專利名稱：涉及缺損性間隙連接聯(lián)系的疾病的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有多酚例如矢車菊苷配質(zhì)，譬如可可多酚如可可矢車菊苷配質(zhì)的組合物，及其使用方法，用于心律失常的治療、預(yù)防、減小危險(xiǎn)性或降低發(fā)生率。本發(fā)明還涉及含有多酚例如矢車菊苷配質(zhì)，譬如可可多酚如可可矢車菊苷配質(zhì)的組合物，及其使用方法，用于神經(jīng)變性和其他涉及細(xì)胞之間缺損性間隙連接聯(lián)系的疾病，例如認(rèn)知機(jī)能障礙的治療、預(yù)防、減小危險(xiǎn)性、減弱進(jìn)展。
背景技術(shù)：
可可多酚，例如黃烷醇及其相關(guān)低聚物，業(yè)已被證實(shí)對高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病具有有益效果。這些效果在例如國際專利申請PCT/US97/05693和該申請報(bào)告的實(shí)施例中得到證實(shí)，該申請公開號為WO97/36497。其中已經(jīng)證實(shí)可可多酚可以用來治療或預(yù)防那些被認(rèn)為受到施用非甾族抗炎藥如阿司匹林影響的疾病。然而，可可多酚而不是阿司匹林在治療和預(yù)防中的應(yīng)用更有益，因?yàn)榭煽啥喾硬痪哂邪⑺酒チ值母弊饔?，例如胃出血?br> 現(xiàn)在令人驚奇地發(fā)現(xiàn)了可可多酚的新用途，例如黃烷醇及其相關(guān)低聚物。在此公開的組合物和產(chǎn)品可以用于心律失常的治療、預(yù)防、減小危險(xiǎn)性和降低發(fā)生率。此外，這些組合物和產(chǎn)品可以用于任何與細(xì)胞間間隙連接聯(lián)系異常有關(guān)的病癥的治療、預(yù)防、減小危險(xiǎn)性或減慢進(jìn)程，例如癌癥，心律失常，以及神經(jīng)變性和其他涉及細(xì)胞間缺損性間隙連接聯(lián)系的疾病。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物患有心率失常的治療、預(yù)防、降低發(fā)生率或減小危險(xiǎn)性，或降低人或獸醫(yī)動(dòng)物如馬、貓或狗所患心率失常危險(xiǎn)性的組合物、產(chǎn)品和方法。此外，本發(fā)明涉及用于任何與細(xì)胞間間隙連接聯(lián)系異常有關(guān)的病癥的治療、預(yù)防、減小危險(xiǎn)性或減慢進(jìn)程，例如涉及細(xì)胞間缺損性間隙連接聯(lián)系的癌癥、心律失常、神經(jīng)變性疾病和認(rèn)知機(jī)能障礙。
一方面，本發(fā)明涉及含有可可多酚的組合物，例如食品，食品添加劑，食品強(qiáng)化劑或藥物。該組合物可以選擇性地含有L-精氨酸和/或降膽固醇劑。
用于心律失常、神經(jīng)變性疾病或任何與細(xì)胞的間隙連接聯(lián)系異常有關(guān)的病癥的治療、預(yù)防、減小危險(xiǎn)性或減慢進(jìn)程的包含上述組合物和標(biāo)簽和/或說明書的包裝產(chǎn)品也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
另一方面，本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物例如人或獸醫(yī)動(dòng)物中心率失常的治療、預(yù)防、減小危險(xiǎn)性或降低發(fā)生率的方法，該方法通過施用含有可可多酚例如可可黃烷醇和/或其相關(guān)低聚物的組合物給需要其的哺乳動(dòng)物。
另一方面，本發(fā)明涉及一種在哺乳動(dòng)物，例如人或獸醫(yī)動(dòng)物中與細(xì)胞間隙連接聯(lián)系異常有關(guān)的病癥的治療、預(yù)防、減慢進(jìn)程或減小危險(xiǎn)性的方法，該方法通過施用含有可可多酚例如可可黃烷醇和/或其相關(guān)低聚物的組合物給需要其的哺乳動(dòng)物。例如，所述病癥是神經(jīng)變性疾病或認(rèn)知機(jī)能障礙并且該哺乳動(dòng)物患有神經(jīng)變性疾病或認(rèn)知機(jī)能障礙或存在患有神經(jīng)變性疾病或認(rèn)知機(jī)能障礙的危險(xiǎn)性。
附圖簡述

圖1A-D表示通過熒光黃染料轉(zhuǎn)移分析法測定的WB-F344細(xì)胞中間隙連接細(xì)胞間聯(lián)系。A對照(0.2％DMSO)；BTPA 10nM(90min)；C染料木素40μM(72h)；D(-)-表兒茶酸40μM(72h)。
圖2A-D表示連接蛋白43的亞細(xì)胞分布的免疫熒光分析。A對照(0.2％DMSO)；BTPA 10nM；CTPA 10nM加(-)-表兒茶酸40μM；DTPA 10nM加染料木素40μM。所有處理的培養(yǎng)時(shí)間均為90分鐘。
圖3表示植物甾醇、可可矢車菊苷配質(zhì)和其組合對表兒茶酸吸收到血漿內(nèi)的影響。
圖4表示植物甾醇、可可矢車菊苷配質(zhì)和其組合對DNA的氧化損傷的影響。
圖5表示植物甾醇、可可矢車菊苷配質(zhì)和其組合對脂質(zhì)的氧化損傷的影響。
發(fā)明詳述所有專利、專利申請和該申請中引用的參考文獻(xiàn)在此引入作為參考。在任何不一致的情況中，以本申請內(nèi)容為準(zhǔn)。
本發(fā)明涉及含有黃烷醇和/或其相關(guān)低聚物，例如至少一種可可黃烷醇和/或其相關(guān)矢車菊苷配質(zhì)低聚物的組合物，給需要其的哺乳動(dòng)物。該組合物可以任選性地含有降膽固醇劑，例如，甾醇和/或stanol類降膽固醇劑，L-精氨酸，鈣，鉀，鎂，抗氧劑，例如維生素E和維生素C，任何復(fù)合維生素B，類胡蘿卜素，瓜爾膠，或者一或多不飽和脂肪酸(例如ω-3脂肪酸)，維生素D3，視黃醛，類維生素A(retinoid)，大豆蛋白質(zhì)和硒。組合物可以含有非可可來源的多酚，例如花生皮，其具有類似于可可多酚的那些性質(zhì)，或代替可可多酚。
在此使用，術(shù)語″可可多酚″(CP)是指存在于可可豆中或提取自可可豆或可可組分的多酚物質(zhì)，例如黃烷醇及其相關(guān)低聚物。術(shù)語″黃烷醇″包括單體兒茶素和表兒茶酸。兒茶素和表兒茶酸的低聚物稱作矢車菊苷配質(zhì)。在此任何所謂的可可多酚應(yīng)當(dāng)理解為也組合形式和單獨(dú)適合于可可黃烷醇和矢車菊苷配質(zhì)。
術(shù)語″可可組分″是指得自無殼可可尖例如巧克力液和部分或全脫脂可可固體(例如餅或粉)的含可可固體的物質(zhì)。
短語″降膽固醇劑″是指任何在給予有效量時(shí)具有降低哺乳動(dòng)物膽固醇水平的性質(zhì)的天然發(fā)現(xiàn)或加工的化合物、化合物的組合、提取物或植物成分。當(dāng)所述的降膽固醇劑是甾醇或stanol類的化合物或化合物的組合時(shí)，即，包括衍生物和異構(gòu)體形式，該降膽固醇劑稱作″甾醇和/或stanol類降膽固醇劑″。當(dāng)該短語用于組合物中時(shí)，例如，″降膽甾醇黑巧克力″，是指該組合物具有降膽甾醇的性質(zhì)。
可可多酚可以是天然來源，即，衍生自可可豆，或合成制備的。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于可利用性或成本選擇天然或合成可可多酚?？煽啥喾涌梢砸院煽啥喾拥目煽山M分的形式含在所述組合物內(nèi)，例如，巧克力中含有的巧克力液，或者可以獨(dú)立地加入可可組分，例如，作為提取物，提取餾分，分離和純化的各個(gè)化合物，合并的提取餾分或合成制備的化合物。
所述可可多酚包括可可黃烷醇和其低聚物。黃烷醇包括(+)-兒茶素，(-)-表兒茶酸和其各自的差向異構(gòu)體(例如(-)-兒茶素和(+)-表兒茶酸)，并且具有結(jié)構(gòu)
所述矢車菊苷配質(zhì)低聚物可以具有2-約18，優(yōu)選2-約12，和最優(yōu)選2-約10個(gè)單體單元。例如，低聚物可以是二聚體，三聚體，四聚體，五聚體，六聚體，七聚體，八聚體，九聚體和十聚體。在所述低聚物中，單體經(jīng)(4→6)和/或(4→8)的黃烷間鍵相連。具有唯一(4→8)鍵的低聚物為直鏈；同時(shí)至少一個(gè)(4→6)鍵的存在得到支鏈化的低聚物。在花生皮多酚的情況中，還存在鍵，例如C2→O→C7。
所以，式An的聚合化合物或其藥學(xué)可接受鹽，可以用于本發(fā)明的組合物和方法中 其中n是2-18的整數(shù)，因此存在至少一個(gè)末端單體單元A，和一個(gè)或多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH，3-(β)-OH；相鄰單體之間的鍵存在于選自4、6和8的位置；附加單體單元的4位中的鍵具有α或β立體化學(xué)；X、Y和Z選自單體單元A或氫，條件是對于至少一個(gè)末端單體單元，其附加單體單元的鍵位于4位且選擇性地是Y＝Z＝氫。
可可多酚可以通過萃取可可豆、可可尖或可可組分例如巧克力液、部分脫脂的可可固體，和/或完全脫脂的可可固體來制備。優(yōu)選地，提取物由完全或部分脫脂可可粉制成?？梢允褂玫米訲heobroma、Herrania或其之間和內(nèi)部品種雜交的任何品種的豆。提取物可以由發(fā)酵過的、發(fā)酵中的或未發(fā)酵的豆制備，發(fā)酵過的豆具有最小量的可可多酚而未發(fā)酵的豆具有最多量的可可多酚。豆的選擇可以基于豆的發(fā)酵因數(shù)而定，例如，可以由具有約275或更小發(fā)酵因數(shù)的豆進(jìn)行提取。通過控制發(fā)酵的程度使可可組分和其提取物中多酚水平最佳化可以按照國際專利申請No.PCT/US97/15893所述內(nèi)容進(jìn)行，其公開號為WO98/09533，其相關(guān)部分在此引入作為參考。
可可多酚可以自通過傳統(tǒng)可可加工方法(例如在《工業(yè)巧克力制造和應(yīng)用》中，Beckett編輯，S.T.，Blackie Acad.&Professional，New York，1997，如1、5和6章所述)或利用Kealey等的美國專利6,015,913所述改進(jìn)的加工方法加工的可可組分進(jìn)行提取，該改進(jìn)的加工方法與傳統(tǒng)方法相反保留了可可組分中的多酚(防止其破壞)。改進(jìn)的可可加工方法省略了傳統(tǒng)焙燒步驟。由此，可以使用通過(a)將可可豆加熱一段時(shí)間且溫度足以使可可殼疏松同時(shí)不焙燒可可尖；(b)精選使可可尖與可可殼分開；(c)螺旋壓榨可可尖和(d)回收可可奶油和部分脫脂的可可固體，其含有保留水平的可可多酚，獲得的可可組分。該方法保持了比傳統(tǒng)加工方法更高水平的高級矢車菊苷配質(zhì)低聚物。這種方法制備的可可固體可含有超過20,000μg的總黃烷醇和/或矢車菊苷配質(zhì)/克無脂肪固體；優(yōu)選大于25,000μg/g，更優(yōu)選大于28,000μg/g，和最優(yōu)選大于30,000μg/g。鑒于本發(fā)明的目的，總黃烷醇和/或矢車菊苷配質(zhì)量按照實(shí)施例2所述方法測定。
可可多酚可以用溶解該多酚的溶劑自上述來源提取。適當(dāng)?shù)娜軇┌ㄋ蛴袡C(jī)溶劑，例如甲醇，乙醇，丙酮，異丙醇和乙酸乙酯。也可以使用溶劑混合物。當(dāng)用水作為溶劑時(shí)，可以將其輕微酸化，例如用乙酸。某些溶劑的實(shí)例是水和有機(jī)溶劑的混合物，例如含水的甲醇、乙醇或丙酮。含水有機(jī)溶劑可以含有，例如，約50％-約95％的有機(jī)溶劑。所以，可以采用含約50％、約60％、約70％、約80％和約90％有機(jī)溶劑的水。溶劑還可以含有少量的酸例如乙酸，譬如，含量為約0.5％-約1.0％。提取物的組合物，即，矢車菊苷配質(zhì)低聚物的表現(xiàn)(即，低聚物性能)和量，將取決于溶劑的選擇。例如，水提取物主要含有單體，乙酸乙酯提取物含有單體和低級低聚物，主要是二聚體和三聚體，含水甲醇、乙醇或丙酮提取物含有單體和大量的高級低聚物。提取單體和高級矢車菊苷配質(zhì)低聚物的一種溶劑是約70％丙酮。然而，任何含有多酚的提取物都適用于本發(fā)明。所屬領(lǐng)域已知可可多酚的提取方法并描述在，例如，Romanczyk等的美國專利5,554,645和國際專利申請PCT/US97/05693(公開號WO97/36497)中。所以，在一實(shí)施方式中，可可提取物通過將可可豆細(xì)化為可可粉，對該粉末進(jìn)行脫脂，提取可可多酚，并且純化該提取物來制備。可可粉可以由冷凍干燥可可豆和制漿，脫漿和去殼該凍干的可可豆，和研磨該去殼的豆來制備。
可以純化該可可多酚，例如，通過除去咖啡因和/或可可堿，并且進(jìn)一步通過凝膠滲透色譜和/或高壓液體色譜(HPLC)純化。凝膠滲透色譜(例如在Sephadex LH-20上)可以用于富集高級矢車菊苷配質(zhì)低聚物的提取物。譬如，可以直至選擇的低聚物開始由柱洗脫出來才收集含有單體和低級低聚物的洗脫物。此類提取物的實(shí)例是所屬領(lǐng)域已知的且公開在國際專利申請PCT/US97/05693(WO97/36497)的實(shí)施例5中，其相關(guān)部分由此引入作為參考。通過使用制備HPLC，例如，標(biāo)準(zhǔn)相HPLC，可以將提取物分級為，例如，單體和含有至少50重量％的單體或特定低聚物的低聚餾分。當(dāng)特定餾分含有單體或任何低級低聚物(例如二聚體，三聚體或四聚體餾分)時(shí)，該餾分含有約90-95重量％的特定低聚餾分。所需餾分可以在分離后合并得到所選擇的低聚物的組合，例如含有低聚物3-10或5-10。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本說明書的指導(dǎo)和本領(lǐng)域公知常識，例如，Romanczyk等的美國專利5,554,645和國際專利申請PCT/US97/05693(公開號WO97/36497)的教導(dǎo)下，控制色譜條件以達(dá)到所需矢車菊苷配質(zhì)性能。
單體餾分通常含有單體表兒茶酸和兒茶素的混合物；并且低聚物餾分通常含有二聚體(在二聚體餾分中)、三聚體(在三聚體餾分中)、四聚體(在四聚體餾分中)等的混合物。單體和低聚物的混合物出現(xiàn)在分離的餾分中，因?yàn)榭煽珊胁恢挂环N的各種單體、二聚體等。低聚物可變性是由于兩種單體和低聚物中連接單體的化學(xué)鍵導(dǎo)致的，兩種單體是指表兒茶酸和兒茶素，它們是矢車菊苷配質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元。所以，可可二聚體主要是B2和B5，其各自含有兩個(gè)表兒茶酸的單體。各單體和低聚物可以利用反相HPLC獲得，例如使用C18柱。
可可多酚可以用于本發(fā)明的組合物中作為可可提取物，例如溶劑獲得的萃取物、可可餾分、分離的化合物或可可組分的形式或含有有效量的可可黃烷醇和/或矢車菊苷配質(zhì)的巧克力?？煽山M分可以利用傳統(tǒng)可可加工方法制備，但優(yōu)選利用Kealey等的美國專利6,015,913所述的方法制備。另外，為了提高可可多酚的水平，可以使用由可可豆制備的具有約275或更小發(fā)酵因數(shù)的巧克力液和可可固體。這些組分具有的可可多酚含量高于用傳統(tǒng)可可加工方法(例如焙燒)和完全發(fā)酵的豆獲得的含量。巧克力可以利用常規(guī)技術(shù)由上述組分或利用國際專利申請PCT/US99/05414(公開號WO99/45788)所述的在巧克力制造中保留可可多酚的改進(jìn)方法來制備，該國際專利申請相關(guān)部分在此引入作為參考。通過至少一種的下列非傳統(tǒng)方法制備的巧克力在此稱作″具有保存量的可可多酚的巧克力″(i)由發(fā)酵下的或未發(fā)酵的可可豆制備可可組分；(ii)在可可組分制造過程中保留可可多酚；和(iii)在巧克力制造過程中保留可可多酚。
在某些實(shí)施方式中，該組合物含有至少一種低聚物，例如二聚體。這種組合物可以另外含有至少一種單體或單體的組合，例如兒茶素和表兒茶酸。在另一實(shí)施方式中，還制備和使用了含有單體兒茶素和表兒茶酸的組合的組合物，例如分離自可可的單體餾分的形式。
還可以使用合成的矢車菊苷配質(zhì)，通過所屬領(lǐng)域的已知方法制備，并且描述在例如國際專利申請PCT/US98/21392(公開號WO99/19319)中，其相關(guān)部分在此引入作為參考。也可以使用可可多酚衍生物。這些包括沒食子酸化的單體和低聚物，葡糖基化的單體和低聚物，和其混合物；矢車菊苷配質(zhì)單體和低聚物的代謝產(chǎn)物，例如硫酸化的、glucoronidated，和甲基化形式；和結(jié)腸微生物區(qū)系代謝或哺乳動(dòng)物內(nèi)部代謝生成的矢車菊苷配質(zhì)的酶裂解產(chǎn)物。衍生物可以來自天然來源或合成制備。
組合物可以選擇性地含有降膽固醇劑?？梢允褂萌魏谓的懝檀紕┒豢紤]其作用方式。適當(dāng)?shù)闹苿┛梢酝ㄟ^降低哺乳動(dòng)物的膽汁內(nèi)膽固醇吸收或通過減少膽固醇合成來發(fā)揮作用。適當(dāng)制劑的實(shí)例為植物甾醇、phytostanol及其衍生物和異構(gòu)體；大豆蛋白質(zhì)；可溶性纖維，例如β-葡聚糖，例如，得自燕麥和歐車前、堅(jiān)果、稻麩油，它們各自都特別適合用在食品、食品強(qiáng)化劑和食品添加組合物中。已知的降膽固醇藥物也可以使用，但不適宜用于食品和食品添加組合物中，而可以用于藥物中。對于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯然降膽固醇劑的選擇取決于預(yù)期施用載體(例如食品，強(qiáng)化劑，藥物)和施用的方式。所以，降低膽汁內(nèi)膽固醇吸收的制劑對于靜脈內(nèi)給藥來說不適宜。同樣地，如果施用載體是食品，具有強(qiáng)烈藥物味道或氣味的降膽固醇劑可能不是所需的。
植物甾醇是不溶于水并具有與膽固醇類似的分子量和結(jié)構(gòu)的植物甾醇。植物甾醇降低膽汁中膽固醇的吸收(內(nèi)源性和飲食的膽固醇兩者)以及血清膽固醇水平(總量和LDL)，但其本身不被吸收。超過40種植物甾醇已經(jīng)被鑒定，但β-谷甾醇，菜油甾醇和豆甾醇最豐富。適用甾醇的其他實(shí)例是菜子甾醇、鏈甾醇、chalinosterol、多孔甾醇、穿貝海綿甾醇。各甾醇或甾醇的混合物，分離自天然來源或合成，并且可以使用其異構(gòu)體和衍生物。特別適用的是甾醇的飽和衍生物，稱作stanol，其中環(huán)內(nèi)的全部碳-碳鍵是飽和的。適宜的stanol具有28或29個(gè)碳原子并且包括β-谷甾烷醇(sitostanol)，clionastanol，22，23-dyhydrobrassicastanol和campestenol。植物甾醇可以是固體(例如粉末、顆粒)或液體(例如油)形式。
所述甾醇和stanol在多種植物原料中被發(fā)現(xiàn)，如例如國際專利申請PCT/EP96/02344所述。甾醇/stanol的示范性來源是松樹樹皮、豆油、妥爾油、竹筍提取物(國際專利申請PCT/US98/12556所述，公開號WO98/57545)，可可殼和油，和稻麩油。妥爾油，一種紙漿和造紙工業(yè)的副產(chǎn)物，是stanol，即β-stanol的良好來源。
植物甾醇可以得自天然來源，例如植物油、植物油沉淀物、植物油蒸餾物，和其他植物油來源，例如通過相對簡單和低成本方法獲得的妥爾油。譬如，利用溶劑如甲醇由植物油沉淀物制備甾醇的方法如Hamunen的美國專利4,420,427所述。發(fā)現(xiàn)在天然中stanol含量少，但很容易利用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的多種方法中的任意一種通過氫化甾醇由甾醇制備。當(dāng)由植物原料制備甾醇原料時(shí)，它將含有多種不同甾醇的混合物，由此，在氫化后，所得stanol也是不同stanol的混合物。該混合物適合用于本發(fā)明。但是，純凈的特定甾醇制品也可以被氫化以生成可以使用的純凈stanol。
由可可殼提取的可可油是植物甾醇的良好來源?？煽芍参镧薮际怯坞x和結(jié)合甾醇的混合物，并且游離甾醇最多是存在的植物甾醇的約90％。植物甾醇包括菜油甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇，環(huán)阿屯甾醇(cycloartenoyl)、24-亞甲基環(huán)阿屯甾醇，以及少量的其他植物甾醇。結(jié)合的植物甾醇包括植物甾醇的脂肪酸酯或阿魏酸衍生物。可可油還含有母育酚類，其包括生育酚類(它們具有抗氧性質(zhì))和tocotrienol類(它們可具有降膽固醇活性)。可可油通過包括下列步驟的方法制備(i)研磨可可殼；(ii)用適于植物甾醇的溶劑提取粉碎的可可殼；(iii)除去溶劑；和(iv)回收可可油。可可殼，可可豆焙燒的一種副產(chǎn)物，可以來自干燥的發(fā)酵可可豆、微粉化可可豆、焙燒的可可豆，并且優(yōu)選得自干燥未發(fā)酵的豆，其具有最高的總甾醇含量。優(yōu)選的可可豆是Theobroma可可。優(yōu)選的溶劑是石油醚、己烷、戊烷和乙醚。溶劑可以通過真空蒸餾回收。在一實(shí)施方式中，用Tekmar Mill(Cincinatti，OH)將凍干的殼研磨為細(xì)粉，并且粉碎物用再蒸餾石油醚(b.p.38-39.6□)在Soxtec裝置(Fisher Scientific，Springfield，NJ)中提取過夜。次日清晨，通過在氮?dú)饬飨戮徛舭l(fā)小心除去溶劑，并且所得提取物儲存在-40℃下。植物甾醇隨后可以通過制備HPLC或柱色譜純化。
還可以使用甾醇和stanol兩者的酯化形式。酯化使甾醇/stanol更加可溶于脂肪和油，在某些情況中，這樣有助于其摻混在食品或其他施用載體中。例如，甾醇可以用脂肪酸酯酯化。酯化的甾醇實(shí)例包括谷甾醇乙酸酯、谷甾醇油酸酯和豆甾醇油酸酯。stanol酯可以按照現(xiàn)有技術(shù)并且例如van Amerongen等的美國專利6,031,118、Higgins的美國專利5,892,068、Miettenen等的美國專利5,502,045，和國際專利申請PCT/CA99/00655(公開號WO00/04887)所述方法制備。在一實(shí)施方式中，適用的stanol酯是通過用C2-C22脂肪酸酯按照Miettenen等的美國專利5,958,913所述方法酯化至少一種甾醇來制備。所屬領(lǐng)域的其他已知方法可以用來提高甾醇/stanol在給予哺乳動(dòng)物時(shí)的溶解度。一種此類方法如Ostlund的美國專利5,932,562所述，其中甾醇/stanol與卵磷脂混和得到水溶性粉末。
甾醇/stanol可以以粉末形式通過與其他組分混和加入到所述組合物中。在食品組合物的情況中，stanol/甾醇以及其他降膽固醇劑通常是在混和步驟時(shí)加入。在制備降膽固醇巧克力的過程中，譬如，甾醇/stanol可以加入到含糖、熔融奶油的干燥混合物；研磨之前的可可尖；或融化的巧克力中，但它們可能不優(yōu)選。為了便于混和，甾醇/stanol首先可以溶解在增溶劑例如脂肪、植物油、甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、生育酚及其混合物中。制備甾醇/stanol的混懸液和乳液的有效載體是水、醇、多元醇、其他可食用化合物例如巧克力液，其中甾醇/stanol至少部分可溶，以及其混合物。
大豆蛋白質(zhì)可以以任何已知方式加入到所述組合物中，例如，可以是大豆蛋白質(zhì)分離物、大豆蛋白質(zhì)濃縮物、textured大豆蛋白質(zhì)或豆粉、餅和粗粉。也可以使用整顆?；蚱渌槠?，如按照實(shí)施例5中所述。不同形式的大豆蛋白質(zhì)是所屬領(lǐng)域公知的且可商購。其性質(zhì)和獲得方法公開在例如Soy Protein and Human Nutrition，Wilcke等編輯，Acad.Press，NY，1979。大豆蛋白質(zhì)可以與任何甾醇和/或stanol類降膽固醇劑聯(lián)合使用。
可溶性植物纖維，例如β-葡聚糖，能夠降低血漿膽固醇。本發(fā)明使用的纖維可以得自任何β-葡聚糖的來源，優(yōu)選燕麥顆粒和燕麥糠。纖維可以按照該領(lǐng)域的已知方法制備并加入到組合物中。它們特別適合于口服給予的組合物，例如食品和食品強(qiáng)化劑。β-葡聚糖和其他可溶性植物纖維可以與任何甾醇和/或stanol類降膽固醇劑聯(lián)合使用。
本發(fā)明的組合物也可以含有L-精氨酸，其可以提供不同形式的本發(fā)明組合物，例如作為純化的化合物，得自含L-精氨酸植物的提取物，或種子/堅(jiān)果組分的形式，例如堅(jiān)果粉，或作為全種/堅(jiān)果?？梢允褂萌魏蜭-精氨酸來源，合成的或天然的。優(yōu)選的L-精氨酸來源是大豆和堅(jiān)果肉，例如花生，胡桃，杏仁和榛實(shí)?？梢允褂妹撝筒糠置撝瑘?jiān)果肉。這些可以是粉碎的并且稱作堅(jiān)果粉。
組合物還可以含有鈣，鉀，鎂，抗氧劑例如維生素E和維生素C，任何維生素B的復(fù)合物，類胡蘿卜素，瓜爾膠，或者一或多不飽和脂肪酸(例如ω-3脂肪酸)，它們可以按照該領(lǐng)域的已知方法獲得。一或多不飽和脂肪酸可以以橄欖油、魚油或堅(jiān)果的形式使用。適合這種用途的堅(jiān)果的實(shí)例是花生，杏仁和胡桃。
本發(fā)明的組合物用作食品、食品添加劑、食品強(qiáng)化劑或藥物。所述組合物可以含有載體、稀釋劑或賦形劑。根據(jù)預(yù)期的用途，可以選擇適合人體或獸醫(yī)、食品、添加劑、強(qiáng)化劑或藥物使用的載體、稀釋劑或賦形劑。
在此使用的″食品″是基本上由蛋白質(zhì)、碳水化合物和/或脂肪組成的物質(zhì)，其用于生物體中來支持生長、修復(fù)和生命過程并且供給能量。食品也可以含有補(bǔ)充物質(zhì)，例如礦物質(zhì)、維生素和調(diào)味品。參見Merriam-Webster的Collegiate Dictionary，第10版，1993。術(shù)語食品包括適合人或動(dòng)物消耗的飲料。在此使用的″食品添加劑″在FDA的21 C.F.R.170.3(e)(1)中作了定義并且包括直接和間接添加劑。在此使用的″藥物″是醫(yī)學(xué)藥物。參見Merriam-Webster的Collegiate Dictionary，第10版，1993。藥物也可以稱作醫(yī)藥。在此使用，″食品強(qiáng)化劑″是補(bǔ)充給食物使其帶有或含有一種或多種下列營養(yǎng)組分的產(chǎn)品(不是煙草)維生素，礦物質(zhì)，藥草或其他植物性藥材，氨基酸，人使用的通過增加全天攝取補(bǔ)充營養(yǎng)的營養(yǎng)物質(zhì)，或濃縮物，代謝物，組分，提取物或這些組分的聯(lián)合。
包括由于可可多酚或其衍生物的存在得到改進(jìn)的飲料在內(nèi)，如甲基化化合物或代謝分解產(chǎn)物，并且選擇性地與降膽固醇劑、L-精氨酸、鈣、鉀、鎂、抗氧劑例如維生素E和維生素C、任何維生素B的復(fù)合物、類胡蘿卜素、瓜爾膠和/或一或多不飽和脂肪酸(例如ω-3)聯(lián)合使用的任何常規(guī)食品，屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
上述改進(jìn)可以通過下列方法達(dá)到(i)將可可多酚或其衍生物加入到不含有可可多酚的食品或(ii)當(dāng)傳統(tǒng)食品可能含有可可多酚時(shí)，例如巧克力，通過使多酚水平提高至高于傳統(tǒng)制成食品中發(fā)現(xiàn)的水平。增強(qiáng)作用可以通過下述方法得到，通過加入附加可可多酚，例如，提取物、餾分或由它們分離和純化的化合物的形式；通過加入可可多酚與其他含多酚組分(例如堅(jiān)果皮)；通過按照上述方法控制可可組分的加工和可可豆選擇，從而保留用于食品生產(chǎn)中的可可組分中的可可多酚；或通過按照上述方法控制巧克力制造過程。由此，這些食品(包括飲料)與相對的常規(guī)食品(包括飲料)相比，含有″升高水平的多酚″(包括可可矢車菊苷配質(zhì))。具有升高水平多酚的巧克力的實(shí)例是當(dāng)巧克力制造商加入含可可多酚的可可提取物到其原市售產(chǎn)品中時(shí)出現(xiàn)的。該食品也可以稱作″高可可多酚食品，″即，它們比其傳統(tǒng)相應(yīng)物具有更高水平的多酚。
含有可可多酚和選擇性地含有至少一種降膽固醇劑(例如甾醇和/或stanol類降膽固醇劑)、L-精氨酸、鈣、鉀、鎂、抗氧劑例如維生素E和維生素C、任何維生素B的復(fù)合物、類胡蘿卜素、瓜爾膠或者一或多不飽和脂肪酸(例如ω-3)的食品可以適合人體或獸醫(yī)用途，并且包括寵物食品。食品可以不是甜食，然而，優(yōu)選的降膽固醇食品是甜食例如標(biāo)準(zhǔn)的特性(SOI)和非SOI巧克力，例如牛奶、甜味和半甜味的巧克力(包括黑巧克力)、低脂巧克力和糖果，其可以是巧克力轉(zhuǎn)化的糖果。其他實(shí)例包括烘焙產(chǎn)品(例如果仁巧克力餅，烘焙點(diǎn)心，糕點(diǎn)，餅干)調(diào)味品，granola棒，太妃糖，粗粉替代棒，spread，糖漿，粉末飲料混合物，可可或巧克力味飲料，布丁，米餅，米混合物，開胃調(diào)味汁等。如果需要，食品可以是巧克力或可可矯味的。除含有可可多酚和降膽固醇劑以外還含有L-精氨酸的食品優(yōu)選是含有堅(jiān)果的巧克力和糖果棒，例如granola棒，例如，花生，胡桃，杏仁和榛實(shí)。應(yīng)該注意到，向本文所述食品中加入帶皮的堅(jiān)果也可以提高總的多酚含量，因?yàn)?，例如花生皮含有約17％黃烷醇和矢車菊苷配質(zhì)，并且杏仁皮含有約30％黃烷醇和矢車菊苷配質(zhì)。在一實(shí)施方式中，將堅(jiān)果皮加入到含降膽固醇劑的巧克力糖的牛軋?zhí)侵小?br> 在某些實(shí)施方式中，非巧克力食品含有至少約5微克/g-約10mg/g，并且，例如，至少5微克/g食品，優(yōu)選至少10微克/g，更優(yōu)選至少100微克/g的可可黃烷醇和/或矢車菊苷配質(zhì)低聚物。如果需要，非巧克力食品可以含有比在下述巧克力食品中發(fā)現(xiàn)的高很多的可可矢車菊苷配質(zhì)水平。
在一實(shí)施方式中，巧克力甜食含有有效量的可可黃烷醇和/或矢車菊苷配質(zhì)用于心率失?；蛘咭话愕厝魏闻c間隙連接聯(lián)系異常有關(guān)的病癥，例如神經(jīng)變性疾病的治療、預(yù)防、減小其危險(xiǎn)性和降低其發(fā)生率。所述的巧克力甜食可以是牛奶或黑巧克力。在某些實(shí)施方式中，基于產(chǎn)品中非脂肪可可固體的總量計(jì)，所述巧克力含有至少3,600微克，優(yōu)選至少4,000微克，優(yōu)選至少4,500微克，更優(yōu)選至少5,000微克，并且最優(yōu)選至少5,500微克可可黃烷醇和/或矢車菊苷配質(zhì)/克的巧克力。在其他實(shí)施方式中，基于產(chǎn)品中非脂肪可可固體計(jì)，所述巧克力含有至少6,000微克，優(yōu)選至少6,500微克，更優(yōu)選至少7,000微克，和最優(yōu)選至少8,000微克的可可矢車菊苷配質(zhì)/克，甚至更優(yōu)選10,000微克/g。
基于牛奶巧克力產(chǎn)品中非脂肪可可固體的總量計(jì)，牛奶巧克力甜食可以具有至少1,000微克，優(yōu)選至少1,250微克，更優(yōu)選至少1,500微克，并且最優(yōu)選至少2,000微克可可黃烷醇和/或矢車菊苷配質(zhì)/克牛奶巧克力。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，基于牛奶巧克力產(chǎn)品中非脂肪可可固體的總量計(jì)，牛奶巧克力含有至少2,500微克，優(yōu)選至少3,000微克，更優(yōu)選至少4,000微克，并且最優(yōu)選至少5,000微克可可黃烷醇和/或矢車菊苷配質(zhì)/克的牛奶巧克力。
L-精氨酸在食品中的含量可以變化。通常，可可含有1-1.1克的L-精氨酸/100克部分脫脂的可可固體。每100克可可中可以在0.8-1.5的范圍內(nèi)。本發(fā)明的巧克力食品含有含量大于天然存在于可可組分中的L-精氨酸。了解了食品中可可組分和L-精氨酸的用量，所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易確定出最終產(chǎn)品中的L-精氨酸總量。食品一般含有至少5微克/克，優(yōu)選至少30微克/克，或至少60微克/克，甚至更優(yōu)選至少200微克/克食品。
當(dāng)食品中使用降膽固醇劑時(shí)，其含量取決于所用制劑的類型并且可以由所屬領(lǐng)域技術(shù)人員基于本說明書的教導(dǎo)，特別是下面提供的日劑量，和該領(lǐng)域的知識進(jìn)行確定。食品組合物，例如，可以含有約0.5-約10g/45g供給量，優(yōu)選約1.5-約5g/45g供給量，最優(yōu)選約2-約4.5g/45g供給量的甾醇/stanol。對于大豆蛋白質(zhì)和得自燕麥的可溶性纖維，F(xiàn)DA已經(jīng)規(guī)定了每種食品份(serving)能夠符合健康要求的最低量。按照FDA，含有β-葡聚糖的食品份必須含有至少0.75g，并且含有大豆蛋白質(zhì)的食品份必須含有至少6.25g的大豆蛋白質(zhì)。這些值也可以用作確定這些降膽固醇劑在食品中的含量的依據(jù)。
在單一份中可以提供日有效量的可可黃烷醇和/或矢車菊苷配質(zhì)。所以，甜食(例如巧克力)可以含有至少約100mg/份(例如150-200，200-400mg/份)可可矢車菊苷配質(zhì)。當(dāng)降膽固醇劑含在組合物中時(shí)，可以加入至少1.5(例如1.5-4.5g)/份甾醇/stanol。
含有可可黃烷醇和/或矢車菊苷配質(zhì)，選擇性地與降膽固醇劑和/或L-精氨酸組合的藥物可以以多種方式給藥，例如口服、舌下、經(jīng)頰、經(jīng)鼻、直腸、靜脈內(nèi)、非腸道和局部給藥。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能夠根據(jù)給藥方式?jīng)Q定適當(dāng)?shù)慕的懝檀紕?。所以，適合各種給藥方式的劑型屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)并且包括固體、液體和半固體劑型，例如片劑、膠囊、明膠膠囊(gelcaps)、大量或單位劑量的散劑或顆粒劑、乳劑、混懸劑、糊劑、霜?jiǎng)?、凝膠劑、泡沫劑或果凍。緩釋劑型也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)并且可以按照美國專利5,024,843；5,091,190；5,082,668；4,612,008和4,327,725所述制備，其相關(guān)部分在此引入作為參考。適當(dāng)?shù)乃幬锟山邮茌d體、稀釋劑或賦形劑通常是該領(lǐng)域已知的并且可以很容易地由所屬領(lǐng)域技術(shù)人員確定。譬如，片劑可以含有有效量的含可可多酚組合物和選擇性的載體，例如山梨糖醇、乳糖、纖維素或磷酸二鈣。
含有可可黃烷醇和/或矢車菊苷配質(zhì)和選擇性含有至少一種降膽固醇劑和/或L-精氨酸的食品強(qiáng)化劑可以利用所屬領(lǐng)域已知的方法制備，并且可以含有，例如，營養(yǎng)素如磷酸二鈣、硬脂酸鎂、硝酸鈣、維生素和礦物質(zhì)。
進(jìn)一步屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是含有本發(fā)明組合物的包裝(例如食品，食品強(qiáng)化劑，藥物)和指示可可黃烷醇和/或矢車菊苷配質(zhì)和/或其衍生物的存在或高含量，或指導(dǎo)所述組合物用于心率失常或與細(xì)胞間隙連接聯(lián)系異常有關(guān)的任何病癥如神經(jīng)變性疾病的治療、預(yù)防、降低發(fā)生率或減小危險(xiǎn)性的標(biāo)簽。任選地，標(biāo)簽可以指明降膽固醇劑和/或L-精氨酸含量，組合的多酚、降膽固醇劑和選擇性L-精氨酸的有益性質(zhì)。該包裝可以包含所述組合物和用于心率失?；蚺c細(xì)胞間隙連接聯(lián)系異常/缺陷有關(guān)的任何病癥如神經(jīng)變性疾病或癌癥的治療、預(yù)防、減小危險(xiǎn)性、減慢進(jìn)程或減小發(fā)生率的說明書。
在此使用，″治療″是指改善現(xiàn)有醫(yī)學(xué)病癥，例如，心律失常，或與其有關(guān)的癥狀。術(shù)語″預(yù)防″是指減小與疾病惡化有關(guān)的危險(xiǎn)性，包括減小疾病的發(fā)作。預(yù)防或防止可以用于已知處于惡化疾病的高危險(xiǎn)性的個(gè)體或保持良好健康的人群，譬如，減小心率失常的危險(xiǎn)性。該方法可以用于人或獸醫(yī)動(dòng)物，例如狗、貓和馬。
所述的方法包括給哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人或獸醫(yī)動(dòng)物，施用有效時(shí)間階段(例如，誘發(fā)de novo連接蛋白合成)、有效量的含有黃烷醇和/或其相關(guān)低聚物的組合物，例如可可黃烷醇和/或其相關(guān)低聚物，選擇性與降膽固醇劑、L-精氨酸、抗氧劑(例如維生素E，維生素C)組合，該黃烷醇和/或其相關(guān)低聚物達(dá)到心率失常或任何與間隙連接異常/缺陷有關(guān)的病癥例如神經(jīng)變性疾病(例如帕金森和阿耳茨海默氏病)治療、預(yù)防或降低發(fā)生率的有效量。此外，與連接蛋白、例如連接蛋白40和/或43有關(guān)的認(rèn)知機(jī)能障礙的治療也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。所以，連接蛋白有關(guān)的功能可以被治療或改進(jìn)?？梢酝ㄟ^本發(fā)明治療的認(rèn)知機(jī)能障礙的實(shí)例是短期記憶和抑郁。也可以使用其他多酚例如那些分離自花生皮的多酚。
所以，下列用途屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)?？煽牲S烷醇和/或其低聚物在用于人或獸醫(yī)動(dòng)物中涉及缺損性間隙連接聯(lián)系的疾病的治療、預(yù)防、減小危險(xiǎn)性，或減慢進(jìn)程的藥物、食品、nutraceutical或食品強(qiáng)化劑的制備中的用途。
下列用途是某些實(shí)施方式的代表?？煽牲S烷醇和/或其低聚物在用于人或獸醫(yī)動(dòng)物中心律失常的治療、預(yù)防、減小危險(xiǎn)性，或者降低發(fā)生率的藥物、食品、nutraceutical或食品強(qiáng)化劑的制備中的用途?？煽牲S烷醇和/或其低聚物在用于人或獸醫(yī)動(dòng)物中認(rèn)知機(jī)能障礙的治療、預(yù)防、減小危險(xiǎn)性，或者減慢進(jìn)程的藥物、食品、nutraceutical或食品強(qiáng)化劑的制備中的用途。
式An的聚合化合物或其藥學(xué)可接受鹽，可以用于本發(fā)明的組合物和用途。
其中n是2-18的整數(shù)，由此存在至少一個(gè)末端單體單元A，和一個(gè)或多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH，3-(β)-OH；相鄰單體之間的鍵位于選自4、6和8的位置；附加單體單元位于4位的鍵具有α或β立體化學(xué)；X、Y和Z選自單體單元A或氫，條件是對于至少一個(gè)末端單體單元，其附加單體單元的鍵位于4位并且選擇性地為Y＝Z＝氫。
所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用本文提供的教導(dǎo)確定有效量。例如，有效量可以譬如是為了在哺乳動(dòng)物機(jī)體內(nèi)達(dá)到生理相關(guān)濃度。此類生理相關(guān)濃度可以是至少20納摩爾(nM)，優(yōu)選至少約100nM，并且更優(yōu)選至少約500nM。在一實(shí)施方式中，在哺乳動(dòng)物的血液中達(dá)到至少約1微摩爾。
該方法可以進(jìn)一步包括測定治療的有效性，通過例如測定心搏，例如利用心電圖(ECG)、流動(dòng)監(jiān)測器、holter監(jiān)測器、transtelephonic監(jiān)測器(選擇性地帶有記憶回路)、應(yīng)激試驗(yàn)、超聲波心動(dòng)圖、心臟導(dǎo)管插入術(shù)、電生理研究和正頭傾斜試驗(yàn)(head upright tilt test)。
所述的組合物可以給予健康哺乳動(dòng)物用于預(yù)防目的或給予需要治療或存在至少一種與心率失常有關(guān)的危險(xiǎn)因素的哺乳動(dòng)物。任何具有至少一種與心率失常有關(guān)的危險(xiǎn)因素的個(gè)體都是施用本發(fā)明組合物的對象。具有心律失常、高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病、心臟病發(fā)作、甲狀腺機(jī)能異常家族病史的個(gè)體以及那些吸煙、具有酒精、咖啡因或非法物質(zhì)攝取(例如可卡因)的個(gè)體，或者那些由心臟手術(shù)恢復(fù)的個(gè)體，是需要本文所述治療的易感個(gè)體。其他易于發(fā)生血管健康問題的哺乳動(dòng)物群體對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
獸醫(yī)動(dòng)物，例如狗、貓和馬，可以施用上述組合物用于心律失常的治療、預(yù)防或降低發(fā)生率。
用于心率失常的治療、預(yù)防、減小危險(xiǎn)性和/或降低發(fā)生率的有效量可以由所屬領(lǐng)域技術(shù)人員利用本文提供的指導(dǎo)和本領(lǐng)域的公知常識進(jìn)行確定?？煽牲S烷醇和/或有關(guān)低聚物可以給予約50mg/天-約1000mg/天，優(yōu)選約100-150mg/天-約900mg/天，并且最優(yōu)選約300mg/天-約500mg/天。然而，當(dāng)給予可可多酚無毒時(shí)，可以采用高于上述的用量。
為了另外獲得降膽固醇效果，利用甾醇/stanol，應(yīng)該給予多于通常非素食者平均飲食的量。一名北美人的典型飲食是每天消耗約200-400mg。所以，當(dāng)植物甾醇，例如谷甾醇，用于降低膽固醇水平時(shí)，應(yīng)該給予約至少1g/天，優(yōu)選至少約3g/天。優(yōu)選地，采用至少約1g/天，優(yōu)選至少約4.5g/天-約20g/天。然而，用量應(yīng)根據(jù)植物甾醇的降膽固醇效價(jià)變化，例如，如果使用更有效的sitostanol，有效量可以降低至約1-約3g/天。該用量可以利用Roger等，J.Amer.Oil Chem.Soc.70(30)1993和Carpenter等，J.Amer.Oil Chem.Soc.71(8)1994所述的分析方法進(jìn)行測定?？梢越o予大豆蛋白質(zhì)，例如，至少約25g/天。其他指導(dǎo)可以參見Recommended Daily Allowances，第9版，National Res.Council/National Acad.Sci.，Washington，D.C?？梢允┯每扇苄岳w維，例如，至少3g/天的量。
當(dāng)用于組合物和治療中時(shí)，L-精氨酸可以施用約2g/天-約50g/天，優(yōu)選約3g/天-約10g/天，并且最優(yōu)選約6g/天-約8g/天。在此，給予食品中天然存在的L-精氨酸時(shí)，可以采用高于上述的量。多酚一般可以以所屬領(lǐng)域已知的量給藥。當(dāng)確定有效量時(shí)，還可以考慮甾醇/stanol存在下吸收的增強(qiáng)。
作為一個(gè)方案，可以持續(xù)治療/預(yù)防性給藥，即有效時(shí)間階段，例如，每天、每月、每月2次、每年2次、每年1次，或者在某些其他方案中，由有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)學(xué)執(zhí)業(yè)者決定所需要的時(shí)間。給藥可以持續(xù)至少誘發(fā)連接蛋白合成所需的時(shí)間階段。優(yōu)選地，每天施用組合物，首選每天2或3次，例如，清晨和夜晚以保持有效化合物在哺乳動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的水平。為了獲得最有益的效果，所述組合物可以給藥至少約30-約60天。這些方案可以定期重復(fù)。
在下列非限定實(shí)施例中進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1可可黃烷醇/矢車菊苷配質(zhì)對細(xì)胞的間隙連接聯(lián)系的影響細(xì)胞培養(yǎng)物在35mm塑料盤中，WB-F344大鼠肝臟上皮細(xì)胞(由Dr.Trosko，East Lansing，MI友情提供)在Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中生長，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有10％胎牛血清(FCS)，2mM L-谷酰胺和青霉素/鏈霉素。細(xì)胞在37℃下在含5％CO2的加濕氣氛中培養(yǎng)。融合細(xì)胞在DMEM(無FCS)中培養(yǎng)24小時(shí)以降低細(xì)胞-細(xì)胞聯(lián)系的基礎(chǔ)水平。將(-)-表兒茶酸、染料木素(Sigma)或TPA溶解在DMSO中并且加入到培養(yǎng)基；對照只接受DMSO。培養(yǎng)基中DMSO的終濃度為0.2％。表兒茶酸二聚體按照Adamson等所述(″HPLC Method for theQuantification of Procyanidins in Cocoa and Chocolate Samples andCorrelation to Total Antioxidant Capacity″J.Ag.Food Chem.，Vol.710，4184-4188)制備，其相關(guān)部分在此引入作為參考。
間隙連接聯(lián)系分析細(xì)胞用(-)-表兒茶酸(4-40μM)和染料木素(40μM)處理24和72小時(shí)并且測定GJIC。對于采用TPA的試驗(yàn)，該培養(yǎng)采用TPA(1，5，10nM)，TPA(1，5，10nM)+表兒茶酸(40μM)，和TPA(1，5，10nM)+染料木素(40μM)進(jìn)行990分鐘；DMSO(0.2％)用作對照。用顯微操作器和微量注射系統(tǒng)(Eppendorf)通過微量注射熒光染料熒光黃CH(在0.33MLiCl中10％)到選定的細(xì)胞中來測定GJIC。注射后1分鐘，計(jì)算單細(xì)胞四周帶有染料的螢光細(xì)胞的數(shù)量。每盤中注射10個(gè)單個(gè)細(xì)胞并且計(jì)算出熒光相鄰細(xì)胞的平均數(shù)。用帶有CCD照相機(jī)的Zeiss axiovert熒光顯微鏡(ORCA II，Hamamatsu)采集圖像。
蛋白質(zhì)印跡分析為了獲得細(xì)胞溶解產(chǎn)物，WB-F344大鼠肝臟上皮細(xì)胞用PBS(2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4，137mM NaCl，10mM Na2HPO4；pH7.4)洗滌，并用SDS-PAGE溶胞緩沖液(125mM Tris，4％SDS，20％甘油，100mM二硫蘇糖醇，0.2％溴酚藍(lán)；pH6.8)處理2次。超聲后，該溶解產(chǎn)物在95℃下加熱5分鐘并進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(10％(w/v)丙烯酰胺)。凝膠印跡在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用多克隆白兔抗-Cx43抗體(Zymed)作為初級抗體和用山羊抗白兔IgG(Dianova)作為二級抗體進(jìn)行免疫檢測。
免疫組織化學(xué)對于免疫組織化學(xué)，WB-F344細(xì)胞在35mm塑料盤內(nèi)的蓋片上于含有FCS的完全培養(yǎng)基中生長，直至它們達(dá)到90％的融合。細(xì)胞與1、5或10nM TPA，40μM(-)-表兒茶酸或40μM染料木素或40μM(-)-表兒茶酸和(1、5、10nM)TPA的組合或40μM染料木素和(1，5，10nM)TPA的組合一起培養(yǎng)90分鐘；DMSO(0，2％)用作對照。處理后，細(xì)胞用PBS洗滌且用甲醇在-20℃下固定10分鐘。進(jìn)一步用PBS洗滌后，室溫下非特異性結(jié)合位點(diǎn)用3％正常山羊血清(NGS)在含0.3％(v/v)Triton-X-100的PBS中封阻45分鐘。細(xì)胞用多克隆抗-Cx43抗體(Zymed)培養(yǎng)；4℃下在含有1％(v/v)NGS的PBS中1∶1500稀釋過夜。細(xì)胞用PBS洗滌，并且用Alexa 546-偶聯(lián)的山羊抗白兔IgG(H+L)二級抗體(分子探針；在PBS中稀釋至1∶800)在37℃下培養(yǎng)45分鐘。洗滌和鑲嵌后，用帶有CCD照相機(jī)的Zeiss axiovert熒光顯微鏡(ORCA II，Hamamatsu)采集圖像。
結(jié)果染料木素在高于10μM的水平下影響細(xì)胞培養(yǎng)物中的GJIC[ZhangYW，Morita I，Nishida M，Murota SI.Involvement of tyrosine kinase inthe hypoxia/reoxygenation-induced gap junctional intercellularcommunication abnormality in cultured human umbilical veinendothelial cells.J Cell Physiol 1999；180305-13.]。
在本研究中，使WB-F344大鼠肝臟上皮細(xì)胞暴露于染料木素或(-)-表兒茶酸(40μM)下從而誘發(fā)GJIC的刺激，該刺激依賴于培養(yǎng)的時(shí)間。暴露24小時(shí)后，染料木素和(-)-表兒茶酸對GJIC的刺激分別是對照的2.1倍和1.5倍。在培養(yǎng)72小時(shí)后，染料木素提高至是對照的2.9倍并且(-)-表兒茶酸是對照的2.1倍。對照是只用DMSO(0.2％)處理；基線聯(lián)系在24小時(shí)下為13.4±1.0細(xì)胞并且在72小時(shí)下為12.1±1.3細(xì)胞。圖1顯示用染料轉(zhuǎn)移試驗(yàn)測定的聯(lián)系量度的典型實(shí)施例；對照(圖1A)，用TPA(10nM)在90分鐘后抑制(圖1B)，用染料木素(圖1C)或(-)-表兒茶酸(圖1D)在40μM下處理72小時(shí)后刺激。
兩種黃酮在90分鐘培養(yǎng)后對GJIC均沒有顯著作用。隨著細(xì)胞培養(yǎng)基中(-)-表兒茶酸水平的增高(4-40μM)，聯(lián)系細(xì)胞的數(shù)量增加(表1)。在用最低濃度(4μM)處理的細(xì)胞中，聯(lián)系仍然是溶劑對照的1.6倍。被測表兒茶酸的二聚體在20μM水平下刺激GJIC達(dá)到與40μM單體下的大致相同水平。
表1(-)-表兒茶酸和染料木素對WB-F344大鼠肝臟中的GJIC的影響細(xì)胞暴露于不同濃度的(-)-表兒茶酸(4-40μM)。在40μM下測定染料木素。培養(yǎng)72小時(shí)后測定聯(lián)系。GJIC表示為通過染料轉(zhuǎn)移分析測定的聯(lián)系細(xì)胞的數(shù)目并表示為對照的％。對照用DMSO(0.2％)處理；基礎(chǔ)聯(lián)系是12.1±1.3細(xì)胞，其設(shè)定為100％。數(shù)據(jù)表示3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±SD。
化合物 聯(lián)系細(xì)胞數(shù) 對照的％對照 (0.2％DMSO) 12.1±1.3 100±11(-)-表兒茶酸 4μM 18.1±2.2*156±18*10μM 20.1±6.8*173±56*40μM 24.2±3.1*209±26*表兒茶酸二聚體20μM 23.4±3.1*202±26*染料木素 40μM 35.4±2.4*293±20**明顯不同于對照(p＜0.001)
TPA通過改變Cx43蛋白質(zhì)影響GJIC。由于Cx43是WB344細(xì)胞中的主要間隙連接蛋白質(zhì)，因而我們調(diào)查了TPA在(-)-表兒茶酸和染料木素的存在下對GJIC的影響(表2)。當(dāng)細(xì)胞暴露在單獨(dú)的TPA下90分鐘時(shí)，細(xì)胞間聯(lián)系在5和10nM的水平下完全打斷(圖1B)；當(dāng)采用1nM TPA時(shí)，GJIC減小約40％。采用0.1nM TPA時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)這種影響。在全部試驗(yàn)中細(xì)胞存活率沒有受到影響。細(xì)胞與TPA培養(yǎng)72小時(shí)對GJIC沒有影響；聯(lián)系細(xì)胞的數(shù)目相當(dāng)于對照，即，在90分鐘時(shí)觀察到完全由損失達(dá)到恢復(fù)。
表2TPA對GJIC的抑制作用；(-)-表兒茶酸和染料木素的對抗作用。
細(xì)胞暴露于不同水平的TPA下和不同量TPA與40μM(-)-表兒茶酸或40μM染料木素的組合下。GJIC表示為對照的％。對照用DMSO(0.2％)處理；基礎(chǔ)聯(lián)系為18.6+/-2.9細(xì)胞，將其設(shè)定為100％。在培養(yǎng)90分鐘后測定聯(lián)系。數(shù)據(jù)代表3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值+/-SD。
TPA(nM) TPA TPA+(-)-表兒茶TPA+染料木素(％對照)酸40μM(％對照) 40μM(％對照)0.1 94±14 95±14n.m.
155±19 95±19*90±23*50 61±15*83±18*10 0 50±16*72±17**明顯不同于用TPA處理的(p＜0.001)平均值±SD(n＝3)n.m.沒有測定當(dāng)TPA與40μM的(-)-表兒茶酸或染料木素共同培養(yǎng)時(shí)，90分鐘后TPA(5和10nM)作用的GJIC的完全損失被部分抵消。染料木素比(-)-表兒茶酸略微更有效。當(dāng)與1nm的TPA一起使用時(shí)，這兩種化合物使GJIC恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。
平行地，Cx43蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的分布通過免疫染色法進(jìn)行調(diào)查(圖2)。典型對照如圖2A所示。細(xì)胞融合，并且連接蛋白定位在血漿膜。某些蛋白信號也可以在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)檢測到。在用TPA處理90分鐘(10nM)后，膜相關(guān)的Cx43的信號急劇減小(圖2B)，檢測不到累積Cx43蛋白質(zhì)的面積。當(dāng)(-)-表兒茶酸(圖2C)或染料木素(圖2D)存在于細(xì)胞培養(yǎng)物中時(shí)，TPA的作用被衰減?？梢栽谝源亟Y(jié)構(gòu)組織的膜中檢測到與對照相當(dāng)?shù)腃x43蛋白(圖2A)。當(dāng)采用1和5nM的TPA時(shí)，發(fā)現(xiàn)同樣的(-)-表兒茶酸和染料木素的對抗作用。
實(shí)施例2黃烷醇/矢車菊苷配質(zhì)的測定矢車菊苷配質(zhì)定量如下使用商購的(-)-表兒茶酸制備組合物標(biāo)準(zhǔn)品，并且純凈狀態(tài)的二聚體至十聚體是按照Hammerstone，J.F.等J.Ag.Food Chem.；1999；47(10)490-496；Lazarus，S.A.等J.Ag.FoodChem.；1999；47(9)；3693-3701；和Adamson，G.E.等J.Ag.FoodChem.；1999；47(10)4184-4188所述方法制備得到的。使用這些化合物的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液采用上面引用的Adamson參考文獻(xiàn)所述的標(biāo)準(zhǔn)相HPLC方法進(jìn)行分析，并且熒光檢測是分別在276nm和316nm的激發(fā)和發(fā)射波長下進(jìn)行。將峰分組且加合其面積以包括任意一種低聚物的所有異構(gòu)體作出的貢獻(xiàn)，并且利用二次擬合得到校準(zhǔn)曲線。單體和較小的低聚物具有幾乎線形的曲線，其與線性回歸的現(xiàn)有使用一致，從而得到單體基礎(chǔ)的和二聚體基礎(chǔ)的校準(zhǔn)曲線。
這些校準(zhǔn)曲線隨后用來計(jì)算樣本中的矢車菊苷配質(zhì)水平，樣本制備如下首先，可可或巧克力樣本(約8克)利用3次己烷提取從而脫脂(每次45mL)。其次，1克的脫脂原料用5mL的丙酮/水/乙酸混合物(70∶29.5∶0.5v/v)提取。隨后通過將樣本的HPLC數(shù)據(jù)與上述所得校準(zhǔn)曲線(它采用純的低聚物)進(jìn)行比較測定出矢車菊苷配質(zhì)在脫脂原料中的含量。利用標(biāo)準(zhǔn)方法通過Association of Official Analytical Chemists(AOAC Official Method 920.177)測定樣本的脂肪百分比(用1克大小的巧克力樣品或半克巧克力液樣本)。此后計(jì)算出總矢車菊苷配質(zhì)水平在原樣本(含脂肪)中的量。在各樣本運(yùn)行之前進(jìn)行校準(zhǔn)從而保護(hù)免于柱-柱間的差異。
實(shí)施例3可可矢車菊苷配質(zhì)，植物甾醇和其組合物的口服消耗的作用本試驗(yàn)的結(jié)果顯示攝食得自妥爾油(″植物甾醇″)和可可粉(CPd)的非脂化植物甾醇和phytostanol的組合物對下列的影響，該組合物含有約70mg/g的總可可矢車菊苷配質(zhì)，(1)氧化應(yīng)激和損傷的指標(biāo)，和(2)膽固醇水平，以及聯(lián)合給予植物甾醇和可可矢車菊苷配質(zhì)的協(xié)同作用。
純化的蛋殼食物中補(bǔ)充有植物甾醇(2wt％)和/或CPd(0，.5，1，2wt％)并且用于喂食雄性大鼠達(dá)2周。將該大鼠分為8組(每組3只)并且按照下列喂食20-25g/天的對照和試驗(yàn)飼料飼料+2％植物甾醇(440mg/d)飼料-植物甾醇1組 0％CPd(0.0mg/d) 5組0％CPd(0.0mg/d)2組 .5％CPd(110mg/d) 6組.5％CPd(110mg/d)3組 1％CPd(220mg/d) 7組1％CPd(220mg/d)4組 2％CPd(440mg/d) 8組2％CPd(440mg/d)隨意進(jìn)食水并且通過稱量殘留食物/收集食物杯下撒出的食物來測定消耗量。每天測定食物攝取并且隔天測定大鼠體重。
測定氧化損傷/應(yīng)激參數(shù)、膽固醇水平和吸收到血漿內(nèi)的表兒茶酸。
利用Yagi所述方法的改進(jìn)(Biochem Med 15212-6.1976)測定血漿TBARS。將100μL的全血加入到1ml的生理鹽水中并且在1700g下離心15分鐘。收集上清液且在-70℃下冷凍直至分析。通過磷鎢酸/硫酸體系沉淀分離脂質(zhì)。脂質(zhì)餾分隨后與硫代巴比土酸反應(yīng)，并且用熒光測量所得加合物，用1，1′，3，3′-四羥基丙烷作為標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表示為每毫升血漿的nM MDA并且是血漿多不飽和脂肪酸濃度的函數(shù)。
8-羥基-2′-脫氧鳥苷(8OH2′dG)測定如下。用Wako DNA ExtractorWB試劑盒(Wako Chemical USA，Inc.，Richmond，VA)分離核DNA。組織(100-250mg)或細(xì)胞(106細(xì)胞)在該試劑盒溶胞緩沖液中勻漿并在10,000g和4℃下離心20秒。顆粒狀物用該溶胞緩沖液處理，所得顆粒狀物溶于該試劑盒酶反應(yīng)溶液中。加入RNA酶達(dá)到終濃度為20μg/ml，樣本在50℃下培養(yǎng)10分鐘。加入該試劑盒蛋白酶溶液并且50℃的培養(yǎng)再持續(xù)1小時(shí)。樣本在10,000g和室溫下離心5分鐘并且上清液用該試劑盒NaI溶液和異丙醇處理以提純DNA。沉淀在10,000g和室溫下收集10分鐘并且用該試劑盒溶液A和B洗滌。最終的顆粒狀物迅速風(fēng)干且重新懸浮在200μl的0.1mM desferyl/20mM乙酸Na中，pH4.8。按照Shigenaga等的方法(Methods Enzymol 23416-33，1994)同時(shí)進(jìn)行某些改進(jìn)來進(jìn)行DNA消化和分析。簡單而言，通過與核酸酶P1在0.1mg/ml的終濃度和65℃下培養(yǎng)15分鐘使DNA消化為5′-一磷酸核苷酸。pH用1M Tris-HCl調(diào)整，并用pH8.5和小牛腸堿性磷酸酶進(jìn)一步消化該樣本為核苷酸(1小時(shí)，37℃)。樣本的pH用3M乙酸鈉緩沖液調(diào)整，并且加入pH5.1和0.1mM EDTA/0.1mM desferyl以防止金屬介導(dǎo)的氧化。用30,000MW截止旋轉(zhuǎn)過濾器(cutoff spinfilter)加入樣本并置于HPLC注射瓶內(nèi)。在制備的48小時(shí)內(nèi)分析樣本以防止人工制品形成。為了分析，將樣本注射到帶有電化學(xué)檢測器的Hewlett Packard 1100 HPLC中(ESA，Coulochem II)。利用SupelcosilLC-18-DB柱(150×4.6mm，3微米粒度)和100mM乙酸Na緩沖液移動(dòng)相，pH5.2，含5％甲醇，等滲的，在1.0ml/min的流速下進(jìn)行分離。OH8dG是在450mV下用電化學(xué)檢測法測定并且2′-脫氧鳥苷(dG)是在248nm下用UV檢測法進(jìn)行測定。OH8dG的水平是相對于樣本中dG的量進(jìn)行表達(dá)。
表兒茶酸吸收按照Rein等，J.of Nutr.，2000，130(8S)，2109S-2114S所述測定。
結(jié)果結(jié)果確立了植物甾醇和多酚的聯(lián)合給藥的意外有益效果。
參考圖3，被吸收表兒茶酸的量以劑量依賴性方式增高。令人驚奇地，植物甾醇的給藥增強(qiáng)了表兒茶酸的吸收，由此，例如，在2wt％CPd的食物中，表兒茶酸血漿水平比不含植物甾醇的對照食物提高了約30％。所以，植物甾醇增進(jìn)了表兒茶酸的生物利用度。
參考圖4，CPd以劑量依賴性方式抑制對DNA的氧化損傷。令人驚奇地，在較高劑量的CPd(2wt％)下，觀察到DNA氧化損傷的意外減輕，由此表明植物甾醇和CPd在防止對DNA的氧化損傷中的協(xié)同作用。
參考圖5，喂食含植物甾醇的食物令人驚奇地引起比對照食物更高的氧化應(yīng)激，其中對照食物即植物甾醇與食物(無可可矢車菊苷配質(zhì))的共同攝取，這是截止到本申請?zhí)峤蝗盏默F(xiàn)有技術(shù)所推薦的，加劇了該氧化應(yīng)激?？煽墒杠嚲哲张滟|(zhì)的攝食逆轉(zhuǎn)或減輕了植物甾醇的這種負(fù)面作用。
還測量了總血漿膽甾醇并且結(jié)果如表3所示。
表3-總血漿膽甾醇
參考表3，如預(yù)期的，植物甾醇降低膽固醇水平。然而，令人驚奇地，當(dāng)植物甾醇與CPd施用時(shí)，膽固醇水平以劑量依賴方式大大降低。譬如，三只喂食含植物甾醇食物的大鼠的平均總膽固醇水平為84mg/dl。該食物中補(bǔ)充2wt％CPd使總膽固醇繼續(xù)降低至80mg/dl，表明這兩種化合物的協(xié)同作用。喂食對照食物的大鼠具有的平均膽固醇水平為88.3mg/dl。
實(shí)施例4含降膽固醇劑的食品組合物與含可可矢車菊苷配質(zhì)的可可或巧克力的組合制備含降膽固醇劑的黑巧克力、太妃糖和granola棒。
太妃糖由表4所示的組分、通過預(yù)混和糖和可可并且將其與焦糖混合來制成。將游離植物甾醇(本身或粉碎的)加入到糖和可可的混合物中。
表4.含植物甾醇的太妃糖
含游離甾醇的黑巧克力利用市售的黑巧克力(DOVE Dark得自Mars Inc.)制成。為了便于和融化的巧克力混和并避免對巧克力紋理的任何不良影響，顆粒形式的植物甾醇/stanol在Universal Muche M20(IKA制造)上碾磨30-60秒，混和，并且再碾磨30秒直至顆粒大小與巧克力的相當(dāng)。將黑巧克力融化并通過緩慢混和加入甾醇以確保甾醇顆粒的均勻分布。所得組合物如表5所示。
表5.含植物甾醇的黑巧克力
含降膽固醇燕麥纖維的granola棒由表6和7的組分制備。通過將棕櫚核油融化至45℃制備糖漿粘合劑且保持在此溫度下直至備用?；旌陀衩滋菨{、甘油、可可粉、紅糖、鹽、卵磷脂和沒食子酸丙酯且加入棕櫚核油。保溫該混合物。為了制備granola，將燕麥或大豆粉(得自Sovex Food，Collegedale，TN)與巧克力塊混和，并向該混合物混和上面制備的熱糖漿粘合劑。隨后將granola混合物制成膠塊，撒上10X糖(62％)、可可粉(33％)和肉桂(5％)的混合物，并且切成塊?；旌衔镏惺褂玫目煽煞郯凑誎ealey等的美國專利6,015,913的方法制備。
表6.含巧克力和燕麥的granola棒
表7.含巧克力和大豆蛋白的granola棒
權(quán)利要求
1.一種包裝，包含含有可可黃烷醇和/或其低聚物的組合物，以及將該組合物用于哺乳動(dòng)物中心率失常的治療、預(yù)防、減小危險(xiǎn)性和降低發(fā)生率的標(biāo)簽和/或說明書，該哺乳動(dòng)物為人或獸醫(yī)動(dòng)物。
2.權(quán)利要求1的包裝，其中該組合物含有至少一種低聚物。
3.權(quán)利要求2的包裝，其中該低聚物為二聚體。
4.權(quán)利要求1的包裝，其中該組合物含有單體兒茶素和表兒茶酸的混合物。
5.權(quán)利要求1的包裝，其中該組合物為食品。
6.權(quán)利要求1的包裝，其中該哺乳動(dòng)物為人類
7.權(quán)利要求1的包裝，其中該哺乳動(dòng)物為獸醫(yī)動(dòng)物。
8.權(quán)利要求5的包裝，其中該食品為甜食。
9.權(quán)利要求1的包裝，其中該組合物進(jìn)一步含有降膽固醇劑。
10.權(quán)利要求9的包裝，其中降膽固醇劑為甾醇和/或stanol類降膽固醇劑。
11.權(quán)利要求1的包裝，其中組合物進(jìn)一步含有大豆蛋白質(zhì)、可溶性纖維和/或L-精氨酸。
12.權(quán)利要求1的包裝，其中該組合物進(jìn)一步含有至少一種下列物質(zhì)鈣，鉀，鎂，維生素E，維生素C，任何維生素B的復(fù)合物，類胡蘿卜素，瓜爾膠或者一或多不飽和脂肪酸。
13.權(quán)利要求1的包裝，其中該可可黃烷醇和/或其低聚物是可可組分、可可提取物或含至少一種黃烷醇或其低聚物的可可提取物的餾分的形式。
14.權(quán)利要求1的包裝，其中該組合物為寵物食品。
15.一種心率失常的治療或減小危險(xiǎn)性或發(fā)生率的方法，包括給患有或者處于患心率失常危險(xiǎn)的哺乳動(dòng)物施用一種組合物，該組合物含有有效量的可可黃烷醇和/或其低聚物，其中該哺乳動(dòng)物為人或獸醫(yī)動(dòng)物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中該組合物含有至少一種低聚物。
17.權(quán)利要求16的方法，其中該低聚物為二聚體。
18.權(quán)利要求15的方法，其中該組合物含有單體兒茶素和表兒茶酸的混合物。
19.權(quán)利要求15的方法，其中該組合物為食品。
20.權(quán)利要求15的方法，其中該哺乳動(dòng)物是人類。
21.權(quán)利要求15的方法，其中該哺乳動(dòng)物是獸醫(yī)動(dòng)物。
22.權(quán)利要求19的方法，其中該食品為甜食。
23.權(quán)利要求15的方法，其中該組合物進(jìn)一步含有降膽固醇劑。
24.權(quán)利要求23的方法，其中該降膽固醇劑為甾醇和/或stanol類降膽固醇劑。
25.權(quán)利要求15的方法，其中該組合物進(jìn)一步含有大豆蛋白質(zhì)、可溶性纖維和/或L-精氨酸。
26.權(quán)利要求15的方法，其中該組合物進(jìn)一步含有至少一種下列物質(zhì)鈣，鉀，鎂，維生素E，維生素C，任何維生素B的復(fù)合物，類胡蘿卜素，瓜爾膠或者一或多不飽和脂肪酸。
27.權(quán)利要求15的方法，其中該可可黃烷醇和/或其低聚物是可可組分、可可提取物或含至少一種黃烷醇或其低聚物的可可提取物的餾分的形式。
28.權(quán)利要求15的方法，其中該組合物是寵物食品。
29.一種改善認(rèn)知機(jī)能的方法，包括給給需要其的哺乳動(dòng)物施用一種組合物，該組合物含有有效量的可可黃烷醇和/或其低聚物，其中該哺乳動(dòng)物為人或獸醫(yī)動(dòng)物。
30.權(quán)利要求29的方法，其中該認(rèn)知機(jī)能為連接蛋白43相關(guān)的。
31.權(quán)利要求29的方法，其中該哺乳動(dòng)物是需要改善短期記憶機(jī)能的人。
32.權(quán)利要求29的方法，其中該組合物含有至少一種低聚物。
33.權(quán)利要求32的方法，其中該低聚物是二聚體。
34.權(quán)利要求29的方法，其中該組合物含有單體兒茶素和表兒茶酸的混合物。
35.權(quán)利要求29的方法，其中該組合物為食品。
36.權(quán)利要求29的方法，其中該哺乳動(dòng)物是人類。
37.權(quán)利要求29的方法，其中該哺乳動(dòng)物是獸醫(yī)動(dòng)物。
38.權(quán)利要求35的方法，其中該食品為甜食。
39.權(quán)利要求29的方法，其中該組合物進(jìn)一步含有降膽固醇劑。
40.權(quán)利要求39的方法，其中該降膽固醇劑為甾醇和/或stanol類降膽固醇劑。
41.權(quán)利要求29的方法，其中該組合物進(jìn)一步含有大豆蛋白質(zhì)、可溶性纖維和/或L-精氨酸。
42.權(quán)利要求29的方法，其中該組合物進(jìn)一步含有至少一種下列物質(zhì)鈣，鉀，鎂，維生素E，維生素C，任何維生素B的復(fù)合物，類胡蘿卜素，瓜爾膠或者一或多不飽和脂肪酸。
43.權(quán)利要求29的方法，其中該可可黃烷醇和/或其低聚物是可可組分、可可提取物或含至少一種黃烷醇或其低聚物的可可提取物的餾分的形式。
44.權(quán)利要求29的方法，其中該組合物是寵物食品。
45.可可黃烷醇和/或其低聚物在制備用于人或獸醫(yī)動(dòng)物中涉及缺損性間隙連接聯(lián)系的疾病的治療、預(yù)防、減小危險(xiǎn)性或減慢進(jìn)程的藥物、食品、nutraceutical或食品強(qiáng)化劑中的用途。
46.可可黃烷醇和/或其低聚物在制備用于人或獸醫(yī)動(dòng)物中心率失常的治療、預(yù)防、減小危險(xiǎn)性或降低發(fā)生率的藥物、食品、nutraceutical或食品強(qiáng)化劑中的用途。
47.可可黃烷醇和/或其低聚物在制備用于人或獸醫(yī)動(dòng)物中認(rèn)知機(jī)能障礙的治療、預(yù)防、減小危險(xiǎn)性或減慢進(jìn)程的藥物、食品、nutraceutical或食品強(qiáng)化劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有多酚例如可可多酚，如黃烷醇及其相關(guān)低聚物的組合物，以及治療細(xì)胞的間隙連接聯(lián)系異常的方法，例如癌癥，心率失常，神經(jīng)變性疾病和認(rèn)知機(jī)能障礙。
文檔編號A61P25/28GK1655806SQ03811566
公開日2005年8月17日 申請日期2003年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月21日
發(fā)明者H·西斯 申請人:瑪爾斯有限公司