字(gated figures)表示)。兩項(xiàng)另外的研究產(chǎn)生了相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。
LAMA 84細(xì)胞與1.0μM SAHA或200nM化合物I單獨(dú)接觸24小時(shí)對(duì)細(xì)胞死亡只發(fā)揮了微弱的作用。但是，當(dāng)將這些物質(zhì)聯(lián)用時(shí)，極大多數(shù)細(xì)胞(即，70％)發(fā)生細(xì)胞凋亡，這一點(diǎn)可以通過膜聯(lián)蛋白陽性反映出來。相反，當(dāng)將SAHA與一些Bcr/Abl-白血病細(xì)胞系(包括U937、HL-62、NB4、和Jurkat)相結(jié)合時(shí)沒有協(xié)同作用的跡象(表5)。細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的％細(xì)胞系對(duì)照 SAHA化合物I化合物I+SAHA K562 0.6±0.3 6.6±3.8 8.3±3.2 74.3±5.3 U937 0.8±0.4 5.4±1.9 0.9±08 6.2±3.0 Jurkat 0.8±0.4 6.3±3.2 1.1±0.6 7.3±2.0 NB4 1.2±0.5 5.6±2.3 1.8±1.3 8.2±2.4 HL60 2.1±0.6 6.4±1.9 3.1±1.3 11.5±3.5 表5將Bcr/Ab1+K562細(xì)胞和一些Bcr/Abl-白血病細(xì)胞系，包括U937單核細(xì)胞白血病、Jurkat成淋巴細(xì)胞白血病和NB4以及HL-60前髓細(xì)胞白血病細(xì)胞與SAHA±化合物I接觸24小時(shí)，其后，如“方法”部分所述通過檢查Wright Giemsa-染色的細(xì)胞離心涂片器載玻片來測(cè)定細(xì)胞凋亡細(xì)胞的百分比。各細(xì)胞系的濃度如下K562SAHA 2.5μM；化合物I 250nM；U937SAHA 1.5μM；化合物I 250nM；JurkatSAHA 0.75μM；化合物I250nM；NB4SAHA 1.5μM；化合物I 250nM；HL-60SAHA 1.0μM；化合物I 250nM。在各種情況中，這些值表示三次獨(dú)立試驗(yàn)的均值±S.D.。
這些結(jié)果表明SAHA和化合物I之間的協(xié)同相互作用僅限于表達(dá)Bcr/Abl蛋白的人白血病細(xì)胞。
Western分析表明LAMA 84細(xì)胞與化合物I+SAHA進(jìn)行的聯(lián)合接觸使得細(xì)胞色素c的細(xì)胞溶質(zhì)釋放顯著增加，并且導(dǎo)致半胱天冬酶-9、-3、和-8的相應(yīng)活化(數(shù)據(jù)未表示出來)。在K562細(xì)胞中得到了相一致的結(jié)果，用化合物I和SAHA聯(lián)合處理的LAMA 84細(xì)胞產(chǎn)生了Raf、p21CIP1、細(xì)胞周期蛋白D1、Mcl-1、磷酸-STAT5的下調(diào)、增強(qiáng)的次-磷酸化作用和pRb裂解，并且JNK磷酸化作用顯著增加(數(shù)據(jù)未表示出來)。
然后，試圖確定該類相互作用是否可以延展至包括除SAHA外的其它HDI。將LAMA 84細(xì)胞與200nM化合物I±1.0μM SAHA接觸24小時(shí)，其后，用Western分析來對(duì)釋放到細(xì)胞溶質(zhì)S-100部分中的細(xì)胞色素c，或在總細(xì)胞提取物中裂解的原半胱天冬酶-9、裂解的原半胱天冬酶-3、或原半胱天冬酶-8的表達(dá)進(jìn)行監(jiān)測(cè)(數(shù)據(jù)未表示出來)。CF＝裂解碎片。將LAMA細(xì)胞如上那樣進(jìn)行處理，其后對(duì)總細(xì)胞提取物的Raf1、磷酸-JNK、p21CIP1、細(xì)胞周期蛋白D1、Mcl-1和磷酸-STAT5表達(dá)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。各泳道包含25μg蛋白；將這些印跡剝離下來并對(duì)微管蛋白再探測(cè)以確保等量填充和轉(zhuǎn)移。兩項(xiàng)另外的研究產(chǎn)生了等值的結(jié)果(數(shù)據(jù)未表示出來)。
為此，將K562和LAMA 84細(xì)胞與所示濃度的化合物I在存在或不存在丁酸鈉(SB；1或2mM)的情況下接觸24小時(shí)，其后，對(duì)細(xì)胞凋亡的程度進(jìn)行評(píng)估，按照“方法”部分的描述通過檢查細(xì)胞離心涂片器載玻片來測(cè)定細(xì)胞凋亡細(xì)胞的百分比。這些值表示三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的均值±S.D.(表6)，化合物I與SB的聯(lián)合給藥使得兩種細(xì)胞系中的細(xì)胞凋亡顯著增加。 化合物I+SB細(xì)胞凋亡的細(xì)胞％對(duì)照SB化合物I SB+化合物I K562 0.6±0.3 5.1±2.2 10.3±3.6 61.2±6.2 LAMA 84 1.8±0.5 6.4±2.8 9.3±3.8 55.1±5.4 與用SAHA獲得的結(jié)果相似，致死率增加與細(xì)胞色素c向細(xì)胞溶膠中的釋放增加、原半胱天冬酶-3和一9的活化、Raf、p21CIP1、Mcl-1、細(xì)胞周期蛋白D1的下調(diào)、以及JNK的顯著活化有關(guān)(數(shù)據(jù)未表示出來)。
將化合物I與MEK1/2抑制劑或與細(xì)胞周期蛋白-依賴性激酶抑制劑flavopiridol一起給藥產(chǎn)生了表現(xiàn)出Bcr/Abl表達(dá)增加的對(duì)化合物I有抗藥性的K562細(xì)胞的致死率增加。因此，涉及化合物I/HDI方案的平行研究是用K562R細(xì)胞(得自具有多重抗藥性的細(xì)胞系)以及對(duì)化合物I有抗藥性的LAMA 84細(xì)胞(LANA 84-R)(其是通過將細(xì)胞在濃度逐漸升高的化合物I中進(jìn)行培養(yǎng)來產(chǎn)生的)進(jìn)行的(表7)?；衔颕+SAHA細(xì)胞凋亡的細(xì)胞％對(duì)照SAHA化合物I SAHA+化合物I K562R 0.9±0.4 6.8±3.5 17.6±4.5 65.3±5.2 LAMA 84R 2.2±0.9 10.3±3.4 14.8±4.7 66.2±6.1 表7將對(duì)化合物I有抗藥性的K562細(xì)胞(K562R)和對(duì)化合物I有抗藥性的LAMA 84細(xì)胞(LAMA 84R)與所示濃度的化合物I和SAHA接觸24小時(shí)，其后，按照“方法”部分的描述通過檢查Wright Giemsa-染色的細(xì)胞離心涂片器載玻片來測(cè)定細(xì)胞凋亡細(xì)胞百分比。插入物包含耐藥和敏感細(xì)胞中蛋白印跡試驗(yàn)Bcr/Abl蛋白水平(同微管蛋白對(duì)照一起)。各泳道包含25μg蛋白。這些值表示三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±S.D.。
LAMA 84-R細(xì)胞表現(xiàn)出比其敏感對(duì)應(yīng)物的I.C.50值約高10倍的化合物II.C.50值(例如，2.1對(duì)0.22μM；數(shù)據(jù)未表示出)。在插入物中表示的是證明各細(xì)胞系Bcr/Abl蛋白水平增加的蛋白印跡?？梢钥闯?，將化合物I(1.0或1.25μM)(其在任何一種細(xì)胞系中僅產(chǎn)生中等的致死率)與最低毒性濃度的SAHA(即，1.0或2.0μM)共同給藥48小時(shí)在大多數(shù)K562R和LAMA84-R細(xì)胞中(例如～66％)中誘導(dǎo)了細(xì)胞死亡。將敏感K562和LAMA 84細(xì)胞與這些化合物I濃度接觸48小時(shí)在基本100％的細(xì)胞中誘導(dǎo)了細(xì)胞死亡(數(shù)據(jù)未表示出來)。當(dāng)將細(xì)胞與化合物I和SB一起進(jìn)行接觸時(shí)得到了基本相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未表示出來)。該類結(jié)果表明將化合物I與HDI聯(lián)合給藥可以有效增加對(duì)化合物I有抗藥性的Bcr/Abl+細(xì)胞中的細(xì)胞死亡，至少可以有效增加表現(xiàn)出Bcr/Abl蛋白表達(dá)增加的細(xì)胞中的細(xì)胞死亡。
最后，為了對(duì)Raf/MEK/MAP激酶軸失調(diào)對(duì)化合物I和HDI在Bcr/Abl+細(xì)胞中的協(xié)同相互作用的功能性影響進(jìn)行評(píng)估，將K562細(xì)胞用僅表達(dá)GFP的載體或組成活性的MEK1/2/GFP融合蛋白瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(表8)。 GFP GFP/M EK對(duì)照 12.1±1.8 11.5±1.9SAHA 22.5±2.6 19.8±2.1化合物I 23.8±2.8 14.7±2.2化合物I+SAHA 68.2±4.6 38.4±3.1 表8按照“方法”部分的描述用Cytomation MoFLO細(xì)胞分離器將表達(dá)GFP的純化群體(例如，＞95％)分離出來。未轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞表現(xiàn)出91％的生存力和0.01％的GFP表達(dá)；僅用GFP轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞；篩選的細(xì)胞表現(xiàn)出95％的生存力和95％的GFP表達(dá)；用GFP/組成活性MEK1/2融合cDNA轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞；篩選的細(xì)胞表現(xiàn)出95％的生存力和96％的GFP-表達(dá)。將篩選出來的僅用GFP或GFP/組成活性MEK1/2融合cDNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在不含藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5小時(shí)，然后將其與2.0μM SAHA±250nM化合物I接觸24小時(shí)，其后，按照“方法”部分的描述通過對(duì)Wright Giemsa-染色的細(xì)胞離心涂片器制劑進(jìn)行檢查來對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行監(jiān)測(cè)。這些值表示兩次獨(dú)立測(cè)定的均值±S.D.。*＝顯著低于僅用GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的值；P＜0.05；**＝P＜0.01。在這一時(shí)期結(jié)束后，如上所述那樣對(duì)細(xì)胞凋亡程度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。用組成活性MEK1/2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)化合物I介導(dǎo)的致死率的抵抗性適度但是顯著高于僅使用GFP轉(zhuǎn)染的對(duì)照的致死率(P＜0.05)，其與早期證明藥理學(xué)MEK1/2抑制劑增強(qiáng)化合物I-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的報(bào)道相一致。此外，用突變MEK1/2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞十分顯著地保護(hù)了細(xì)胞不受SAHA/化合物I方案的致死率影響(P＜0.01)。這些結(jié)果表明與化合物I和HDI一起進(jìn)行接觸的K562細(xì)胞中的Raf/MEK/MAP激酶級(jí)聯(lián)失調(diào)在致死率增加中起著顯著的功能作用。
本研究的結(jié)果表明將Bcr/Abl激酶抑制劑化合物I與臨床相關(guān)的HDI共同給藥使得Bcr/Abl+人白血病細(xì)胞中的線粒體損害和細(xì)胞凋亡顯著增加。已知在人白血病細(xì)胞中，HDI(據(jù)推測(cè)是通過促進(jìn)染色質(zhì)松弛)使得可以進(jìn)行在分化過程中所涉及的轉(zhuǎn)錄基因活化。就這一點(diǎn)而言，HDI如SB已經(jīng)顯示出誘導(dǎo)Bcr/Abl+細(xì)胞系如K562中紅細(xì)胞系統(tǒng)的成熟。最近，已經(jīng)將注意力集中到HDI、特別是更新一代化合物誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞中細(xì)胞凋亡而不是成熟程序的能力上。一直沒有完全闡明決定HDI究竟誘導(dǎo)細(xì)胞死亡還是誘導(dǎo)細(xì)胞分化的因素，但是已經(jīng)表明反應(yīng)性氧類型的產(chǎn)生可能在這種過程中起著一定的作用。在任何情況下，K562細(xì)胞都對(duì)HDI-介導(dǎo)的細(xì)胞死亡相對(duì)不敏感，這可能是由于其對(duì)Bcr/Abl激酶以及其下游細(xì)胞保護(hù)靶點(diǎn)的組成活化所產(chǎn)生的對(duì)細(xì)胞凋亡的抗性所致。對(duì)將HDI和化合物I共同給藥使得這些Bcr/Abl細(xì)胞中細(xì)胞凋亡閾值顯著降低的結(jié)果有一些可能的解釋。例如，化合物I可以通過干擾一種或多種Bcr/Abl下游細(xì)胞保護(hù)靶點(diǎn)的抗細(xì)胞凋亡作用增強(qiáng)HDI觸發(fā)細(xì)胞死亡級(jí)聯(lián)的能力。相反，與由化合物I所誘發(fā)的情況一起，由HDI誘導(dǎo)的各種信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)途徑中的紊亂可產(chǎn)生線粒體損傷和細(xì)胞凋亡的放大。另外的可能是，當(dāng)與HDI聯(lián)合時(shí)，已經(jīng)報(bào)道可以誘導(dǎo)Bcr/Abl+細(xì)胞成熟的化合物I引發(fā)了產(chǎn)生細(xì)胞凋亡而不是分化的沖突信號(hào)。在這一方面，很好地證明了白血病細(xì)胞成熟失調(diào)代表了有效的細(xì)胞凋亡刺激的發(fā)現(xiàn)。因?yàn)檫@些機(jī)理不是相互排他的，所以不排除其中一種以上機(jī)理有助于細(xì)胞死亡顯著增加的可能性。
一系列證據(jù)支持了HDI對(duì)Bcr/Abl+細(xì)胞中Raf/MEK/MAP激酶級(jí)聯(lián)的干預(yù)有助于化合物I/HDI方案中顯著誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的想法。之前的研究已經(jīng)暗示了Bcr/Abl+細(xì)胞中HDI-介導(dǎo)的分化-誘導(dǎo)中MEK/MAP激酶的紊亂，盡管已經(jīng)報(bào)道了該類紊亂性質(zhì)上的差異。例如，Rivero早些時(shí)候報(bào)道了與丁酸鈉接觸的K562細(xì)胞中ERK的活化，而Witt等人描述了在丁酸鹽誘導(dǎo)的K562細(xì)胞的分化和ERK的抑制之間的相關(guān)性。這些完全不同的結(jié)果可以反映亞系-特異性差異或者，在與丁酸鹽接觸后出現(xiàn)一種ERK活化/下調(diào)的雙目暫時(shí)模式。在這一方面，還已經(jīng)表明阻撓ERK活化的化合物I至少在早期促進(jìn)了K562細(xì)胞成熟。與這些結(jié)果相一致，我們還觀察到在化合物I處理的K562細(xì)胞中ERK活化的早期抑制，但是，其后，較晚些時(shí)候其返回活性的基礎(chǔ)水平或高于該水平?；衔颕處理的K562細(xì)胞中MEK/ERK活化的抑制(即，被藥理學(xué)MEK1/2抑制劑抑制)表示對(duì)線粒體損害和細(xì)胞凋亡十分有效的刺激[25]。但是，目前，有關(guān)在Bcr/Abl+細(xì)胞中在上游部位(例如在Raf水平上)中斷MEK/MAP激酶途徑的影響的信息幾乎沒有。就我們目前所知，之前一直沒有描述過Bcr/Abl+細(xì)胞中由HDI引起的Raf下調(diào)。這些結(jié)果可以與下面的概念相容a)Raf/MEK/EREK軸的下調(diào)改變了經(jīng)HDI處理的細(xì)胞的活化程序，從而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡；或b)該Raf/MEK/ERK細(xì)胞保護(hù)途徑的瓦解降低了HDI-介導(dǎo)細(xì)胞死亡的閾值。我們最近觀察到，藥理學(xué)MEK1/2/ERK阻斷(例如，用諸如U0126之類的物質(zhì))使得在與HDI接觸的K562細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡顯著加強(qiáng)(C.Yu和S.Grant，未公開的數(shù)據(jù))，這支持了后一種可能性。
化合物I和HDI的聯(lián)合治療還使得應(yīng)激-相關(guān)的激酶JNK的活化顯著增加。雖然存在例外，但是應(yīng)激相關(guān)的激酶如JNK和p38 MAPK的活化通常有利于細(xì)胞死亡，而MEK/MAP激酶的活化則發(fā)揮了細(xì)胞保護(hù)作用。實(shí)際上，已經(jīng)表明JNK和MAP激酶級(jí)聯(lián)的凈輸出在決定存活/細(xì)胞死亡方面起著關(guān)鍵性的作用。因此推測(cè)，在與化合物I和HDI聯(lián)合接觸的Bcr/Abl+細(xì)胞中由MEK/MAP激酶向JNK信號(hào)傳導(dǎo)的顯著轉(zhuǎn)移有助于細(xì)胞凋亡的顯著加強(qiáng)。
除MEK1/2/ERK途徑瓦解外，CDKI p21CIP1失調(diào)也在Bcr/Abl+細(xì)胞中化合物I和HDI之間的協(xié)同相互作用中起作用。例如，已經(jīng)表明干擾p21CIP1誘導(dǎo)(例如，在表達(dá)反義構(gòu)建體的細(xì)胞中或在與CDK抑制劑flavopiridol接觸的細(xì)胞中)促進(jìn)了用一些分化誘導(dǎo)劑處理后白血病細(xì)胞的凋亡，所說的分化劑包括PMA、苔蘚抑素1和最近的包括丁酸鹽和SAHA在內(nèi)的HDI。這種現(xiàn)象的基礎(chǔ)在一定程度上是未知的，但是其可能涉及p21CIP1與半胱天冬酶-3結(jié)合和對(duì)其抑制的能力。所觀察到的HDI對(duì)組蛋白的乙酰化特定活化了p21CIP1啟動(dòng)子，而p21CIP1被HDI有規(guī)律地誘導(dǎo)、特別是在正在成熟的白血病細(xì)胞中被誘導(dǎo)的結(jié)果表明這種CDKI表達(dá)增加在HDI-介導(dǎo)的成熟中起著重要作用。雖然并不清楚化合物阻斷HDI-處理的細(xì)胞中的p21CIP1誘導(dǎo)的機(jī)理，但是其可能是由于Raf/MEK/ERK軸的瓦解(已知其操縱p21CIP1的上游)?；蛘?，施用化合物I、特別是當(dāng)將化合物I與HDI聯(lián)用時(shí)可能干擾Akt途徑——一種在p21CIP1調(diào)節(jié)中也被涉及的Bcr/Abl的下游目標(biāo)。仍需要明確Raf/MEK/ERK的與HDI-有關(guān)的下調(diào)和化合物I-介導(dǎo)的p21CIP1誘導(dǎo)干擾(如果有的話)對(duì)HDI和化合物I在Bcr/Abl+細(xì)胞中的協(xié)同相互作用中的相對(duì)貢獻(xiàn)。
HDI在對(duì)化合物I有抗藥性的K562細(xì)胞和LAMA 84細(xì)胞中對(duì)化合物I的致死率的加強(qiáng)作用與我們之前在涉及藥理學(xué)MEK1/2抑制劑或最近的CDK抑制劑flavopiridol的聯(lián)合方案中所觀察到的結(jié)果相似或更高。對(duì)化合物I的抗藥性可能是由于多種因素造成的，包括細(xì)胞吸收減少、bcr/abl擴(kuò)增和Bcr/Abl蛋白表達(dá)增加、藥動(dòng)學(xué)因素、以及Bcr/Abl激酶結(jié)構(gòu)域中的突變。由于仍然還不清楚的原因，Bcr/Abl表達(dá)增加是所培養(yǎng)的細(xì)胞系(包括在我們實(shí)驗(yàn)室所分離出來的細(xì)胞系)的抗藥性的最普通的機(jī)理[25，26]。但是，在得自已經(jīng)在體內(nèi)對(duì)化合物I形成抗藥性的CML患者的細(xì)胞中，觀察到Bcr/Abl表達(dá)增加的頻率比觀察到該Bcr/Abl激酶結(jié)構(gòu)域突變的頻率低。其中，最廣泛報(bào)道了Bcr/Abl激酶接觸部位(例如，T315和Y253)的突變。此外，Corbin等人最近用定位誘變來確定降低化合物I的抑制作用并且可能是臨床相關(guān)的Bcr/Abl激酶結(jié)構(gòu)域的其它突變?；衔颕/HDI方案在其它有抗藥性的K562或LAMA 84細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力表明這種策略繞開了Bcr/Abl表達(dá)增加的作用，或者通過操縱Bcr/Abl下游或者獨(dú)立操縱Bcr/Abl的途徑起作用。雖然該類策略可能在表現(xiàn)出Bcr/Abl上調(diào)的細(xì)胞中有效，但是仍然需要確定其是否在表達(dá)使得對(duì)化合物I有抗藥性的Bcr/Abl突變的細(xì)胞中有效。在這一方面，可能涉及化合物I/HDI方案觸發(fā)Bcr/Abl下調(diào)的能力，因?yàn)樵摷っ附Y(jié)構(gòu)域中單個(gè)氨基酸取代可能不太可能阻止該類過程。
通過誘導(dǎo)組蛋白乙?；徒饴菪?，HDI促進(jìn)了在成熟過程中所涉及的基因的表達(dá)。所以，一直對(duì)用HDI來增強(qiáng)其它物質(zhì)誘導(dǎo)分化的能力的應(yīng)用，特別是在白血病中的應(yīng)用感興趣。例如，最近已經(jīng)報(bào)道了HDI如丁酸鹽克服白血病細(xì)胞對(duì)全反式視黃酸(ATRA)的抗藥性的能力。因?yàn)榛衔颕能誘導(dǎo)Bcr/Abl+細(xì)胞中的分化(雖然程度有限)，所以存在HDI共同給藥可能增強(qiáng)這種過程的可能性。但是，這里所提供的數(shù)據(jù)表明化合物I和HDI之間的協(xié)同作用主要反映在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而不是誘導(dǎo)成熟方面。由于最近在人臨床試驗(yàn)中引入了一些新型的HDI，所以將該類物質(zhì)與化合物I聯(lián)合用于治療患有CML和相關(guān)病癥的患者的概念是可行的。因此，正在進(jìn)行進(jìn)一步的努力來對(duì)這種策略進(jìn)行進(jìn)一步探究。
實(shí)施例2實(shí)施例3含有4-[(4-甲基-1-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基[苯基]苯甲酰胺甲磺酸鹽(β-晶型)的膠囊 制備具有下面組成的包含119.5mg作為活性物質(zhì)的標(biāo)題中所命名的化合物(化合物I單甲磺酸鹽)(相當(dāng)于100mg化合物I(游離堿))的膠囊 組成 鹽I 119.5mg Avicel 200mg PVPPXL 15mg Aerosil 2mg 硬脂酸鎂1.5mg 338mg 該膠囊是通過將這些組分混合并將該混合物填充到1號(hào)硬明膠膠囊中來進(jìn)行制備的。
權(quán)利要求
1.一種用于同時(shí)、獨(dú)立或相繼應(yīng)用的組合，其包含(a)式I的N-{5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基-甲基)-苯甲酰氨基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶或其可藥用的鹽
和(b)至少一種游離形式或其可藥用鹽形式的組蛋白脫乙酰基酶抑制劑以及任選的至少一種可藥用的載體。
2.如權(quán)利要求1所述的組合，其中(b)選自丁酸鈉、MS-275、SAHA、aphacidin、縮肽、FK 228、曲古抑菌素A、式II的化合物或其可藥用的鹽
和式III的化合物或其可藥用的鹽，
以及任選的至少一種可藥用的載體。
3.如權(quán)利要求2所述的組合，其中(b)選自丁酸鈉、SAHA、式II的化合物和式III的化合物。
4.如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的組合在治療白血病中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的組合用于制備治療白血病的藥物的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求4或5中任意一項(xiàng)所述的組合應(yīng)用，其中的白血病是對(duì)化合物I有抗藥性的白血病。
7.一種對(duì)患有白血病的溫血?jiǎng)游镞M(jìn)行治療的方法，其包括以對(duì)所說白血病的聯(lián)合治療有效量給所說的動(dòng)物施用如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的組合并且其中所說的化合物還可以以其可藥用鹽的形式存在。
8.一種包含對(duì)白血病聯(lián)合治療有效量的如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的藥物組合以及至少一種可藥用載體的藥物組合物。
9.一種包含如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的組合以及說明其用于同時(shí)、獨(dú)立或相繼應(yīng)用以治療白血病的說明的商品化包裝。
10.如權(quán)利要求7所述的方法、如權(quán)利要求8所述的藥物組合物和如權(quán)利要求10所述的商品化包裝，其中所說的白血病是對(duì)化合物I有抗藥性的白血病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于同時(shí)、獨(dú)立或相繼應(yīng)用來治療白血病，尤其是對(duì)N－{5－[4－(4－甲基－哌嗪－1－基－甲基)－苯甲酰氨基]－2－甲基苯基}－4－(3－吡啶基)－2－嘧啶有抗藥性的白血病的組蛋白脫乙?；敢种苿┖蚇－{5－[4－(4－甲基－哌嗪－1－基－甲基)－苯甲酰氨基]－2－甲基苯基}－4－(3－吡啶基)－2－嘧啶或其可藥用的鹽的組合。
文檔編號(hào)A61K31/4406GK1681505SQ0382176
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2003年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月13日
發(fā)明者P·登特, S·格蘭特, G·克里斯塔爾, C·于 申請(qǐng)人:弗吉尼亞州立大學(xué), 麥克艾瓦醫(yī)療中心111K