專利名稱：慢性腎臟疾病治療藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型的慢性腎臟疾病治療藥物。
背景技術(shù)：
細(xì)胞內(nèi)的游離Ca2+對控制心肌或各種平滑肌的收縮、神經(jīng)傳遞物質(zhì)的釋放、基因的表達(dá)具有重要的作用，可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜以及肌囊泡膜中的Ca2+泵、Ca2+通道以及Na+/Ca2+交換轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NCX)來調(diào)節(jié)Ca2+的濃度。特別是其中的Na+/Ca2+交換轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在心肌以及血管平滑肌的收縮和松弛中起著重要作用(Ann.Rev.Physiol.第52卷467頁(1990))。目前從哺乳動(dòng)物中分離鑒定了3種NCX基因。并且發(fā)現(xiàn)NCX1蛋白在腦、心臟、腎臟中大量表達(dá)，NCX2蛋白主要在腦內(nèi)表達(dá)，在內(nèi)臟平滑肌中少量表達(dá)，NCX3蛋白主要在腦內(nèi)表達(dá)，在骨骼肌中少量表達(dá)(《血管》第24卷No.3，101頁(2001)，Am.J.Physiol.，272，C1250-C1261(1997))。
另外，在有關(guān)作為NCX抑制劑的2-[2-[4[硝基苯氧基]苯基]乙基]異硫脲甲磺酸酯(KB-R7943)等異硫脲衍生物或2-[4-[(2，5-二氟苯基)甲氧基]苯氧基]-5-乙氧基苯胺(SEA0400)等苯氧基苯胺衍生物的報(bào)告中，確認(rèn)了K-BR7943對急性心肌梗塞模型或腦以及腎臟的缺血再灌流模型的有效性(J.Pharmacol.Exp.Ther.第296卷412頁(2001))。但是，還沒有有關(guān)NCX抑制劑在慢性腎臟疾病的治療中應(yīng)用的報(bào)告。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人等用由腦、心臟、腎臟調(diào)制的Na+/Ca2+交換轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NCX)測定了K-BR7943、SEA0400等的NCX抑制作用。結(jié)果表明，與來自腦的NCX相比，以SEA0400為代表的苯氧基苯胺衍生物以及苯氧基吡啶衍生物對來自心臟以及腎臟的NCX具有選擇性抑制作用。
另外，至目前為止的研究表明上述化合物在抑制NCX的濃度下對其他受體、通道以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白幾乎不產(chǎn)生任何影響(J.Pharmacol.Exp.Ther.第298卷249頁(2001))。
以上結(jié)果表明，苯氧基苯胺衍生物等對NCX1具有高選擇性。
另外，本發(fā)明人等為了揭示NCX1與疾病、治療之間的關(guān)系，對各種疾病模型(慢性腎功能不全/腎小球硬化癥模型、糖尿病大鼠等)應(yīng)用NCX1選擇性抑制劑進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上述慢性腎功能不全、腎小球硬化癥、糖尿病性腎病等疾病中，通過抑制NCX1可以有效地進(jìn)行腎保護(hù)，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及以抑制Na+/Ca2+交換轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(NCX1)的化合物作為有效成分的慢性腎臟疾病治療藥物。
本發(fā)明的慢性腎臟疾病治療藥物以式(1)表示的2-苯氧基苯胺衍生物或其藥學(xué)上允許的鹽作為有效成分， 式中，R1表示氫原子或C1-C6烷氧基，R2表示鹵素原子或硝基，R3表示氫原子或鹵素原子。
具體實(shí)施例方式
作為本發(fā)明的NCX1抑制化合物，只要是對來自于腎臟的NCX1具有抑制作用的化合物即可，沒有特別的限制，優(yōu)選在后述試驗(yàn)(參考例3)中以3μM濃度抑制50％以上的化合物。再有，從防止副作用的目的出發(fā)，優(yōu)選對NCX1具有特異性抑制作用的化合物。
作為對NCX1具有特異性抑制作用的化合物，是指在抑制NCX1的濃度下對其他受體、通道以及交換轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白幾乎不產(chǎn)生抑制作用的化合物，具體優(yōu)選例如在3μM濃度下對Ca2+通道、Na+通道、K+通道、Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、Na+，K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、磷脂酶A2、磷脂酶C、5-脂肪氧合酶、誘導(dǎo)型氮氧化物合酶、組成型氮氧化物合酶、腺苷受體、腎上腺素受體、谷氨酸受體、舒緩激肽受體、LTB4受體、PAF受體等的抑制低于50％的化合物。另外，使用各離子通道、酶、受體的測定方法，按照J(rèn).Pharmacol.Exp.Ther.第298卷249頁(2001)以及其中所引用的文獻(xiàn)中記載的方法進(jìn)行。
作為對NCX1特異性抑制的化合物，例如有苯氧基苯胺衍生物以及苯氧基吡啶衍生物。
優(yōu)選式(2)表示的化合物或其藥學(xué)上允許的鹽， 式中，R4、R5以及R6相同或不同，表示氫原子或鹵素原子。X表示 或 R7表示氫原子、取代或未取代的C1-C6烷基或者取代或未取代的C1-C6烷氧基。Z表示硝基、氨基或NHC(O)CH2R8。R8表示氫原子、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C1-C6烷氧基、鹵素原子、羥基、C2-C7酰氧基、NR9R10或 R9以及R10相同或不同，表示氫原子、取代或未取代的C1-C6烷基、N-甲基-4-哌啶基，R11表示氫原子、羥基或C2-C7烷氧羰基，Y表示亞甲基、環(huán)氧基、硫基或NR12，n表示1至4的整數(shù)，R12表示氫原子、取代或非取代的C1-C6烷基或者取代或非取代的苯基。
從對NCX1的抑制活性出發(fā)，優(yōu)選式(1)表示的2-苯氧基苯胺衍生物或其藥學(xué)上允許的鹽， 式中，R1表示氫原子或C1-C6烷氧基，R2表示鹵素原子或硝基，R3表示氫原子或鹵素原子。
式(1)以及式(2)中，C1-C6烷氧基是指碳原子數(shù)1-6的直鏈或支鏈烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、異戊氧基、新戊氧基、叔戊氧基、1-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、1，2-二甲基丙氧基、己氧基、異己氧基等。
作為取代C1-C6烷氧基的取代基，例如氯原子、氟原子、硝基、氨基、二甲基氨基、羧基、甲氧羰基、乙氧羰基、苯基、羥基、氰基、氨基甲?；取?br> 作為鹵素原子，是指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
作為C1-C6烷基，是指碳原子數(shù)1-6的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、1，2-二甲基丙基、己基、異己基等。
作為取代C1-C6烷基的取代基，例如氯原子、氟原子、硝基、氨基、二甲基氨基、羧基、甲氧羰基、乙氧羰基、苯基、甲氧基、乙氧基、羥基、氰基、氨基甲?；?。
作為C2-C7酰氧基，是指碳原子數(shù)2-7的直鏈或支鏈狀酰氧基，?；糠挚梢允黔h(huán)狀，也可以含有芳香族基團(tuán)。例如乙酰氧基、丙酰氧基、異丙酰氧基、環(huán)己酰氧基、苯甲酰氧基等。
作為C2-C7烷氧羰基，是指碳原子數(shù)2-7的直鏈或支鏈狀烷氧羰基，烷氧基部分可以是環(huán)狀，也可以含有芳香族基團(tuán)。具體例如甲氧羰基、乙氧羰基、丙氧羰基、異丙氧羰基、丁氧羰基、異丁氧羰基、仲丁氧羰基、叔丁氧羰基、戊氧羰基、異戊氧羰基、新戊氧羰基、叔戊氧羰基、1-甲基丁氧羰基、2-甲基丁氧羰基、1，2-二甲基丙氧羰基、己氧羰基、異己氧羰基等。
作為取代苯基的取代基，例如氯原子、氟原子、硝基、氨基、二甲基氨基、羧基、甲氧羰基、乙氧羰基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、羥基、氰基、氨基甲?；?。
作為具有優(yōu)良腎保護(hù)作用的化合物的具體例，有下式表示的化合物(SEA0400) 以及式 表示的化合物(SEA0064)。
從防止副作用的目的出發(fā)，優(yōu)選對NCX1具有比NCX2、NCX3更強(qiáng)抑制作用的化合物。例如在后述的Na+/Ca2+交換轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的測定方法中，優(yōu)選IC50(來自腎皮質(zhì))/IC50(來自腦)IC50(來自腎皮質(zhì))/IC50(來自心肌膜)的各計(jì)算值小于使用SEA0400時(shí)的計(jì)算值。
另外，式(1)以及(2)表示的化合物，可以通過WO98/43943、WO99/20598、特開平10-265460、特開平10-218844、特開平11-49752、特開平11-92454中記載的制造方法合成。
本發(fā)明的慢性腎臟疾病治療藥物，是指對包括慢性腎功能不全、腎小球硬化癥、糖尿病性腎病、腎硬化、慢性腎炎、慢性腎小球腎炎、多發(fā)性囊腫腎等在內(nèi)的因慢性腎臟疾病而導(dǎo)致腎臟生理機(jī)能降低的疾病的治療藥物，可以減少尿蛋白或白蛋白等，具有優(yōu)良的腎保護(hù)作用。
本發(fā)明的治療藥物可以用適當(dāng)?shù)墓d體、稀釋劑等配制成適當(dāng)?shù)乃幬锝M成形態(tài)(片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、干糖漿、注射液等)，經(jīng)口或非經(jīng)口給藥。
在制造固體制劑時(shí)，可以使用各種添加劑，例如賦形劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、包衣基質(zhì)，通過攪拌制粒法、流化床制粒法、破碎制粒法制備。
可以根據(jù)需要添加抗氧化劑、包衣劑、著色劑、矯味矯臭劑、表面活性劑、增塑劑等。
本發(fā)明藥物有效成分的給藥量，根據(jù)年齡、體重、給藥形態(tài)等不同而不同，成人通常0.1～1000mg/日，一天一次或分?jǐn)?shù)次給藥。
以下通過制劑例、試驗(yàn)例說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于這些試驗(yàn)例。
制劑例1SEA0400 50mg乳糖 40mg玉米淀粉 49.75mg微晶纖維素17mg羧甲基纖維素鈣17mg羥丙基纖維素 5.25mg硬脂酸鎂 1mg合計(jì) 180mg將SEA0400、乳糖、玉米淀粉、微晶纖維素、羧甲基纖維素鈣均勻混和，在其中添加10％羥丙基纖維素水溶液，練合后，干燥，將顆粒過30目篩，得到均勻顆粒，添加硬脂酸鎂，壓片制成片劑。
制劑例2SEA046450mg乳糖 40mg
玉米淀粉 49.75mg微晶纖維素 17mg羧甲基纖維素鈣 17mg羥丙基纖維素 5.25mg硬脂酸鎂 1mg合計(jì) 180mg將SEA0464、乳糖、玉米淀粉、微晶纖維素、羧甲基纖維素鈣均勻混和，在其中添加10％羥丙基纖維素水溶液，練合后，干燥，將顆粒過30目篩，得到均勻顆粒，添加硬脂酸鎂，壓片制成片劑。
參考例1大腦微粒體Na+/Ca2+交換轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的測定方法將由大白鼠(8周齡)的大腦得到的微粒體(1.5mg/ml)用含有160mM NaCl的緩沖液進(jìn)行預(yù)處理，將Na載入囊泡(membrane derivedvesicles)內(nèi)。將該懸浮液用含有20μM45CaCl2的緩沖液稀釋50倍誘發(fā)45Ca的攝入后，用緩沖液(0℃)稀釋使反應(yīng)停止，迅速回收硝基纖維素膜上的囊泡。然后用液體閃爍法對囊泡內(nèi)的45Ca定量?？梢愿鶕?jù)J.Biol.Chem.第257卷，5111頁(1982)的方法對上述的大腦微粒體中Na+/Ca2+交換活性進(jìn)行測定。
參考例2狗心肌囊泡Na+/Ca2+交換轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的測定方法按Methods Enzymology第157卷，85頁(1988)記載的離心分級法調(diào)制狗心肌囊泡(0.5mg/ml)，在溶液A(20mM MOPS-Tris(pH7.4)，160mM NaCl或KCl)中懸浮，室溫下靜置約1小時(shí)，將Na或K載入囊泡內(nèi)。將該懸浮液用含有20μM45CaCl2的緩沖液稀釋50倍誘發(fā)45Ca的攝入后，用緩沖液(0℃)稀釋使反應(yīng)停止，迅速回收硝基纖維素膜上的囊泡。然后用液體閃爍法對囊泡內(nèi)的45Ca定量。用從載入Na的情況下的值減去載入K的情況下的值評價(jià)Na+/Ca2+交換活性。根據(jù)J.Biol.Chem.第257卷，5111頁(1982)的方法對上述的狗心肌膜囊泡中Na+/Ca2+交換活性進(jìn)行測定。
參考例3來自大白鼠腎臟皮質(zhì)的BLMV(basolateral membranevesicles)的調(diào)制方法以及Na+/Ca2+交換活性的測定方法
(BLMV的調(diào)制方法)來自大白鼠腎臟皮質(zhì)的BLMV的調(diào)制以及Na+/Ca2+交換活性的測定可以按照Am.J.Physiol.第266卷F785頁(1994)中記載的方法進(jìn)行。
將大白鼠的腎臟摘除后，置于冰冷卻的蔗糖緩沖液(0.25mM蔗糖，0.1mM PMSF，10mM Tris-HCl(pH7.6))中，除去被膜后，將分離的皮質(zhì)在蔗糖緩沖液中細(xì)細(xì)切斷。用Dounce型勻漿機(jī)勻漿后，再用Polytron型勻漿機(jī)勻漿。然后2500g離心分離15分鐘，回收上清液。再24000g離心20分鐘，回收片狀物的白色松散部分。再添加蔗糖緩沖液，用Dounce型勻漿機(jī)勻漿，添加珀可(商品名，Percoll)后，30000g離心35分鐘，回收中間層。再添加緩沖液(100mM KCl，100mM甘露糖醇，5mM HEPES-Tris(pH7.4))后，34000g離心30分鐘回收松散的白色片狀物(BLMV)。再在KCl-甘露糖醇緩沖液中懸浮后，34000g離心30分鐘回收沉淀，用于測定活性。
(Na+/Ca2+交換轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na依存性45Ca的攝取)的測定方法)將BLMV用預(yù)平衡緩沖液(100mM NaCl，40mM KCl，1mM MgSO4，10mM葡萄糖，5mM HEPES-Tris(pH7.4))平衡(37℃，10分鐘)后，離心(20000g，5min)，回收沉淀，用預(yù)平衡緩沖液再次懸浮。再次離心回收沉淀后，用預(yù)平衡緩沖液再次懸浮。將該BLMV懸浮液用外介質(zhì)(100mM膽堿鹽酸鹽，40mM KCl，1mM MgSO4，10mM葡萄糖，5mMHEPES-Tris(pH7.4)，25μM纈氨霉素，10μM CaCl2，1mCi/l45CaCl2)稀釋20倍開始攝入。在25℃下反應(yīng)一定時(shí)間后，添加用來終止反應(yīng)的溶液(stop solution)(冰冷卻的150mM KCl)2ml使反應(yīng)停止后，迅速用超濾膜(0.45μM硝基纖維素過濾器)過濾，從過濾器上回收BLMV。然后用2ml終止反應(yīng)液洗滌2次，用液體閃爍法定量攝入到BLMV中的45Ca。
表1Na+/Ca2+交換抑制活性(Na依存性45Ca的攝取)(IC50值μM)

另外，在來自腎皮質(zhì)的Na+/Ca2+交換活性的測定中，發(fā)現(xiàn)使用SEA0064時(shí)的抑制活性是SEA0400的約0.07倍。
試驗(yàn)例1Na+/Ca2+交換體系抑制劑對Dahl-salt敏感性大鼠的腎保護(hù)作用按照J(rèn).Cardiovascular Pharmacology第23卷970頁(1994)記載的方法準(zhǔn)備本試驗(yàn)。具體如下所示。
<方法>
實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇Dahl-salt敏感性(sensitive)(Dahl-S)大鼠和Dahl-salt抗性(resistance)(Dahl-R)大鼠(雄性，7周齡)作為對照動(dòng)物，按下述方法分為3組(每組各6只)進(jìn)行試驗(yàn)。
I組Dahl-R+4％NaCl(食用生理鹽水)+經(jīng)口給予溶劑(1日2次)II組Dahl-S+4％NaCl(食用生理鹽水)+經(jīng)口給予溶劑(1日2次)III組Dahl-S+4％NaCl(食用生理鹽水)+經(jīng)口給予SEA040010mg/kg(1日2次)各組動(dòng)物給予含有4％NaCl的高鹽飼料(正常飼料含0.6％)，飲用水可以自由攝取。連續(xù)6周每日2次經(jīng)口給予溶劑以及SEA0400(第1次8:30-9:30，第2次16:30-17:30)。給藥開始6周后，將每只大鼠裝入代謝籠中采取尿液，測定尿蛋白量以及白蛋白量，觀察對腎功能帶來的影響。尿蛋白以及白蛋白的測定分別按照BunsekiKagaku第32卷E379-E386頁(1983)以及Hypertension第40卷6號834-839頁(2002)中記載的方法準(zhǔn)備，用日立自動(dòng)分析裝置7060進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
試驗(yàn)開始6周后尿蛋白的排泄量I組為23±2mg/天，II組為144±11mg/天，SEA0400給藥組(III組)為91±12mg/天，SEA0400給藥組(III組)與溶劑給藥組(II組)相比數(shù)值明顯偏低。
另外尿中白蛋白的排泄量I組為2±1mg/天，II組為109±14mg/天，SEA0400給藥組(III組)為58±8mg/天，SEA0400給藥組(III組)與溶劑給藥組(II組)相比數(shù)值明顯偏低。
以上結(jié)果表明，SEA0400顯著抑制了Dahl-S大鼠中確認(rèn)的尿蛋白以及白蛋白排泄量的增加，顯示出腎保護(hù)作用。
試驗(yàn)例2Na+/Ca2+交換體系抑制劑對自然發(fā)病的糖尿病大鼠(ZSF-1)的腎保護(hù)作用<方法>
ZSF-1是自然發(fā)病的糖尿病大鼠，已知會產(chǎn)生腎功能障礙(RenalFailure第22卷4號，387-406頁，2000)。本試驗(yàn)利用從The Jackson Laboratory處購入的8周齡ZSF-1以及對照動(dòng)物ZSF-1/lean，按下述分為5組(每組8只)進(jìn)行試驗(yàn)。
I組ZSF-1/lean+經(jīng)口給予溶劑(1日2次)II組ZSF-1+經(jīng)口給予溶劑(1日2次)III組ZSF-1+SEA0400 1mg/kg經(jīng)口給藥(1日2次)IV組ZSF-1+SEA0400 3mg/kg經(jīng)口給藥(1日2次)V組ZSF-1+SEA0400 10mg/kg經(jīng)口給藥(1日2次)連續(xù)8周每日2次經(jīng)口給予溶劑以及SEA0400(第1次8:30-10:30，第2次16:30-18:30)。給藥開始8周后，將每只大鼠裝入代謝籠中采取尿液，測定尿蛋白量以及白蛋白量，觀察對腎功能帶來的影響。尿蛋白以及白蛋白的測定按上述文獻(xiàn)中記載的方法進(jìn)行，用日立自動(dòng)分析裝置7060進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
試驗(yàn)開始8周后尿蛋白的排泄量I組為14±1mg/天，II組為58±9mg/天，III組為40±8mg/天，IV組為37±7mg/天，V組為29±5mg/天，SEA0400 10mg/kg給藥組(V組)與溶劑給藥組(II組)相比數(shù)值明顯偏低。
另外尿中白蛋白的排泄量I組為1±0.1mg/天，II組為28±5mg/天，III組為20±5mg/天，IV組為17±5mg/天，V組為9±2mg/天，SEA040010mg/kg給藥組(V組)與溶劑給藥組(II組)相比數(shù)值明顯偏低。
以上結(jié)果表明，SEA0400顯著抑制了自然發(fā)病的糖尿病大鼠中確認(rèn)的尿蛋白以及白蛋白排泄量的增加，顯示出腎保護(hù)作用。
產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用通過本發(fā)明可以提供基于新的作用機(jī)理的慢性腎功能疾病的治療藥物，是一種副作用少的慢性腎臟疾病的治療和預(yù)防藥物。
權(quán)利要求
1.慢性腎臟疾病治療藥，其特征在于以對Na+/Ca2+交換轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(NCX1)具有抑制作用的化合物作為有效成分。
2.慢性腎臟疾病治療藥，其特征在于以對Na+/Ca2+交換轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(NCX1)具有特異性抑制作用的化合物作為有效成分。
3.慢性腎臟疾病治療藥，其特征在于以式(1)表示的2-苯氧基苯胺衍生物或其藥學(xué)上允許的鹽作為有效成分， 式中，R1表示氫原子或C1-C6烷氧基，R2以及R3表示鹵素原子。
4.慢性腎臟疾病的治療或預(yù)防方法，其特征在于抑制Na+/Ca2+交換轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(NCX1)。
5.用于腎保護(hù)的抑制Na+/Ca2+交換轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(NCX1)的化合物在治療慢性腎臟疾病中的用途。
全文摘要
慢性腎臟疾病治療藥物，含有對Na
文檔編號A61K31/075GK1620312SQ0380259
公開日2005年5月25日 申請日期2003年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月25日
發(fā)明者宮田則之, 奧山茂, 高橋禎介 申請人:大正制藥株式會社